專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種針對(duì)人opn基因用于腫瘤基因治療的短的干擾核糖核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有特異性腫瘤治療的RNA干擾片段制備方法。眾議不RNAi的高度特異性和相對(duì)寬松的設(shè)計(jì)條件，使RNAi不僅可以應(yīng)用于基因功能研究，更廣泛的，RNAi將被應(yīng)用到基于基因組序列的核酸藥物研究和藥物耙標(biāo)驗(yàn)證中。截止2000年末，共計(jì)215個(gè)基于基因水平治療的藥物在研，其中87個(gè)為基因治療藥物，62個(gè)為DNA疫苗，35個(gè)為針對(duì)RNA的反義核酸和核酶。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>截止2000年底，基于基因組的在研藥物分布表由上表可見(jiàn)，RNA攻擊核酸制藥迄今為止是以反義核酸為主，核酶技術(shù)為輔的一個(gè)領(lǐng)域。1997年ISIS制藥公司的抗病毒反義核酸藥物得到美國(guó)醫(yī)藥食品管理局的批準(zhǔn)，為反義核酸藥物的發(fā)展提供了先例。近年高等動(dòng)物功能基因組研究正在以更快的速度為反義核酸藥物的發(fā)展提供靶基因，使反義核酸藥物的適用范圍從癌癥向傳染病，心血管疾病，炎癥及自身免疫等多方面擴(kuò)張。2001年8月ISIS將蛋白激酶C的反義核酸藥物以2億美元的高價(jià)轉(zhuǎn)讓給大制藥公司EliLilly,2002年4月，世界第二大反義核酸藥物公司Genta將其bc1-2的反義核酸藥物以4.8億美元的高價(jià)轉(zhuǎn)讓給大制藥公司Aventis標(biāo)志了反義核酸藥物的發(fā)展走向成熟并進(jìn)入制藥業(yè)的主流。這不僅是反義核酸的成功，而更重要的是以RNA攻擊為手段的制藥思路和領(lǐng)域的成功。與反義核酸藥物相比，siRNA在體外顯示了非常優(yōu)越的性質(zhì)。siRNA和非常好的反義核酸對(duì)基因的表達(dá)抑制都可以達(dá)到在80-90%以七，但篩選這樣的siRNA要相對(duì)容易的多。而且，達(dá)到同樣水平的表達(dá)抑制所需的siRNA比反義核酸濃度低10—IOO倍。不僅如此，siRNA對(duì)基因表達(dá)抑制的有效時(shí)間也比反義核酸有較大的延長(zhǎng)(從兩天延長(zhǎng)到5-7天)。siRNA在體外顯示的這些優(yōu)越性質(zhì)，如果能在RNA攻擊制藥中體現(xiàn)出來(lái)，將為著-領(lǐng)域注入強(qiáng)大的生命力和價(jià)值。從哲學(xué)的角度，siRNA這一有效的基因操作手段和RNA攻擊這一成熟的制藥領(lǐng)域的結(jié)合是不可避免的。siRNA—旦進(jìn)入制藥，首先將在病毒性傳染病如HIV和癌癥如白血病的治療方面形成巨大的經(jīng)濟(jì)效益。中國(guó)在這兩個(gè)方面有以百億計(jì)的市場(chǎng)，世界在癌癥和病毒性傳染病的治療方面還存在大的空白，siRNA的介入可以產(chǎn)生很好的社會(huì)作用。如果中國(guó)在這一領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)突前發(fā)展，對(duì)提高中國(guó)制藥業(yè)在加入WTO后的競(jìng)爭(zhēng)力有重要意義。吉?jiǎng)P基因早在2002年就開(kāi)始RNA干擾開(kāi)發(fā)和相關(guān)技術(shù)研究，針對(duì)OPN基因制備的可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的siRNA是長(zhǎng)期研究的結(jié)果之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于利用RNA干擾技術(shù)，制備一種可以用于腫瘤基因治療的核心分子，這種核心基因治療分子是以RNA干擾技術(shù)作為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的A.從genebank中調(diào)取humanOPN基因序列；B.利用GeneChem軟件預(yù)測(cè)有效的siRNA位點(diǎn)；C.合成12個(gè)針對(duì)0PN基因的siRNA;D.12個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；E.RT-PCR檢測(cè)這些siRNA對(duì)OPN基因的mRNA的抑制作用；F.Western檢測(cè)這些siRNA對(duì)OPN基因的蛋白表達(dá)水平的抑制作用；G.篩選mRNA水平和蛋白質(zhì)水平抑制作用超過(guò)90%的siRNA。H.該siRNA是本權(quán)利要求書(shū)要求的專(zhuān)利材料。I.對(duì)該siRNA進(jìn)行LNA化學(xué)修飾，增加其穩(wěn)定性。J.將該siRNA構(gòu)建入病毒載體，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)研究。