一種治療器官纖維化的藥物組合物及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種治療器官纖維化的藥物組合物，它是由如下重量配比的原料藥制備而成的制劑：菟絲子17-23份，女貞子17-23份，巴戟天10-15份，山萸肉10-15份，五味子3-7份，百合17-23份，玉竹12-18份，石斛12-18份，沙參12-18份，黨參15-20份，黃芪15-20份，白術(shù)10-15份，蘇葉2-4份，蘇子10-15份，栝蔞15-20份。本發(fā)明還提供了該類藥物組合物的制備方法和用途。本發(fā)明藥物組合物能有效治療或輔助治療器官特別是肺的纖維化，改善其相關(guān)指標(biāo)，從而達(dá)到緩解其癥狀以提高其生存質(zhì)量的治療效果，且避免了西醫(yī)化學(xué)藥物的嚴(yán)重毒副作用，為臨床用藥提供了一種新的選擇。
【專利說(shuō)明】一種治療器官纖維化的藥物組合物及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種治療器官纖維化的藥物組合物及其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺纖維化（Pulmonary fibrosis/PF)疾病是多種原因引起肺部炎癥和肺泡持續(xù)性 損傷及細(xì)胞外基質(zhì)（Extracelluluar matrix/ECM)的反復(fù)破壞、修復(fù)、重建和過(guò)度沉積從而 導(dǎo)致正常的肺組織結(jié)構(gòu)改變和功能喪失的一類疾病譜，是多種原因引起慢性肺疾病的共同 結(jié)局，是呼吸衰竭的主要病理基礎(chǔ)，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其確切的發(fā)病機(jī)制雖然目前尚 未徹底闡明，但多種細(xì)胞因子及其網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控是其發(fā)生發(fā)展病理機(jī)制的極重要因素。
[0003] 肺纖維化屬于國(guó)際關(guān)注度極高的一類難治性重大病種，國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為：纖維化 是慢性病久治不愈的根本原因，也是其致殘、致死的主因，有近50%的死亡與纖維化有關(guān)， 而各種慢性肺病久治不愈的根本原因即在于其有纖維化病變。肺纖維化（PF)是器官纖維 化中最具代表性、最典型最常發(fā)者，其病因復(fù)雜，除非典型肺炎可致PF外，很多肺系疾病均 可導(dǎo)致PF，至少有150種以上病因與之相關(guān)。治療上，目前尚僅限于非特異性抗炎、免疫抑 制劑及糖皮質(zhì)激素等方法，其共同特點(diǎn)是缺少特異性治療，且大量使用抗生素和激素，這本 身就是導(dǎo)致纖維化和加重纖維化的重要原因。隨著其發(fā)病率、死亡率的不斷上升，PF研究 已成為世界關(guān)注熱點(diǎn)，故尋求中醫(yī)藥等其他療法已成當(dāng)務(wù)之急。
[0004] 過(guò)去認(rèn)為器官的纖維化一旦形成，就不能逆轉(zhuǎn)。然而，上世紀(jì)九十年代以來(lái)，大 量實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，包括肺纖維化在內(nèi)的器官纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。各種器官纖維化 之所以都可以經(jīng)過(guò)正確的治療和調(diào)理發(fā)生過(guò)程相似的逆轉(zhuǎn)，是因?yàn)樵诩?xì)胞水平和分子水 平上各種纖維化形成的過(guò)程就非常相似，具有殊途同歸的特點(diǎn)。這些相似的發(fā)生過(guò)程 提示，一種器官纖維化發(fā)生機(jī)制的研究結(jié)果，也適用于其他各種器官纖維化；對(duì)一種器 官纖維化的有效治療方法，對(duì)阻止、減輕其他各種組織器官纖維化也是有益的（Border WA. Evidence that TGF-β should be a therapeutic target in diabetic nephropathy. Kidney Int，1998, 54:1390-1391.)。有鑒于此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者集中力量從一種器官纖維化 的逆轉(zhuǎn)開始，逐漸擴(kuò)展到多種器官纖維化逆轉(zhuǎn)的研究，獲得了器官纖維化可以逆轉(zhuǎn)的大量 證據(jù)，其中包括肺纖維化。
