專利名稱：一種預(yù)防羅非魚鏈球菌病的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚用疫苗，特別涉及一種預(yù)防羅非魚鏈球菌病的疫苗。
背景技術(shù)：
羅非魚(Tilapia)為一種中小型魚,它是世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)科研培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類，且被譽(yù)為未來動(dòng)物性蛋白質(zhì)的主要來源之一，原產(chǎn)于非洲，屬于麗鯛科之熱帶魚類，和鱸魚相似。羅非魚是我國重要的出口型經(jīng)濟(jì)魚類之一，其健康養(yǎng)殖的意義重大。但是，近年來在廣東、海南、福建等羅非魚主產(chǎn)區(qū)大規(guī)模的爆發(fā)羅非魚鏈球菌病， 波及范圍廣，病害控制難，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病魚表現(xiàn)為精神、食欲很差，體色發(fā)黑，離群打轉(zhuǎn)游動(dòng)，部分病魚出現(xiàn)晶狀體混濁，眼球突出甚至脫落的現(xiàn)象；疾病的發(fā)病率接近40%，死亡量與氣溫呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，氣溫在35°C以上時(shí)發(fā)病魚的死亡率可高達(dá)100%，養(yǎng)殖戶的損失慘重，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2009年該病對(duì)華南地區(qū)羅非魚養(yǎng)殖造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)7億人民幣。據(jù)調(diào)查，羅非魚病害往年已有發(fā)生，然而往年都能以氟苯尼考等藥物很快控制，但近年來的病害來勢兇猛，因耐藥性等原因，藥物控制效果差，養(yǎng)殖戶損失慘重。“羅非魚”作為海南人工養(yǎng)殖首要魚種，若不能有效地預(yù)防和控制疾病的發(fā)生及蔓延，海南將面臨“無魚可養(yǎng)”的局面。因此，安全有效的治療方式對(duì)于拯救海南羅非魚養(yǎng)殖業(yè)顯得迫在眉睫，疫苗免疫不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，是一種安全、有效、環(huán)保的方法，引起鏈球病菌的病原菌有海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、副乳房鏈球菌、格式乳球菌等。申請(qǐng)?zhí)?00580013779.X，發(fā)明名稱“無乳鏈球菌疫苗”的專利申請(qǐng)公開了一種疫苗，其中包含免疫有效量的分離β溶血性無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的完整滅活細(xì)胞和β溶血性無乳鏈球菌培養(yǎng)物的濃縮提取物，菌株是保藏號(hào)為NRRL Β-30608和NRRL Β-30607的無乳鏈球菌，根據(jù)實(shí)施例表2可以得知，將該疫苗以注射的方式免疫時(shí)，保護(hù)率為7(Γ80%，以浸泡的方式免疫時(shí)，保護(hù)率為34 35%，該專利申請(qǐng)公開的疫苗實(shí)質(zhì)上是滅活無乳鏈球菌與外毒素的二聯(lián)疫苗，其安全性差，接種重量為5g的羅非魚會(huì)致死；申請(qǐng)?zhí)?01010207289. 6，發(fā)明名稱羅非魚二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗的制備方法的專利申請(qǐng)公開了一種羅非魚二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗，菌種是保藏號(hào)CCTCCN0 M209279的海豚鏈球菌，以及保藏號(hào)為CCTCCN0 M209278的無乳鏈球菌，二者等比例混合制成羅非魚二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗，胸腔或者腹腔注射免疫，保護(hù)率為85%左右，但用該無乳鏈球菌制備的單一疫苗的保護(hù)率卻并不高?，F(xiàn)有技術(shù)公開的使用無乳鏈球菌制備的疫苗均是二聯(lián)疫苗，制備方法復(fù)雜、成本高，存在安全性問題，需要尋找更為安全、成本低的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的疫苗和新菌株。
本發(fā)明疫苗，它是由無乳鏈球菌〔Streptococcus agaJaciiae)和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。所述疫苗包含致免疫有效量的滅活的無乳鏈球菌以及藥學(xué)上可接受的輔料或者載體。所述的無乳鏈球菌是保藏號(hào)為ATCC51487無乳鏈球菌或者保藏號(hào)為CCTCC NO M2011271的無乳鏈球菌WR-6。
分離株 WR-6,鑒定為無乳鏈球菌"m&^Streptococcus agalactiae WR-6),于 2011 年7月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271。 所述致免疫有效量為不低于IX 106CFU/ml ;優(yōu)選地，所述的致免疫有效量為lX106-lX108CFU/ml。所述輔料或者載體為水或吸附劑。所述水為生理鹽水或蒸餾水，所述吸附劑是沸石或硅藻土。本發(fā)明還提供了前述疫苗在制備預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物中的用途。其中，所述的預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物是通過口服、注射或者浸泡的方式給藥的。本發(fā)明還提供了一種聯(lián)合用藥物，它包含前述的疫苗以及透皮吸收促進(jìn)劑且任選一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料或載體。其中，所述透皮吸收劑為氮酮，或莨菪堿。本發(fā)明最后提供了一種無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)菌株,它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無乳鏈球菌WR-6。本發(fā)明疫苗，用福爾馬林滅活無乳鏈球菌菌液即得，注射免疫的保護(hù)率高達(dá)90%，用10倍正常注射劑量的疫苗攻毒時(shí)，未出現(xiàn)異常，為臨床提供了一種新的、安全、保護(hù)率高、制備方法簡單、成本低廉的無乳鏈球菌單聯(lián)疫苗，可用于預(yù)防無乳鏈球菌引起的鏈球菌病。本發(fā)明保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無乳鏈球菌WR-6滅活制備的單聯(lián)疫苗的保護(hù)率高，臨床應(yīng)用前景良好。


