全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝及產(chǎn)品的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝及產(chǎn)品，利用全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞接種禽流感病毒，將收獲的禽流感病毒液澄清、滅活、除菌、濃縮純化、乳化后制備成禽流感滅活疫苗產(chǎn)品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝優(yōu)化，成本低，在保障病毒滴度的情況下，通過(guò)本發(fā)明能夠使MDCK細(xì)胞培養(yǎng)密度大幅提高，從而易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模的放大化，使禽流感病毒大量增殖；相較于現(xiàn)有的載體懸浮培養(yǎng)，本發(fā)明不需要載體介入，從而大幅降低了污染風(fēng)險(xiǎn)；本發(fā)明高效地解決了“雞胚法”污染率高、抗原產(chǎn)量低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)，SPF雞胚供應(yīng)不足等問(wèn)題；適于反應(yīng)器細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在禽流感行業(yè)的推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝及產(chǎn)品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疫苗的制備方法及產(chǎn)品，尤其涉及全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝以及由此工藝獲得的產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，禽流感滅活疫苗及其他動(dòng)物流感疫苗的生產(chǎn)主要依靠傳統(tǒng)的“雞胚法”工藝實(shí)現(xiàn)?！半u胚法”制取疫苗的技術(shù)由來(lái)已久，最初于20世紀(jì)50年代開(kāi)發(fā)，工人將病毒注入雞胚中，讓病毒伴隨雞胚的發(fā)育自然繁殖，等雞胚發(fā)育3天左右，工人要把一個(gè)個(gè)蛋殼打開(kāi)，逐個(gè)收集抗原，一般來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)一批疫苗的抗原往往需要幾萬(wàn)枚雞蛋，工作量大。雖然目前以雞蛋制取疫苗的工藝經(jīng)過(guò)發(fā)展演變，已經(jīng)不再是一個(gè)完全人工的操作過(guò)程，但很多生產(chǎn)環(huán)節(jié)依然無(wú)法超越人工介入的局限性，潛在的高污染風(fēng)險(xiǎn)、抗原產(chǎn)量低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等方面也亟待改觀。此外，在實(shí)際的生產(chǎn)過(guò)程中，“雞胚法”除去技術(shù)本身存在缺陷，還有一個(gè)值得關(guān)注的焦點(diǎn)就是SPF雞胚供應(yīng)量的制約以及成本問(wèn)題，大多數(shù)的禽流感滅活疫苗并非全部由SPF雞胚制造，而是用普通雞胚生產(chǎn)的滅活疫苗，由于卵黃抗體的存在導(dǎo)致的抗原量不足，直接影響疫苗的質(zhì)量，常常會(huì)造成免疫失敗。
[0003]當(dāng)前，在技術(shù)改進(jìn)方面，反應(yīng)器細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在動(dòng)物疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的研發(fā)和應(yīng)用正成為行業(yè)技術(shù)革新、產(chǎn)業(yè)升級(jí)的重要內(nèi)容。在我國(guó)，農(nóng)業(yè)部公告第1708號(hào)中明確規(guī)定，自2012年2月I日起，各省級(jí)獸醫(yī)行政管理部門(mén)停止轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細(xì)胞苗生產(chǎn)線項(xiàng)目獸藥GMP驗(yàn)收 申請(qǐng)。該公告對(duì)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)技術(shù)升級(jí)做出了強(qiáng)制性規(guī)定。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用不僅能提高疫苗抗原產(chǎn)量，縮短疫苗生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，而且規(guī)?；?、自動(dòng)化的反應(yīng)器疫苗生產(chǎn)平臺(tái)有效保證每批疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性。
[0004]細(xì)胞懸浮培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞是否貼壁分為無(wú)載體的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)(全懸浮)和貼壁細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)即細(xì)胞貼附在微載體上，再借助攪拌系統(tǒng)懸浮在培養(yǎng)液中培養(yǎng)。載體培養(yǎng)本質(zhì)上還是貼壁培養(yǎng)，技術(shù)難度低，適用于難以馴化為全懸浮的細(xì)胞，而且載體培養(yǎng)在成本、細(xì)胞密度、操作簡(jiǎn)便性和工業(yè)放大等方面有重大的先天缺陷，其最大培養(yǎng)體積不超過(guò)300升，這限制了該技術(shù)的大規(guī)?；瘧?yīng)用。而大規(guī)?；巧锓磻?yīng)器的根本優(yōu)勢(shì)，1000升以上的培養(yǎng)規(guī)模才能充分發(fā)揮其規(guī)模效應(yīng)，小于此培養(yǎng)規(guī)模的生產(chǎn)線在人力成本、污染風(fēng)險(xiǎn)方面相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶技術(shù)無(wú)明顯提高。
[0005]近來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞對(duì)禽流感病毒敏感，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)優(yōu)化，病毒滴度高于雞胚。如現(xiàn)有技術(shù)中的發(fā)明專(zhuān)利ZL201010159741.6，其公開(kāi)了一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產(chǎn)品，其技術(shù)要點(diǎn)主要涉及病毒適應(yīng)細(xì)胞系的篩選、確定、馴化，病毒適應(yīng)細(xì)胞的初級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)、接種病毒培養(yǎng)制備病毒液以及最終的滅活及疫苗產(chǎn)品的制備，主要采用微載體技術(shù)懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)禽流感滅活疫苗。但受載體放大工藝等限制，其無(wú)法滿足規(guī)模化工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)禽流感滅活疫苗的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，提供全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，滿足規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)的需要，并且，保證所生產(chǎn)的禽流感滅活疫苗在安全性及效力等方面均表現(xiàn)為優(yōu)質(zhì)。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種禽流感滅活疫苗產(chǎn)品，該產(chǎn)品利用全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝進(jìn)行生產(chǎn)，制得的產(chǎn)品在安全性及效力等方面均有高質(zhì)表現(xiàn)。
