紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及紫草素及其衍生物在制備基因治療增敏劑中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑具有相對(duì)較小的毒性；使用紫草素及其衍生物聯(lián)合基因治療進(jìn)行惡性腫瘤治療時(shí)，紫草素及其衍生物本身的抗癌作用與其增強(qiáng)的基因治療的作用疊加，可以最大發(fā)揮抗腫瘤作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]紫草(英文名:Lithospermum erythrorhizon)是中醫(yī)學(xué)常用中藥,入藥種屬及部位為紫草科植物紫草、新藏假紫草或滇紫草的根。性寒，味甘、咸；歸心、肝經(jīng)；功效:涼血止血，清熱解毒；主治:血熱壅盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷。紫草素是紫草的主要有效成分之一，分子式:C16H16O5，分子量:288.30 g/mol。紫草素具有抗炎作用，這種作用是通過(guò)抑制腫瘤壞死因子_a (TNF-a)造成的，而TNF_a是形成和持續(xù)炎癥的重要因素。另外紫草素還具有抗細(xì)菌，抗真菌，和抗HIV的作用。
[0003]基因治療(Gene therapy)是利用分子生物學(xué)方法將目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，使之表達(dá)目的基因產(chǎn)物，從而使疾病得到治療，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合而誕生的新技術(shù)。rAAV是目前基因治療領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的病毒載體，目前正在越來(lái)越多地應(yīng)用到肝癌的基因治療中。使用rAAV作為載體的研究都取得了一定的肝癌抑制效果，但并沒(méi)有確定靶向肝癌最好的rAAV血清型；而作為殺傷性治療，對(duì)肝癌細(xì)胞的獨(dú)特靶向性是至關(guān)重要的。另夕卜，臨床使用rAAV，降低用量，保證安全至關(guān)重要，怎樣將對(duì)肝癌靶向性最好rAAV感染效率最大化，目前還沒(méi)有人提出解決方案。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供紫草素及其衍生物在制備基因治療增敏劑中的應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:紫草素及其衍生物在制備基因治療增敏劑中的應(yīng)用。
[0006]所述的基因治療是指基于病毒為載體的基因治療。
[0007]所述的病毒是腺相關(guān)病毒。
[0008]所述的腺相關(guān)病毒是2型、3型、8型腺相關(guān)病毒。
[0009]所述的基因治療是以腺相關(guān)病毒為載體對(duì)肝癌的基因治療。
[0010]所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、去氧紫草素、消旋乙酰紫草素、1-甲氧基乙酰紫草素、β，β二甲基丙烯酰紫草素、2，3-二甲基戊烯酰紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、β，β - 二甲基丙烯阿卡寧、乙酰阿卡寧、β -乙酰氧基異戊酰阿卡寧、β -羥基異戊酰阿卡寧。
[0011]所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、β，β 二甲基丙烯酰紫草素。
[0012]所述的基因治療是以攜帶天花粉蛋白基因的優(yōu)化3型腺相關(guān)病毒為載體對(duì)肝癌的基因治療。
[0013]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于: 1、紫草素及其衍生物作為基因治療增敏劑具有相對(duì)較小的毒性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的常用蛋白酶體抑制劑MG132具有較高的毒性，不能應(yīng)用于臨床，硼替佐米作為一種蛋白酶體抑制劑用于臨床抗癌治療也產(chǎn)生了一定的毒副反應(yīng)，紫草素及其衍生物作為植物來(lái)源的物質(zhì)，在發(fā)揮基因治療增敏劑的作用時(shí)毒副作用較??；
2、使用紫草素及其衍生物聯(lián)合基因治療進(jìn)行惡性腫瘤治療時(shí)，紫草素及其衍生物本身的抗癌作用與其增強(qiáng)的基因治療的作用疊加，可以最大發(fā)揮抗腫瘤作用。基因治療目前最常用的載體類(lèi)型是病毒載體，其中又因非致病性而對(duì)腺相關(guān)病毒使用越來(lái)越廣泛，利用腺相關(guān)病毒的特殊靶向性治療惡性腫瘤是目前基因治療的研究熱點(diǎn)之一，在這一過(guò)程中紫草素及其衍生物作為蛋白酶體抑制劑本身就具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用，攜帶治療基因的腺相關(guān)病毒的治療作用被紫草素及其衍生物增強(qiáng)之后，可以疊加產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤作用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1.體外實(shí)驗(yàn)挑選最佳中藥單體，DMSO作為陰性對(duì)照，MG132作為陽(yáng)性對(duì)照。(A)HeLa細(xì)胞，不同藥物在多個(gè)濃度下處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV2_CMVp_hrGFP病毒，并藥物共同作用2小時(shí)，48小時(shí)后拍攝GFP照片，ImageJ軟件分析。(B)與實(shí)驗(yàn)(A)相同方法，僅測(cè)試更小濃度跨度的紫草素效果。(C)HeLa細(xì)胞，所示4種藥物在實(shí)驗(yàn)(A)中得出的最佳濃度處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并藥物共同作用2小時(shí)，48小時(shí)后拍攝EGFP照片，ImageJ軟件分析。(D)實(shí)驗(yàn)(C)細(xì)胞拍照過(guò)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。(E)HeLa細(xì)胞5，000 MOI感染rAAV2_CB_EGFP病毒，48小時(shí)后5 μ M紫草素或DMSO處理2小時(shí)，再48小時(shí)后拍攝EGFP照片，ImageJ軟件分析。
[0015]圖2.紫草素提高rAAV在肝癌細(xì)胞中的感染效率，DMSO作為陰性對(duì)照，MG132作為陽(yáng)性對(duì)照。(A) Huh7細(xì)胞，紫草素多個(gè)濃度下處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV3-CB-EGFP病毒，并藥物共同作用2小時(shí)，48小時(shí)后拍攝GFP照片，ImageJ軟件分析。(B)與實(shí)驗(yàn)(A)相同方法，僅換成rAAV2-CB-EGFP病毒。(C)Huh7細(xì)胞，紫草素采用實(shí)驗(yàn)(A)測(cè)得的最佳濃度處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV3-UF50病毒，并藥物共同作用2小時(shí),48小時(shí)后拍攝M-apple突光照片，ImageJ軟件分析。(D)實(shí)驗(yàn)(C)的細(xì)胞拍照過(guò)后進(jìn)行Fluc信號(hào)檢測(cè)。(E)紫草素化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0016]圖3.紫草素不改變AFP特異性啟動(dòng)子的rAAV3在人肝臟細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。(A)人肝細(xì)胞，紫草素多個(gè)濃度下處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV2-UF50病毒，并藥物共同作用2小時(shí)，48小時(shí)后檢測(cè)熒光素酶信號(hào)。(B)人肝細(xì)胞，紫草素多個(gè)濃度下處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV3-UF50病毒，并藥物共同作用2小時(shí)，48小時(shí)后檢測(cè)Fluc信號(hào)。(C) 5，000 Μ0Ι, rAAV3_AFP_EGFP病毒感染所示細(xì)胞，48小時(shí)后拍攝EGFP熒光照片，圖中為各組代表性照片。
[0017]圖4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證紫草素對(duì)rAAV的增強(qiáng)效果。(A)C57BL/6小鼠，腹腔注射紫草素 lmg-3mg/kg/day,第 3 天通過(guò)尾靜脈系統(tǒng)注射 rAAV8-CB-Fluc_EYFP, I X 109vgs/mouse,第90天拍攝活體熒光照片，圖為各組代表性小鼠照片。(B)實(shí)驗(yàn)(A)中各組小鼠在所示不同時(shí)間點(diǎn)拍攝活體熒光照片后，統(tǒng)計(jì)分析熒光強(qiáng)度。(C)實(shí)驗(yàn)(A)中所示兩組小鼠第90天處死，每鼠取等量肝組織提取全DNA并取三份，每份10ng qPCR檢測(cè)病毒基因組數(shù)量。
