專利名稱：：一種馬鏈球菌獸疫亞種pcr檢測方法及用于該方法的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于流行病學(xué)和衛(wèi)生檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種快速檢測馬鏈球菌獸疫亞種(&n/^ococcuse《wfsubsp.zooep'cifemz'cus)的PCR快速檢測試劑盒，以及使用該試劑盒進(jìn)行檢測的方法。
背景技術(shù)：
：豬鏈球菌病是一種嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要的細(xì)菌性傳染病，并可引起人類的感染。該病的主要病原為馬鏈球菌獸疫亞種(Sfreptococciwe《w!'subsp.zoogWemz'cus)和豬鏈球菌2型(&reptoC0CCM&，type2)。目前，對(duì)豬鏈球菌病的病原學(xué)診斷主要依賴于病原菌的分離、培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。馬鏈球菌獸疫亞種是我國豬鏈球菌病的主要病原，目前尚缺乏快速、敏感的檢測方法。因此，研制快速、敏感的新型檢測試劑盒是當(dāng)務(wù)之急。PCR檢測方法快速、敏感、特異，是目前快速檢測的熱點(diǎn)之一。HASSAN等建立了PCR檢測方法用于區(qū)分乳房鏈球菌(&re/tococcttywZen》)禾卩副孚L房鏈球菌(5^ep/"ococcu/flraw6en's)(A.A.HASSAN"，I.U.KHAN,A.ABDMLMAWJOOD，andC,LAMMLER.EvaluationofPCRMethodsforRapidIdentificationandDifferentiationofS^e/7tococciw6erisand5r印tococcMs戸raM6e"'s,AmericanSocietyforMicrobiologyApr.2001,p.1618-1621)。但用于快速檢測馬鏈球菌獸疫亞種的PCR方法未見報(bào)道。馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多種生物學(xué)功能(TimoneyJF,ArliushinSC,BoschwitzJS.ComparisonofthesequencesandfunctionsofS加/7tocoec船e一M隱likeproteinSemandSzPse.InfectImmun，1997，65(9):3600~3605)。其表面有調(diào)理素表位，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗調(diào)理素抗體(TimoneyJF，MukhtarM.VarabilityintheMproteinsoftheequinestrainsofStreptococcussubspzooe/!V/ew/a，P.15~20InW.Plowright,PDRossdale，andJFWade(ed),EquineInfectiousdiseasesVI，Cambridge1991,R&WPublications,Newmarket,England);倉巨抑制補(bǔ)體C3b在菌體表面沉積，從而抑制機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)的活化(BoschwitzJS,TimoneyJF.InhibitionofC3depositionofa邵tococciwbyMprotein:amechanismforsurvivalinequineblood.InfectImmun,1994,62:35153520);能結(jié)合機(jī)體的纖維蛋白原，使其具有抗吞噬細(xì)胞的吞噬活性(BoschwitzJS,TimoneyJF.Characterizationoftheantiphagocyticactivityofequinefibrinogenfori^eptococctw.z00e;7!Vfe附fcus.MicrobPathog,1994，17:121~129)。類M蛋白是該菌重要的毒力因子和保護(hù)性抗原，而馬鏈球菌獸疫亞種無毒菌株不表達(dá)類M蛋白。因此，可嘗試以類M蛋白基因?yàn)榘悬c(diǎn)，建立檢測馬鏈球菌的PCR方法，并且可以同時(shí)區(qū)分馬鏈球菌強(qiáng)毒和弱毒菌株。馬鏈球菌獸疫亞種另外一種表面蛋白是纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白(fibronectinbindingprotein,Fnz)，該蛋白介導(dǎo)馬鏈球菌獸疫亞種黏附宿主細(xì)胞，與宿主細(xì)胞上的纖聯(lián)蛋白(fibronectin)結(jié)合，從而建立感染,所以纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白亦是馬鏈球菌獸疫亞種重要的毒力因子(KyongsuHong(2005)Identificationandcharacterizationofanovelfibronectin-bindingproteingenefrom6^ptococciisssp.zooepz.fite附/ciwstrainVTU211.ImmunologyandMedicalMicrobiology45231-237)。馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型均表達(dá)纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白，但二者同源性低于20%，而其他種的鏈球菌不表達(dá)該蛋白。所以馬鏈球菌獸疫亞種的纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白基因可作為馬鏈球菌獸疫亞種快速檢測的靶基因，并可作為鑒別強(qiáng)弱毒株的靶基因之一。超氧化物歧化酶A(SodA)是馬鏈球菌獸疫亞種產(chǎn)生的一種胞外酶，能特異清除正常生命過程中產(chǎn)生的過量的超氧陰離子自由基，在生物體的生命活動(dòng)中具有重要意義(Abd)uLmawjood，A.,andC.La"mmler,2000:DeterminationofintraspeciesvariationsoftheV2regionoftheSodAgeneofi^pZococcwse，*ssp.zooe/^ewncws.Res.Vet.Sci.68,33—39)。在馬鏈球菌中三個(gè)不同的亞種中，僅馬鏈球菌獸疫亞種產(chǎn)生超氧化物歧化酶A。以超氧化物歧化酶A基因?yàn)榘一颍山CR檢測方法，區(qū)分馬鏈球菌不同亞種?；谏鲜隹紤]，本發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)，建立了可同時(shí)檢測馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白基因、纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白基因、超氧化物歧化酶A基因的多重PCR擴(kuò)增體系，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，開發(fā)出了馬鏈球菌獸疫亞種多重PCR檢測試劑盒，以及建立了檢測馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白基因、纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白基因、超氧化物歧化酶A基因的多重PCR檢測方法。所述方法和試劑盒不僅可用于該菌的快速檢測，還可以區(qū)分馬鏈球菌獸疫亞種類強(qiáng)毒菌株和無毒菌株。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供用于豬鏈球菌病快速診斷的多重PCR檢測試劑及方法。一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于馬鏈球菌獸疫亞種致病性檢測的多重PCR檢測試劑，該試劑包括分別特異性地針對(duì)類M蛋白(SzP)、纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白(Fnz)超氧化物歧化酶A(SodA)編碼基因的引物對(duì)，因而可同時(shí)針對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種的三種毒力因子SzP、Fnz和SodA進(jìn)行檢測，其中所述的特異性地針對(duì)SzP編碼基因的引物對(duì)的核苷酸序列為SzP弓l物(正向)5'CTATCGGTGGTCGTAATGGAGA3，SzP引物(反向)5'ACCTGCCATAACTGCAAGAGCT3'其中所述的特異性地針對(duì)Fnz編碼基因的引物對(duì)的核苷酸序列為Fnz引物(正向)5，GAGGTGGACCAGCTTCACCT3，F(xiàn)nz引物(反向)5'GAGGAAAGACGGTCCAGACG3'其中所述的特異性地針對(duì)SodA編碼基因的引物對(duì)的核苷酸序列為SodA引物(正向)5'CAGCATTCCTGCTGACATTCGTCAGG3，SodA引物(反向)5'CTGACCAGCCTTATTCACAACCAGCC3'其中所述的SzP引物對(duì)、Fnz引物對(duì)與SodA引物對(duì)可以預(yù)先混合在一起，也可以獨(dú)立存在于所述檢測試劑中，使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。本發(fā)明所述的檢測試劑進(jìn)一步還可以含有其他PCR擴(kuò)增用成分，例如，包括但不限于PCR緩沖液、MgCl2和dNTP。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該試劑為表1所列成分的混合液表1.馬鏈球菌獸疫亞種多重PCR檢測反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測馬鏈球菌獸疫亞種的多重PCR檢測方法，該方法同吋選取馬鏈球菌獸疫亞種三種毒力因子SzP、Fnz和SodA編碼基因?yàn)槟康幕颍褂帽景l(fā)明所述的特異性地針對(duì)SzP、Fnz和SodA編碼基因的引物對(duì)和探針實(shí)施檢測。