豬鏈球菌疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及豬鏈球菌亞單位抗原，和編碼其蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及提供了一種豬鏈球菌疫苗組合物，該疫苗組合物用于預(yù)防和/或治療豬鏈球菌相關(guān)疾病和由豬鏈球菌造成的感染的相關(guān)疾病。
【專(zhuān)利說(shuō)明】豬鏈球菌疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及豬鏈球菌（Streptococcus suis)的疫苗組合物及其制備方法，所述組合物包含兩種豬鏈球菌免疫抗原。本發(fā)明還涉及 將所述免疫抗原用于制備預(yù)防和/或治療與豬鏈球菌相關(guān)的疾病和由豬鏈球菌導(dǎo)致的感 染的組合物和方法中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬鏈球菌是一種重要的豬病原體，可導(dǎo)致許多病理疾病諸如關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腦 膜炎、肺炎和敗血病。其還是對(duì)于接觸污染的豬或它們的副產(chǎn)物的人的重要的動(dòng)物傳染病 病原體，導(dǎo)致腦膜炎和心內(nèi)膜炎。目前已知基于莢膜抗原的三十三種血清型（1-31型、33和 1/2型），但還不完全了解涉及豬鏈球菌的發(fā)病機(jī)理和致病力的機(jī)制，所以仍未有有效的疫 苗來(lái)防控豬鏈球菌的感染。
[0003] 現(xiàn)有的滅活全菌疫苗和活的無(wú)毒疫苗，因需要重復(fù)多次免疫并且不能抵御異型菌 株的攻擊，其保護(hù)功效是十分有限的。由于豬鏈球菌莢膜在致病力中具有重要作用，因此進(jìn) 行了基于莢膜物質(zhì)開(kāi)發(fā)疫苗的嘗試，然而，這種疫苗因?yàn)榍v膜多糖的免疫原性較差未取得 令人滿(mǎn)意的效果。有人嘗試使用溶血素（suilysin)，或溶菌酶釋放蛋白（MRP)和細(xì)胞外蛋 白質(zhì)因子（EF)開(kāi)發(fā)亞單位疫苗，然而，在一些地理區(qū)域中有顯著數(shù)量的致病力強(qiáng)的菌株并 不表達(dá)這些蛋白質(zhì)，造成其免疫保護(hù)的局限性。本發(fā)明首次通過(guò)將38KDA蛋白與SaoA蛋白 組合使用，針對(duì)不同血清型豬鏈球菌感染有著較好的保護(hù)作用，而且只需要免疫一次，避免 多次重復(fù)免疫帶來(lái)的應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)免疫效力比較試驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白組合使用，協(xié) 同刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，有效降低了免疫劑量，大大降低免疫成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種預(yù)防和/或治療豬鏈球菌感染的 疫苗組合物，包含兩種豬鏈球菌免疫保護(hù)性抗原和佐劑。
[0005] 本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬鏈球菌感染的疫苗組合物包含的兩種豬鏈球菌 免疫抗原為38KDA蛋白和SaoA蛋白。
[0006] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬鏈球菌感染的疫苗組合物包含的豬鏈球 菌免疫抗原38KDA蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0007] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的治療和/或預(yù)防豬鏈球菌感染的疫苗組合物包含的豬鏈球 菌免疫抗原SaoA蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0008] 本發(fā)明提供的預(yù)防和/或治療豬鏈球菌感染的疫苗組合物包含的豬鏈球菌免疫 抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白還可以是與其功能衍生物基本相同的氣基酸序列的多膚。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供包含豬鏈球菌免疫抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白或其 功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于預(yù)防和/或治療動(dòng)物中豬鏈球菌相關(guān)疾 病或感染的組合物和/或方法中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明可以應(yīng)用的豬鏈球菌相關(guān)疾病的非窮舉性列表包括，如關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、 腦膜炎、肺炎和敗血癥。
[0011] 術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"指對(duì)鏈球菌菌株如豬鏈球菌感染敏感的任何動(dòng)物。具體地，這樣的動(dòng) 物可以是，但不限于，小鼠、豬、山羊、馬和人。更具體地，所述動(dòng)物由豬組成。
[0012] 術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"指通過(guò)其與鏈球菌菌株相關(guān)的感染或疾病的癥狀被阻斷或延遲；術(shù)語(yǔ) "治療"指通過(guò)與鏈球菌菌株相關(guān)的感染或疾病的癥狀被緩和或完全消除的過(guò)程。