圖116S rDNA擴(kuò)增結(jié)果，I :空白對(duì)照；2 :鑒定樣品；M DL2000DNA maker。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I菌株的分離鑒定I、實(shí)驗(yàn)材料與方法I. I實(shí)驗(yàn)材料待鑒定的細(xì)菌從海南文昌的患病羅非魚體內(nèi)分離，分離培養(yǎng)基為BHI，培養(yǎng)溫度為37°C，編號(hào)為 WR-6。試劑耗材16S rDNA通用擴(kuò)增試劑盒(TAKARA)、BHI培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管(杭州天和生物試劑有限公司)、Taq DNA聚合酶(TAKARA)、瓊脂糖(TianGen)、DL2000DNAmaker (TianGen)。I. 2實(shí)驗(yàn)方法I. 2. I革蘭氏染色劑觀察
取過夜培養(yǎng)的新鮮斜面一支，用接種環(huán)挑取少量菌體，涂在滴有少量無菌生理鹽水的載玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。I. 2. 216S rDNA的擴(kuò)增與分析以提取的細(xì)菌基因組DNA作為模板，使用16S rDNA通用擴(kuò)增引物擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA全長(PCR體系及擴(kuò)增程序如下)，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化系統(tǒng)純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。使用RDP數(shù)據(jù)庫和NCBI Blast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)分析，得到細(xì)菌的種屬。PCR 體系
權(quán)利要求
1.一種疫苗，其特征在于它是由無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的疫苗，其特征在于所述疫苗包含致免疫有效量的滅活的無乳鏈球菌以及藥學(xué)上可接受的輔料或者載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述無乳鏈球菌是保藏號(hào)為ATCC51487無乳鏈球菌或者保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無乳鏈球菌WR-6。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述致免疫有效量為不低于IXlO6CFU/ml ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于所述致免疫有效量為IX IO6^l X IO8CFU/ml ο
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于所述輔料或者載體為水或吸附劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于所述水為生理鹽水或蒸餾水，所述吸附劑是沸石或硅藻土。
8.權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的疫苗在制備預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物是通過ロ服、注射或者浸泡的方式給藥的。
10.ー種聯(lián)合用藥物，包含權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的疫苗以及透皮吸收促進(jìn)劑且任選ー種或多種藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于所述透皮吸收劑為氮酮，或莨菪堿。
12.一種無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae),其特征在于它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NO M 2011271的無乳鏈球菌WR-6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種疫苗，它是由無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成；本發(fā)明公開了該疫苗在制備預(yù)防羅非魚鏈球菌病的藥物中的用途，以及一種聯(lián)合用藥物；本發(fā)明還公開了一種新的無乳鏈球菌菌株。本發(fā)明疫苗可有效刺激羅非魚產(chǎn)生抗鏈球菌病的免疫力，預(yù)防羅非魚鏈球菌病，保護(hù)率高，有較高的實(shí)用價(jià)值和良好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61K39/09GK102847146SQ20121033726
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者肖丹, 汪開毓, 陽濤 申請(qǐng)人:通威股份有限公司