黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因，該黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，編碼黑眶蟾蜍抗菌肽的基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，通過固相多肽合成手段獲得的黑眶蟾蜍抗菌肽對多種微生物包括臨床分離的多藥物耐受病原體具有強(qiáng)大的抗菌活性，并且抗菌作用迅速，無明顯溶血活性。黑眶蟾蜍抗菌肽具有體外生產(chǎn)方便、抗菌作用強(qiáng)大、迅速和安全等特點，可做為新型抗菌藥物進(jìn)行應(yīng)用。
【專利說明】黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種黑眶蟾蜍抗菌肽基因獲取、合成及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 黑眶蟾蜍，無尾目，蟾蜍科，蟾蜍屬，是傳統(tǒng)蟾蜍類中藥材(蟾酥、干蟾、蟾皮和蟾 衣)的主要來源之一。近年，大量的研究表明蟾酥藥理活性譜極廣，具有抗腫瘤、強(qiáng)心、升壓、 興奮呼吸、鎮(zhèn)咳平喘、利尿、興奮平滑肌、抗血小板聚集、抗炎、增強(qiáng)免疫力及局麻藥等作用。 20世紀(jì)80年代蟾酥應(yīng)用于臨床，用于治療惡性腫瘤、各種感染性疾病、慢性肝炎、骨髓炎、 周圍性面神經(jīng)麻痹、止痛麻醉等。目前對蟾蜍類藥物活性成分的研究主要集中在小分子化 合物上，主要發(fā)現(xiàn)的有蟾蜍留烯、環(huán)氧蟾蜍內(nèi)酯類、蟾毒色胺類（bufotenines)和留醇類等。
[0003] 有實驗表明蟾酥對金黃色葡萄球菌和甲型溶血性鏈球菌感染的家兔，具有明顯的 治療效果；且抑菌效果迅速，對一些抗生素不敏感或耐受的化膿性感染病原體亦有抑制效 果，但其物質(zhì)基礎(chǔ)不甚清晰。2010年，研究人員對黑眶蟾蜍皮膚分泌物進(jìn)行了初步的分離純 化，得到一種耐熱、pH穩(wěn)定和抗菌譜廣的抗菌物質(zhì)。該抗菌物質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶水解后，抑菌活 性完全喪失，說明該抑菌活性成分為蛋白多肽類物質(zhì)。但該蛋白多肽成分的序列以及具體 功能現(xiàn)今未明。發(fā)明人通過基因工程手段獲得了黑眶蟾蜍抗菌肽的基因序列，并對其進(jìn)行 了多肽合成與性質(zhì)研究。
[0004] 發(fā)明人將本發(fā)明所述的黑眶蟾蜍抗菌肽氨基酸全序列及其編碼基因分別對蛋白 質(zhì)數(shù)據(jù)庫和基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對搜索，均未發(fā)現(xiàn)有任何相同序列信息。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種黑眶蟾蜍抗菌肽，該黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列如 SEQ ID N0 :2所示，其是一種單鏈多肽，分子量4161. 268道爾頓，等電點11. 11。
[0006] 本發(fā)明另一目的是提供一種編碼所述黑眶蟾蜍抗菌肽的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N0 :1 所示。 黑眶蟾蜍抗菌肽基因的克隆方法如下： 黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及設(shè)計引物并利用PCR方法篩選黑眶蟾蜍抗菌肽基 因，其中正向擴(kuò)增引物長度為24個核苷酸，其序列如SEQ ID N0 :3所示，反向擴(kuò)增引物長度 為23個核苷酸，其序列如SEQ ID N0 :4所示；所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定， 基因測序結(jié)果表明編碼黑眶蟾蜍抗菌肽的基因由495個核苷酸組成，自5'端至3'端序列 為： atgaggagct ggaggctgtc tctgctgctg gtctctgcag tcacattaca cggctgtctc 60 tctgaccctg cagagcctga ggtccaagat ggaagatcta tagaagatgt catcgacctc 120 tacaaccaga gggagggggt cacatactta tataaatccc tggaccagct gccccctgtt 180 ccaatggagg aggatgagaa tccgaacaga agaggcttta tcatgaaaga gaccgtgtgc 240 ctcaaatccg agaatcctga tttaacccag tgtgatttca agcctgacgg agatgtgaag 300 atctgttctc tggatttggg ggatgaggat cctgaggata tcatgtgctt cagtctgaac 360 aaggaggtcc gtatgaagcg gtccagcaga aggaaaccat gcaaggggtg gctctgcaag 420 ctgaagctaa gaggaggtta tactcttatc ggcagtgcta caaacctaaa tagacctacc 480 tacgtgaggg cataa 495 編碼黑眶蟾蜍成熟抗菌肽為第382 - 492位核苷酸，其氨基酸序列為： Ser Ser Arg Arg Lys Pro Cys Lys Gly Trp Leu Cys Lys Leu Lys Leu 15 10 15 Arg Gly Gly Tyr Thr Leu lie Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro 20 25 30 Thr Tyr Val Arg Ala 35 黑眶蟾蜍抗菌肽的制備方法為多肽固相合成法，通過HPLC反相C18柱純化。該抗菌肽 具有強(qiáng)大的抗菌活性。