[0018]圖5.紫草素增強(qiáng)rAAV感染效率的機(jī)理。(A) Cy3染料標(biāo)記的，或未標(biāo)記的rAAV2-CB-Fluc病毒，分別2，000Μ0Ι，或20，000Μ0Ι感染HeLa細(xì)胞2小時(shí)，48小時(shí)后檢測(cè)相對(duì)Fluc信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度。(B) Cy3染料標(biāo)記的，或未標(biāo)記的rAAV2_CB_Fluc病毒，2，000Μ0Ι感染HeLa細(xì)胞，感染前I小時(shí)和感染時(shí)2小時(shí)，同時(shí)紫草素5 μ M處理或DMSO處理，感染48小時(shí)后檢測(cè)相對(duì)Fluc信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度。(C) Cy3染料標(biāo)記的rAAV2-CB_Fluc病毒感染HeLa細(xì)胞，感染前I小時(shí)和感染時(shí)2小時(shí)，同時(shí)DMSO或紫草素5 μ M或MG132 5 μ M處理，分別在感染后2小時(shí)和24小時(shí)后沖洗并固定細(xì)胞，DAPI染色細(xì)胞核，拍攝共聚焦照片。綠色:細(xì)胞核，藍(lán)色:細(xì)胞質(zhì)，紅色:Cy3。
[0019]圖6.紫草素增強(qiáng)rAAV感染效率的機(jī)理。(A) HeLa細(xì)胞，如圖所示藥物處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并藥物共同作用2小時(shí)。感染24小時(shí)后分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，分別提取全DNA，用EGFP基因特異性引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)。(B)HeLa細(xì)胞，如圖所示藥物處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并藥物共同作用2小時(shí)。24小時(shí)后提取細(xì)胞總RNA，用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并用EGFP特異性引物進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)。(C)HeLa細(xì)胞，如圖所示藥物處理I小時(shí)，然后5，000 MOI感染rAAV2-CB-EGFP病毒，并藥物共同作用2小時(shí)。2小時(shí)后收集獲取細(xì)胞并裂解，用泛素蛋白特異性抗體做western blot，GAPDH作為參照。(D) C57BL/6小鼠，尾靜脈注射rAAV8_UF50病毒，I X 109vgs/mouse, 100天后腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day,連續(xù)5天，并在如圖所示時(shí)間點(diǎn)拍攝活體熒光照片并統(tǒng)計(jì)分析。
[0020]圖7.紫草素對(duì)肝細(xì)胞癌的體外抑制作用。(A)所示細(xì)胞系同樣數(shù)量培養(yǎng)在96孔板中，用等倍稀釋的紫草素作用24小時(shí)，CCK-8試劑盒檢測(cè)活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，未加藥組設(shè)為100%。(B)所示細(xì)胞系同樣數(shù)量培養(yǎng)在96孔板中，用等倍稀釋的紫草素作用24小時(shí)，CCK-8試劑盒檢測(cè)活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，未加藥組設(shè)為100%。(C)實(shí)驗(yàn)(B)同樣處理的細(xì)胞用LDH試劑盒檢測(cè)殺傷細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，加細(xì)胞裂解液組設(shè)為100%。
[0021]圖8.紫草素對(duì)肝細(xì)胞癌的體內(nèi)抑制作用。(A) NSG小鼠，右前肢腋窩皮下種植Huh7-Fluc腫瘤,待腫瘤生長(zhǎng)至5mmX 5mm時(shí)開(kāi)始腹腔注射紫草素lmg/kg/day,連續(xù)注射10天后活體熒光成像儀圖片。(B)實(shí)驗(yàn)A的小鼠體內(nèi)腫瘤在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度量化數(shù)據(jù)。(C)停止用藥后第5天兩組小鼠的體重。
[0022]圖9.紫草素對(duì)小鼠正常臟器的影響。健康C57BL/6雄性小鼠15只，如圖隨機(jī)分為三組，腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day，或紫草素4mg/kg/day，連續(xù)注射10天后處死小鼠，檢測(cè)血清 AST (A)、ALT (B)、ALP (C)值。
[0023]圖10.試驗(yàn)中使用的rAAV基因組圖譜及TCS基因序列。(A) rAAV-CBAp-FIuc,rAAV-CBAp-EGFP，rAAV-AFPp-TCS病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖。(B ) TCS基因原始核苷酸序列，起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)分別用綠色和紅色標(biāo)記。(C)添加旗幟標(biāo)簽的(Flag-tagged)TCS基因。Eco TtV和ZAo I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(加粗斜體)用于克隆化學(xué)方法合成的TCS基因，下劃線字體為包含終止密碼子(TAA)的旗幟標(biāo)簽序列。
[0024]圖11.TCS基因載體的構(gòu)建。(A)質(zhì)粒pdsAAV-AFP-EGFP圖譜；(B)質(zhì)粒pdsAAV-AFP-TCS-Flag 圖譜；(C)質(zhì)粒 pdsAAV-AFP-TCS-TAA 圖譜。
[0025]圖12.天花粉基因體外對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。(A)如圖所示質(zhì)粒PEI方法轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，48小時(shí)后CCK-8試劑盒檢測(cè)存活細(xì)胞相對(duì)量；(B)如圖所示病毒100，000Μ0Ι感染Huh7細(xì)胞，48小時(shí)后CCK-8試劑盒檢測(cè)存活細(xì)胞相對(duì)量。
[0026]圖13.攜帶TCS基因的rAAV3對(duì)肝癌的體內(nèi)殺傷作用。(A)第O天荷Huh7_Fluc腫瘤的小鼠尾靜脈注射病毒5 X 101° vgs/mouse,從第O天到第11天多次活體成像儀檢測(cè)腫瘤表達(dá)的Fluc信號(hào)；(B)第8天各組具有代表性的小鼠照片；(C)第11天處死小鼠后檢測(cè)血清中AST，ALT濃度。
[0027]圖14.紫草素與攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3共同治療肝癌的體內(nèi)效果。如圖所示組別在第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP病毒或rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag或PBS，并在第O天到第11天腹腔注射紫草素或PBS，活體成像儀在圖示的時(shí)間拍攝小鼠全身活體照片讀取并統(tǒng)計(jì)腫瘤部位Fluc信號(hào)。
[0028]圖15.聯(lián)合治療終點(diǎn)小鼠腫瘤直徑。圖9試驗(yàn)中小鼠第11天處死并解剖獲取腫瘤，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑。
[0029]圖16.紫草素與攜帶TCS基因的rAAV3共同治療肝癌對(duì)小鼠的肝功能影響。圖9試驗(yàn)中小鼠第11天處死后取血檢測(cè)血清中AST (A)、ALT (B)濃度。
[0030]圖17.乙酰紫草素對(duì)rAAV感染效率的影響。
[0031]圖18.β，β -二甲基丙烯酰紫草素對(duì)rAAV感染效率的影響。
[0032]【【具體實(shí)施方式】】
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明。
[0033]實(shí)施例1紫草素對(duì)rAAV感染效率的影響一、實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.化合物，質(zhì)粒，引物
高效液相層析(HPLC)級(jí)別的雷公藤紅素、扁蒴藤素、紫草素、姜黃素、芹黃素、白楊素、木禪草素和丹酌.酸 B 鹽購(gòu)于 Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA,溶解于 DMSO, 5mg/ml濃度作為儲(chǔ)存液。HPLC 級(jí)別的 MG132 購(gòu)于 Calb1chem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany,5mg/ml 溶解于 DMSO。HPLC 級(jí)別的硼替佐米購(gòu)于 Santa Cruz B1technology, Inc.SantaCruz, USA, 5m g/ml 溶解于 DMSO。
[0034]pHelper 質(zhì)粒購(gòu)于 Agilent Technologies, Santa Clara, USA。pdsAAV-CBAp-EGFP和pAAV-CBAp-Fluc，制備方法如下:利用分子克隆技術(shù)，將雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(CBAp)驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)或熒光素酶基因(Fluc)嵌入到攜帶AAV2的末端重復(fù)序列(ITR)的質(zhì)粒中，使嵌入的基因位于兩個(gè)ITR之間。pACG2質(zhì)粒和 pdsAAV-CBAp-Fluc 質(zhì)粒分別由 Wu 等(Wu J, Zhao ff, Zhong L, Han Z, Li B, Ma W,Weigel-Kelley KA, Warrington KH, Srivastava A: Self-complementary recombinantadeno—associated viral vectors: packaging capacity and the role of rep proteinsin vector purity.Human gene therapy 2007, 18 (2): 171-182.),和 Wang 等(Wang Y,Ling C, Song L, Wang L, Aslanidi GV, Tan M, Ling C, Srivastava A: Limitat1ns ofencapsidat1n of recombinant self-complementary adeno—associated viral genomesin different serotype capsids and their quantitat1n.Human gene therapymethods 2012，23 (4): 225-233.)構(gòu)建。所有質(zhì)粒均在使用之前進(jìn)行了測(cè)序。
