重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8）在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8）在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明建立了大鼠骨質(zhì)疏松保護(hù)作用、逆轉(zhuǎn)作用模型，經(jīng)過(guò)rLZ-8給藥治療，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，rLZ-8大幅提高骨礦物質(zhì)密度，有效調(diào)節(jié)代謝相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)。說(shuō)明rLZ-8具有顯著改善地塞米松引起的骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度并且對(duì)骨質(zhì)疏松有一定逆轉(zhuǎn)作用。
【專利說(shuō)明】重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，本發(fā)明涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，具體涉及骨質(zhì)疏松模型的建立，治療程序的設(shè)計(jì)以及治療結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，重點(diǎn)涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在治療骨質(zhì)疏松模型中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨質(zhì)疏松(Osteoporosi s，OP )癥是骨組織的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退化、骨組織含量減少、脆性增加，而易于發(fā)生骨折的一種全身性的退行性疾病。骨質(zhì)疏松是由多種因素引發(fā)的疾病，它與性激素、遺傳、營(yíng)養(yǎng)攝入以及生活方式等因素有著密切的關(guān)系。據(jù)新加坡舉行的國(guó)際骨質(zhì)疏松癥基金會(huì)(IOF)第一屆亞洲地區(qū)骨質(zhì)疏松癥研討會(huì)和《骨質(zhì)疏松癥中國(guó)白皮書(2009)》報(bào)道，2006年中國(guó)50歲以上人群中約有6944萬(wàn)人患有骨質(zhì)疏松，其中男性1534萬(wàn)(8.8%)，女性5410萬(wàn)(30.8%)。骨量減少的人數(shù)達(dá)2.139億，其中男性1.004億，女性1.135億。預(yù)計(jì)2020-2050年，中國(guó)患有骨質(zhì)疏松癥為2.87億，骨量減少的人數(shù)為5.33億。
[0003]骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制主要是由于性激素的缺乏，導(dǎo)致破骨細(xì)胞生成的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)發(fā)生改變。促使破骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)，而成骨細(xì)胞活性遭到抑制，骨的吸收速度超過(guò)形成速度，造成骨組織中的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物減少。隨著全球人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥及其引起的骨折也隨之普遍，OP已經(jīng)對(duì)人類健康乃至社會(huì)的公共健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。
[0004]靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(FungalImmunomodulatory Protein of Ganodermalucidium, LZ_8)是19 89年Kino等從靈芝菌絲體提取物中分離到第一個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。以往研究表明，LZ-8具有抑制小鼠系統(tǒng)性過(guò)敏反應(yīng)，刺激人類外周血淋巴細(xì)胞增殖和IL-2、TNF-a和IFN-Y等細(xì)胞因子產(chǎn)生的免疫學(xué)活性。利用已構(gòu)建的畢赤酵母GS115菌株重組表達(dá)LZ-8及相應(yīng)的中試純化工藝獲得重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)。rLZ-8作為重組蛋白免疫調(diào)節(jié)制劑，具有多種免疫功能，它可避免化療在發(fā)揮抗癌、抑癌作用的同時(shí)所帶來(lái)的一系列毒副反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用，重點(diǎn)考察了保護(hù)作用、逆轉(zhuǎn)作用、不同給藥劑量等因素對(duì)治療效果的影響，采用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)處理，得出rLZ-8在治療骨質(zhì)疏松過(guò)程中具有顯著療效。具體
【發(fā)明內(nèi)容】
如下:
骨質(zhì)疏松模型的建立:1)保護(hù)作用模型:選用健康的雌性Wistar大鼠，6周齡，體重180±20g，SPF級(jí)。大鼠腹腔注射地塞米松(2.5mg/kg)，給藥體積0.00125ml/g，每周2次，連續(xù)給藥13次(連續(xù)給藥7周)。2)逆轉(zhuǎn)作用模型:選用健康的雄性Wistar大鼠，體重250-300g, SPF級(jí)。大鼠腹腔注射地塞米松(2.5mg/kg)，給藥體積0.00125ml/g，每周2次，連續(xù)給藥13次(連續(xù)給藥7周)。[0006]實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法:
O保護(hù)作用分組與給藥方法:大鼠60只隨機(jī)分為6組(n=10):生理鹽水組、模型組、陽(yáng)性藥組、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組。大鼠造模開始前3天給藥。生理鹽水組:大鼠腹腔注射生理鹽水0.00245ml/kg ;模型組:大鼠腹腔注射生理鹽水0.00245ml/kg ;陽(yáng)性藥組:大鼠灌胃阿倫磷酸鈉1.0mg/kg ;rLZ_8低劑量組:大鼠腹腔注射rLZ-8 28 μ g/kg ；rLZ-8中劑量組:大鼠腹腔注射rLZ_8 56 μ g/kg ;rLZ_8高劑量組:大鼠腹腔注射rLZ-8 112 μ g/kg。陽(yáng)性藥組每天給藥I次，其余各組每天給藥2次。連續(xù)給藥45天。
[0007])逆轉(zhuǎn)作用分組與給藥方法:大鼠20只隨機(jī)分為2組(n=10):rLZ-8逆轉(zhuǎn)模型組、rLZ-8逆轉(zhuǎn)組。大鼠造模結(jié)束后開始給藥。rLZ-8逆轉(zhuǎn)模型組:大鼠腹腔注射生理鹽水
0.00245ml/kg,每天給藥2次，連續(xù)給藥21天；rLZ_8逆轉(zhuǎn)組:大鼠腹腔注射rLZ_8 112 μ g/kg,每天給藥2次,連續(xù)給藥21天。
[0008]實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì):本發(fā)明主要通過(guò)大鼠體征觀察、大鼠體重、骨礦物密度、血液生化指標(biāo)及臟器指數(shù)等指標(biāo)考察rLZ-8骨質(zhì)疏松模型的治療效果的影響。以上述指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)各治療組間進(jìn)行分析檢驗(yàn)得出結(jié)論。
[0009]體征觀察方面:通過(guò)每天上午、下午對(duì)大鼠的狀態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)地塞米松對(duì)正常大鼠的毛色無(wú)影響，但對(duì)正常大鼠的活動(dòng)有一定影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，與正常組的大鼠相比給地塞米松的大鼠進(jìn)食情況明顯減少，伴有脫毛現(xiàn)象。
[0010]體重方面:每天稱量并記錄大鼠的體重。I)保護(hù)作用大鼠體重變化:體重?cái)?shù)據(jù)由實(shí)驗(yàn)前三天大鼠體重及實(shí)驗(yàn)時(shí)間大鼠體重組成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每組大鼠體重均有大幅變化，由此可知地塞米松對(duì)正常大鼠的體重有影響。2)逆轉(zhuǎn)作用大鼠體重變化:體重?cái)?shù)據(jù)由實(shí)驗(yàn)前三天大鼠體重及實(shí)驗(yàn)時(shí)間大鼠體重組成。造模過(guò)程中兩組大鼠體重均有浮動(dòng)，逆轉(zhuǎn)給藥過(guò)程中兩組大鼠體重成穩(wěn)定上升趨勢(shì)，由此可知地塞米松對(duì)正常大鼠的體重具有一定影響。
[0011]股骨礦物含量方面:實(shí)驗(yàn)第46天，生理鹽水組、模型組、陽(yáng)性藥組、rLZ-8低劑量、中、高組大鼠使用水合氯醛麻醉。腹主動(dòng)脈取血后迅速分離骨組織。實(shí)驗(yàn)第46天、第64天，rLZ-8逆轉(zhuǎn)模型組、rLZ-8逆轉(zhuǎn)組大鼠使用水合氯醛麻醉。腹主動(dòng)脈取血后迅速分離骨組織。測(cè)定骨礦物密度值。I)保護(hù)作用大鼠股骨礦物密度:rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組的骨礦物質(zhì)密度顯著升高，說(shuō)明rLZ-8可以顯著改善地塞米松引起的骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度。2)逆轉(zhuǎn)作用大鼠股骨礦物密度:給藥46天，相比于rLZ-8逆轉(zhuǎn)模型組，rLZ-8逆轉(zhuǎn)組大鼠股骨礦物質(zhì)密度顯著增加，說(shuō)明rLZ-8對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。
[0012]血液生化指標(biāo)方面:實(shí)驗(yàn)第46天、67天分別測(cè)定血液生化指標(biāo)，rLZ-8可以降低血清堿性磷酸酶活性，rLZ-8可以升高血清鈣離子含量，rLZ-8可以降低血清無(wú)機(jī)磷含量，rLZ-8可以降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。與骨代謝密切相關(guān)的血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，rLZ-8可以通過(guò)調(diào)節(jié)上述指標(biāo)來(lái)改善骨質(zhì)疏松的狀況。
[0013]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1保護(hù)作用大鼠體重變化 圖2逆轉(zhuǎn)作用大鼠體重變化圖3保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)46天各組大鼠股骨礦物質(zhì)密度的測(cè)定結(jié)果注:*與生理鹽水組相比，rLZ-8給藥組、陽(yáng)性藥組及模型組大鼠股骨礦物質(zhì)密度都明顯減少，具有顯著性差異01)，Λ與模型組相比，rLZ-8給藥組及陽(yáng)性藥組大鼠股骨礦物質(zhì)密度顯著增加0X0.01)，# rLZ-8給藥組與陽(yáng)性藥組相比，rLZ-8低劑量組股骨礦物質(zhì)密度有顯著性差異0X0.01)。