[0007] 本發(fā)明另一目的是將黑眶蟾蜍抗菌肽應(yīng)用在制備新型抗菌藥物中。
[0008] 本發(fā)明中所用黑眶蟾蜍來源于云南省西雙版納州，從農(nóng)貿(mào)市場購得。
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于： 由黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的黑眶蟾蜍抗菌肽具有廣譜抗菌 活性，尤其對臨床多藥物耐受病原體仍具有良好的生物活性，且無溶血作用。該黑眶蟾蜍抗 菌肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣和無明顯副作用的特點。
[0010] 本發(fā)明提供的黑眶蟾蜍抗菌肽在6 μ Μ-12 μ Μ濃度時可有效抑制多種病原體(包 括臨床分離的多藥物耐受病原體)，與微生物接觸后15分鐘內(nèi)即可殺滅98%的細(xì)菌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明中黑眶蟾蜍抗菌肽的殺菌動力學(xué)結(jié)果示意圖，圖中Wholehkcath代 表黑眶蟾蜍抗菌肽，Control為未加入抗菌肽的陰性對照。

【具體實施方式】
[0012] 下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0013] 實施例1 :黑眶蟾蜍抗菌肽基因的克隆 一、黑眶蟾蜍皮膚總RNA提?。?A、 活體黑眶蟾蜍用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300 mg 皮膚組織，加入10 ml總RNA提取緩沖液（Trizol溶液，美國Invitrogen公司產(chǎn)品），于20 ml玻璃勻漿器中勻漿10分鐘； B、 加入等體積酚/氯仿溶液，振蕩混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘， 吸取上層水相液體； C、 上清加入1/2體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下7500g離心10分鐘，沉淀用 75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為黑眶蟾蜍皮膚總RNA。
[0014] 二、黑眶蟾蜍皮膚cDNA文庫合成 米用 CL0NTECH 公司 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit cDNA 文庫 構(gòu)建試劑盒，參照試劑盒說明書方法操作如下： A、 cDNA第一鏈合成（mRNA反轉(zhuǎn)錄）： 1、 在0. 5 ml無菌的離心管加入1 μ?黑眶蟾蜍皮膚總RNA、1 μ? SMART IV寡聚核 苷酸、1 μ 1 CDS 111/3' PCR引物與2 μ 1去離子水； 2、 混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C保溫2分鐘； 3、 將離心管在冰上孵育2分鐘； 4、 在離心管中加入2. 0 μ? 5X第一鏈緩沖液、1.0 μ? 20mM二硫蘇糖醇、Ι.ΟμΙ 10 mM dNTP混合物、Ι.ΟμΙ PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶，混勻； 5、 短暫離心，在42°C保溫1小時； 6、 將離心管置于冰上中止第一鏈的合成； 7、 移取2 μ 1所合成的cDNA第一鏈備用； B、 采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD- PCR )方法擴(kuò)增第二鏈 1、 951：預(yù)熱？0?儀； 2、 將2 μ? cDNA第一鏈產(chǎn)物、80 μ? 去離子水、10 μ? lOXAdvantage 2 PCR 緩沖、 2以150父(1階13混合物、2 415'？0?引物、2 410)5 111/3'？0?引物以及2 410嫩 聚合酶混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3、 在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增： (1) 預(yù)變性 95 °C 20秒鐘 (2) 22個循環(huán)： 95 °C 5秒鐘 68 °C 6分鐘 4、 循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行后續(xù)過程。