[0035]引物EGFP-F(5 ' -AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3 ' ) (SEQ ID N0.1)和 EGFP-R(5' -TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3' ) (SEQ ID N0.2)用來(lái)做逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qTR-PCR)檢測(cè)。
[0036]2.細(xì)胞系培養(yǎng)
人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，胚胎腎細(xì)胞系HEK293，和肝癌細(xì)胞系Huh7，均購(gòu)于AmericanType Culture Collect1n (Manassas, VA,USA)。上述細(xì)胞均由完全 Dulbecco，s modifiedEagle medium 培養(yǎng)液(C-DMEM, Mediatech Inc.Herndon, USA)加 10% 熱滅活的胎牛血清(FBS, Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA), 1% 青霉素和鏈霉素(Lonza,ffalkersville, MD)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在加濕，37°C，5% CO2環(huán)境下，需要時(shí)用胰酶-EDTA混合液(LonZa，Walkersville，MD，USA)室溫消化2-5分鐘，C-DMEM沖懸后傳代培養(yǎng)。人原代肝細(xì)胞購(gòu)于 Triangle Research Labs (Research Triangle Park, North Carolina, USA),貝占壁培養(yǎng)在加濕，37°C，5% CO2環(huán)境下原代培養(yǎng)。
[0037]3.rAAV 的制備
包裝:高純度的rAAV儲(chǔ)存液由三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法制造(Ling C，Lu Y, Cheng B, McGooganKE, Gee Sff, Ma W, Li B, Aslanidi GV, Srivastava A: High-efficiency transduct1nof liver cancer cells by recombinant adeno—associated virus serotype 3 vectors.Journal of visualized experiments: JoVE 2011 (49).):
使用聚乙烯亞胺(polyethelenimine,PEI, linear, MW 25000, Polysciences, Inc.Warrington, PA，USA)將三種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞，6小時(shí)后更換細(xì)胞培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后收獲細(xì)胞,經(jīng)過(guò)3次反復(fù)凍融后用限制性內(nèi)切酶及?flzoftase (Life Technology,Grand Island, USA)酶切破壞細(xì)胞基因組DNA。
[0038]純化:碘克沙醇(1dixanol,Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis,USA)分層超高速離心法離心，然后用HiTrap SP/Q HP過(guò)濾柱(GE Healthcare,Piscataway,USA)離子交換法純化病毒顆粒，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS，Mediatech Inc.Herndon, USA)沖洗，并用150K分子量尚心分尚濃縮器濃縮。
[0039]鑒定:病毒的物理基因組由southern blot測(cè)定。方法如下:10 μ I病毒儲(chǔ)存液稀釋到 100 μ I 加入限制性內(nèi)切酶(Novagen, Darmstadt, Germany)在 37°C酶切 I小時(shí)，破壞所有病毒外殼蛋白以外DNA，加入相同體積的10mM NaOH在65°C作用30分鐘，便Benzonase酶失活并破壞外殼蛋白釋放病毒基因組DNA，并解鏈，放冰水混合物中快速冷卻。一種已知濃度且與病毒基因組相同序列的片段DNA同時(shí)相同方法解鏈。將含有DNA的溶液和進(jìn)行凝膠電泳，ssAAV基因組選擇堿性1.2%瓊脂糖凝膠，scAAV基因組選擇中性1.2%瓊脂糖凝膠。將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用Southern公布的方法(1975年)進(jìn)行檢測(cè)。先將膠在I號(hào)溶液(0.25M HCl)中進(jìn)行平衡，室溫，20分鐘；2號(hào)溶液(1M NaCl, 0.5M NaOH)，室溫，40分鐘；3號(hào)溶液(1M NaCl, 0.5M Tris-HCl)，室溫，40分鐘。在20xSSC溶液中，將膜上的 DNA 轉(zhuǎn)移到 Immobilon-NY +TM 膜(Millipore,Billerica,MA)上。經(jīng)過(guò)交聯(lián)，將膜放置在25ml雜交液(6x SSC, 100 ug/ml煮沸過(guò)的魚(yú)精蛋白DNA，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，和5x Denhardfs溶液)中，68°C，6小時(shí)預(yù)雜交。將膜放置在含有煮沸過(guò)的32P-標(biāo)記的DNA探針的雜交液中，68°C雜交18-20小時(shí)。用50ml的I號(hào)沖洗液(2x SSC,0.1% SDS)沖洗膜2次，室溫，每次15分鐘；再用50ml的2號(hào)沖洗液(0.1xSSC, 0.1% SDS)沖洗2次，68。。，30分鐘,在-70°C，使用 B1MAX MRTM X-ray 感光膠片(Kodak，Rochester，NY)曝光。
[0040]滴度測(cè)定:滴度由定量DNA slot blot方法測(cè)得，具體如下:高度純化的rAAV的物理顆粒滴度由定量DNA slot blot方法檢測(cè)。10 μ I病毒儲(chǔ)存液稀釋到100 μ I加入Benzonase限制性內(nèi)切酶在37°C酶切I小時(shí)，破壞所有病毒外殼蛋白以外的DNA，加入相同體積的10mM NaOH在65°C作用30分鐘，使此瓜ase酶失活并破壞外殼蛋白釋放病毒基因組DNA，并解鏈。然后放冰水混合物中快速冷卻。一種已知濃度且含有與病毒基因組相同序列的質(zhì)粒DNA同時(shí)相同方法解鏈。所有解鏈的DNA兩倍稀釋法點(diǎn)樣到Immobilon-NY +TM膜上(Millipore，Bedford，MA)。經(jīng)過(guò)交聯(lián)，將膜放置在 25ml 雜交液(6x SSC, 100 ug/ml煮沸過(guò)的魚(yú)精蛋白DNA，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)，和5x DenhardtJ s溶液)中，68°C，6小時(shí)預(yù)雜交。將膜放置在含有煮沸過(guò)的32P-標(biāo)記的DNA探針的雜交液中，68V雜交18-20小時(shí)。50ml的I號(hào)沖洗液(2xSSC,0.1% SDS)沖洗膜2次，室溫，每次15分鐘；再用50ml的2號(hào)沖洗液(0.1xSSC, 0.1% SDS)沖洗 2 次，68°C，30 分鐘，在-70°C，使用 B1MAX MRTM X-ray感光膠片(Kodak, Rochester, NY)曝光。
[0041]4.篩選對(duì)rAAV感染效率增強(qiáng)效果最好的中藥單體
rAAV體外感染:細(xì)胞放置于普通96孔板，C-DMEM培養(yǎng)液中，5，000或10，000個(gè)細(xì)胞每孔。24小時(shí)后，細(xì)胞被空白處理或用相關(guān)藥物處理I小時(shí)，rAAV在C-DMEM中感染細(xì)胞2小時(shí)，同時(shí)伴有或不伴有相關(guān)的藥物處理。PBS沖洗細(xì)胞，并換C-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。感染48小時(shí)之后進(jìn)行熒光檢測(cè)、熒光素酶信號(hào)檢測(cè)或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
[0042]熒光顯微鏡檢測(cè):兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次4個(gè)重復(fù)孔，拍照后使用ImageJ軟件定量分析。轉(zhuǎn)基因強(qiáng)度由統(tǒng)計(jì)整個(gè)視野的熒光像素?cái)?shù)來(lái)判斷。
[0043]熒光素酶信號(hào)檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)并處理于白色底部透明96孔板中(Corning，cat#3610, Tewksbury, MA, USA),按說(shuō)明書(shū)加入 Bright-Glo ?突光素酶檢測(cè)試劑(PromegaCorporat1n, Madison, WI, USA),使用 Fluoroskan Ascent FL 光度計(jì)(Thermo FisherScientific, USA)檢測(cè)各孔熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度。