所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)human0PN基因)，其特征在于其序列為5，GCAGCTTTACMCMATACCC3，5'TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5，GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3'5'CCATTCTGATGAATCTGAT3，5，GCCTTATATCGTGATCTGC3'5，GATGCCMCGATTCCTCCT3，5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5，ACACCTGAMTTTCGTATT3'5，Tcaggccagttgcagccttct3，5'GTTGTCCAGCMTTMTM3，5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3'所述的siRNA結(jié)構(gòu)為s畫(huà)5，p,N隨剛,國(guó)國(guó)湖,國(guó)TT3，本發(fā)明的優(yōu)選方案為所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)human0PN基因)基于RNA干擾原理；所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)human0PN基因)針對(duì)OPN基因；和傳統(tǒng)基因抑制技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下有益效果使用RNA干擾技術(shù)，可以提高對(duì)目的基因的特異性，可以提高對(duì)目的基因的抑制效率，可以對(duì)目的基因的抑制效率實(shí)施不同抑制效率的選擇。附閨說(shuō)明圖1為RNA干擾作用原理圖圖2為siRNA結(jié)構(gòu)圖圖3為siRNA制備流程圖具體實(shí)施方式從genbank調(diào)取目的基因信息LOCUSDEFINITIONACCESSIONVERS腦KEYWORDSSOURCEORGANISMREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALPUBMEDREMARKREFERENCEAUTHORSTTLEJOURNALPUBMED0005821616bpmRNAlinearPRI03-DEC-2006Homosapienssecretedphosphoprotein1(osteopontin,bonesialoproteinI,earlyT-lymphocyteactivation1)(SPP1),transcriptvariant2，.NM—000582—000582.2GI:38146097Homosapiens(human)HomosapiensEukaryota:Metazoa;Chordata;Craniata;Vertebrata;Euteleostomi;Mammalia;Eutheria;Euarchontoglires;Primates;H即lorrhini;Catarrhini;Hominidae;Homo.1(bases1to1616)Kita，Y.,Natsugoe，S.，0kumura，H.,Matsumoto,M.,Uchikado，Y.,Setoyama,T.,Owaki，T.，Ishigami,S.andAikou,T.ExpressionofosteopontininoesophagealsquamouscellcarcinomaBr.J.Cancer95(5)，634-638(2006)16880782GeneRIF:TheevaluationofOsteopontinexpressionisusefulforpredictingthemalignantpropertiesofesophagealsquamouscelcarcinoma.2(bases1to1616)Cook，A丄，Chambers,A.F.，Turley,E.A.andTuck,A.B.Osteopontininductionofhyaluronansynthase2expressionpromotesbreastcancermalignancyJ.Biol.Chem.281(34),24381-24389(2006)16807238REMARKGeneRIF:.OPN-transfectedcellsexpresshighlevelsofhyaluronansynthase2,whichisassociatedwithincreasedHAproductionandmatrixretentionandisnecessaryfortumorcelladhesiontobonemarrowendothelialcellsandanchorage-independentgrowthREFERENCE3(bases1to1616)AUTHORSSeth,D.,Gorrell，M.D.,Cordoba,S.,McCaughan，G.W.andHaber，P-S.TITLEIntrahepaticgeneexpressioninhumanalcoholichepatitisJOURNALJ.H印atol.45(2),306-320(2006)PUBMED16797773REMARKGeneRIF:Real-timeRT-PCRconfirmedup-regulationofIL-8,osteopontin,andTNFRSF14anddown-regulationofSAMeSandCD209inAH,REFERENCE4(bases1to1616)AUTHORSMaeno,Y.,Nakazawa，S.,Daole,D.,VanTuan，N.，Giang,N.D.，VanHanh,T.andTaniguchi，K.TITLEOsteopontinisinvolvedinThl-mediatedimmunityagainstPlasmodiumfalciparuminfectioninaholoendemicmalariaregioninVietnamJOURNALActaTrop.98(3)，305-310(2006)PUBMED16765311REMARKGeneRIF:resultssuggestthatOPNmightsuppressmultiplicationofPlasmodiumfalciparumthroughThelper1cells-mediatedimmuner6spons6sREFERENCE5(bases1to1616)AUTHORSNakamura,H.