[0014]圖4逆轉(zhuǎn)作用實(shí)驗(yàn)46天各組大鼠股骨礦物質(zhì)密度測(cè)定結(jié)果
注:*與生理鹽水組相比，rLZ-8逆轉(zhuǎn)組及逆轉(zhuǎn)模型組大鼠股骨礦物質(zhì)密度都顯著降低，且具有顯著性差異(P<0.01 )。
[0015]圖5逆轉(zhuǎn)作用實(shí)驗(yàn)64天各組大鼠股骨礦物質(zhì)密度的測(cè)定結(jié)果
注:**與模型組相比，rLZ-8逆轉(zhuǎn)組的骨礦物質(zhì)含量顯著增加，且有顯著性差異，(p<0.01)，## rLZ-8逆轉(zhuǎn)組與生理鹽水組相比，無(wú)顯著性差異，逆轉(zhuǎn)模型組與生理鹽水組相t匕，存在顯著性差異OX0.01)。
[0016]圖6各組大鼠血清堿性磷酸酶活力測(cè)定結(jié)果
注:**與生理鹽水組相比，模型組的堿性磷酸酶活力顯著升高(/X0.01)，ΛΛ與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的堿性磷酸酶活力明顯降低OX0.01)，#與rLZ-8逆轉(zhuǎn)模型組相比，rLZ-8逆轉(zhuǎn)組大鼠的堿性磷酸酶活力明顯降低QAQ.05)。
[0017]圖7各組大鼠血清鈣離子含量測(cè)定結(jié)果
注:**與生理鹽水組相比，模型組的血清鈣離子含量顯著降低(/X0.01)，ΛΛ與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清鈣離子含量顯著升高OX0.0I)。
[0018]圖8各組大鼠血清無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定結(jié)果
注:*與生理鹽水組相比，模型組的血清無(wú)機(jī)磷含量顯著升高(/7〈0.05)，ΛΛ與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠的血清無(wú)機(jī)磷含量明顯降低ΟΧ0.01)，#與rLZ-8逆轉(zhuǎn)模型組相比，rLZ_8逆轉(zhuǎn)組大鼠的血清無(wú)機(jī)磷含量明顯降低OX0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例lrLZ-8對(duì)Wistar大鼠骨質(zhì)疏松模型的保護(hù)作用
1.1實(shí)驗(yàn)方法
1.1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑
rLZ-8 (吉林大學(xué)鉆智基因工程藥物研究中心)，地塞米松(河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司)，阿侖膦酸鈉片(萬(wàn)特制藥(海南)有限公司)，血清堿性磷酸酶試劑盒(南京建成)，血清鈣離子試劑盒(南京建成)，血清無(wú)機(jī)磷試劑盒(南京建成)，抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(南京建成)，甲醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，生理鹽水，無(wú)水乙醇(北京化工廠)，水合氯醛(上海國(guó)藥)。
[0020]1.1.2儀器設(shè)備
分析天平、電子天平、單光子骨礦物密度測(cè)定儀、移液器(大、中、小、數(shù)顯恒溫循環(huán)水箱、渦旋混勻器、4°C箱、-80°C冰箱、低溫離心機(jī)、紫外光柵分光光度計(jì)、恒溫干燥箱、多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)、湘儀 離心機(jī)。
[0021]1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康靈活Wistar大鼠，雌性，6周齡，體重180±20g，SPF級(jí)。購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK京2009-0004。在吉林大學(xué)SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)。將大鼠置于室溫(19 土 2) V，24h晝夜循環(huán)光照條件下生活(于20:00-8:00給予光照，8:00-20:00黑暗)，自由飲水、取食。
[0022]1.1.4實(shí)驗(yàn)分組與給藥方式 具體實(shí)驗(yàn)分組與給藥方式見表1
表1骨質(zhì)疏松模型的保護(hù)作用分組與給藥程序
【權(quán)利要求】
1.重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于增加骨礦物密度。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該藥物制劑核心成分是由權(quán)利要求1所述的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)和任選的藥學(xué)可接受的輔劑組成。
5.如權(quán)利要求1、4所述的應(yīng)用，其特征在于給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括口服液，片劑，丸劑和膠囊；非腸道給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK103990109SQ201410266772
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】孫非, 梁重陽(yáng), 張喜田 申請(qǐng)人:張喜田, 孫非