[0044]流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):6孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物處理后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并用含2%FBS的PBS沖懸細(xì)胞，離心棄上清再用含2%FBS的PBS沖懸細(xì)胞，離心 _ 沖懸 2 次。FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson B1sciences,San Jose, CA，USA)分析熒光細(xì)胞數(shù)量、比例。
[0045]5.檢測(cè)不同中藥單體的細(xì)胞毒性
細(xì)胞存活量分析:細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 (Cell Counting Kit-8 CCK-8, DojindoMolecular Technologies, Gaithersburg, USA)被用來(lái)評(píng)價(jià)存活的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞放置在96孔板，C-DMEM培養(yǎng)液中，5，000個(gè)細(xì)胞每孔，24小時(shí)后空白處理或相關(guān)藥物在不同濃度處理，從0.16 μ Mo I/L到20 μ Mol/L。CCK-8溶液按照制造商推薦的方法加入每個(gè)孔中。相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4小時(shí)后，用VERSAmax可調(diào)節(jié)微板檢測(cè)器(Sunnyvale，CA，USA)檢測(cè)450nm峰值下的吸光度。
[0046]6.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機(jī)理
提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR):使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN，Gaithersburg, USA)獲取全 RNA, Reverse Transcript1n 系統(tǒng)(Promega, Fitchburg, USA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后使用 SYBR GreenER qRT-PCR SuperMix for iCycIer (Life Technology,Grand Island,USA)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。中性膠分離的銳利的S28和18S rRNA條帶為完整的細(xì)胞RNA。
[0047]7.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機(jī)理
細(xì)胞質(zhì)核分離:6孔板每孔收集的細(xì)胞用175μ I預(yù)冷的RLN緩沖液(50 mmol/LTris-HCl,pH 8.0,140 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L MgCl2 和0.5% Nonidet P_40)輕輕沖懸細(xì)胞。渦旋震蕩樣本10秒，放置冰上5分鐘，300 g離心2分鐘。收集上清液作為細(xì)胞質(zhì)部分，沉淀作為細(xì)胞核部分。用western blot檢測(cè)細(xì)胞不同部分的純度,抗體如下:SantaCruz B1technology公司相關(guān)抗體和適合的二抗:抗IkB多克隆抗體(C_21)(細(xì)胞質(zhì)部分)和antilamin B多克隆抗體(C-20)(細(xì)胞核部分)。
[0048]DNA 提取:使用 PureLink Genomic DNA Mini 試劑盒(Life Technology, GrandIsland, USA)從全細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或動(dòng)物組織中抽取全DNA，使用NanoDrop Lite分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，USA)測(cè)定DNA濃度，稀釋后每個(gè)qPCR反應(yīng)體系加入300ng DNA并應(yīng)用病毒基因組特異性引物來(lái)檢測(cè)病毒基因組DNA數(shù)量。
[0049]8.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機(jī)理
Western blot分析:二燒基硫酸鈉(SDS), 1% Nonidet P-40,0.25%脫氧膽酸鈉和
Immol/L乙二胺四乙酸加蛋白酶抑制劑混合物，I mmol/L NaF和I mmol/L Na3VO4)裂解細(xì)胞。使用Bradford試劑(B1-Rad, Hercules, USA)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并將所有蛋白質(zhì)濃度均一化，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣本，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上(B1-Rad，Hercules, USA)，將膜與相關(guān)的抗體在4°C孵育過(guò)夜。然后將膜與辣根過(guò)氧化物酶共軛二抗(GE Healthcare, Piscataway, USA)孵育，用增強(qiáng)化學(xué)突光底物(MEMD Millipore,Darmstadt, Germany)檢測(cè)。所有的膜都經(jīng)過(guò)洗脫之后進(jìn)行了抗-甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體的再次檢測(cè)，作為點(diǎn)樣參照。抗GAPDH抗體購(gòu)于Thermo Scientific，USA，抗-泛素多克隆抗體購(gòu)于 Santa Cruz B1technology, Inc.Santa Cruz, USA。
[0050]9.分析中藥單體提高rAAV感染效率的機(jī)理
共聚焦顯微鏡檢測(cè)rAAV在細(xì)胞內(nèi)位置:Cellmask Orange plasma membrane染料購(gòu)于 Life Technology, Grand Island, USA。單次反應(yīng) Cy3 染料購(gòu)于 GE HealthcareB1-Sciences, Pittsburgh, USA。將 rAAV 保存液加入 Microcon YM-100 (EMD MilliporeCorporat1n, Billerica, MA, USA)離心過(guò)濾器按說(shuō)明書(shū)濃縮，將濃縮的rAAV保存液與Cy3染料室溫孵育，并不斷震蕩。使用20K MWCO Slide-a-Lyzer MINI透析單元(ThermoFisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA)按說(shuō)明書(shū)透析。將透析產(chǎn)物加入 MicroconYM-100離心過(guò)濾器再次過(guò)濾，即獲得Cy3染色的rAAV。用Flurodish細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)(WorldPrecis1n Instruments C0.Sarasota, FL, USA)培養(yǎng)細(xì)胞，C-DMEM, 5，000 個(gè)細(xì)胞每盤(pán)。感染Cy3標(biāo)記的rAAV，2或24小時(shí)后PBS沖洗，4%多聚甲醛37°C 10分鐘固定，再用PBS沖洗，用 20 μ g/ml DAPI (4' ,6-Diamidino-2_Phenylindole, Dihydrochloride, Sigma-AldrichC0.LLC, St.Louis，USA) 37。。10分鐘染色細(xì)胞核，再換成PBS，用Leica TCS SP5共聚焦顯微鏡63x油浸物鏡觀察并拍照。
[0051]10.rAAV體內(nèi)感染效率的檢測(cè)及分析
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由美國(guó)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并且按照佛羅里達(dá)大學(xué)(Gainesville，F(xiàn)L, USA)或上海第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)規(guī)范進(jìn)行操作。6_10周鼠齡，體重 15_20g 的 nonobese diabetic/severe combined immunodeficient gamma (NSG)或C57BL/6，雄性或雌性小鼠購(gòu)于Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor, ME, USA)，喂養(yǎng)在佛羅里達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院(Gainesville，F(xiàn)L, USA)，室溫，小鼠自由取水取食。