，Honda，H.,Inada，Y.，Kato,N.,Kato，K.，Kitazawa，LandSugisaki,T.TITLEOsteopontinexpressioninvascularsmoothrausclecellsinpatientswithend-stagerenaldiseaseJOURNALTherApherDial10(3),273-277(2006)PUBMED16817793REMARKGeneRIF:hyperphosphatemiaorazotemiaisassociatedwiththeexpressionofosteopontininvascularsmoothmusclecellsinpatientswithESRDREFERENCE6(bases1to1616)AUTHORSKohri,K.,Suzuki'Y.，Yoshida，K.,Yam畫(huà)to,K.，Amasaki，N.'Yamate，T.,Umekawa，T.,Iguchi，M.，Sinohara,H.andKurita,T.TITLEMolecularcloningandsequencingofcDNAencodingurinarystoneprotein,whichisidenticaltoosteopontinJOURNALBiochem.Biophys.Res.Commun.184(2)，859—864(1992)PUBMED1575754REFERENCE7(bases1to1616)AUTHORSShiraga，H.，Min,W.'VanDusen，W.丄，Clayman,M.D.,Miner,D.,Terrell,C.H.,Sherbotie，J.R.,Foreman,J.W.,Przysiecki,C.,Neiison,E.G.etal.■TITLEInhibitionofcalciumoxalatecrystalgrowthinvitrobyuropontin:anothermemberoftheasparticaci.d-richproteinsuperfamilyJOURNALPr()c.Natl.Acad.ScLU.S.A.89(1),426-430(1992)PUBMED1729712REFERENCE8(bases1to1616)AUTHORSYoung,M.F.，Kerr，J.M.,Termine，J.D.，Wewer,U.M.,Wang,M.G.，McBride，0.W.andFisher,L.W.TITLEcDNAcloning,mRNAdistributionandheterogeneity,chromosomallocation,andRFLPanalysisofhumanosteopontin(OPN)JOURNALGenomics7(4)，491-502(1990)PUBMED1974876REFERENCE9(bases1to1616)AUTHORSFisher,L.W.,McBride,0.W.，Termine,J.D.andYoung，M.F.TITLEHumanbonesialoprotein.DeducedproteinsequenceandchromosomallocalizationJOURNALJ.Biol.Chem.265(4)，2347-2351(1990)PUBMED2404984REFERENCE10(bases1to1616)AUTHORSEtheridge，L.L.TITLEInmemoriam:EllaThompsonJOURNALJPractNurs26(3)，10(1976)PUBMED1107524COMMENTVALIDATEDREFSEQ:Thisrecordhasundergonepreliminaryreviewofthesequence,buthasnotyetbeensubjecttofinalreview.ThereferencesequencewasderivedfromCB117856.1,BF699765.1，BX648003.1andAF052124.1.OnNov3,2003thissequenceversionreplacedgi:4759165.PublicationNote:ThisRefSeqrecordincludesasubsetofthepublicationsthatareavailableforthisgene.PleaseseetheEntrezGenerecordtoaccessadditionalpublications.FEATURESLocation/Qualifierssource1..1616/organism="Homosapiens*"/mol—type="mRNA〃/db—xref=〃taxon:9606w/chromosome=〃4w/map="4q21-q25〃gene1..1616/gene="SPPl〃/note=〃secretedphosphoprotein1(osteopontin,bonesialoproteinI,earlyT-lymphocyteactivationi);synonyms:OPN,BNSP，BSPI，ETA-1,MGC110940"/db—xref="GeneID:6696"/db—xref="HGNC:11255〃/db—xref=〃HPRD:01325"/db—xref="MW:166490"CDS166..1068/gene="SPPl〃/go—component=〃extracellularmatrix(sensuMetazoa)[pmid1107524];extracellularregion[pmid1107524];extracellularspace"/go—function=〃cytokineactivity;growthfactoractivity[pmid1107524];integrinbinding;proteinbinding"/go_process