[0005] 雖然肺纖維化具有治療可逆性，但目前尚缺乏滿意的西醫(yī)藥防治手段，這可能與 肺纖維化發(fā)病的多因素、病變的多靶點(diǎn)、病理進(jìn)程的多樣性等相關(guān)。作為一種典型的復(fù)雜性 疾病，以單靶點(diǎn)為主的西醫(yī)化學(xué)藥物經(jīng)常顯得無(wú)能為力，中醫(yī)藥等傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在器官纖維化 的治療方面擁有很大的潛力和優(yōu)勢(shì)，基于療效確切的中醫(yī)藥開發(fā)抗器官纖維化的藥物，特 別是開發(fā)抗肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化的藥物，前景日益廣闊。
[0006] 中醫(yī)認(rèn)為肺纖維化屬于典型的"本虛標(biāo)實(shí)"病證，其病機(jī)為"病已久一本已虛"、 "虛、阻相夾"，可歸屬中醫(yī)絡(luò)病范疇（李戎.論艾灸肺俞膏肓俞治療肺纖維化的中醫(yī)理 論基礎(chǔ)與施治依據(jù).遼寧中醫(yī)雜志，2004, 31 (4):291-293.)。楊珂等報(bào)道了一種扶正 化瘀方，主要成分為絞股藍(lán)、丹參、冬蟲夏草，用于抗大鼠肺纖維化，效果明顯。專利號(hào)： CN201110162621. 6,提供了一種治療肺纖維化的藥物組合物，其原料組成為：人參5-15份、 丹參5-15份、當(dāng)歸1-11份、黃精5-15份、紫蘇子5-15份、白芥子1-11份、枳實(shí)1-11份、紫 金牛5-15份，可以抑制人胚肺二倍體纖維母細(xì)胞2BS細(xì)胞株增殖的功效，治療肺纖維化。專 利號(hào)：201110162761. 3,提供了一種治療肺纖維化的藥物組合物，其原料組成為：人參5-15 份、丹參7. 5-22. 5份、銀杏葉7. 5-22. 5份、天門冬7. 5-22. 5份、黃精7. 5-22. 5份、瓜萎皮 7. 5-22. 5份、當(dāng)歸2. 5-7. 5份、三七2. 5-7. 5份，可以改善器官纖維化患者臨床癥狀及生存 質(zhì)量。
[0007] 根據(jù)目前的治療情況而言，中醫(yī)藥在對(duì)器官纖維化（尤其是肺纖維化）的治療上， 取得了重大的研究進(jìn)展，因此，從中醫(yī)藥角度出發(fā)研發(fā)治療器官纖維化的新藥，已成為當(dāng)前 的研究熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療器官纖維化的新藥物組合物及其制備方法和用 途。
[0009] 本發(fā)明提供了一種治療器官纖維化的藥物組合物，它是由如下重量配比的原料藥 制備而成的制劑：
[0010] 菟絲子17-23份，女貞子17-23份，巴戟天10-15份，山萸肉10-15份，五味子3-7 份，百合17-23份，玉竹12-18份，石斛12-18份，沙參12-18份，黨參15-20份，黃芪15-20 份，白術(shù)10-15份，蘇葉2-4份，蘇子10-15份，栝萎15-20份。
[0011] 進(jìn)一步地，它是由如下重量配比的原料藥制備而成的制劑：
[0012] 菟絲子20份，女貞子20份，巴戟天12份，山萸肉10份，五味子5份，百合20份，玉 竹15份，石斛15份，沙參15份，黨參18份，黃芪18份，白術(shù)12份，蘇葉3份，蘇子12份， 栝萎18份。
[0013] 其中，所述栝萎同時(shí)含有栝萎殼和栝萎仁。
[0014] 其中，所述藥物組合物是由所述重量配比的原料藥的水或/和乙醇提取物為活性 成分，加上藥學(xué)上常用的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。
[0015] 其中，所述制劑為經(jīng)胃腸道吸收制劑。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述藥物組合物的制備方法，它包括如下步驟：