本發(fā)明所述方法可以直接對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行檢測，也可以對(duì)組織中攜帶的馬鏈球菌獸疫亞種進(jìn)行檢測。在采用培養(yǎng)菌液作為檢測材料時(shí)，菌體分離及培養(yǎng)須在P3實(shí)驗(yàn)室、按照CDC(中國疾病預(yù)防控制中心)推薦的豬鏈球菌分離培養(yǎng)程序進(jìn)行。即采用扁桃體拭子采取待檢豬的病料，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分別接種綿羊鮮血瓊脂平板。37'C培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37。C培養(yǎng)24h后，再接種血清肉湯，37。C搖床培養(yǎng)后，滅活備用。在對(duì)帶菌的組織，如豬扁桃體、肌肉等進(jìn)行檢測時(shí)，須首先采用商品化的基因組提取試劑盒提取其基因組DNA作為PCR檢測用模板。在利用本發(fā)明所述方法對(duì)待檢樣本實(shí)施檢測時(shí)，可直接取一定量的本發(fā)明所述檢測試劑，按照確立的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測并判定結(jié)果。簡而言之，本發(fā)明所述的用于檢測馬鏈球菌獸疫亞種的多重PCR檢測方法包括下述步驟1)使用本發(fā)明所述的特異性地針對(duì)SzP、Fnz和SodA的引物對(duì)，與PCR擴(kuò)增用的dNTP、MgCl2、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測預(yù)混液；2)向上述檢測預(yù)混液中加入待檢菌液或從待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將歩驟2)中建立的擴(kuò)增反應(yīng)體系置于PCR儀上，按照預(yù)定擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增；4)電泳檢測，觀察是否有目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。在本發(fā)明中，所述的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)是指，當(dāng)電泳(優(yōu)選為瓊脂糖電泳、SDS-PAGE電泳等)檢測時(shí)，同時(shí)出現(xiàn)750bp、540bp和230bp三個(gè)條帶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，取由表1所列成分組成的試劑lOpL，加入0.15pLTaqDNA聚合酶(5U//iL)，加滅菌雙蒸水12.85/iL，制備得到預(yù)混液，然后加入2^L滅活菌液或者待檢組織基因組DNA作為模板，即檢測體系體積為25ML。將檢測體系放入PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)94'C變性4min;然后進(jìn)入循環(huán)，94°C30s，55°C30s,72°C30s,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)750bp、540bp和230bp三條帶時(shí)，則判定為陽性，表示被檢樣品中存在馬鏈球菌獸疫亞種。本發(fā)明所述的馬鏈球菌獸疫亞種類PCR快速檢測試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)快速簡便，可直接從病料中檢測出細(xì)菌，避免了常規(guī)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)和生化鑒定的復(fù)雜過程，縮短了檢測時(shí)間。且操作方便，經(jīng)過簡單培訓(xùn)即能熟練使用；(2)敏感性高，PCR檢測方法具有高度的敏感性，能檢測出微量的病原；(3)特異性強(qiáng)，本發(fā)明能將馬鏈球菌獸疫亞種和其它種類的鏈球菌區(qū)別開來，且沒有任何交叉反應(yīng)。提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常采用常規(guī)條件例如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。實(shí)施例實(shí)施例1:多重PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化1.1引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)獸疫亞種類M蛋白基因、纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白、超氧化物歧化酶A基因的公開序列AY263781、DQ363208、AY938342,利用DNAStar軟件自行設(shè)計(jì)三對(duì)引物，其中引物Pl和P2擴(kuò)增出馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白基因片段的長度為750bp，引物P3和P4擴(kuò)增出馬鏈球菌獸疫亞種纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白基因片段的長度為540bp，引物P5和P6擴(kuò)增出馬鏈球菌獸疫亞種超氧化物歧化酶A基因片段的長度為230bp。