=〃anti—鄰optosis;celladhesion;cell—cellsignaling[pmid1107524];cell-matrixadhesion;inductionofpositivechemotaxis[pmid1107524];leukocytechemotaxis[pmid1107524];negativeregulationofbonemineralization[pmid1729712];ossification[pmid10766759]:positiveregulationofTcellproliferation[pmid1107524];regulationofmyeloidcelldifferentiation[pmid1107524];T-helper1typeimmuneresponse[pmid1107524]"/note="isoformbisencodedbytranscriptvariant2;osteopontin;secretedphosphoprotein-1(osteopontin,bonesialoprotein);SPP1/CALPHA1fusion;osteopontin/iramunoglobulinalpha1heavychainconstantregionfusionprotei,/codon—start=l/product=wsecretedphosphoprotein1isoformb〃/protein—id="NP—000573.1〃/db—xref=〃GI:4759166〃/db—xref=〃CCDS:CCDS3626.1"/db—xref=〃GeneID:6696"/db—xref="HGNC:11255"/db_xref=〃HPRD:01325〃Mb—xref=〃MIM:166490"/translation=〃MRIAVICFCLLGITCAIPVKQADSGSSEEKQLYNKYPMVATWLNPDPS諷QNLLAPQTLPSKSNESHD剛DD船DEDDDDHVDSQDSIDSNDSDDVDDTDDSHQSDESHHSDESDELVTDFPTDLPATEVFTPVVPTVDTYDGRGDSVVYGLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHMESEELNGAYKAIPVAQDLNAPSDTOSRGKDSYETSQLDDQSAETHSHKQSRLYKRKANDESNEHSDVIDSQELSKVSREFHSHEFHSHEDMLVVDPKSKEEDKHLKFRISHELDSASSEVN"STS416..611/gene=〃SPPl〃/standard—腦e-〃PMC351321P4〃/db—xref="UniSTS:273245"STS662..1313/gene=〃SPPl〃/standard—name=〃SPPl—3239〃/db—xref=〃UniSTS:462569〃STS756..994/gene=〃SPPl"/standard—n柳e-〃SHGC—59479〃/db一xref=〃UniSTS:41951〃STSSTSSTSORIGIN6〗12〗18〗24]30〗36〗42]48]54〗60〗66〗72〗78〗8490〗96J102〗腦114〗120〗126〗132138]144]15015611156..1288/gene=〃SPPl〃/standard—name="D4S3132"/db—xref=〃UniSTS:81923"1266..1475/genesppi"/standard—nameSHGC4-1078"/db—xref=〃UniSTS:77951"1359..1485/gene=〃SPPl〃/standard—翻e:〃SHGC-36594〃/dbxref="UniSTS:4033"ctccctgtgtcagcagcagcttgcagccttEltttgCttttagttctg鄉(xiāng)cctgacccatgaaagccatgcaggactccatctgatgagtctgccagc朋ggtgatagtgcagtaccctgggtgcatacacgtgggaaggC3C33gC3gtgtgattgatatttcgtattttacaatttctaacatga犯ttaactaatgtaasgcttcagttaatatttgcccacttaaatgtat3tttttaagaatttgtggtggagg3agg鄉(xiāng)aggcCtC8gCC8朋gcctcctaggaaaagcagctctcagaagcattgactcg朋ctcaccattcccgaagtttttggtttatggaggccatcccacagttatgagtcaggaactstatgctggtCtC3tg犯ttcactttgcatgcttctttctgtttgataatggttstgtctttattctctcgttgtgstt已gtggtgtc犯tttttactgctgtctgcagcagagcscagccgccgacc肌catcacctgtttacaacaaag犯tctcctatgattgttggatcgactctgattgatgaatctcsctccagttactgaggtcEtcgaggacatccgttgcccagaacggigtcagt33gCgg333ttccaaagtctgtagacccc￡lg￡lt3gtgC3cagtttattgtagtttagttatgttcattcaacattt;tattctttttgtgttgcttatttagcatttaaa3tCgtCggg3gg朋aactcagccataccagtacccagatggccccacagagatga卿tggatgt柳tggatgaactgggtccccacaggacctgaacgctggatg獄gccaatgatgagccgtgaattcttctgaggggtaaaaatgcgttg組gtgtgtggcttcagtcactataagtgtg犯t犯gttttcccac狐記33鄉(xiāng)詔ttctggg鄉(xiāng)ccagactcgtctsccatgagttaaacaggcctgtggccaccccttccaagatg8tg3ccaacactgatgatc過(guò)ctgatttagtttcgcetgtgg,gcgacgccttctgaagagtgctgatccacagccatttatagcaiatatctatttgtggaaactccatgca朋cta犯gca^ieic犯tcttttgtttatctUtatxggttgt:ccaggcttggttgtctcaggccag幼ttgC3gtgtgattctggaatggct犯actaagtccaactgtggacagcttctcaccagtcccacggactgatggccgaacctgacatcttgggacagc^CCC3C3gCgcattccgattga3tttcm;;Hgtctgga^Ctgt犯3CUlt:cactgtattaatetcttttHttgaatgt肌針對(duì)OPN設(shè)計(jì)可能有效的siRNA靶點(diǎn):<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>GTCAGGMCTTTCCAMGT274542.86%GCMTGAGCATTCCGATGT271847.62%TGCTGGTTGTAGACCCCAA280847.62%CCCTTCCMGTAAGTCCM217552.38%GATTATATMGCGG嵐GC1.568833.33%TGTAGATGACACTGATGAT1.528738.腦AAGCTAATGATGAGAGCAA1.570338.應(yīng)ATGATGAGAGCAATGAGCA1.570938.10%ACGACTCTGATGATGTAGA1.527442.86%ACCGMGTTTTCACTCCAG1.538442.86%AGGACAGTTATGAAACGAG1.562242.86%ATGAGCATTCCGATGTGAT1.572142.86%TTGACTCGMCGACTCTGA1.526547.62%CACTGATGATTCTCACCAG1.529647.62%CTGATGATTCTCACCAGTC1.529847.62%TTCTCACCAGTCTGATGAG1.530547.62%GTCTGATGAGTCTCACCAT1.531447.62%CATATGATGGCCGAGGTGA1.542147.62%CTCCATTGACTCGMCGAC1.526052.38%CCTGCCAGCMCCGMGTT1.537452.38%CACATGGMAGCGAGGAGT1.553152.38%GATGCTGTGGCCACATGGC1.511157.14%CAGCCAGGACTCCATTGAC1.525157.14%GACCTGACATCCAGTACCC1.548457.14%CCTGAACGCGCCTTCTGAT1.558757.14%CAGCCGTGGGAAGGACAGT1.561157.14%GCCGTGGGMGGACAGTTA1.561357.14%GCCGTGAATTCCACAGCCA1.576657.14%GATAMCACCTG織TTTC1.584033.33%GTAAGGAAGMGAT総CA1.582938.10%GGMGAAGATAAACACCTG1.583338.應(yīng)TTAGATAGTGCATCTTCTG1.587338.10%TGATATCGATGATGMGAT1.521533.33%TATGGATGATGAAGATGAT1.521833.33%TTCTGATGMTCTGATGAA1.533233.33%合成12對(duì)siRNA;耙序列為5，GCAGCTTTACAACMATACCC3，5'TCTCCTTGCGCCACAGAAT3'5，GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3，5'CCATTCTGATGMTCTGAT3，5，GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCAACGATTCCTCCT3'5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3'5，Tcaggccagttgcagccttct3，5，GTTGTCCAGCMTTAATM3，5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞；活細(xì)胞計(jì)數(shù)用無(wú)血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到2002000個(gè)/毫升(一般稀釋倍數(shù)為100倍)，在0.1毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1毫升的0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。細(xì)胞株的凍存取培養(yǎng)23天生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2X1062X107/ml。在lml細(xì)胞凍存管中加入0.5ml細(xì)胞懸液，0.4ral小牛血清和0.lml二甲基亞砜(或甘油)，混勻后密封。置4-Cl小時(shí)，一2(TC2小時(shí)，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過(guò)夜后浸入液氮中。細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，應(yīng)帶有防護(hù)眼睛和手套。迅速放入盛有5(TC水的水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍。用70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺(tái)上，吸出細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加3ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置溫箱培養(yǎng)。次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代棄去舊培養(yǎng)液，加入5mL滅菌PBS溶液，輕輕晃動(dòng)，洗滌細(xì)胞生長(zhǎng)面，然后棄去PBS溶液。加入2mL胰酶消化液，消化l-2min直到細(xì)胞完全消化下來(lái)。加入含10%胎牛血清和100U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)基5ml，用刻度吸管吹打數(shù)次，將瓶壁上的細(xì)胞沖洗下來(lái)?；靹蚣?xì)胞后分至兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。裝染棄去細(xì)胞液，加5mlPBS洗一次。加2ml胰酶消化1-2分鐘。棄去胰酶，加3-4mlMEM(不含血清)吹打均勻。將細(xì)胞滴加于6孔培養(yǎng)板中(每孔2ml)，使培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞融合度控制在4050%。對(duì)于6孔板的每個(gè)孔，用2ug質(zhì)粒DNA與245plDMEM混合。將LipofectAMINE2000試劑輕柔搖勻，取5jxiLipofect層INE2000試劑在另一管中與245ji1DMEM混合，在室溫下溫育5分鐘。把稀釋后的shRNA與稀釋后的LipofectAMINE2000進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內(nèi)混合?；旌虾?，在室溫下溫育20分鐘，以便形成shRNA與LipofectAMINE2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。把shRNA與LipofectAMINE2000的混合液加入培養(yǎng)細(xì)胞，輕柔前后推搖培養(yǎng)板以混勻液體。然后將培養(yǎng)板送入細(xì)胞培養(yǎng)箱。在檢測(cè)RNAi效果(即檢測(cè)靶基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平)之前，一般無(wú)需換培養(yǎng)液。但如果以上轉(zhuǎn)染試劑用量時(shí)有明顯細(xì)胞毒性(如黏附細(xì)胞在轉(zhuǎn)染4小時(shí)后出現(xiàn)明顯較多細(xì)胞死亡)，那么可以在轉(zhuǎn)染滿(mǎn)3小時(shí)但不滿(mǎn)4小時(shí)，將培養(yǎng)板中所有培養(yǎng)基棄去，并加入新鮮培養(yǎng)基(可以使用含血清的培養(yǎng)基)。RT-PCR檢測(cè)0PN的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；RT1HiOligodT(O.5ug/ul)+2TotalRNA(lug/ul)+6PiDEPC-H20(mixwell470°C,lOmin4立即插入(TC冰水浴中4addllMlmixture4W5XRTbuffer2Wl關(guān)d證s0.5RNasin1PiMLV-RTase3.514DEPCH20I42°C，lhr470°C,lOmini0°C42ul用于PCR，其余jC:存在-20°CPCRPCR引物退火溫度55°CPCR循環(huán)數(shù)目28cycles目的片斷大小400bpWestern檢測(cè)0PN的蛋白表達(dá)水平；1.加入適量預(yù)冷的6XLysisBuffer。2.用預(yù)冷的刮刀將細(xì)胞刮下，冰上裂解細(xì)胞10—15miri。3.超聲破碎儀破碎細(xì)胞(200W共4次，每次5秒，間隔2秒)4.4。C，12000g，離心15min。5.取上清，測(cè)蛋白濃度后，調(diào)整為2Pg/W的蛋白終濃度，取20-40Pg蛋白，加入6Xloading上樣緩沖液，10(TC煮5-10min。6.SDS-PAGE:根據(jù)目的蛋白大小及表達(dá)豐度，取一定量蛋臺(tái)總樣品進(jìn)行相應(yīng)分離膠濃度的SDS-PAGE。采用Bio-Rad電泳裝置將總蛋白進(jìn)行分離。7.電轉(zhuǎn)移電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置(Bio-Rad，Richraoad，CA)，在4°C，400mA恒流條件下電轉(zhuǎn)移120分鐘，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。8.封閉用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%牛奶配制成封閉液。室溫封閉PVDF膜1小時(shí)或4'C過(guò)夜。9.一抗孵育用含5X牛奶的TBST分別稀釋目的蛋白或者內(nèi)參Actin—抗。室溫下與封閉好的PVDF膜孵育2小時(shí)或4"C過(guò)夜。10.洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。11.二抗孵育用含5X牛奶的TBST稀釋與一抗相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶驢抗兔/小鼠二抗。于室溫下孵育2小時(shí)。12.洗膜TBST洗膜3次，每次10分鐘。TBS洗膜一次，10分鐘。13.ECL:采用Amersh柳公司ECL+plusTMWesternblottingsystem試劑盒進(jìn)行顯色反應(yīng)，于暗房中曝光、顯影、過(guò)水、定影。X光片(柯達(dá))晾千待分析。