[0052]rAAV體內(nèi)感染與熒光素酶信號(hào)分析:對(duì)小鼠進(jìn)行rAAV尾靜脈注射，或直接腫瘤內(nèi)注射。對(duì)于熒光報(bào)告基因，注射病毒8周之后獲取小鼠肝臟，然后對(duì)每個(gè)肝葉切片再用熒光顯微鏡觀察。對(duì)于Fluc報(bào)告基因，先對(duì)小鼠稱重計(jì)算獲得底物注射劑量，然后腹腔注射按 5 mg/mL 稀釋在 PBS 中的 D-1uciferin-K+ salt (Caliper Life Sciences, Hopkinton,USA)底物,4 mg/kg體重,并且麻醉小鼠,用裝備冷卻電子稱合器的Xenogen活體成像儀(Xenogen,Alameda, USA)拍攝突光素酶照片。信號(hào)密度用相機(jī)控制軟件Living Image統(tǒng)計(jì)，單位為光子/秒/平方厘米/球面度(p/s/cmVsr)。
[0053]11.統(tǒng)計(jì)
結(jié)果以中位數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P〈0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0054]二、結(jié)果
1.紫草素對(duì)rAAV感染效率的影響
根據(jù)已有的報(bào)道，本發(fā)明選擇了共8種中藥單體提取物，分別是雷公藤紅素(Celastrol)、扁蒴藤素(Pristemerin)、紫草素(Shikonin)、姜黃素(Curcumin)、療黃素(Apigenin)、白楊素(Chrysin)、木禪草素(Luteolin)和丹酌.酸 b (Salvianolic acid b),測(cè)試了它們?cè)贖eLa細(xì)胞中對(duì)rAAV2_CMVp_hrGFP感染的增強(qiáng)作用，發(fā)現(xiàn)其中紫草素的效果最佳[圖1.A]。圖中紫草素從2.5 μ M組到5 μ M組的轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率有一個(gè)突然的提高，為了進(jìn)一步驗(yàn)證其濃度依賴性的真實(shí)性，又檢測(cè)了紫草素從2.5 μ M到6 μ M更小濃度階梯變化對(duì)rAAV2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率影響，證實(shí)了之前實(shí)驗(yàn)的可信性[圖1.B]。另外，更換了包含另外一種報(bào)告基因的rAAV2-CB-EGFP病毒，選取前面實(shí)驗(yàn)中效果最好的4種中藥單體提取物的最佳濃度再次檢測(cè)，紫草素的效果仍然最強(qiáng)[圖1.C]。此外流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到了同樣的結(jié)果[圖1.D]。
[0055]我們的目標(biāo)是用篩選出來(lái)最優(yōu)的中藥單體聯(lián)合rAAV3治療肝癌，所以接下來(lái)測(cè)試了紫草素[圖2.E]在人肝癌細(xì)胞系——Huh7中對(duì)rAAV3-CB-EGFP感染效率的增強(qiáng)作用及濃度依賴性[圖2.A]，結(jié)果顯示紫草素仍然具有顯著的增強(qiáng)作用，但最佳濃度與在HeLa細(xì)胞系中有所區(qū)別。同樣在Huh7細(xì)胞系中，同樣濃度的紫草素也可以增強(qiáng)rAAV2-CB-EGFP的感染效率[圖2.B]。然后選取最佳濃度的紫草素作用于Huh7細(xì)胞系，換另外一種包含兩種報(bào)告基因的rAAV3-UF50，并檢測(cè)了兩種報(bào)告基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示兩種報(bào)告基因趨勢(shì)相同，并與之前實(shí)驗(yàn)的增強(qiáng)趨勢(shì)相同[圖2.C，圖2.D]。
[0056]rAAV2在正常小鼠體內(nèi)靶向肝臟最明顯，而rAAV3在正常小鼠體內(nèi)幾乎不靶向任何器官。使用攜帶殺傷基因rAAV治療肝癌要避免殺傷正常肝臟細(xì)胞，接下來(lái)檢測(cè)了購(gòu)于三角研究實(shí)驗(yàn)室有限責(zé)任公司(Triangle Research Labs, LLC)的2位臨床捐贈(zèng)者的人肝臟細(xì)胞。首先用rAAV2-UF50病毒感染，紫草素在一定濃度可以明顯增強(qiáng)感染效率[圖3.A]。rAAV3本身對(duì)肝細(xì)胞感染能力較弱，用攜帶CB啟動(dòng)子加Fluc基因的rAAV3_UF50病毒感染人肝臟細(xì)胞效率較低，與紫草素聯(lián)合應(yīng)用有一定提高，但與rAAV2相比有顯著差距[圖
3.B]。攜帶AFP啟動(dòng)子加EGFP基因的雙鏈rAAV3可以高效感染Huh7細(xì)胞，但感染人肝細(xì)胞后不能檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因表達(dá)，即使與紫草素聯(lián)用也無(wú)法檢測(cè)到綠色熒光[圖3.C]。這說(shuō)明攜帶AFP特異性啟動(dòng)子基因的rAAV3在體外可以選擇性的感染肝癌細(xì)胞系而不感染正常人肝細(xì)胞，并且紫草素不能增加這種rAAV3對(duì)人肝細(xì)胞的感染效率。至此，得出的結(jié)論是:紫草素作用于多種細(xì)胞時(shí)可以增強(qiáng)多種不同血清型rAAV的體外感染效率，但對(duì)攜帶AFP特異性啟動(dòng)子的rAAV3，并不能在人肝臟細(xì)胞增強(qiáng)其感染效率，用于針對(duì)肝癌的靶向性基因治療相對(duì)安全。
[0057]2.紫草素對(duì)rAAV體內(nèi)感染效率的影響
rAAV8在體外幾乎不能感染任何細(xì)胞，但其對(duì)小鼠肝臟的體內(nèi)感染效率要遠(yuǎn)高于其他任何rAAV血清型。為了檢測(cè)紫草素在體內(nèi)能否增強(qiáng)感染效率已經(jīng)很高的rAAV8，這次選用攜帶 Fluc 基因的 rAAV8-CB-Fluc-EYFP，I X 109vgs/mouse,尾靜脈注射 C57BL/6 品系小鼠，并在注射病毒的當(dāng)天及前后2天，共5天連續(xù)腹腔注射紫草素lmg?3mg/kg/day，然后在不同時(shí)間段用活體成像儀拍攝小鼠照片[圖4.A]，并量化分析[圖4.B]。數(shù)據(jù)顯示紫草素Img組小鼠肝臟報(bào)告基因表達(dá)量在30天時(shí)開(kāi)始顯著性高于對(duì)照組，在90天時(shí)Img組和2mg組均顯于對(duì)照組(P〈0.05)。說(shuō)明紫草素可以在體內(nèi)提高rAAV8的感染效率。第90天處死小鼠并獲取DMSO組和紫草素Img組小鼠的肝組織，提取全DNA后qPCR檢測(cè)rAAV8病毒基因組數(shù)量[圖4.C]，紫草素Img組明顯高于DMSO組。這說(shuō)明紫草素可以幫助rAAV病毒基因組DNA更多保留在其靶器官細(xì)胞中，也進(jìn)一步驗(yàn)證了體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0058]實(shí)施例2紫草素增強(qiáng)rAAV感染效率的機(jī)理 1.紫草素體外增強(qiáng)rAAV感染效率的機(jī)理
首先設(shè)計(jì)用Cy3染料標(biāo)記rAAV2-CB-Fluc的外殼蛋白，然后用萊卡TCS SP5共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記后的rAAV2-CB-Fluc-Cy3病毒外殼在HeLa細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。正式觀察之前，先檢測(cè)了標(biāo)記后的rAAV2-CB-Fluc-Cy3病毒的生物活性，感染HeLa細(xì)胞，高劑量組和低劑量組的報(bào)告基因表達(dá)量都可以檢測(cè)到，但比同等劑量的未標(biāo)記組有明顯降低[圖5.A]；另外，又檢測(cè)了紫草素對(duì)rAAV2-CB-Fluc-Cy3感染效率的影響，結(jié)果顯示紫草素仍然可以顯著增強(qiáng)其感染效率[圖5.B]，說(shuō)明Cy3染料標(biāo)記對(duì)rAAV生物活性有一定負(fù)影響，但可以接受。然后用rAAV2-CB-Fluc-Cy3感染HeLa細(xì)胞2小時(shí)和24小時(shí)，并用藥物干預(yù)，觀察rAAV2-CB-Fluc-Cy3外殼在不同時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。圖片顯示在紫草素和MG132作用下，細(xì)胞內(nèi)rAAV外殼量略微更多，并且更多地聚集在細(xì)胞核周?chē)?，但很少進(jìn)細(xì)胞核[圖
5.C]。
[0059]下一步，檢測(cè)了細(xì)胞感染rAAV后，病毒基因組DNA在細(xì)胞質(zhì)部分和細(xì)胞核部分比例的情況。rAAV2-CB-EGFP病毒感染24小時(shí)后，分離HeLa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，然后從兩部分提取全部DNA，做qPCR檢測(cè)病毒基因組DNA數(shù)量，可以看到紫草素和MG132處理過(guò)后，HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)的病毒基因組DNA數(shù)量與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)病毒基因組DNA數(shù)量的比例都顯著高于單純病毒感染組。這說(shuō)明紫草素可以幫助病毒基因組更多地進(jìn)核[圖6.A]。本發(fā)明還檢測(cè)了總細(xì)胞內(nèi)病毒基因組DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的數(shù)量，同樣是rAAV2_CB_EGFP病毒感染HeLa，24小時(shí)后提取細(xì)胞總RNA，用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并用病毒基因組特異性引物進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)[圖6.B]。圖中可以看出不同濃度紫草素組的細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)mRNA數(shù)量比DMSO組都有提高，而且從2.5μ M到5μ M有一個(gè)明顯的大幅度升高，這也跟報(bào)告基因的蛋白表達(dá)量的趨勢(shì)是一致的[圖1.Α]。以上都是從增加感染效率的方面驗(yàn)證紫草素對(duì)rAAV的增強(qiáng)作用，接下來(lái)檢測(cè)了紫草素對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體通路的影響作用。HeLa細(xì)胞被紫草素或MG132處理過(guò)后，感染rAAV2_CB_EGFP病毒，2小時(shí)后收集全細(xì)胞，并裂解細(xì)胞做western blot，圖片中可以看到HeLa細(xì)胞被紫草素和MG132處理過(guò)后，全細(xì)胞的泛素蛋白含量明顯增高[6.C]，提示處理過(guò)這些藥物之后細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體對(duì)泛素化蛋白的降解作用被抑制。而且紫草素各組隨著用藥濃度的提高，泛素化蛋白的累計(jì)也逐步增多，有濃度依賴性。