三對(duì)引物均由TaKaRa公司合成，三對(duì)引物的序列分別為類M蛋白正義引物PI:5'CTATCGGTGGTCGTAATGGAGA3，反義引物P2:5'ACCTGCCATAACTGCAAGAGCT3，纖連蛋白結(jié)合蛋白正義引物P3:5'GAGGTGGACCAGCTTCACCT3，反義引物P4:5'GAGGAAAGACGGTCCAGACG3'超氧化物歧化酶A正義引物P5:5，CAGCATTCCTGCTGACATTCGTCAGG3'反義引物P6:5'CTGACCAGCCTTATTCACAACCAGCC3'引物合成后，將其稀釋為10wmoL/L，-2(rC避光保存?zhèn)溆谩?.2DNA模板的制備利用蛋白酶K裂解法提取馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。具體操作為，挑取血清Todd-Hewittbroth(THB)平板上ATCC35246單菌落，接種至含5%犢牛血清的THB液體培養(yǎng)基中，37'C靜置培養(yǎng)過夜。取lml菌液離心8000r/min10min，棄去上清(盡量棄去液體)，棄上清的細(xì)菌備用。取緩沖液(lOmMAnlTris-cl,lmM/mlEDTA)35pL加入0.4ug//iL的蛋白酶K5pL配成反應(yīng)體系，將上述棄去上清的細(xì)菌全部轉(zhuǎn)移到反應(yīng)體系中。水浴55'C反應(yīng)10min,再加入80的CTAB/NaCl溶液，混勻，65。C水浴10min;加入等體積的氯仿/異戊醇抽提，在加入0.6體積的異丙醇沉淀、12000rpm離心20min;用75%的乙醇洗滌兩次，然后在室溫下干燥，將乙醇揮發(fā)，沉淀溶解于pH8.0的TE緩沖液中，-20%凍存?zhèn)溆谩?.3引物濃度及引物對(duì)之間比例的優(yōu)化在多重PCR檢測體系中，引物濃度及引物間相互比例是多重PCR反應(yīng)體系的關(guān)鍵，因此對(duì)引物濃度及引物對(duì)之間比例進(jìn)行優(yōu)化。按正、反向引物等體積，三種引物對(duì)之間體積比為i:i:l、l:i:2、i:2:2和2:2:l，混合三種引物對(duì)混合液，共四種組合。四種組合及各引物具體用量(yi)見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>用上述1.2中制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，加入擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑組成表3所示的反應(yīng)體系，反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(以無菌水代替DNA模板進(jìn)行)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>Taq(5U>l)0.15組合1或2或3或4的引物對(duì)混合液3或4或5或5ddH20補(bǔ)足總體積25混勻后，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)為94'C變性4min后，進(jìn)入循環(huán)，94°C30s，55°C30s,72°C30s,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析引物濃度組合比對(duì)多重PCR擴(kuò)增效果的影響。觀察電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)引物M:FllZ:SodA為2:2:1時(shí)，可同時(shí)擴(kuò)增出目的片段、擴(kuò)增效果最好。1.4退火溫度的優(yōu)化用上述1.2中制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，加入擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑組成表4所示的反應(yīng)體系，反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(以無菌水代替DNA模板進(jìn)行)。表4成分體積(Pl)模板DNA210xPCRBuffer(Mg2+free)5MgCl2(5mM)3dNTP(各2.5mM)4Taq(5U/pL)0.15引物混合液*2.5ddH20補(bǔ)足總體積25*引物混合液中包含引物P1、P2、P3、P4各0.5/xL，引物P5、P6各0.25/^L?；靹蚝?，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)94。C變性4min后，進(jìn)入循環(huán)，94'C變性30s，退火溫度[11]分別為54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60°C30s,72。