一種桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法及應(yīng)用，可有效解決桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備及桃仁多糖在制備增強免疫力的藥物和保健品中的應(yīng)用和桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制備抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑及化妝品中的應(yīng)用的問題，制備的桃仁多糖在制備增強免疫力的藥物和保健品中的應(yīng)用，制備的桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制備抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑及化妝品中的應(yīng)用，本發(fā)明制備方法簡單，易操作，方法簡單，原料豐富，產(chǎn)品應(yīng)用面廣，以桃仁為原料同時制備桃仁蛋白、桃仁多糖及桃仁低聚糖，開發(fā)了桃仁藥材的應(yīng)用范圍，開拓了桃仁蛋白、桃仁多糖及桃仁低聚糖的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法及應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica(L. )Batsch或山桃Prusua davidiana(Carr. )Franch.的干燥成熟種子。具有活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘的功效，臨 床用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，肺癰腸癰，跌撲損傷，腸燥便秘，咳嗽氣喘。桃仁中含有多種活 性成分，現(xiàn)在對其活性成分（或化學(xué)成分）的研究主要集中在桃仁蛋白、多糖、桃仁苷、野櫻 甙、油脂等成分，如何解決一體化制備桃仁蛋白、多糖及其他成分，如桃仁低聚糖未見有公 開報導(dǎo)，也未見有對桃仁低聚糖的研究的公開報導(dǎo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種桃仁蛋白、多 糖及低聚糖的制備方法及應(yīng)用，可有效解決桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備及桃仁多糖在 制備增強免疫力的藥物和保健品中的應(yīng)用和桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制備抗氧化的藥物、 保健品、食品添加劑及化妝品中的應(yīng)用的問題。
[0004] 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法，包括以下步 驟：
[0005] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量5-10倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取 器中提取l_3min，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量8-20倍的pH為10的NaOH溶 液，40°C _55°C水浴浸泡l_3h，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清 液備用，得沉淀物，沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白；
[0006] (2)取步驟⑴中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心15min， 40°C -55°C減壓濃縮至比重為1.05-1. 12的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80%，靜置 12h，離心，上清液備用，底部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物 中的無水乙醇，最后用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50°C下減壓干燥，得桃仁多糖；
[0007] (3)取步驟（2)中離心后所得的上清液，35°C _50°C減壓揮盡乙醇，4000r/min離心 15min，得上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過大孔吸附樹脂 柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得桃仁低聚 糖；所述的大孔吸附樹脂為弱極性大孔吸附樹脂，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由陽離子 交換樹脂與陰離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的；所述的弱極性大孔吸附樹 脂為AB-8、D-101、CAD-45、DA-201、HPD-400、SP-825型大孔吸附樹脂中的一種；陽離子交換 樹脂為強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，陰離子交換樹脂為強堿性苯乙烯系陰離子交換樹 脂。實現(xiàn)以桃仁為原料制備桃仁蛋白、多糖及低聚糖，并有效用于制備增強免疫力的藥物、 保健品、美白類化妝品和食品添加劑，實現(xiàn)了桃仁多糖在制備增強免疫力的藥物和保健品 中的應(yīng)用，桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制備抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑及化妝品中的 應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明制備方法簡單，易操作，方法簡單，原料豐富，產(chǎn)品應(yīng)用面廣，以桃仁為原料 同時制備桃仁蛋白、桃仁多糖及桃仁低聚糖，開發(fā)了桃仁藥材的應(yīng)用范圍，用于制備增強免 疫力和抗氧化的藥物、保健品、食品添加劑和美白類化妝品，開拓了桃仁蛋白、桃仁多糖及 桃仁低聚糖的應(yīng)用價值，具有很好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益，是中藥上的巨大創(chuàng)新。

【具體實施方式】
[0009] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體情況作詳細(xì)說明。
[0010] 本發(fā)明在具體實施中，可由以下實施例給出：
[0011] 實施例1
[0012] 本發(fā)明在具體實施中，包括以下步驟：
[0013] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量8倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取器 中提取3min，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量20倍的pH為10的NaOH溶液，55°C 水浴浸泡3h，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清液備用，得沉淀 物，沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白；
[0014] (2)取步驟⑴中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心15min，55°C減 壓濃縮至比重為1. 12的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80%，靜置12h，離心，上清液備 用，底部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后 用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50°C下減壓干燥，得桃仁多糖；