[0060]2.紫草素體外、體內(nèi)增強(qiáng)rAAV感染效率的作用階段
為了明確紫草素是否能幫助已經(jīng)由rAAV介導(dǎo)表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)一步增加蛋白質(zhì)表達(dá)量，用rAAV2-CB-EGFP病毒感染HeLa細(xì)胞48小時(shí)后再用紫草素處理細(xì)胞，再過(guò)48小時(shí)后觀察，GFP熒光強(qiáng)度沒(méi)有顯著變化[圖1.E]。說(shuō)明紫草素對(duì)rAAV轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增強(qiáng)作用發(fā)生于病毒感染早期。
[0061]除了與rAAV同時(shí)給藥，我們還測(cè)試了在rAAV之后給藥。C57BL/6正常小鼠尾靜脈注射rAAV8-UF50病毒，I X 109vgs/mouse, 100天之后，按照肝臟Fluc強(qiáng)度平均分成兩組(每組5只)，分別腹腔注射DMS0，或紫草素lmg/kg/day，連續(xù)5天，然后多次拍攝活體熒光照片，F(xiàn)luc信號(hào)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[圖6.D]。說(shuō)明rAAV感染小鼠穩(wěn)定表達(dá)蛋白質(zhì)之后，注射紫草素并不能增加rAAV攜帶外源蛋白質(zhì)基因表達(dá)量，提示紫草素作用于rAAV感染早期。
[0062]實(shí)施例3紫草素聯(lián)合攜帶殺傷基因的rAAV3治療肝癌
天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)來(lái)源于傳統(tǒng)中藥天花粉(Radicestrichosanthis),天花粉為多年生攀援草本植物，葫蘆科括樓屬，熱後iTrichosantheskirilowii Maxim)或雙邊括樓(,ricAosafliAes rosthornii Herms)的根。天花粉的功效為:清熱瀉火，生津止渴，消腫排膿，主治:熱病口渴、消渴、黃疸、肺燥咳血、癰腫、痔漏，等。TCS由247個(gè)氨基酸殘基組成，屬于I型核糖體失活蛋白(Ribosome-1nactivatingproteins, RIP),具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗艾滋病病毒等多種藥理活性。Shaw PC等最早確認(rèn)了 TCS基因的序列，其長(zhǎng)度為870bp。本發(fā)明試圖將這段基因包裝進(jìn)rAAV3并將其與紫草素聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行治療肝癌的研究。
[0063]一、實(shí)驗(yàn)材料與方法 1.化合物，質(zhì)粒，引物
HPLC 級(jí)別的紫草素購(gòu)于 Sigma-Aldrich C0.LLC, St.Louis, USA,溶解于 DMSO, 5mg/ml 濃度作為儲(chǔ)存液。HPLC級(jí)別的MGl32 購(gòu)于 Calb1chem,Merck KGaA, Darmstadt, Germany,5mg/ml 溶解于 DMSO。
[0064]pdsAAV-AFPp-EGFP 質(zhì)粒由 Glushakova 等構(gòu)建(Mingozzi F，High KA:Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress andchallenges.Nature reviews Genetics 2011, 12 (5):341-355.)。TCS 基因由 LifeTechnologies 公司合成，基于公布的序列(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/M34858.1; T.kirilowii trichosanthin (TCS) mRNA, complete cds; GenBank:M34858.1)，并用限制性內(nèi)切酶J職I細(xì)ind JJJ進(jìn)行亞克隆，放進(jìn)pdsAAV-AFPp-EGFP質(zhì)粒中。所有質(zhì)粒均在使用之前進(jìn)行了測(cè)序。
[0065]2.細(xì)胞系培養(yǎng)
人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，胚胎腎細(xì)胞系HEK293，肝癌細(xì)胞系Huh7，慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系 K562,均購(gòu)于 American Type Culture Collect1n (Manassas, VA, USA)。新型肝癌細(xì)胞系LH86由佛羅里達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科提供(Zhu H, Dong H, Eks1glu E, HemmingA, Cao M, Crawford JM, Nelson DR, Liu C: Hepatitis C virus triggers apoptosisof a newly developed hepatoma cell line through antiviral defense system.Gastroenterology 2007, 133 (5): 1649-1659.)。以上細(xì)胞均由 C-DMEM 培養(yǎng)液加 10% 熱滅活的FBS，1%青霉素和鏈霉素(L0nZa，WalkerSVille，MD)。一種新建立的人肝癌細(xì)胞系(Hep293TT) (Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM: Noveladeno—associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United States of America2002，99(18):11854-11859.)用完全 RPMI 1640 培養(yǎng)基(Life Technologies)培養(yǎng)，添加15%熱滅活FBS和1%青霉素和鏈霉素(Lonza，Walkersville，MD)。人原代肝細(xì)胞購(gòu)于Triangle Research Labs, Research Triangle Park, North Carolina, USA 。細(xì)胞貝占壁培養(yǎng)在加濕，37°C，5% CO2 環(huán)境下，胰酶-EDTA 混合液(Lonza, ffalkersville, MD，USA)室溫消化2-5分鐘，C-DMEM沖懸后傳代培養(yǎng)。
[0066]3.rAAV 的制備同實(shí)施例1。
[0067]4.細(xì)胞存活量及殺傷量分析
LDH 細(xì)胞毒性試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham, MA, USA)被用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞殺傷情況。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 _8 (Cell Counting Kit-8 CCK-8,Dojindo MolecularTechnologies, Gaithersburg, USA)用來(lái)評(píng)價(jià)存活的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞放置在96孔板，C-DMEM培養(yǎng)液中，5，000個(gè)細(xì)胞每孔，24小時(shí)后空白處理或相關(guān)藥物在不同濃度處理，從
0.16 μ Mol/L到20 μ Mol/L。LDH試劑盒:藥物處理24小時(shí)每孔取培養(yǎng)液50 μ I轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板，每孔加50 μ I反應(yīng)混合物室溫孵育30分鐘，加入30 μ I終止溶液，然后VERSAmax可調(diào)節(jié)微板檢測(cè)器(Sunnyvale, CA, USA)檢測(cè)490nm和680nm波段的吸光度,判斷細(xì)胞毒性。CCK-8試劑盒:相同96孔板中的細(xì)胞，CCK-8溶液按照制造商推薦的方法加入每個(gè)孔中。相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4小時(shí)后,用VERSAmax可調(diào)節(jié)微板檢測(cè)器(Sunnyvale, CA, USA)檢測(cè)450nm峰值下的吸光度。
[0068]5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同實(shí)施例1。
[0069]6.人肝癌異種接種小鼠模型
6-10周鼠齡的雄性或雌性NSG小鼠右前肢腋窩皮下注射約5 X 16個(gè)Huh7或H印293TT細(xì)胞。小鼠在無(wú)菌環(huán)境中培養(yǎng)直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
[0070]7.紫草素/rAAV3體內(nèi)殺傷肝癌
rAAV體內(nèi)感染與Fluc信號(hào)分析:同實(shí)施例1。