C延伸30s,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán),最后72'C延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析退火溫度對(duì)多重PCR擴(kuò)增效果的影響。觀察電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，退火溫度的高低影響目的片段的擴(kuò)增效果，從54'C到60'C均能擴(kuò)增出目的片段，擴(kuò)增量效果隨溫度的升高而增加，從55'C到6(TC擴(kuò)增量變化不大。1.5退火時(shí)間的優(yōu)化用上述1.2中制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，加入擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑組成表5所示的反應(yīng)體系，反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(以無菌水代替DNA模板進(jìn)行)。表5成分體積(ML)模板DNA210xPCRBuffer(Mg2+free)5MgCl2(5mM)3dNTP(各2.5mM)4Taq(5U/|iL)0.15引物混合液*2.5ddH20補(bǔ)足總體積25*引物混合液中包含:引物P1、P2、P3、P4各0.5pL，引物P5、P6各0.25^L。混勻后，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)94'C變性4min后，進(jìn)入循環(huán)，94'C變性時(shí)間分別為20s、30s、40s、60s，退火溫度55'C退火時(shí)間分別為20s、30s、40s、60s，72°C延伸時(shí)間分別為20s、30s、40s、60s,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析退火時(shí)間對(duì)多重PCR擴(kuò)增效果的影響。觀察電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)退火時(shí)間大于30s時(shí)擴(kuò)增出清晰的目的片段。1.6循環(huán)數(shù)的優(yōu)化用上述1.2中制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，加入擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑組成表6所示的反應(yīng)體系，反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(以無菌水代替DNA模板進(jìn)行)。表6成分體積(yl)模板DNA210XPCRBuffer(Mg2+free)5MgCl2(5raM)3d,(各2.5mM)410Taq(5UAH)0.15引物混合液*2.5ddH20補(bǔ)足總體積25^引物混合液中包含:引物P1、P2、P3、P4各0.5/A，引物P5、P6各0.25/xL。混勻后，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)94。C變性4min后，進(jìn)入循環(huán)，94'C變性30s，退火溫度55。C30s,72'C延伸30s,分別進(jìn)行30、25、20、15個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用"/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測,分析循環(huán)數(shù)對(duì)多重PCR擴(kuò)增效果的影響。觀察電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，循環(huán)數(shù)大于20開始出現(xiàn)條帶，當(dāng)循環(huán)數(shù)為30時(shí)效果目的條帶清晰。1.7反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的建立根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，建立的多重PCR反應(yīng)體系為表7成分體積(yi)模板DNA210XPCRBuffer(Mg2+free)10MgCl"5mM)6d證(各2.5mM)8Taq(5U/W)0.3引物混合液*5ddH20補(bǔ)足總體積50*引物混合液中包含引物P1、P2、P3、P4各ljuL，引物P5、P6各0.5^L。優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)條件是94'C變性4min;然后進(jìn)入循環(huán)，94'C30s，55°C30s,72°C30s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。用SDS-PAGE電泳檢測PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段。