[0015] (3)取步驟（2)中離心后所得的上清液，50°C減壓揮盡乙醇，4000r/min離心 15min，得上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過AB-8型大孔 吸附樹脂柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得 桃仁低聚糖，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂與強堿性苯 乙烯系陰離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的。
[0016] 實施例2
[0017] 本發(fā)明在具體實施中，包括以下步驟：
[0018] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量10倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取 器中提取lmin，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量8倍的pH為10的NaOH溶液， 40°C °C水浴浸泡lh，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清液備用， 得沉淀物，沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白；
[0019] (2)取步驟⑴中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心15min，4(TC減 壓濃縮至比重為1. 05的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80%，靜置12h，離心，上清液備 用，底部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后 用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20°C下減壓干燥，得桃仁多糖；
[0020] (3)取步驟（2)中離心后所得的上清液，35°C°C減壓揮盡乙醇，4000r/min離心 15min，得上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過D-101型大孔 吸附樹脂柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得 桃仁低聚糖，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂與強堿性苯 乙烯系陰離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的。
[0021] 實施例3
[0022] 包括以下步驟：
[0023] (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量7. 5倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取 器中提取2min，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量15倍的pH為10的NaOH溶液， 50°C水浴浸泡2h，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清液備用，得 沉淀物，沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白；
[0024] (2)取步驟⑴中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心15min，50°C減 壓濃縮至比重為1. 10的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80%，靜置12h，離心，上清液備 用，底部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后 用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50°C下減壓干燥，得桃仁多糖；
[0025] (3)取步驟（2)中離心后所得的上清液，47°C減壓揮盡乙醇，4000r/min離心 15min，得上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過DA-201型的 大孔吸附樹脂柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥 即得桃仁低聚糖，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂與強堿 性苯乙烯系陰離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的。
[0026] 上述制備的桃仁多糖、低聚糖經(jīng)苯酚-硫酸法（常規(guī)測定方法，是公知技術(shù)）測 定，其糖含量均不低于80%。經(jīng)HPGPC法（公知技術(shù)）測定，桃仁低聚糖的分子量均在 300-2000之間。經(jīng)凱氏定氮法測定本發(fā)明制備的桃仁蛋白的含量在85%以上。
[0027] 上述僅是給出的幾個實施例，在研制中，發(fā)明人經(jīng)反復(fù)多次實驗，均取得了相同或 相近似的結(jié)果，方法科學(xué)有效，原料豐富，產(chǎn)品應(yīng)用面廣，具有實際的應(yīng)用價值，并對桃仁蛋 白、多糖及低聚糖進(jìn)行反復(fù)的試驗均取得了滿意的技術(shù)效果，有關(guān)試驗資料如下：
[0028] 桃仁多糖的免疫試驗：
[0029] 一.試驗材料
[0030] 1.試驗動物：18. 5?23g昆明種清潔劑小鼠，雌雄各半。由鄭州大學(xué)實驗動物中 心提供。
[0031] 2.實驗試藥：本發(fā)明方法制備的桃仁多糖，含量為88. 17%，瑞士染液，香菇多糖 (湖北廣仁藥業(yè)有限公司），環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），枸櫞酸鈉，氯化鈣，氯 化鈉，酒石酸鉀鈉，氯化鉀，葡萄糖，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，酚紅。
[0032] 二.試驗方法
[0033] 1.桃仁多糖對正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
[0034] 取小鼠50只，體重18. 5?23g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為5組。分別灌服小、中、大 劑量的桃仁多糖水溶液（l〇mg/ml，20mg/ml，40mg/ml ;0.21111/1(^)，香燕多糖混懸液（5mg/ ml ;0. 2ml/10g)及同體積的生理鹽水（0. 2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于7天 早上各組小鼠均腹腔注射5 %雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0. 5ml。于第7天灌胃給藥后2h，注 射5%雞紅細(xì)胞4h后，脫頸椎處死小鼠，腹腔注入漢氏液2. 5ml，輕揉小鼠腹部；然后剪開小 鼠腹部皮膚，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于試管中，混勻；吸取少許腹腔 液滴于載玻片上，液點大小約為1. 5cmX 2cm。將載玻片放在鋪有濕紗布的糖瓷盤中，37°C孵 育30min，生理鹽水沖去附著的細(xì)胞，瑞氏染液染色，自來水沖洗晾干；顯微鏡下觀察小鼠 腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬情況，并計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量5-10倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取器中 提取l-3min，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量8-20倍的pH為10的NaOH溶液， 40°C -55°C水浴浸泡l_3h，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清液 備用，得沉淀物，沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白； (2) 取步驟（1)中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心15min，40°C -55°C 減壓濃縮至比重為1.05-1. 