[0008]本發(fā)明解決問(wèn)題的技術(shù)方案是:提供全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，包括如下步驟:
[0009](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞；
[0010](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒；
[0011](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化；
[0012](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品。
[0013]進(jìn)一步地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，在步驟(1)中，所述的全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，通過(guò)以下培養(yǎng)條件制得:全懸浮MDCK細(xì)胞以0.5 X IO6個(gè)/ml的密度接種生物反應(yīng)器，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)溫度為36~37°C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70%。
[0014]進(jìn)一步地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，在所述步驟
(2)中，利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒的方法為:接種前MDCK細(xì)胞密度要大于3.0X IO6個(gè)/ml，利用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞更換培養(yǎng)基，最終更換為含
0.5~2.0 %新生牛血清的營(yíng)養(yǎng)液，禽流感病毒接種入反應(yīng)器中，接種劑量為培養(yǎng)基終體積的1.0~5.0%，其中，禽流感病毒培養(yǎng)溫度為32°C~37°C;禽流感病毒培養(yǎng)pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70% ;累計(jì)培養(yǎng)36~72h，收獲病毒液。
[0015]優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，在所述步驟(1)中，接種生物反應(yīng)器的全懸浮MDCK細(xì)胞通過(guò)以下方法制備:從液氮中取出凍存的全懸浮MDCK細(xì)胞株，直接用搖瓶懸浮培養(yǎng)傳代，擴(kuò)增至生物反應(yīng)器所需體積和濃度。
[0016]優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述的用于禽流感病毒生產(chǎn)接種的禽流感種毒為H5N1亞型；較佳地，采用H5N1亞型禽流感病毒為種毒時(shí)，禽流感病毒培養(yǎng)溫度如下:接種后6~IOh內(nèi)36~37°C，大于IOh后34~36°C。
[0017]優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述的用于禽流感病毒生產(chǎn)接種的禽流感種毒為H5N1重組疫苗毒的雞胚毒；較佳地,采用H5N1重組疫苗毒的雞胚毒為種毒時(shí),禽流感病毒培養(yǎng)溫度如下:接種后6~IOh內(nèi)36~37°C，大于IOh后34 ~36°C。
[0018]優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述的用于禽流感病毒生產(chǎn)接種的禽流感種毒為H9N2亞型禽流感病毒。較佳地，采用H9N2雞胚毒，以H9N2雞胚毒為種毒時(shí),禽流感病毒培養(yǎng)溫度為32~34°C。
[0019]優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述的病毒液的濃縮滅活純化工藝包括澄清、超濾濃縮、滅活和除菌步驟。
[0020] 優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述禽流感病毒液的澄清是通過(guò)連續(xù)流離心機(jī)離心完成。
[0021]優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述禽流感病毒液的濃縮純化為超濾濃縮純化，通過(guò)750K中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)完成。
[0022]優(yōu)選地，按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述禽流感病毒液的滅活通過(guò)甲醛滅活，所述禽流感病毒液的除菌采用0.2um的囊式濾器過(guò)濾除菌。
[0023]本發(fā)明還提供一種禽流感滅活疫苗，其通過(guò)本發(fā)明所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝得到。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:工藝優(yōu)化，成本低，在保障病毒滴度的情況下，通過(guò)本發(fā)明能夠使MDCK細(xì)胞培養(yǎng)密度大幅提高，從而易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模的放大化，使禽流感病毒的大量增殖；相較于現(xiàn)有的載體懸浮培養(yǎng)，本發(fā)明不需要載體介入，從而大幅降低了污染風(fēng)險(xiǎn)；本發(fā)明高效地解決了 “雞胚法”污染率高、抗原產(chǎn)量低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)，SPF雞胚供應(yīng)不足等問(wèn)題；適于反應(yīng)器細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在禽流感行業(yè)的推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0026]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0027]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]在下面的描述中，除非特別說(shuō)明，“ % ”均表示重量百分?jǐn)?shù)，即“wt% ”。
[0029]在本發(fā)明中，所謂的“禽流感”(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒(AIV)引起的一種急性傳染病，目前已知其可 以感染人類(lèi)。
[0030]本發(fā)明所述的“滅活疫苗”是一種采用物理方法、化學(xué)方法等殺死病原生物而制得的用于預(yù)防接種的生物制品。
[0031]在本發(fā)明中，全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，利用MDCK細(xì)胞接種禽流感病毒，將收獲的禽流感病毒液制備成禽流感滅活疫苗產(chǎn)品；包括如下步驟:
[0032](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞；
[0033](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒；
[0034](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化；
[0035](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品。
[0036]按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，在步驟(1)中，所述的全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，優(yōu)選通過(guò)以下培養(yǎng)條件制得:全懸浮MDCK細(xì)胞以0.5 X IO6個(gè)/ml的密度接種生物反應(yīng)器，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)溫度為36~37°C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70%。較佳地，在所述步驟(1)中，接種生物反應(yīng)器的全懸浮MDCK細(xì)胞通過(guò)以下方法制備:從液氮中取出凍存的全懸浮MDCK細(xì)胞株，直接用搖瓶懸浮培養(yǎng)傳代，擴(kuò)增至生物反應(yīng)器所需體積和濃度。