實(shí)施例2:多重PCR特異性試驗(yàn)2.1菌株2.1.1陽性菌株馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株，1977年分離自我國四川，有ATCC收藏馬鏈球菌獸疫亞種CVCC552株，購自中國菌種保藏中心。馬鏈球菌獸疫亞種CVCC555株，購自中國菌種保藏中心。馬鏈球菌獸疫亞種CC株，江蘇省農(nóng)科院惠贈(zèng)。馬鏈球菌獸疫亞種CT株，江蘇省農(nóng)科院惠贈(zèng)。馬鏈球菌獸疫亞種CY株，江蘇省農(nóng)科院惠贈(zèng)。2.1.2陰性菌株馬鏈球菌馬亞種CVCC1892株，購自中國菌種保藏中心。停乳鏈球菌CVCC588株，購自中國菌種保藏中心無乳鏈球菌CVCC1886株，購自中國菌種保藏中心鏈球菌CVCC595株，蘭氏E群豬源中國非模式株，購自中國菌種保藏中心豬鏈球菌1型SH28株，本試驗(yàn)室保存。豬鏈球菌2型HA9801株，系姚火春等從江蘇1998年爆發(fā)豬鏈球菌病的病豬中分離，保藏號(hào)為CGMCCNO.1446。2.2試驗(yàn)方法2.2.1細(xì)菌基因組DNA的獲取，方法同1.2中所述。2.2.2細(xì)菌類M蛋白、纖連蛋白、超氧化物歧化酶A目的基因片段的擴(kuò)增采用1.7所述的多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，方法同實(shí)施例1中所述。2.2.3試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論電泳結(jié)果表明2.1.1中所列的馬鏈球菌獸疫亞種陽性菌株均同時(shí)擴(kuò)增得到三條長度分別為750bp、540bp、230bp的類M蛋白、纖連蛋白、超氧化物歧化酶A的目的基因片段；2丄2中所列的陰性菌株中，僅與馬鏈球菌獸疫亞種有很近同源關(guān)系的馬鏈球菌馬亞種擴(kuò)增得到一條230bp的超氧化物歧化酶A基因片段，其余菌株擴(kuò)增產(chǎn)物中均未出現(xiàn)任一上述基因片段。本申請所述檢測試劑及方法以同時(shí)擴(kuò)增得到750bp、540bp、230bp三條基因片段為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，本申請針對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白、纖連蛋白、超氧化物歧化酶A基因片段設(shè)計(jì)合成的引物，特異性強(qiáng)，進(jìn)行多重PCR檢測檢出率1(XPA。實(shí)施例3:多重PCR檢測方法的敏感性試驗(yàn)用馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株，通過蛋白酶K裂解法提取基因組DNA作為擴(kuò)增模板。用分光光度儀測量基因組DNA的濃度，從100ng/ml開始IO倍比稀釋，以不同稀釋度的細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。采用1.7所述的多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，方法同實(shí)施例1中所述。比較不同模板濃度對(duì)多重PCR擴(kuò)增效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)模板量達(dá)10ng/ml時(shí)便能擴(kuò)增出目的片段，并且隨DNA模板量的增加擴(kuò)增的目的條帶逐步增強(qiáng)。由此可知本發(fā)明建立的多重PCR擴(kuò)增方法具有很高的敏感性。實(shí)施例4:多重PCR檢測試劑盒的重復(fù)性試驗(yàn)以本發(fā)明的不同批次PCR檢測試劑盒分別對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種參考株ATCC35246、豬鏈球菌2型、馬鏈球菌馬亞種進(jìn)行檢測。具體檢測方法同實(shí)施例1中所述。結(jié)果顯示，不同批次的PCR檢測試劑盒對(duì)以上細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果完全相同。由此可知本發(fā)明的PCR檢測試劑盒具有很好的重復(fù)性。序列表<110>范紅結(jié)李芳陸承平〈120〉一種馬鏈球菌獸疫亞種PCR檢測方法及用于該方法的試劑盒<130><160>6<170〉P3tentlnversion3.4<210>1<211〉22<212>DNA<213>人工序列〈220><221〉引物〈222〉(l)..咖<400〉1ctatcggtggtcgtaatggaga22<210>2<211>22〈212>腿〈213〉人工序列〈220>〈221>引物<222>(l)..咖<400>2acctgccataactgcaagagct2214<210>3<211〉20<212>腿〈213>人工序列<220><221>引物<222〉(l)..咖<400>3gaggtggaccagcttcacct20<210>4〈211>20<212>腿〈213>人工序列<220><221>引物〈222>(l)..咖<400〉4g3gg肪ag3cggtcc卿cg20〈210>5<211>26<212>腿<213>人工序列<220><221>引物〈222>(1)..