12的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80%，靜置12h，離心，上 清液備用，底部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙 醇，最后用無水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50°C下減壓干燥，得桃仁多糖； (3) 取步驟（2)中離心后所得的上清液，35°C -50°C減壓揮盡乙醇，4000r/min離心 15min，得上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過大孔吸附樹脂 柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得桃仁低聚 糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法，其特征在于，所述的大 孔吸附樹脂為弱極性大孔吸附樹脂，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由陽離子交換樹脂與陰 離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法，其特征在于，所述的弱 極性大孔吸附樹脂為AB-8、D-101、CAD-45、DA-201、HPD-400、SP-825型大孔吸附樹脂中的 一種；陽離子交換樹脂為強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，陰離子交換樹脂為強堿性苯乙 烯系陰離子交換樹脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法，包括以下步驟： (1) 取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量8倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取器中提 取3min，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量20倍的pH為10的NaOH溶液，55°C水 浴浸泡3h，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清液備用，得沉淀物， 沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白； (2) 取步驟（1)中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心Ιδη?η,δδ?減壓濃 縮至比重為1. 12的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80 %，靜置12h，離心，上清液備用，底 部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無 水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，50°C下減壓干燥，得桃仁多糖； (3) 取步驟（2)中離心后所得的上清液，5(TC減壓揮盡乙醇，4000r/min離心15min，得 上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過AB-8型大孔吸附樹脂 柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得桃仁低聚 糖，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂與強堿性苯乙烯系陰 離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法，包括以下步驟： (1)取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量10倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取器中提 取lmin，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量8倍的pH為10的NaOH溶液，40°C °C水 浴浸泡lh，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清液備用，得沉淀物， 沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白； (2) 取步驟（1)中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心15min，4(TC減壓濃 縮至比重為1. 05的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80 %，靜置12h，離心，上清液備用，底 部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無 水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20°C下減壓干燥，得桃仁多糖； (3) 取步驟（2)中離心后所得的上清液，35°C°C減壓揮盡乙醇，4000r/min離心15min， 得上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過D-101型大孔吸附樹 脂柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得桃仁低 聚糖，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂與強堿性苯乙烯系 陰離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制備方法，包括以下步驟： (1) 取去皮的桃仁，粉碎，加桃仁重量7. 5倍的石油醚，浸泡30min，置于閃式提取器中 提取2min，過濾，藥渣揮去石油醚，晾干，加入桃仁重量15倍的pH為10的NaOH溶液，50°C 水浴浸泡2h，過濾，濾液加酸調(diào)pH至4. 5,4000r/min離心15min，濾取上清液備用，得沉淀 物，沉淀物冷凍干燥即得桃仁蛋白； (2) 取步驟（1)中濾取的上清液，加酸調(diào)pH至中性，4000r/min離心15min，5(TC減壓濃 縮至比重為1. 10的浸膏，加乙醇至溶液體積含醇量為80 %，靜置12h，離心，上清液備用，底 部沉淀物用無水乙醇洗去沉淀物中的水分，再用丙酮洗去沉淀物中的無水乙醇，最后用無 水乙醚洗去沉淀物中的丙酮，20-50°C下減壓干燥，得桃仁多糖； (3) 取步驟（2)中離心后所得的上清液，47?減壓揮盡乙醇，4000r/min離心15min，得 上清液既為桃仁低聚糖部位浸膏；將桃仁低聚糖部位浸膏依次經(jīng)過DA-201型的大孔吸附 樹脂柱、活性炭柱、陰陽離子混合床樹脂柱，最后所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得桃仁 低聚糖，陰陽離子混合床離子樹脂柱是由強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂與強堿性苯乙烯 系陰離子交換樹脂以1:1的重量比混合后裝柱制成的。
7. 權(quán)利要求1或2-6中任意一項所述方法制備的桃仁多糖在制備增強免疫力的藥物和 保健品中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1或2-6中任意一項所述方法制備的桃仁低聚糖、桃仁蛋白在制備抗氧化 的藥物、保健品、食品添加劑及化妝品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K8/97GK104042714SQ201410315742
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】劉學(xué)芳, 周悌強, 董浩然, 鄭萬春, 白燕, 李先 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院