[0013] 術(shù)語(yǔ)"功能衍生物"指具有與完整蛋白/肽序列的生物活性基本類(lèi)似的功能生物 活性的蛋白/肽序列。換言之，其優(yōu)選地指當(dāng)將所述功能衍生物施用于動(dòng)物時(shí)，基本上保留 了激發(fā)免疫應(yīng)答，如針對(duì)豬鏈球菌菌株攻擊的保護(hù)性反應(yīng)的能力的多肽或其片段。
[0014] 術(shù)語(yǔ)"片段"指這樣的多核苷酸序列，其是人工構(gòu)建（例如通過(guò)化學(xué)合成）或通過(guò) 將天然產(chǎn)物裂解成多個(gè)小片段（使用限制性?xún)?nèi)切酶，或機(jī)械剪切）構(gòu)建的本發(fā)明核酸的分 離的部分，或通過(guò)PCR、DNA聚合酶或本領(lǐng)域公知的任何其他聚合技術(shù)合成的核酸的部分， 或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組核酸技術(shù)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸部分。
[0015] 術(shù)語(yǔ)"保護(hù)性反應(yīng)"意為在動(dòng)物中預(yù)防豬鏈球菌相關(guān)疾病或由豬鏈球菌導(dǎo)致的感 染的發(fā)作或減輕存在的這樣的疾病的嚴(yán)重性。
[0016] 本發(fā)明涉及的豬鏈球菌多肽，其有利地激發(fā)動(dòng)物中的保護(hù)性反應(yīng)。具體地，本發(fā)明 實(shí)施方式的多肽包含與其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0017] 如本文一般理解和使用，"功能性片段"指編碼與完整核酸序列的生物活性基本相 似的功能生物活性的核酸序列。換言之，在本發(fā)明的上下文中，其優(yōu)選地指基本上保留了編 碼這樣的多肽/蛋白質(zhì)能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白質(zhì)當(dāng)施用于動(dòng)物時(shí)，激發(fā)針對(duì) 豬鏈球菌菌株攻擊的免疫應(yīng)答，和更優(yōu)選地保護(hù)性反應(yīng)。
[0018] 當(dāng)指氨基酸序列時(shí)，"基本上相同"可以理解為本發(fā)明的多肽優(yōu)選地具有這樣的氨 基酸序列，其與SEQ ID NO :3-4中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至 優(yōu)選地80%同源性，或甚至更優(yōu)選地90%同源性，或最優(yōu)選地95%同源性。
[0019] 在本文中術(shù)語(yǔ)"同源性"還包括與參比序列相同或類(lèi)似，同時(shí)提供任何氨基酸的簡(jiǎn) 單替換/修飾?？梢杂肂LAST-P (基本局部排比檢索工具），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的程序進(jìn) 行該方面的同源性檢索。對(duì)于相應(yīng)的核酸序列，同源性涉及在本領(lǐng)域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0020] 術(shù)語(yǔ)"佐劑"指加入到本發(fā)明的組合物中以增加組合物的免疫原性的物質(zhì)。已知 的佐劑包括，但不限于：油佐劑，水乳狀液（例如：完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑），水溶 性佐劑，Quil A佐劑，氫氧化鋁佐劑，葡聚糖，硫酸葡聚糖，藻酸鈉。
[0021] 本發(fā)明實(shí)施例中使用了水溶性佐劑中的一種gel佐劑，本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"水溶性 佐劑"又稱(chēng)"水基佐劑"或"水佐劑"，是一種聚合物水溶性分散體，用于提高水溶性疫苗的功 效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸類(lèi)合成聚合物組成。
[0022] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物中g(shù)el佐劑含量為10%?40% (V/V)。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防豬鏈球菌感染的疫苗組合 物，由豬鏈球菌免疫抗原38KDA蛋白、SaoA蛋白和gel佐劑組成。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種治療和/或預(yù)防動(dòng)物中豬鏈球菌相關(guān)疾病或感 染的疫苗組合物的制備方法，包括：
[0025] (1)制備38KDA蛋白和SaoA蛋白抗原；
[0026] (2)按比例混合抗原，加入佐劑，乳化。