[0071]8.統(tǒng)計(jì)
結(jié)果以中位數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P〈0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0072]二、紫草素對(duì)肝癌的殺傷作用及對(duì)臟器的影響 1.紫草素對(duì)肝細(xì)胞癌的體外殺傷作用
我們選用了 3種不同肝癌細(xì)胞系:常用的肝癌細(xì)胞系Huh7、一種在2009年初次報(bào)道的取自兒童的侵襲性肝癌細(xì)胞系ifep293TT (Chen TTj Rakheja D，Hung JYjHornsby PJj Tabaczewski P， Malogolowkin M， Feusner J， Miskevich F， SchultzRj Tomlinson GE: Establishment and characterizat1n of a cancer cell linederived from an aggressive childhood liver tumor.Pediatric blood & cancer2009，53(6):1040-1047.)、一種在2007年初次報(bào)道的從一個(gè)分化較好的人肝癌組織中分離的細(xì)胞系 LH86 (Zhu H, Dong H, Eks1glu E, Hemming A, Cao M, Crawford JM,Nelson DR, Liu C: Hepatitis C virus triggers apoptosis of a newly developedhepatoma cell line through antiviral defense system.Gastroenterology 2007,133(5): 1649-1659.)，以及正常肝臟原代培養(yǎng)細(xì)胞，在用不同濃度的紫草素處理24小時(shí)后用CCK-8試劑盒檢測(cè)了其對(duì)這些細(xì)胞的增殖抑制作用[圖7.A]。檢測(cè)結(jié)果顯示，紫草素對(duì)肝癌細(xì)胞系普遍具有增殖抑制作用，而對(duì)于原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞增殖抑制作用相對(duì)較弱，這也符合了其他人研究的發(fā)現(xiàn):人的癌細(xì)胞比正常細(xì)胞對(duì)于蛋白酶體的抑制作用更為敏感。這種現(xiàn)象也更利于將來(lái)的臨床應(yīng)用:選擇性抑制癌細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞影響較小。為了鑒別紫草素是直接殺傷肝癌細(xì)胞，還是抑制細(xì)胞增值，接下來(lái)針對(duì)Huh7和HepRG兩種細(xì)胞系進(jìn)行了 CCK-8試劑盒與LDH檢測(cè)試劑盒同時(shí)進(jìn)行的檢測(cè)比較。同樣濃度梯度的紫草素處理，CCK-8試劑盒檢測(cè)活細(xì)胞比例[圖7.B]，LDH試劑盒檢測(cè)被殺傷細(xì)胞比例[圖7.C]。結(jié)果顯示紫草素有明確的直接殺傷作用。
[0073]2.紫草素對(duì)肝細(xì)胞癌的體內(nèi)殺傷作用
選用免疫缺陷性小鼠品系，NSG小鼠，皮下種植Huh7-Fluc (攜帶Fluc基因的Huh7細(xì)胞系)腫瘤，待腫瘤生長(zhǎng)至5_X 5mm時(shí)開(kāi)始腹腔注射紫草素lmg/kg/day (實(shí)施例1中測(cè)得的小鼠體內(nèi)增強(qiáng)rAAV感染效率的最佳濃度)，連續(xù)注射2周，活體熒光成像儀圖片[圖8.A]及熒光信號(hào)[圖8.B]統(tǒng)計(jì)顯示:用藥期間，用藥組的腫瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著性低于DMSO對(duì)照組。而停止用藥后，用藥組小鼠的腫瘤熒光強(qiáng)度再次快速上升。這說(shuō)明:紫草素可以抑制NSG小鼠體內(nèi)Huh7-Fluc移植瘤的生長(zhǎng)。在停止用藥5天后對(duì)小鼠稱重，兩組間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著性差異[圖8.C]，提示治療劑量紫草素對(duì)NSG小鼠的毒性作用不明顯。
[0074]3.對(duì)正常臟器的影響。
[0075]為了解紫草素對(duì)小鼠主要臟器功能的毒性，我們進(jìn)行了一系列檢測(cè)。健康C57BL/6雄性小鼠15只，隨機(jī)分為三組:DMS0組，紫草素Img組和紫草素4mg組，同時(shí)開(kāi)始腹腔注射DMSO或紫草素lmg/kg/day,或紫草素4mg/kg/day,連續(xù)注射10天后處死小鼠,檢測(cè)血清AST、ALT、ALP值。結(jié)果顯示:AST兩個(gè)不同劑量治療組與空白對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異[圖9.A] ；ALT和ALP，Img治療劑量組與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異，4倍治療劑量組對(duì)比空白對(duì)照組均有明顯降低[圖9.B.C]。
[0076]三、攜帶天花粉蛋白基因的優(yōu)化rAAV3對(duì)肝癌的殺傷作用 1.天花粉蛋白基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的體外影響
根據(jù)已知的TCS基因序列[圖10.BKSEQ ID N0.3)，我們對(duì)其進(jìn)行了合成，為了方便檢測(cè)其合成的蛋白質(zhì)的表達(dá)，我們還在其基因序列末端加入了一個(gè)旗幟標(biāo)簽(Flag tag)[圖10.C] (SEQ ID N0.4)。
[0077]基于已有包含報(bào)告基因的rAAV基因組質(zhì)粒:含有肝癌特異性AFP啟動(dòng)子pdsAAV-AFP-EGFP [圖11.A]，我們將含有旗幟標(biāo)簽或不含有旗幟標(biāo)簽的TCS基因序列通過(guò)分子克隆技術(shù)分別替換質(zhì)粒中原有的EGFP基因，得到2種新的質(zhì)粒:pdsAAV-AFP-TCS-Flag [圖 11.B]，pdsAAV-AFP-TCS-TAA [圖 11.C]。在包裝病毒之前，我們進(jìn)行了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試上述6種質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后CCK-8試劑盒檢測(cè)存活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量[圖11.A]。結(jié)果顯示pdsAAV-AFP-TCS-Flag質(zhì)粒組細(xì)胞數(shù)量最少，與pdsAAV-CB-EGFP組相比有顯著差異(p〈0.01)。
[0078]根據(jù)轉(zhuǎn)染效果，我們選擇包裝了 rAAV3-T492V+S663V-AFP-TCS-Flag病毒來(lái)進(jìn)一步研究。此病毒由突變型外殼蛋白攜帶一個(gè)由人甲胎蛋白啟動(dòng)子(AFPp)驅(qū)動(dòng)的TCS基因。這種AFPp啟動(dòng)子理論上只有在高表達(dá)AFP的肝癌細(xì)胞內(nèi)才可以被提高效率。首先我們進(jìn)行了體外感染實(shí)驗(yàn)，100, 000Μ0Ι感染Huh7細(xì)胞48小時(shí)，然后用CCK-8試劑盒檢測(cè)判斷細(xì)胞存活量，吸光度數(shù)值提示攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3在體外對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用[圖12.B]。
[0079]2.TCS基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的體內(nèi)影響
接下來(lái)進(jìn)行了體內(nèi)試驗(yàn)。為了在腫瘤的早期，未觸摸到明顯腫瘤的時(shí)候就開(kāi)始治療，我們還構(gòu)建了一個(gè)基因修飾的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系:Huh7-Fluc，這個(gè)細(xì)胞系被一個(gè)由CBAp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Fluc基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可以隨著細(xì)胞分裂在子代細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)Fluc蛋白，這樣的細(xì)胞形成的體內(nèi)腫瘤在無(wú)法觸及的時(shí)候就可以被活體成像儀探測(cè)到。NSG小鼠右前肢腋窩皮下種植Huh7-Fluc腫瘤，2周后經(jīng)拍攝活體熒光照片判斷移植成功，小鼠分為
2組，一組尾靜脈注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS 病毒(第 O 天)，5X 101° vgs/mouse ；另外一組尾靜脈注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 病毒，5 X 101° vgs/mouse,作為對(duì)照。病毒注射的第O天、第3天、第8天和第11天，拍攝小鼠全身活體熒光照片。結(jié)果如[圖13.A]，盡管rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP組的小鼠Huh7_Fluc腫瘤漸進(jìn)地生長(zhǎng)，但rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS組小鼠的腫瘤卻被明顯抑制，直到第11天(p〈0.05)，而最大的腫瘤抑制效果出現(xiàn)在第8天(p〈0.01)。第8天各組具有代表性的小鼠全身Fluc信號(hào)照片見(jiàn)[圖13.B]。第11天處死小鼠后獲取血清檢測(cè)AST，ALT，兩組之間無(wú)明顯差別[圖13.C]，提示rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS病毒有效抑制小鼠體內(nèi)肝癌生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)肝功能無(wú)明顯損傷。