[0037]按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，在所述步驟(2)中，利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒優(yōu)選的方法為:接種前MDCK細(xì)胞密度要大于3.0 X IO6個(gè)/ml，利用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器將培養(yǎng)基更換為含0.5~2.0 %新生牛血清的營(yíng)養(yǎng)液，禽流感病毒接種入反應(yīng)器中，接種劑量為培養(yǎng)基終體積的1.0~5.0%，其中，禽流感病毒培養(yǎng)溫度為32°C~37°C ;禽流感病毒培養(yǎng)pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70% ;累計(jì)培養(yǎng)36~72h，收獲病毒液。
[0038]按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述的用于禽流感病毒生產(chǎn)接種的禽流感種毒優(yōu)選為H5N1亞型禽流感病毒；優(yōu)選地，采用H5N1重組疫苗毒的雞胚毒；較佳地，在采用上述種毒時(shí)，禽流感病毒培養(yǎng)溫度如下:接種后6~IOh內(nèi)36~37°C，大于IOh后35~36°C。
[0039]按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述的用于禽流感病毒生產(chǎn)接種的禽流感種毒為H9N2亞型禽流感病毒；優(yōu)選地，采用H9N2雞胚毒；較佳地，在采用上述種毒時(shí)，禽流感病毒培養(yǎng)溫度為32~34°C培養(yǎng)。
[0040]按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述禽流感病毒液的澄清是優(yōu)選通過(guò)連續(xù)流離心機(jī)離心完成。
[0041]按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述禽流感病毒液的濃縮純化為超濾濃縮純化，優(yōu)選通過(guò)750K中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)完成。
[0042]按照本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，所述禽流感病毒液的滅活優(yōu)選通過(guò)甲醛滅活，所述禽流感病毒液的除菌優(yōu)選采用0.2um的囊式濾器過(guò)濾除菌。
[0043]本發(fā)明的禽流感滅活疫苗，其通過(guò)本發(fā)明所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝得到。
[0044]采用本發(fā)明的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，能夠?qū)崿F(xiàn)禽流感滅活疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0045]下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的制備工藝。
[0046](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞
[0047](1.1)MDCK細(xì)胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)
[0048]取出兩支液氮凍存的懸浮MDCK細(xì)胞，快速融化后，直接加入500ml搖瓶中補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液至200ml，置于36~37°C懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)60~72小時(shí)后，按照1:3~1:5的比例傳代至其他搖瓶中，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積；
[0049](1.2)MDCK細(xì)胞的反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0050](1.2.1) 20L以上反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0051]將步驟(1)中搖瓶懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6個(gè)/ml后接種至20L以上(20L指工作體積，以下提到的所有反應(yīng)器體積均為工作體積，反應(yīng)器工作體積為實(shí)際罐體體積的2/3)生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為為36~37°C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70% ;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0X IO6個(gè)/ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至100L以上反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0052](1.2.2) 100L以上反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0053]將步驟(1.2.1)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml后接種至100L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36~37°C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70% ;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0X IO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0054](1.2.3) 500L以上反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0055]將步驟(1.2.2)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5X IO6/個(gè)ml接種至500L以上生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為為36~37°C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70% ;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0X IO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐。
[0056](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒
[0057]采用兩組由步驟(1.2.3)最后培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒，即，將兩罐500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)至1000L以上病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C~37 °C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70% ;采用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞，用無(wú)血清懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液更換掉500L細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，領(lǐng)取30L生產(chǎn)用禽流感種毒(H5N1亞型或H9N2亞型)接入反應(yīng)器，其中H5N1亞型禽流感接毒后6~IOh內(nèi)設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為36~37°C，IOh后設(shè)為35~36°C，H9N2亞型禽流感接毒后設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為32~34°C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70% ;從接毒24h起每隔4h采樣檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度小于0.6X IO6個(gè)/ml，活力≤25%時(shí)收獲禽流感病毒液。