[0015] 三、黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因的擴(kuò)增 1、 951：預(yù)熱？0?儀； 2、 將2 μ? cDNA雙鏈(上述產(chǎn)物)、75.5 μ?去離子水、10 μ? PCR緩沖液、 8 μ? dNTP混合物(各2.5 μΜ)、2 μ?正向擴(kuò)增引物、2 μ?反向擴(kuò)增引物以及 0.5 μι DNA聚合酶于離心管中進(jìn)行反應(yīng)。正向擴(kuò)增引物長度為24個核苷酸，其序 列為5' -atgaggagctggaggctgtctctg-3'，反向擴(kuò)增引物長度為23個核苷酸，序列為 -ttatgccctcacgtaggtaggtc -3、
[0016] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增： (1) 預(yù)變性 95 °C 5分鐘 (2) 25個循環(huán)： 95 °C 30秒鐘 56 °C 40秒鐘 72 °C 30秒鐘 (3)后擴(kuò)增 72 °C 5分鐘 4、循環(huán)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用TIANGEN公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行抽提回收，步 驟如下： (1) 將PCR產(chǎn)物與等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將其轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜 置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。12000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液； (2) 加入700 μ?的漂洗液(含乙醇）于離心純化柱中，12000 rpm離心1分鐘，倒掉收 集管中的廢液； (3) 重復(fù)步驟2 ; (4) 12000 rpm 離心 3 分鐘； (5) 將離心純化柱置于新的離心管中； (6) 加入30 μ?洗脫緩沖液，在室溫下靜置5分鐘； (7) 12000 rpm離心1分鐘，管底溶液即為純化過的黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因 PCR產(chǎn) 物。
[0017] 四、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備 1、 挑取單個DH5a菌落，接種于3 ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜， 次日取上述菌液按比例1:100再接種于50 ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩約2小時。當(dāng)0D600 值達(dá)到0. 35時，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物； 2、 將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個50 ml預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置10 min，使培養(yǎng)物冷卻； 3、 于4°C下8000 g離心10 min，吸出培養(yǎng)液； 4、 每 50 ml 初始培養(yǎng)液用 30 ml 預(yù)冷的 0· 1 M CaCl2-MgCl2 溶液（80 mM MgCl2,20 mM CaCl2)重懸細(xì)胞沉淀； 5、 于4°C下8000 g離心10 min，吸出上清液，并將管倒置1 min以使殘留的液體流盡； 6、 每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml預(yù)冷的0. 1 M CaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，分裝后備用。
[0018] 五、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 1、 在微量離心管中加入1 μ? Takara PMD19-T simple載體、4 μι黑眶蟾蜍抗菌肽編 碼基因 PCR產(chǎn)物及5 μ 1的連接酶緩沖混合物； 2、 16°C反應(yīng)3小時； 3、 全量（10 μ 1)加入至100 μ 1 DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘； 4、 42 C加熱90秒鐘后，再在冰中放直1分鐘； 5、 加入37°C溫浴過的LB培養(yǎng)基890 μ 1，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘； 6、 取200 μ 1涂布于含有X-Gal、IPTG、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16小時 以形成單菌落。