有效的siRNA使用LNA修飾；修飾后的siLNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(流程描述同前)；RT-PCR檢測(cè)0PN的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(流程描述同前)；Western檢測(cè)OPN的蛋白表達(dá)水平(流程描述同前)；保留在mRNA水平和western水平抑制效率均達(dá)到90%的siLNA;進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。權(quán)利要求1.一種針對(duì)人OPN基因用于腫瘤基因治療的短的干擾核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。制備方法包括如下步驟A.從genebank中調(diào)取humanOPN基因序列；B.利用GeneChem軟件預(yù)測(cè)有效的siRNA位點(diǎn)；C.合成12個(gè)針對(duì)OPN基因的siRNA；D.12個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；E.RT-PCR檢測(cè)這些siRNA對(duì)OPN基因的mRNA的抑制作用；F.Western檢測(cè)這些siRNA對(duì)OPN基因的蛋白表達(dá)水平的抑制作用；G.篩選mRNA水平和蛋白質(zhì)水平抑制作用超過(guò)90％的siRNA。H.該siRNA是本權(quán)利要求書(shū)要求的專(zhuān)利材料。I.對(duì)該siRNA進(jìn)行LNA化學(xué)修飾，增加其穩(wěn)定性。J.將該siRNA構(gòu)建入病毒載體，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)研究。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)h咖anOPN基因)，其特征在于所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)humanOPN基因)是化學(xué)合成的RNA干擾制品，針對(duì)OPN基因。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)humanOPN基因)，其特征在于其序列為5,GCAGCTTTACMCMATACCC3'5'TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5'GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3'5，CCATTCTGATGAATCTGAT3:5'GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCMCGA竹CCTCCT3，5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3,5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3，5，Tcaggccagttgcagccttct3，5,GTTGTCCAGCMTTMTM3,5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，4、siRNA結(jié)構(gòu)為,5，pNN麵ll,繼國(guó)誦國(guó)TT3，5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)human0PN基因),其特征在于所述siRNA在mRNA水平的抑制效率大于90%。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)human0PN基因)，其特征在于所述siRNA在蛋白質(zhì)水平的抑制效率大于90%。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤基因治療的siRNA(針對(duì)h咖anOPN基因)，其特征在于所述siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)人OPN基因用于腫瘤基因治療的短的干擾核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。該siRNA使用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)利用短片斷的雙鏈RNA促使特定基因的mRNA降解來(lái)高效、特異的阻斷特定基因的表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因沉默的表型，被研究人員應(yīng)用到疾病治療領(lǐng)域。OPN基因表達(dá)一種多功能蛋白質(zhì)，參與人腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。它廣泛存在于正常成人組織和體液中。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，抑制OPN基因表達(dá)之后，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。文檔編號(hào)C07H21/02GK101210037SQ20061014796公開(kāi)日2008年7月2日申請(qǐng)日期2006年12月26日優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日發(fā)明者曹躍瓊申請(qǐng)人:上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司