[0058](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化
[0059]將步驟(3)收獲的禽流感病毒液利用連續(xù)流離心機(jī)離心，得到的澄清液轉(zhuǎn)入滅活罐中，用終濃度為2%。甲醛滅活，滅活后抗原利用中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)，參照滅活前抗原液的體積，對(duì)抗原進(jìn)行5~10倍濃縮純化。
[0060](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品 [0061]抗原經(jīng)檢驗(yàn)合格后，參照其HA效價(jià)利用磷酸鹽緩沖液稀釋為水相，將水相和礦物油佐劑以1:2比例充分混合乳化，將檢驗(yàn)合格的半成品定量分裝。
[0062](5)成品檢驗(yàn)
[0063]對(duì)成品疫苗按照《重組禽流感病毒(H5N1亞型)滅活疫苗(細(xì)胞源，Re-6株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》或者《禽流感(H9亞型)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0064]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。在下述具體實(shí)施例中，H5NlRe-6雞胚毒是由H5NlRe_6重組毒接種雞胚獲得的種毒，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司提供；所述的H9N2 (JY株)雞胚毒由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司提供。
[0065]實(shí)施例1
[0066]全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗，包括如下步驟:
[0067](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞
[0068](1.1)MDCK細(xì)胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)
[0069]取出兩支液氮凍存的懸浮MDCK細(xì)胞，快速融化后，直接加入500ml搖瓶中補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液至200ml，置于37°C懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)60小時(shí)后，按照1:3的比例傳代至其他搖瓶中，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積；
[0070](1.2)MDCK細(xì)胞的反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0071](1.2.1) 20L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0072]將步驟(1.1)中搖瓶懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6個(gè)/ml后接種至20L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40%;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6個(gè)/ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；[0073](1.2.2) IOOL反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0074]將步驟(1.2.1)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml后接種至100L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40% ;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0XlO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0075](1.2.3) 500L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0076]將步驟(1.2.2)中100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml接種至500L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40% ；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6/個(gè)ml時(shí),活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐。
[0077](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒
[0078]采用兩組由步驟(1.2.3)最后培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒，即，將兩罐500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)至1000L病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40% ;用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞，用無(wú)血清懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液更換掉500L細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，領(lǐng)取30L生產(chǎn)用H5N1亞型禽流感病毒接入反應(yīng)器，接毒后6h內(nèi)設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為36°C，10h后設(shè)為35°C，pH值為7.2，溶氧為40% ;從接毒24h起每隔4h采樣檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度小于0.6X IO6個(gè)/ml，活力≤ 25%時(shí)收獲禽流感病毒液。
[0079](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化
[0080]將步驟(3)收獲的禽流感病毒液利用連續(xù)流離心機(jī)離心，得到的澄清液轉(zhuǎn)入滅活罐中，用終濃度為2%。甲醛滅活，滅活后抗原利用中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)，參照滅活前抗原液的體積，對(duì)抗原進(jìn)行5~10倍濃縮純化。
[0081](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品
[0082]抗原經(jīng)檢驗(yàn)合格后，參照其HA效價(jià)利用磷酸鹽緩沖液稀釋為水相，將水相和礦物油佐劑以1:2比例充分混合乳化，將檢驗(yàn)合格的半成品定量分裝。
[0083](5)成品檢驗(yàn)
[0084]對(duì)成品疫苗按照《重組禽流感病毒(H5N1亞型)滅活疫苗(細(xì)胞源，Re-6株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0085]實(shí)施例2
[0086]全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗，包括如下步驟:
