Pvp修飾的納米銀與唑類藥物在制備抗耐藥真菌活性聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了PVP修飾的納米銀與唑類藥物在制備抗耐藥真菌活性聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明表明氟康唑或者伏立康唑與PVP修飾的納米銀聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以產(chǎn)生協(xié)同的抗耐藥真菌的作用。對唑類耐藥菌株CA10(MIC>256mg/L)，聯(lián)合用藥可以使其最低抑菌濃度降低至1mg/L，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。
【專利說明】PVP修飾的納米銀與唑類藥物在制備抗耐藥真菌活性聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及PVP修飾的納米銀(Ag-NPs)與唑類藥物氟康唑或伏立康唑在制備抗耐藥真菌活性聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]近20年來，隨著癌癥放療、化療、器官移植、艾滋病患者的增加，廣譜抗生素和免疫抑制劑的長期廣泛應(yīng)用，免疫功能低下患者不斷增多，深部真菌感染的發(fā)生率急劇升高，真菌感染已成為上述免疫功能低下的重大疾病患者的主要死亡原因之一。在抗真菌藥物長期大量地應(yīng)用于臨床的同時(shí)，耐藥菌已經(jīng)成為臨床抗真菌治療失敗的主要原因[RuhnkeM，Eigler A，Tennagen I，Geiseler B，Engelmann F，Trautmann M.1994.Emergence ofFluconazole-Resistant Strains of Candida albicans in Patients with RecurrentOropharyngeal Candidosis and Human Immunodeficiency Virus Infect1n.J ClinMicrob1l.32:2092 - 2098.]。多種念珠病、新型隱球菌、煙曲霉菌依然是最常見的深部致病真菌。在醫(yī)院血液標(biāo)本中念珠菌的檢出率為7.6%，位列所有病原體的第四位，致病真菌的第一位。念珠菌屬中最常見的致病菌種是白色念珠菌。
[0003]目前可供臨床選擇的抗真菌藥物數(shù)目有限，常用的主要有多烯類抗生素(兩性霉素B)、唑類抗真菌藥物(氟康唑)、烯丙胺類抗真菌藥物(特比萘芬)、氟胞嘧啶和棘球白素類抗真菌化合物等。其中，氟康唑因良好的生物利用度、較少的不良反應(yīng)和適中的價(jià)格，成為臨床應(yīng)用最廣泛的抗真菌藥物。但由于氟康唑只具有抑制真菌的作用，因此在長期和重復(fù)的治療中，使真菌產(chǎn)生了快速發(fā)展的耐藥性。而且，氟康唑耐藥真菌對其他抗真菌藥物具有交叉耐藥性，使酮康唑、伊曲康唑、甚至兩性霉素B對越來越多的耐藥菌也束手無策，這是臨床真菌感染治療失敗的主要原因。
[0004]應(yīng)對真菌耐藥性的策略主要有:(I)開發(fā)新藥。但是新藥開發(fā)過程費(fèi)用昂貴，時(shí)間冗長以及候選藥物淘汰率高；(2)聯(lián)合用藥。聯(lián)合用抗真菌藥物是目前臨床最簡便易行地克服真菌耐藥的策略之一。聯(lián)合治療的理論優(yōu)勢是:不同藥物抑制真菌代謝的不同階段而產(chǎn)生協(xié)同作用，一種藥物作用于細(xì)胞壁或細(xì)胞膜而增加另一種藥物向細(xì)胞內(nèi)滲透；作用不同的分子靶位；藥動學(xué)/藥效學(xué)上的互補(bǔ)；單藥劑量減少而降低毒副作用；減少耐藥的發(fā)生等。臨床上聯(lián)合用藥主要集中于治療隱球菌病、侵襲性念珠菌病和侵襲性曲霉菌病。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供PVP修飾的納米銀與唑類藥物在制備抗耐藥真菌活性聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用。
[0006]其中，所述唑類藥物選自氟康唑和伏立康唑中的一種或兩種。
[0007]其中，所述耐藥真菌為耐藥白色念珠菌。
[0008]本發(fā)明運(yùn)用了標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋法測定藥物敏感性，運(yùn)用棋盤式微量稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法和時(shí)間-殺菌曲線方法評價(jià)Ag-NPs與氟康唑或伏立康唑聯(lián)合應(yīng)用抗耐藥白色念珠菌體外關(guān)系，結(jié)果表明顯示=Ag-NPs與氟康唑或伏立康唑聯(lián)合應(yīng)用抗唑類耐藥菌株有協(xié)同作用關(guān)系。