[0019] 六、黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因克隆篩選及鑒定 挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件同前述黑眶蟾蜍抗菌肽編碼基因的擴(kuò)增；將經(jīng)PCR確證 的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取后，以美國Applied Biosystems3730A全自動核苷酸序列測定 儀進(jìn)行核苷酸序列的測定；測序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47 (5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -3'），基因測序結(jié)果自5'端至3'端序列如SEQ ID NO :1所 /_J、1 ο
[0020] 黑眶蟾蜍抗菌肽基因核苷酸序列長度為495個堿基，序列類型：核酸，鏈數(shù)：單鏈， 拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀，序列種類：cDNA，來源：黑眶蟾蜍皮膚。
[0021] 編碼黑眶蟾蜍成熟抗菌肽為第382 - 492位，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示。 其中包含兩個半胱氨酸殘基，形成一對二硫鍵。
[0022] 實施例2 :黑眶蟾蜍抗菌肽的應(yīng)用 一、黑眶蟾蜍抗菌肽的制備方法 根據(jù)編碼黑眶蟾蜍抗菌肽的基因推導(dǎo)出黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列，用自動多肽合 成儀合成其全序列，通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
[0023] 二、黑眶蟾蜍抗菌肽的質(zhì)量評價與分子量測定 純化的黑眶蟾蜍抗菌肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，并采用基質(zhì)輔助激光 解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-T0F-MS )測定其精確分子量，最后用自動氨基酸測序儀測定 氨基酸序列結(jié)構(gòu)以進(jìn)行確證。
[0024] 三、黑眶蟾蜍抗菌肽藥理活性檢測 1、抗菌活性檢測 采用二倍稀釋法進(jìn)行最小抑制濃度（minimal inhibitory concentration, MIC) 的檢測，受試菌株為溶血葡萄球菌)、表皮葡萄球菌 (成r/ococciAs )、大腸埃希菌 r&cAericAia co/i )、甲型副傷寒沙門氏 菌(/kraijpAi 4)、奠腸球菌（/?ierococcws /aeca/is)、弗勞地枸橡酸桿 菌(CYiroAacier />·(9?/7￡/?)、肺炎克雷伯菌(Z/e/wieBa 金黃色葡萄球菌 {Staphylococcus aureus、。
[0025] 以上菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后，用接 種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。在紫外分 光光度計上檢測菌液0D600,根據(jù)1 0D600=1 X 109 CFU/ml將菌液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至 2X105 CFU/ml。在無菌96孔板各孔中預(yù)先加入100 μ? LB液體培養(yǎng)基，然后在第一孔中 加入100 μ 1稀釋到一定濃度的經(jīng)0. 22 Mm微孔濾膜過濾除菌的黑眶蟾蜍抗菌肽樣品，混 勻后取100 μ 1加入第2孔，依次倍比稀釋，從第10孔吸出100 μ 1棄去，至此二倍濃度梯 度樣品即制備好，各孔的濃度分別為48 μ Μ、24 μ Μ、12 μ Μ、6 μ Μ和3 μ Μ，同時設(shè)立陰性 對照和陽性對照。
[0026] 以肉眼觀察未見微生物生長濃度為最小抑制濃度。
[0027] 結(jié)果如表1所示，黑眶蟾蜍抗菌肽對多種受試菌株均具有良好的抗菌活性，最小 抑菌濃度不超過12 μΜ。值得注意的是，敏感菌株中，大腸埃希菌13Α10022、大腸埃希菌 13U1780和肺炎克雷伯菌13Α13361為臨床分離的多藥物耐受病原體。
[0028] 表1黑眶蟾蜍抗菌肽的最小抑菌濃度

【權(quán)利要求】
1. 一種黑眶蟾蜍抗菌肽，其特征在于：所述黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述黑眶蟾蜍抗菌肽的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 權(quán)利要求1所述的黑眶蟾蜍抗菌肽在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/04GK104119434SQ201410307750
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】宋玉竹, 王梅, 孫鹥, 劉娃, 張阿梅, 韓芹芹, 張金陽 申請人:昆明理工大學(xué)