[0087](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞
[0088](1.1)MDCK細(xì)胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)
[0089]取出兩支液氮凍存的懸浮MDCK細(xì)胞，快速融化后，直接加入500ml搖瓶中補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液至200ml，置于37°C懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)72小時(shí)后，按照1:5的比例傳代至其他搖瓶中，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積；
[0090](1.2)MDCK細(xì)胞的反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0091](1.2.1)20L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0092]將步驟(1.1)中搖瓶懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6個(gè)/ml后接種至20L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為60%;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6個(gè)/ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0093](1.2.2) 100L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0094]將步驟(1.2.1)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml后接種至100L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為60%，；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0XlO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0095](1.2.3) 500L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0096]將步驟(1.2.2)中100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml接種至500L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為60%，；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6/個(gè)ml時(shí),活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐。
[0097](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒
[0098]采用兩組由步驟(1.2.3)最后培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒，即，將兩罐500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)至1000L病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為60% ;采用用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞，用無(wú)血清懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液更換掉500L細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，領(lǐng)取30L生產(chǎn)用H5N1亞型禽流感病毒接入反應(yīng)器，接毒后8h內(nèi)設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為37°C, IOh后設(shè)為36°C,pH值為7.2，溶氧為60%;從接毒24h起每隔4h采樣檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度小于0.6X IO6個(gè)/ml，活力≤25%時(shí)收獲禽流感病毒液。
[0099](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化同實(shí)施例1。 [0100](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品同實(shí)施例1。
[0101](5)成品檢驗(yàn)
[0102]對(duì)成品疫苗按照《重組禽流感病毒(H5N1亞型)滅活疫苗(細(xì)胞源，Re-6株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0103]實(shí)施例3
[0104]全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗，包括如下步驟:
[0105](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞
[0106](1.1)MDCK細(xì)胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)
[0107]取出兩支液氮凍存的懸浮MDCK細(xì)胞，快速融化后，直接加入500ml搖瓶中補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液至200ml，置于36.5°C懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)60小時(shí)后，按照1:4的比例傳代至其他搖瓶中，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積；
[0108](1.2)MDCK細(xì)胞的反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0109](1.2.1)20L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0110]將步驟(1.1)中搖瓶懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6個(gè)/ml后接種至20L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36.5°C，pH值為6.8，溶氧為40%;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0X IO6個(gè)/ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0111](1.2.2) 100L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0112]將步驟(1.2.1)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml后接種至100L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36.5°C，pH值為6.8，溶氧為40% ；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0113](1.2.3) 500L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0114]將步驟(1.2.2)中100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml接種至500L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36.50C，pH值為6.8，溶氧為40 % ；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6/個(gè)ml時(shí),活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐。
[0115](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒
[0116]采用兩組由步驟(1.2.3)最后培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒，即，將兩罐500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)至1000L病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36.5°C，pH值為6.8，溶氧為40% ;用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞，用無(wú)血清懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液更換掉500L細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，領(lǐng)取30L生產(chǎn)用H5N1亞型禽流感病毒接入反應(yīng)器，接毒后6h內(nèi)設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為36.5°C, IOh后設(shè)為35.5°C，pH值為6.8，溶氧為40%;從接毒24h起每隔4h采樣檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度小于0.6X IO6個(gè)/ml，活力≤25%時(shí)收獲禽流感病毒液。
[0117](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化
[0118]將步驟(3)收獲的禽流感病毒液利用連續(xù)流離心機(jī)離心，得到的澄清液轉(zhuǎn)入滅活罐中，用終濃度為2%。甲醛滅活，滅活后抗原利用中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)，參照滅活前抗原液的體積，對(duì)抗原進(jìn)行5~10倍濃縮純化。
[0119](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品
[0120]抗原經(jīng)檢驗(yàn)合格后，參照其HA效價(jià)利用磷酸鹽緩沖液稀釋為水相，將水相和礦物油佐劑以1:2比例充分混合乳化，將檢驗(yàn)合格的半成品定量分裝。
[0121](5)成品檢驗(yàn)
[0122]對(duì)成品疫苗按照《重組禽流感病毒(H5N1亞型)滅活疫苗(細(xì)胞源，Re-6株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0123]實(shí)施例4
[0124]全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗，包括如下步驟:
[0125](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞
[0126](1.1)MDCK細(xì)胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)
[0127]取出兩支液氮凍存的懸浮MDCK細(xì)胞，快速融化后，直接加入500ml搖瓶中補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液至200ml，置于37°C懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)72小時(shí)后，按照1:4的比例傳代至其他搖瓶中，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積；
[0128](1.2)MDCK細(xì)胞的反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0129](1.2.1) 20L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[0130]將步驟(1.1)中搖瓶懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6個(gè)/ml后接種至20L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，pH值為7.2，溶氧為70%;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6個(gè)/ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0131](1.2.2) 100L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0132]將步驟(1.2.1)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml后接種至100L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，pH值為7.2，溶氧為70% ;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0XlO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0133](1.2.3)500L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0134]將步驟(1.2.2)中100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml接種至500L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，PH值為7.2，溶氧為70%，；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6/個(gè)ml時(shí),活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐。
[0135](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒
[0136]采用兩組由步驟1.2.3最后培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒，即，將兩罐500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)至1000L病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，pH值為7.2，溶氧為70% ;采用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞，用無(wú)血清懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液更換掉500L細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，領(lǐng)取30L生產(chǎn)用H5N1亞型禽流感病毒接入反應(yīng)器，接毒后8h內(nèi)設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為37°C, IOh后設(shè)為36°C, pH值為7.2,溶氧為70% ;從接毒24h起每隔4h采樣檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度小于0.6X IO6個(gè)/ml，活力≤25%時(shí)收獲禽流感病毒液。
[0137](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化同實(shí)施例1。
[0138](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品同實(shí)施例1。
[0139](5)成品檢驗(yàn)
[0140]對(duì)成品疫苗按照《重組禽流感病毒(H5N1亞型)滅活疫苗(細(xì)胞源，Re-6株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0141]實(shí)施例5
[0142]以禽流感H5NlRe_6雞胚種毒為用于禽流感病毒接種的禽流感種毒，通過(guò)全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗的基本工藝步驟同實(shí)施例1。所得疫苗成品檢驗(yàn)中，按照《重組禽流感病毒(H5N1亞型)滅活疫苗(細(xì)胞源，Re-6株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0143]實(shí)施例6