[0080]四、紫草素與攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3共同治療肝癌
1.紫草素與攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3共同治療肝癌的體內(nèi)效果接下來(lái)我們將紫草素和攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3聯(lián)合在小鼠體內(nèi)應(yīng)用，來(lái)觀察聯(lián)合抗肝癌效果。
[0081]NSG小鼠共20只，全部右前肢腋窩皮下接種Huh7_Fluc腫瘤，2周后經(jīng)活體成像儀檢測(cè)接種成功后，隨機(jī)分為5組，每組4只。分別是:①空白對(duì)照組:第O天尾靜脈注射PBS，第O天至第11天腹腔注射PBS;②非治療基因組:第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP 病毒 5 X 101° vgs/mouse,第 O 天至第 11 天腹腔注射 PBS ；③紫草素加非治療基因組:第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-EGFP病毒5 X 101°vgs/mouse,第O天至第11天腹腔注射紫草素lmg/kg/day ;④治療基因組--第O天尾靜脈注射 rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag 病毒 5 X 101° vgs/mouse,第 O 天至第 11 天腹腔注射PBS 紫草素加治療基因組:第O天尾靜脈注射rAAV3-S663V+T492V-AFPp-TCS-Flag病毒SXlOw vgs/mouse,第O天至第11天腹腔注射紫草素lmg/kg/day。病毒注射日期為第O天，在第0、3、8、11天使用活體成像儀拍攝小鼠全身照片，分析腫瘤組織中Fluc信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果如[圖14]，第11天時(shí)，非治療基因組與紫草素加非治療基因組之間有明顯差異(p〈0.05)，紫草素加非治療基因組更低，提示紫草素對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有抑制作用；另外，非治療基因組與治療基因組之間有明顯差異(P〈0.05)，治療基因組更低，提示攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有抑制作用；還有，治療基因組與紫草素加治療基因組之間也有明顯差異(P〈0.05)，紫草素加治療基因組更低，提示紫草素聯(lián)合攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3可以更大程度抑制腫瘤的生長(zhǎng)。據(jù)此得出的結(jié)論是:紫草素聯(lián)合攜帶TCS基因的外殼蛋白優(yōu)化rAAV3對(duì)小鼠體內(nèi)人肝癌種植瘤的抑制效果，比單獨(dú)使用紫草素或單獨(dú)使用攜帶TCS基因的外殼蛋白優(yōu)化rAAV3都更強(qiáng)。
[0082]第11天處死小鼠，解剖獲得腫瘤，并測(cè)量直徑，結(jié)果如[圖15]，與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的Fluc信號(hào)呈相同趨勢(shì)。
[0083]2.紫草素與攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3共同治療肝癌對(duì)小鼠的肝功能影響在上述實(shí)驗(yàn)中，第11天處死小鼠時(shí)獲得血清，并檢測(cè)AST、ALT[圖16]，各組之間均無(wú)顯著差異，提示治療劑量的紫草素和/或攜帶TCS基因的優(yōu)化rAAV3治療小鼠肝癌時(shí)，對(duì)肝功能影響不明顯。
[0084]五、結(jié)論
1.紫草素本身具有體外、體內(nèi)抗肝癌的作用；
2.TCS基因經(jīng)過(guò)介導(dǎo)具有在體外、體內(nèi)抗肝癌的作用；
3.紫草素與攜帶TCS的優(yōu)化rAAV3聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)小鼠體內(nèi)人肝癌移植瘤的抑制效果優(yōu)于紫草素或攜帶TCS的優(yōu)化rAAV3任何一個(gè)單獨(dú)使用；
4.有效治療劑量的紫草素和/或攜帶TCS基因的rAAV3不會(huì)對(duì)小鼠肝臟造成明顯損害。
[0085]通過(guò)一系列的體外和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，證明了“紫草素聯(lián)合攜帶天花粉蛋白基因的優(yōu)化3型重組腺相關(guān)病毒用于治療人肝細(xì)胞癌比單獨(dú)應(yīng)用紫草素或攜帶天花粉蛋白基因的優(yōu)化3型重組腺相關(guān)病毒能獲得更好的治療效果”，此結(jié)果為在基因治療領(lǐng)域開(kāi)展中西醫(yī)結(jié)合研究提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0086]實(shí)施例4紫草素衍生物對(duì)rAAV感染效率的影響一、實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.化合物
高效液相層析(HPLC)級(jí)別的乙酰紫草素(Acetylshikonin)，β, β-二甲基丙烯酰紫草素(β , β -Dimethylacrylshikonin),溶解于 DMS0,20mmol 濃度作為儲(chǔ)存液。
[0087]2.細(xì)胞系培養(yǎng)
人宮頸癌細(xì)胞系 HeLa,由完全 Dulbecco’ s modified Eagle medium 培養(yǎng)液(C-DMEM，Mediatech Inc.Herndon, USA)加 10% 熱滅活的胎牛血清(FBS, Sigma-Aldrich C0.LLC,St.Louis，USA)，1%青霉素和鏈霉素(Lonza，Walkersville，MD)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在加濕，37°C, 5% CO2環(huán)境下，需要時(shí)用胰酶-EDTA混合液(Lonza，ffalkersville, MD，USA)室溫消化2-5分鐘，C-DMEM沖懸后傳代培養(yǎng)。
[0088]3.rAAV體外感染
細(xì)胞放置于白色96孔板，C-DMEM培養(yǎng)液中，10，000個(gè)細(xì)胞每孔。24小時(shí)后，細(xì)胞被空白處理或用相關(guān)藥物處理I小時(shí)，rAAV2-UF50在C-DMEM中感染細(xì)胞2小時(shí)，同時(shí)伴有或不伴有相關(guān)的藥物處理。PBS沖洗細(xì)胞，并換C-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。感染48小時(shí)之后進(jìn)行熒光檢測(cè)、熒光素酶信號(hào)檢測(cè)或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
[0089]4.統(tǒng)計(jì)
結(jié)果以中位數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，兩個(gè)構(gòu)成比比較用卡方檢驗(yàn)。P〈0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0090]5.結(jié)論
請(qǐng)參見(jiàn)附圖17和附圖18，由圖示結(jié)果可知，乙酰紫草素，β，β - 二甲基丙烯酰紫草素，在一定濃度下作用細(xì)胞，可以顯著增強(qiáng)rAAV的感染效率。
[0091]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.紫草素及其衍生物在制備基因治療增敏劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因治療是指基于病毒為載體的基因治療。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的病毒是腺相關(guān)病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腺相關(guān)病毒是2型、3型、8型腺相關(guān)病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因治療是以腺相關(guān)病毒為載體對(duì)肝癌的基因治療。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、去氧紫草素、消旋乙酰紫草素、1-甲氧基乙酰紫草素、β，β二甲基丙烯酰紫草素、2，3-二甲基戊烯酰紫草素、β -羥基異戊酰紫草素、β，β - 二甲基丙烯阿卡寧、乙酰阿卡寧、β -乙酰氧基異戊酰阿卡寧、羥基異戊酰阿卡寧。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的紫草素衍生物是乙酰紫草素、β， 二甲基丙烯酰紫草素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因治療是以攜帶天花粉蛋白基因的優(yōu)化3型腺相關(guān)病毒為載體對(duì)肝癌的基因治療。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104127885SQ201410334493
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】凌昌全, 王園, 王麗娜, 張?jiān)狠x 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)