[0009]協(xié)同作用細(xì)胞學(xué)機(jī)制在于:Ag_NPs增加真菌細(xì)胞膜缺損，氟康唑和伏立康唑能增加Ag-NPs粘附到真菌細(xì)胞膜的數(shù)量，Ag-NPs與唑類聯(lián)用能顯著地抑制正常出芽過程等。
[0010]協(xié)同作用分子機(jī)制在于:PVP修飾的納米銀與唑類藥物通過作用于麥角甾醇生物合成途徑相關(guān)基因和外排泵表達(dá)基因產(chǎn)生協(xié)同作用。
[0011]本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括PVP修飾的納米銀和唑類藥物，所述唑類藥物選自氟康唑和伏立康唑中的一種或兩種。
[0012]有益效果:為了克服白色念珠菌耐藥現(xiàn)象，本發(fā)明利用現(xiàn)有藥物組合提供了唑類藥物與PVP修飾的納米銀在制備抗耐藥真菌活性聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用。
[0013]具體而言，本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)與效果:
[0014](I)本發(fā)明表明，氟康唑或者伏立康唑與PVP修飾的納米銀聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以產(chǎn)生協(xié)同的抗耐藥真菌的作用。對唑類耐藥菌株CAlO (MIC>256mg/L)，聯(lián)合用藥可以使其最低抑菌濃度降低至lmg/L,從而逆轉(zhuǎn)耐藥。
[0015](2)本發(fā)明表明，作用于麥角留醇生物合成通路及抑制細(xì)胞膜外排泵基因表達(dá)的藥物可能是聯(lián)合抗真菌作用的分子機(jī)制，為新藥開發(fā)及老藥新用提供可能的研究方向。
[0016](3)在臨床上納米銀凝膠是由于它是非抗生素類廣譜高效抗菌劑，用于婦科疾病的預(yù)防和治療。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)修飾后的納米銀穩(wěn)定性更高。與唑類聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對耐藥真菌同樣有效，并且可以降低各自的用藥劑量，從而降低藥物不良反應(yīng)，擴(kuò)大藥物的適用范圍，放緩耐藥性的發(fā)生。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為AgNPs的表征圖譜。其中，A為AgNPs單獨(dú)或者添加唑類藥物后的電鏡數(shù)據(jù)；B為AgNPs紫外吸收譜；C為AgNPs的晶體衍射數(shù)據(jù)；D為AgNPs單獨(dú)或者添加唑類藥物后的的水力直徑和zeta電位值。
[0018]圖2為AgNPs與唑類聯(lián)合應(yīng)用抗耐藥白色念珠菌CAlO協(xié)同作用分析。其中，A為氟康唑與AgNPs聯(lián)用后的等效性曲線；B為平板點(diǎn)滴法暗示氟康唑與AgNPs聯(lián)用后具有殺菌協(xié)同效果；(:為瓊脂擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D為殺菌曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所用菌株是耐藥菌株CA10，F(xiàn)LC代表氟康唑；V0R代表伏立康唑。
[0019]圖3為氟康唑與AgNPs聯(lián)用后對白色念珠菌形態(tài)上的改變。其中，A為AgNPs對真菌細(xì)胞的粘附作用，氟康唑濃度4mg/L，AgNPs濃度2mg/L及它們的聯(lián)合應(yīng)用；B為氟康唑濃度影響AgNPs對真菌細(xì)胞的粘附作用；C為相對出芽率的比較，氟康唑濃度4mg/L，AgNPs濃度2mg/L及它們的聯(lián)合應(yīng)用。芽體定義為小于母體1/2大小的細(xì)胞。#p〈0.01。
[0020]圖4為氟康唑與AgNPs聯(lián)用對白色念珠菌吸收碘化丙啶的影響。其中，A為聯(lián)合用藥對白色念珠菌吸收碘化丙啶(PI)的影響為藥物處理后白色念珠菌吸收碘化丙啶的比率變化。氟康唑濃度是4mg/L，AgNPs濃度是4mg/L。**p<0.01o
[0021]圖5為定量PCR測定氟康唑與AgNPs聯(lián)用對基因表達(dá)的影響。氟康唑濃度是4mg/L, AgNPs 濃度是 4mg/L。**ρ〈0.01。
[0022]圖6為氟康唑與AgNPs聯(lián)用對麥角甾醇含量的影響。其中，A為麥角甾醇紫外吸收譜為氟康唑與AgNPs聯(lián)用對麥角甾醇含量的影響。氟康唑濃度是4mg/L，AgNPs濃度是 4mg/L。**p<0.01.