[0144]以禽流感H5NlRe_6雞胚種毒為用于禽流感病毒接種的禽流感種毒，通過(guò)全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗的基本工藝步驟同實(shí)施例2。所得疫苗成品檢驗(yàn)中，按照《重組禽流感病毒(H5N1亞型)滅活疫苗(細(xì)胞源，Re-6株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0145]實(shí)施例7
[0146]全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗，包括如下步驟:
[0147](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞
[0148](1.1)MDCK細(xì)胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)
[0149]取出兩支液氮凍存的懸浮MDCK細(xì)胞，快速融化后，直接加入500ml搖瓶中補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液至200ml，置于36°C懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)60小時(shí)后，按照1:3的比例傳代至其他搖瓶中，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積；
[0150](1.2)MDCK細(xì)胞的反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0151](1.2.1) 20L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0152]將步驟(1.1)中搖瓶懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6個(gè)/ml后接種至20L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40%;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6個(gè)/ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)； [0153](1.2.2) 100L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0154]將步驟(1.2.1)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml后接種至100L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40% ;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0XlO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0155](1.2.3)500L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0156]將步驟(1.2.2)中100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml接種至500L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40% ；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6/個(gè)ml時(shí),活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐。
[0157](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒
[0158]采用兩組由步驟(1.2.3)最后培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒，即，將兩罐500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)至1000L病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為36°C，pH值為7.2，溶氧為40% ;采用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞，用無(wú)血清懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液更換掉500L細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，領(lǐng)取30L生產(chǎn)用H9N2亞型禽流感病毒雞胚種毒接入反應(yīng)器，接毒后設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為32°C,PH值為7.2，溶氧為40%;從接毒24h起每隔4h采樣檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度小于0.6 X IO6個(gè)/ml，活力(25 %時(shí)收獲禽流感病毒液。
[0159](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化
[0160]將步驟(3)收獲的禽流感病毒液利用連續(xù)流離心機(jī)離心，得到的澄清液轉(zhuǎn)入滅活罐中，用終濃度為2%。甲醛滅活，滅活后抗原利用中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)，參照滅活前抗原液的體積，對(duì)抗原進(jìn)行5-10倍濃縮純化。
[0161](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品
[0162]抗原經(jīng)檢驗(yàn)合格后，參照其HA效價(jià)利用磷酸鹽緩沖液稀釋為水相，將水相和礦物油佐劑以1:2比例充分混合乳化，將檢驗(yàn)合格的半成品定量分裝。[0163](5)成品檢驗(yàn)
[0164]對(duì)成品疫苗按照《禽流感(H9亞型)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0165]實(shí)施例8
[0166]全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗，包括如下步驟:
[0167](I)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞
[0168](1.1)MDCK細(xì)胞的搖瓶懸浮培養(yǎng)
[0169]取出兩支液氮凍存的懸浮MDCK細(xì)胞，快速融化后，直接加入500ml搖瓶中補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液至200ml，置于37°C懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)72小時(shí)后，按照1:5的比例傳代至其他搖瓶中，擴(kuò)增至反應(yīng)器所需體積；
[0170](1.2)MDCK細(xì)胞的反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)
[0171](1.2.1) 20L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0172]將步驟(1.1)中搖瓶懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6個(gè)/ml后接種至20L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，pH值為6.8，溶氧為60%;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6個(gè)/ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0173](1.2.2) 100L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0174]將步驟(1.2.1)中反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml后接種至100L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，pH值為6.8，溶氧為60% ;細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0XlO6/個(gè)ml時(shí)，活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)；