[0017] (1)按所述重量配比稱取原料藥；
[0018] (2)將各藥加水煎煮，合并水煎液，加上藥學(xué)上可用的輔料或輔助性成分制備成常 規(guī)制劑。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述藥物組合物在制備治療或輔助治療器官纖維化的藥物中的 用途。
[0020] 進(jìn)一步地，所述藥物是治療肺纖維化的藥物。
[0021] 更進(jìn)一步地，所述藥物是降低肺組織內(nèi)金屬蛋白酶_3含量的藥物。
[0022]目前已公認(rèn)"整體觀念"、"辨證施治"、"復(fù)方使用"、"復(fù)方配伍用藥如用兵"是中 醫(yī)最科學(xué)最有效的幾大優(yōu)勢(shì)，其中"復(fù)方配伍用藥如用兵"是非?？茖W(xué)的中醫(yī)藥原創(chuàng)理論。 中醫(yī)組方中各藥如行兵布陣那樣環(huán)環(huán)相扣的嚴(yán)密配伍，是其優(yōu)于西醫(yī)化學(xué)藥配方的有效手 段。中醫(yī)方劑理論認(rèn)為，每一方劑，不僅需要根據(jù)病因病機(jī)選擇合適的藥物妥善配伍，同時(shí) 也應(yīng)符合組方的基本結(jié)構(gòu)，即"君、臣、佐、使"的組方配伍理論，所謂"君、臣、佐、使"的組方 配伍，就是其建立在對(duì)疾病病機(jī)的全方位判斷基礎(chǔ)上的科學(xué)配比。中醫(yī)用方通過(guò)多環(huán)節(jié)、多 靶點(diǎn)整合調(diào)節(jié)的生物學(xué)機(jī)制，對(duì)肺纖維化這樣具有發(fā)病多因素、病變多靶點(diǎn)、病理進(jìn)程多樣 性（"三多"）等復(fù)雜特點(diǎn)、治療困難的疾病或其癥狀進(jìn)行調(diào)控，可以取得比西醫(yī)化學(xué)藥更 好、更持久的治療效果，且避免了西醫(yī)化學(xué)藥的毒副作用，而這種療效是建立在上述中醫(yī)傳 統(tǒng)原創(chuàng)理論的正確指導(dǎo)之上的，本發(fā)明藥物組合物正遵循了這一原則。
[0023] 本發(fā)明組方針對(duì)腎氣不固、肺陰不布、脾氣不聚、肺氣不降這一證型，患者身體虛 弱，呼吸困難，是本證型患者的主要臨床表現(xiàn)，而要解決則當(dāng)扶正固本。然而，要扶正固本 則又需兼顧其肺、脾、腎三臟，特別是這個(gè)證型的患者，更需匡扶此三臟正氣。"腎為先天之 本"，本型患者已腎氣不固，腎不納氣，故重用"二子"即菟絲子、女貞子同為君藥，以補(bǔ)腎納 氣。巴戟天壯腎陽(yáng)，山萸肉、五味子補(bǔ)腎陰，此三味襄助君藥入腎增效，是為臣藥。"脾為后 天之本"，中土脾胃已弱，需氣陰雙補(bǔ)，復(fù)其健旺，故用黨參、黃芪、白術(shù)扶養(yǎng)脾氣，石斛、沙參 滋潤(rùn)胃陰，充任左路之佐藥，從"脾胃后天"這一路輔佐君臣。肺、脾、腎三臟已"安居平二 路"，但尚有纖維化之主臟肺，也需要從氣陰兩個(gè)方面一起"發(fā)兵"，"肺為儲(chǔ)痰之器"而"脾為 生痰之源"，黨參、黃苗、白術(shù)既扶養(yǎng)了脾氣，也就扶養(yǎng)了肺氣，但肺氣還喜宣發(fā)、肅降，因遣 蘇葉以開宣肺氣、蘇子以沉降肺氣、百合與玉竹敷濡肺陰，如此氣陰并治，可謂右路之佐藥， 從肺之本臟這一路輔佐君臣。一味栝萎，不僅有清熱作用，可防大批腎脾熱藥生熱之弊，且 其包含瓜萎殼與瓜萎仁；萎殼可助開宣肺氣、通疏脾氣，萎仁則又可助沉降肺氣，造成"升降 出入，無(wú)器不有"的活泛氛圍；除此之外，栝萎還善化痰止咳，正切肺癥。由此可見(jiàn)，栝萎顯 然非常優(yōu)秀地?fù)?dān)當(dāng)了使藥之職，矧可謂良使。
[0024] 以上君臣佐使各組藥味職司分明，相輔相成，充分發(fā)揮了中醫(yī)學(xué)所獨(dú)有的復(fù)方配 伍用藥如排軍布陣般的思辨性科學(xué)研究方法論精髓，可共收固腎氣而滋養(yǎng)肺陰，補(bǔ)脾氣而 宣降肺氣之功效，由此而改善肺部狀況，對(duì)于本發(fā)明組方所針對(duì)的肺纖維化有著良好的治 療效果，為臨床用藥提供了一種新的選擇。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1本發(fā)明藥物組合物的制備