[0027] 抗原的制備可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行，包括基因工程手段， 例如通過(guò)包含本發(fā)明多核苷酸的克隆或表達(dá)載體。術(shù)語(yǔ)"載體"涉及被設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn) 染一種或多種細(xì)胞類(lèi)型的多核苷酸構(gòu)建體。載體可以是，例如"克隆載體"，其被設(shè)計(jì)用于分 離、增殖和復(fù)制插入的核苷酸；"表達(dá)載體"，其被設(shè)計(jì)用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列； 或"病毒載體"，其被設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)重組病毒或病毒樣顆粒；或"穿梭載體"，其包含不只一種 類(lèi)型的載體的性質(zhì)。適合制備本發(fā)明豬鏈球菌抗原的公眾可獲得的載體包括質(zhì)粒、腺病毒、 桿狀病毒、酵母桿狀病毒、植物病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、α病毒、慢病 毒等，還可以獲得構(gòu)建這樣的載體的方法。本發(fā)明豬鏈球菌抗原的制備還包括通過(guò)人工合 成的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種疫苗組合物在制備治療和/或預(yù)防動(dòng)物中豬鏈 球菌相關(guān)疾病或感染的藥物的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明疫苗組合物可以進(jìn)一步包含豬鏈球菌全菌抗原。
[0030] 優(yōu)選地，所述的豬鏈球菌全菌抗原為豬鏈球菌2型全菌抗原。
[0031] 更優(yōu)選地，所述的豬鏈球菌2型全菌抗原為豬鏈球菌2型SC株全菌抗原。
[0032] 還可以將其他的試劑加入到本發(fā)明的組合物。例如，本發(fā)明的組合物還可以包含 試劑，如：藥物，免疫刺激劑（如：α -干擾素 、β -干擾素 、Υ -干擾素、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落 刺激因子（GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF)和白介素2(IL2))，抗氧化劑，表面活 性劑，著色劑，揮發(fā)性油，緩沖劑，分散劑，推進(jìn)劑和防腐劑。為了制備這樣的組合物，可以使 用本領(lǐng)域公知的方法。
[0033] 本發(fā)明的組合物的成分或組分的量?jī)?yōu)選地是治療有效量。所述治療有效量是指在 組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學(xué)作用而不導(dǎo)致過(guò)度副作用所必需量。所用的成分 和待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類(lèi)型，待治療的動(dòng)物的類(lèi)型和年 齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0034] 優(yōu)選地，對(duì)于動(dòng)物豬而言，本發(fā)明疫苗組合物38KDA蛋白抗原含量為10-100 μ g/ ml ;SaoA蛋白抗原有效量為50-300μ g/ml。
[0035] 更優(yōu)選地，所述疫苗組合物38KDA蛋白抗原含量為50 μ g/ml ;SaoA蛋白抗原有效 量為 150 μ g/ml。
[0036] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：
[0037] (1)本發(fā)明疫苗組合物可通過(guò)基因工程手段或人工合成手段對(duì)疫苗組合物的組分 進(jìn)行大量合成表達(dá)，不僅耗時(shí)短，還可便于大規(guī)模生產(chǎn)；
[0038] (2)本發(fā)明豬鏈球菌疫苗組合物中多免疫原性抗原的組合可誘導(dǎo)產(chǎn)生協(xié)同的免疫 效果；
[0039] (3)本發(fā)明疫苗組合物可有效保護(hù)豬只抵抗不同血清型豬鏈球菌的感染，提供了 一種完善預(yù)防和/或治療豬鏈球菌感染的途徑，對(duì)于凈化豬鏈球菌有著積極的現(xiàn)實(shí)意義。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1 :本發(fā)明疫苗組合物免疫小鼠后的抗體水平。
[0041] 圖2 :本發(fā)明疫苗組合物同單一組分抗原免疫仔豬后抗體水平比較。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0043] 本發(fā)明實(shí)施例中所用PBS緩沖液如無(wú)特別說(shuō)明，均采用pH7. 4的PBS，配制方法： NaC18. 0g，KC10. 2g，ΚΗ2Ρ040· 24g，Na2HP04 · 12Η203· 628g，溶于 800ml 蒸餾水中，用鹽酸調(diào) pH 值為7. 4,蒸餾水定容至1000ml，121°C高壓滅菌20min，室溫保存。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 豬鏈球菌免疫原性抗原的制備
[0046] 豬鏈球菌免疫原性抗原可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行制備，例如 通過(guò)包含本發(fā)明多核苷酸的克隆或表達(dá)載體。。適合制備本發(fā)明豬鏈球菌多肽抗原的公眾 可獲得的載體包括質(zhì)粒、腺病毒、桿狀病毒、酵母桿狀病毒、植物病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄 病毒、單純皰疹病毒、α病毒、慢病毒等，還可以獲得構(gòu)建這樣的載體的方法。本發(fā)明豬鏈 球菌多肽抗原的制備還包括人工合成的多肽抗原。本發(fā)明實(shí)施例采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來(lái) 制備38KDA蛋白和SaoA蛋白。
[0047] 1.材料
[0048] 本發(fā)明采用的pMDlS-Τ載體（購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司），大腸桿菌 DH5a感受態(tài)購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。