[0175](1.2.3) 500L反應(yīng)器中的MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
[0176]將步驟(1.2.2)中100L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞稀釋至0.5 X IO6/個(gè)ml接種至500L生物反應(yīng)器，補(bǔ)充懸浮營(yíng)養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，pH值為6.8，溶氧為60% ；細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后采樣，用臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度大于3.0 X IO6/個(gè)ml時(shí),活力大于90%時(shí)轉(zhuǎn)至病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐。
[0177](2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒
[0178]采用兩組由步驟(1.2.3)最后培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞進(jìn)行全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒，即，將兩罐500L反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)至1000L病毒培養(yǎng)反應(yīng)器罐，將細(xì)胞培養(yǎng)溫度設(shè)為37°C，pH值為6.8，溶氧為60% ;采用用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截流細(xì)胞，用無(wú)血清懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液更換掉500L細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液，領(lǐng)取30L生產(chǎn)用H9亞型禽流感病毒接入反應(yīng)器，接毒后設(shè)置病毒培養(yǎng)溫度為34°C, pH值為6.8,溶氧為60% ;從接毒24h起每隔4h采樣檢測(cè)細(xì)胞密度和活力，當(dāng)細(xì)胞密度小于0.6X IO6個(gè)/ml，活力≤25%時(shí)收獲禽流感病毒液。
[0179](3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化同實(shí)施例5。
[0180](4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品同實(shí)施例5。
[0181](5)成品檢驗(yàn)
[0182]對(duì)成品疫苗按照《禽流感(H9亞型)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體見(jiàn)表一至表五。
[0183]基于上述實(shí)施例，具體以H9N2(JY株)雞胚毒為用于禽流感病毒接種的禽流感種毒進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗的基本工藝步驟同實(shí)施例7。所得疫苗成品檢驗(yàn)中，按照《禽流感(H9亞型)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行性狀、裝量檢查、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、甲醛和汞類(lèi)防腐劑殘留量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例7。
[0184]本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員所做出的對(duì)上述實(shí)施方式任何顯而易見(jiàn)的改進(jìn)或變更，都不會(huì)超出本發(fā)明的構(gòu)思和所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。 [0185]表1性狀檢驗(yàn)結(jié)果
[0186]
【權(quán)利要求】
1.全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于，包括如下步驟: (1)全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞； (2)利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒； (3)禽流感病毒液的澄清、滅活、除菌、濃縮純化； (4)將收獲的病毒液乳化制成疫苗成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于: 在步驟(1)中，所述的全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，通過(guò)以下培養(yǎng)條件制得:全懸浮MDCK細(xì)胞以0.5X IO6個(gè)/ml的密度接種生物反應(yīng)器，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)溫度為36~37°C，pH值為6.8~7.2，溶氧為40%~70%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于: 在所述步驟(2)中，利用步驟(1)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感病毒的方法為:接種前MDCK細(xì)胞密度要大于3.0 X IO6個(gè)/ml，利用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器截留細(xì)胞，更換培養(yǎng)基，最終為含0.5~2.0 %新生牛血清的營(yíng)養(yǎng)液，將禽流感病毒接種入反應(yīng)器中，接種劑量為培養(yǎng)基終體積的1.0~5.0%，其中，禽流感病毒培養(yǎng)溫度為32°C~37°C;禽流感病毒培養(yǎng)pH值為6.8~7.2，溶氧為4 0%~70% ;累計(jì)培養(yǎng)36~72h，收獲病毒液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于:在所述步驟(1)中，接種生物反應(yīng)器的全懸浮MDCK細(xì)胞通過(guò)以下方法制備:從液氮中取出凍存的全懸浮MDCK細(xì)胞株，直接用搖瓶懸浮培養(yǎng)傳代，擴(kuò)增至生物反應(yīng)器所需體積和濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于:所述的用于禽流感病毒接種的禽流感種毒為H5N1亞型或者H9N2亞型。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于:所述的用于禽流感病毒生產(chǎn)接種的禽流感種毒為H5N1雞胚毒或者H9N2雞胚毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于:所述禽流感病毒液的澄清是通過(guò)連續(xù)流離心機(jī)離心完成；所述禽流感病毒液的濃縮純化為超濾濃縮純化，通過(guò)750K中空纖維超濾濃縮系統(tǒng)完成。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的全懸浮培養(yǎng)細(xì)胞制造禽流感滅活疫苗工藝，其特征在于:所述禽流感病毒液的滅活通過(guò)甲醛滅活，所述禽流感病毒液的除菌采用0.2um的囊式濾器過(guò)濾除菌。
9.一種禽流感滅活疫苗，其特征在于:其通過(guò)權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的工藝得到。
【文檔編號(hào)】A61K39/145GK104001167SQ201410212197
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】李少英, 徐樹(shù)蘭, 吳華偉, 劉宏斌 申請(qǐng)人:鄭州愛(ài)科生物科技有限公司