[0026] 取菟絲子20克，女貞子20克，巴戟天12克，山萸肉10克，五味子5克，百合20克， 玉竹15克，石斛15克，沙參15克，黨參18克，黃芪18克，白術(shù)12克，蘇葉3克，蘇子12克， 栝萎18克。各藥味按量稱取，摻以足量的凈水，武火煎沸后改文火再煎煮10分鐘至15分 鐘，收集水煎液后，再加水煎煮2次，合并各次水煎液，即得湯劑。
[0027] 本方中，栝萎為全栝萎，即含有栝萎殼與栝萎仁的中藥飲片。
[0028] 實(shí)施例2本發(fā)明藥物組合物的制備
[0029] 取菟絲子17克，女貞子23克，巴戟天15克，山萸肉13克，五味子7克，百合23克， 玉竹18克，石斛18克，沙參18克，黨參20克，黃芪20克，白術(shù)15克，蘇葉4克，蘇子15克， 栝萎20克。先以70% v/v乙醇提取2次后，合并醇提液，藥渣再以水煎煮2次，合并水煎 液。分別將醇提液、水煎液濃縮后，混合，再加入適當(dāng)糊精、可溶性淀粉，制粒，即得顆粒劑。
[0030] 實(shí)施例3本發(fā)明藥物組合物的制備
[0031] 取菟絲子23克，女貞子17克，巴戟天10克，山萸肉7克，五味子3克，百合17克， 玉竹12克，石斛12克，沙參12克，黨參15克，黃芪15克，白術(shù)10克，蘇葉2克，蘇子10克， 栝萎15克。各藥味按量稱取，將貝母粉研為極細(xì)末，摻以足量的凈水，用武火將其余各藥煎 煮至沸后，改文火，再煎10分鐘至15分鐘左右，然后收集水煎液，兌入貝母粉，拌勻；藥渣再 加水煎煮2次，兌粉如前，合并濾液，濃縮、干燥后，加入適量微晶纖維素，混勻后，裝膠囊， 即得膠囊劑。
[0032] 實(shí)施例4本發(fā)明藥物組合物的制備
[0033] 取實(shí)施例1制備的湯劑，靜置，取上清液，濃縮后，干燥，粉碎，備用；取適量聚乙二 醇4000,熔融后，將上述藥粉加入熔融基質(zhì)中，75-85°C下保溫；采用各型滴丸機(jī)，滴口內(nèi)/ 外徑及滴速適度，將其滴入二甲基硅油中，收集滴丸，即得滴丸劑。
[0034] 實(shí)施例5本發(fā)明藥物組合物的制備
[0035] 取實(shí)施例1制備的湯劑，濃縮后，加適當(dāng)?shù)矸邸⒑?和微晶纖維素，制粒。
[0036] 以下通過(guò)試驗(yàn)例具體說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
[0037] 試驗(yàn)例本發(fā)明藥物對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化的治療作用
[0038] 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料
[0039] 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0040] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取100只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重為200g±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一 周，保持室溫18-25°C，相對(duì)濕度55-70 %，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水與進(jìn)食。
[0041] 1.2實(shí)驗(yàn)藥品
[0042] 本發(fā)明藥物組合物：實(shí)施例1制備的湯劑，配成1. 5g生藥/ml的藥液。
[0043] 博萊霉素原液zeocinl25mg/支，用時(shí)以無(wú)菌生理鹽水稀釋成4mg/ml的溶液。
[0044] 0· 9 % 生理鹽水（250ml/ 瓶）。
[0045] 1. 3實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器
[0046] RNA prep pure Tissue Kit (組織總 RNA 提取試劑盒）。
[0047] RNAstore reagent (RNA 樣本保存液）。
[0048] Parafim 封 口膜。