(26)<400>5cagcattcctgctgacaltcgtcagg26〈210>6〈211>26<212〉腿<213>人工序列<220〉<221>引物<222>(1)..(26)〈400>6ctgaccagccttattcacaaccagcc261權(quán)利要求1.一種用于檢測馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)的多重PCR檢測試劑，該試劑包括分別特異性地針對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種的類M蛋白(SzP)、纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白(Fnz)和超氧化物歧化酶A(SodA)編碼基因的引物對(duì)。2.權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測試劑，其中所述的特異性地針對(duì)類M蛋白編碼基因的引物對(duì)的核苷酸序列為正向引物5，CTATCGGTGGTCGTAATGGAGA3，反向引物5，ACCTGCCATAACTGCAAGAGCT3，其中所述的特異性地針對(duì)纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白編碼基因的引物對(duì)的核苷酸序列為正向引物5，GAGGTGGACCAGCTTCACCT3'反向引物5'GAGGAAAGACGGTCCAGACG3'其中所述的特異性地針對(duì)超氧化物歧化酶A編碼基因的引物對(duì)的核苷酸序列為正向引物5，CAGCATTCCTGCTCACATTCGTCAGG3'反向引物5，CTGACCAGCCTTATTCACAACCAGCC3'3.權(quán)利要求1或2所述的多重PCR檢測試劑，其中所述的三對(duì)引物可以預(yù)先混合在一起，也可以獨(dú)立存在于所述檢測試劑中，使用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。4.一種檢測馬鏈球菌獸疫亞種的多重PCR檢測方法，該方法包括下列步驟1)使用權(quán)利要求1或2所述的三對(duì)引物，與PCR擴(kuò)增用的dNTP、MgCl2、PCR緩沖液及聚合酶混合，得到檢測預(yù)混液；2)向上述檢測預(yù)混液中加入待檢菌液或從待檢組織提取的基因組DNA作為模板；3)將步驟2)中建立的擴(kuò)增反應(yīng)體系置于PCR儀上，按照預(yù)定擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增；4)觀察是否有目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。5.權(quán)利要求4所述的多重PCR檢測方法，其中所述的擴(kuò)增條件為94°C變性4min;然后進(jìn)入循環(huán)，94°C30s，55°C30s，72°C30s,共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。6.權(quán)利要求4或5所述的多重PCR檢測方法，其中所述的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)是指，當(dāng)電泳檢測時(shí)，同時(shí)出現(xiàn)750bp、540bp和230bp三個(gè)條帶。7.權(quán)利要求6所述的多重PCR檢測方法，其中所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳或SDS-PAGE電泳。全文摘要本發(fā)明屬于流行病學(xué)和衛(wèi)生檢測領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種快速檢測馬鏈球菌獸疫亞種的PCR快速檢測試劑盒及方法。具體而言，本發(fā)明所述試劑盒包括三對(duì)引物，分別特異性地針對(duì)類M蛋白(SzP)、纖聯(lián)蛋白結(jié)合蛋白(Fnz)超氧化物歧化酶A(SodA)編碼基因，可同時(shí)針對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種的三種毒力因子SzP、Fnz和SodA進(jìn)行檢測。本發(fā)明所述的多重PCR檢測方法快速簡便，可直接對(duì)病料檢測，避免了常規(guī)細(xì)菌分離、培養(yǎng)和生化鑒定的復(fù)雜過程，縮短了檢測時(shí)間，且操作方便，簡單培訓(xùn)即能熟練使用。敏感性高，能檢測出微量的病原。特異性強(qiáng)，能將馬鏈球菌獸疫亞種和其它種類的鏈球菌區(qū)別開來，且無任何交叉反應(yīng)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101597649SQ20091014393公開日2009年12月9日申請日期2009年6月3日優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日發(fā)明者芳李,范紅結(jié),陸承平申請人:范紅結(jié);李芳;陸承平