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。
[0024]本發(fā)明使用的AgNPs合成過程參照文獻(xiàn)進(jìn)行[Guo D, Zhu L, Huang Z, etal.Ant1-leukemia activity of PVP-coated silver nanoparticles via generat1nof reactive oxygen species and release of silver 1ns.B1materials2013 ；34:7884-94]。制得的 AgNPs 純度 99.99%。
[0025]AgNPs的結(jié)構(gòu)表征，見圖1:
[0026](I)紫外全波長掃描得出的最大吸收峰在416nm ；
[0027](2)晶體衍射數(shù)據(jù)有四個(gè)納米銀典型的峰值，111，200，220，311 ；
[0028](3)電鏡觀察統(tǒng)計(jì)粒徑大小，AgNPs粒徑分布與加入唑類藥物后的粒徑大小，聚合度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異；
[0029](4)達(dá)爾文粒度儀測定AgNPs (lmg/mL)粒徑34.92±2.1nm,添加氟康唑和伏立康唑后 AgNPs 粒徑 34.67 ± 1.7nm 和 35.12±2.4nm ;
[0030](5) AgNPs的zeta電位-5.35± 1.4mV,添加8mg/L的氟康唑和8mg/L的伏立康唑后zeta電位-4.23± 1.5mV和-4.23± 1.2mV,唑類藥物的加入對AgNPs的穩(wěn)定沒有明顯的影響。
[0031]實(shí)施例1體外協(xié)同實(shí)驗(yàn)
[0032]抗真菌藥物的體外敏感性實(shí)驗(yàn)及棋盤式微量稀釋法參照文獻(xiàn)Nat1nalCommittee for Clinical Laboratory Standards.Methods for antifungal diskdiffus1n susceptibility testing of yeasts ；approved guideline M44-A.NCCLSj Wayne, PA，USA, 2004。具體操作如下:
[0033](I)菌液制備及敏感性分析
[0034]-70°C保存的白色念珠菌菌株解凍后，接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h。取發(fā)育良好的單一菌落再次接種到Y(jié)PD上，35°C培養(yǎng)24h，以獲得純培養(yǎng)。選擇直徑大于Imm的菌落5個(gè)，將其用0.85%滅菌生理鹽水制成細(xì)菌懸液。將菌懸液在振蕩器上振蕩15秒鐘，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)菌數(shù)，調(diào)整菌懸液濃度為I~5X106cfu/ml。將其用RPM1-1640培養(yǎng)液稀釋菌液1000倍，作為接種的菌懸液，以保證接種后每孔菌液的終濃度為0.5~
2.5X 103cfu/ml。將96孔板置37°C恒溫培養(yǎng)箱中48小時(shí)后，當(dāng)生長對照良好且質(zhì)控菌株的MIC值在CLSI M27-A2方案給定范圍之內(nèi)時(shí)，用酶標(biāo)儀測定600nm處的光密度(OD)。生長率=各孔的OD值/生長對照0D，以真菌生長80%以上受抑制為標(biāo)準(zhǔn)判斷各株菌的最小抑菌濃度。
[0035](2)棋盤式微量稀釋法(Checkerboard microdilut1n assay)
[0036]根據(jù)CLSI M27-A2方案的棋盤式微量稀釋法，確定了各個(gè)藥物的最低抑制濃度。根據(jù)其最低抑制濃度來確定此實(shí)驗(yàn)中所用到的藥物濃度范圍，并用RPM1-1640液體培養(yǎng)基稀釋藥物使其成為4倍工作濃度。按濃度從高到底的順序吸收唑類藥物50 μ 1，分別加入96孔板的第12-2列，第I列中加入50 μ I的液體培養(yǎng)基；按濃度從高到低的順序吸取AgNPs藥液50 μ 1，分別加入96孔板的第A-G行，H行中相應(yīng)加入50 μ I液體培養(yǎng)基。然后將調(diào)好濃度的菌懸液0.5~2.5Χ103(^ιι/πι1100μ1加入各孔中。Hl是不含藥物的生長對照。這樣就產(chǎn)生了兩種藥物聯(lián)合用藥不同濃度的77種組合。將96孔板置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后用酶標(biāo)儀600nm處測定并記錄結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。對于聯(lián)合用藥的殺菌效果評價(jià)，把96-孔板中每個(gè)樣本通過平板點(diǎn)滴的方法取5微升點(diǎn)滴到Y(jié)PD平板上，然后在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)后拍照分析它們的殺菌效果。