[0049] 本發(fā)明所用菌株為豬鏈球菌2型CVCC606菌株購(gòu)自中國(guó)北京中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察 所，屬于一個(gè)商業(yè)菌株。
[0050] 大腸桿菌培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)液及固體培養(yǎng)基（每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨 10g，NaC110g，用 10mol/LNa0H 調(diào) pH 至 7. 5，121°C 高壓滅菌 20min，4°C保存?zhèn)溆?。在?100 毫升LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5g瓊脂即為固體LB培養(yǎng)基，121°C高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)?用）。
[0051] 引物設(shè)計(jì)與合成：
[0052] 根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的38KDA基因序列，設(shè)計(jì)上游引引物 CGGGATCCCGATGGATATTAGACAGGTTAGA 與下游引物 GCTGCAGCTTAGTTCTTAAAGCTATGA 擴(kuò)增 38KDA基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0053] 根據(jù)SEQ ID N0. 2所示的SaoA基因序列，設(shè)計(jì)上游引物 AAAGGATCCGCAACCTGATGGGGGAC 與下游引物 GGGCTGCAGTCATTACATTGCTTCCTTA 擴(kuò)增 SaoA 基 因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0054] 2.抗原蛋白制備
[0055] 將豬鏈球菌2型菌種CVCC606株（購(gòu)自中國(guó)北京，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）接種于 含有10%滅活新生牛血清的TSA固體培養(yǎng)基（購(gòu)自Sigma公司）上，挑取單個(gè)菌落接種于 TSB液體培養(yǎng)基（購(gòu)自Sigma公司）中，置于搖床中（150r/min)，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
[0056] 遵照TIANGEN細(xì)菌基因組提取試劑盒（購(gòu)自武漢大風(fēng)生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū) 提供的操作方法提取基因組DNA。
[0057] PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。
[0058] 表1PCR反應(yīng)體系
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬鏈球菌疫苗組合物，其特征在于，所述的疫苗組合物含有38KDA蛋白、SaoA蛋 白和佐劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的38KDA蛋白是由SEQ ID NO. 3編碼的蛋白；所述的SaoA蛋白是由SEQ ID NO. 4編碼的蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的38KDA蛋白含量為 10-100 μ g/ml ;SaoA 蛋白含量為 50-300 μ g/ml。
4. 一種豬鏈球菌疫苗組合物，其特征在于，所述的組合物由38KDA蛋白、SaoA蛋白和佐 劑組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的38KDA蛋白是由SEQ ID NO. 3編碼的蛋白；所述的SaoA蛋白是由SEQ ID NO. 4編碼的蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的38KDA蛋白含量為 10-100 μ g/ml ;SaoA 蛋白含量為 50-300 μ g/ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的佐劑包括油佐劑，水乳狀 液，水溶性佐劑，Quil A佐劑，氫氧化鋁佐劑，葡聚糖，硫酸葡聚糖，藻酸鈉。
8. -種制備權(quán)利要求1-6所述疫苗組合物的方法，其中，所述的制備方法包括： 1) 制備38KDA蛋白和SaoA蛋白抗原的步驟； 2) 按比例混合抗原，加入佐劑，乳化的步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的疫苗組合物，其特征在于，所述的疫苗組合物進(jìn)一步包含 豬鏈球菌全菌抗原；優(yōu)選地，所述的豬鏈球菌全菌抗原為豬鏈球菌2型全菌抗原；更優(yōu)選 地，所述的豬鏈球菌2型全菌抗原為豬鏈球菌2型SC株全菌抗原。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬鏈球菌相關(guān)疾病或 由豬鏈球菌導(dǎo)致的感染的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/09GK104248754SQ201410202836
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 張海洋, 田克恭 申請(qǐng)人:普萊柯生物工程股份有限公司