[0037](3)評價(jià)與判定方法
[0038]LA模型的非參數(shù)法采用分級抑菌濃度指數(shù)(fract1nal inhibitoryconcentrat1n index, FICI),公式為 Σ FIC = FICA+FICB = (MIC A,聯(lián)用 /MIC A,單用) + (MIC B，聯(lián)用/MIC B單用)。
[0039]決定FIC指數(shù):計(jì)算數(shù)據(jù)表中所有的FIC值，當(dāng)數(shù)據(jù)表中所有的FIC值都小于4時(shí)，此時(shí)FIC最小的那個(gè)值就是FIC值；否則，F(xiàn)IC值最大值為FIC。FIC ( 0.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用；FIC>4則為拮抗；處于兩者之間則為不相關(guān)。FIC指數(shù)越小表示兩藥協(xié)同作用越強(qiáng)[Odds FC.2003.Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.JAntimicrob Chemother.52:1]。
[0040]等效線圖解法:通過棋盤稀釋法，將每個(gè)藥的最低抑菌濃度按照等效線圖解法繪制，若兩藥聯(lián)合后的MIC值降到單藥MIC值的1/4即可認(rèn)為兩藥具有協(xié)同效果，這意味聯(lián)用藥的FICs的總和等于或低于0.5。根據(jù)曲線的形狀可以判斷協(xié)同(凸形)、拮抗(凹形)和無關(guān)(直線)[Te Dorsthorst DTA, Verweij PE, Meletiadis J, Bergervoet M, PuntNC, Meis FGM, Mouton Jff.2002.1n vitro interact1n of flucytosine combined withamphotericin B or fluconazole against thirty-five yeast isolates determined byboth the fract1nal inhibitory concentrat1n index and the response surfaceapproach.Antimicrob Agents Chemother.46:2982 - 2989]。
[0041](4)敏感性分析及棋盤式微量稀釋法的結(jié)果(見表1)
[0042]敏感性分析結(jié)果，見表1，顯示=AgNPs對10株臨床分離的白色念珠菌的MIC值范圍在16-32mg/L之間，對唑類敏感菌與唑類耐藥菌沒有明顯差異。
[0043]棋盤式微量稀釋法結(jié)果，見表1，顯示:對耐藥菌株CA10、CA135和CA137，聯(lián)合用藥能顯著降低藥物的MIC，如對于CAlO菌株，聯(lián)用之后，氟康唑的MIC值從256mg/L降低到lmg/L ;伏立康唑的MIC值從64mg/L降低到0.25mg/L，MIC值能降低200多倍以上。它們的體外作用關(guān)系是對耐藥菌株是協(xié)同的作用關(guān)系；對敏感菌株是協(xié)同或不相關(guān)的作用關(guān)系。
[0044]表1棋盤式微量稀釋法測定AgNPs與唑類藥物抗10株臨床分離的白色念珠菌及FICI評價(jià)
[0045]

【權(quán)利要求】
1.PVP修飾的納米銀與唑類藥物在制備抗耐藥真菌活性聯(lián)合用藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述唑類藥物選自氟康唑和伏立康唑中的一種或兩種。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐藥真菌為耐藥白色念珠菌。
4.一種藥物組合物，其特征在于:包括PVP修飾的納米銀和唑類藥物，所述唑類藥物選自氟康唑和伏立康唑中的一種或兩種。
【文檔編號】A61K31/506GK104069128SQ201410291369
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】孫玲美, 廖凱, 王大勇 申請人:東南大學(xué)