[0049] ReverTra Ace qPCR RT Kit (RT-PCR 高性能逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒）。
[0050] THUNDERBIRD qPCR Mix ( "雷鳥"定量 PCR 試劑）。
[0051] Rabbit Anti-MMP_3antibody (兔抗 MMP-3 抗體）。
[0052] eblot蛋白轉(zhuǎn)印試劑盒。
[0053] 動(dòng)物組織蛋白提取試劑盒。
[0054] Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑。
[0055] BCA蛋白定量試劑盒。
[0056] Western封閉液封閉抗體。
[0057] AccuPower GreenStar qPCR PreMix (突光定量 PCR 試劑盒）。
[0058] AccuPower? RocketScriptTM RT PreMix (板型逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）。
[0059] DF110型電子分析天平秤。
[0060] CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
[0061] L00205C-1型eblot干式快速蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)。
[0062] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0063] 2. 1造模方法
[0064] 博萊霉素 A5(BLMA5)為最常用的肺纖維化誘導(dǎo)劑，由于其對(duì)肺的毒性作用的可預(yù) 測(cè)性，已成為當(dāng)今經(jīng)典的肺纖維化動(dòng)物模型誘導(dǎo)劑。具體方法如次：在乙醚麻醉下，將大鼠 仰臥位固定于手術(shù)板上，拉出舌，壓迫舌腹，暴露喉頭，額鏡直視下趁動(dòng)物吸氣瞬間，將與注 射器相連的7號(hào)鈍頭腰穿針經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端插入氣管，將大鼠直立，繼續(xù)進(jìn)針 1.5?2. 0cm，回抽見(jiàn)空氣無(wú)阻力后，將藥液注入氣管內(nèi)?？瞻捉M（η = 10)注入生理鹽水 2ml/Kg。其余3組（模型組，η = 30 ;本發(fā)明藥物組合物治療組（以下簡(jiǎn)稱"本方組"），η =30 ;艾灸對(duì)照組，η = 30。一次性緩慢注入博萊霉素原液稀釋液5mg/Kg，并注入0. 2ml空 氣，完畢后立即將大鼠手術(shù)板直立，旋轉(zhuǎn)，使藥物充分均勻的散布于雙肺。幾分鐘后，大鼠即 可醒來(lái)并隨意覓食。
[0065] 2. 2動(dòng)物分組
[0066] 100只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：模型組30只、本方治療組30只、艾灸對(duì)照治療組 (下稱艾灸組）30只。另設(shè)空白對(duì)照組10只。
[0067] 2. 3動(dòng)物治療
[0068] 2. 3. 1空白組、模型組不給予任何治療和干預(yù)措施，從造模后第7天開始，只在每 天同一時(shí)間內(nèi)以相同的方式進(jìn)行抓取、固定，并按等容量生理鹽水灌胃作為對(duì)照。
[0069] 2. 3. 2本方組：從造模后第7天開始，每只每天以本發(fā)明藥物中劑量組按人劑量的 10倍，即5g生藥/kg給大鼠灌胃，每日1次，10次為1療程，共治療3個(gè)療程，療程間休息 1天。
[0070] 2. 3. 3艾灸組：于造模后第7天開始治療，將大鼠固定在自制的手術(shù)板上，取"肺 俞"、"膏肓俞"穴（腧穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》及《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》），先用剃毛器在其穴 位周圍剔除被毛，用馬克筆對(duì)穴位進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)在施灸前用手指觸摸確定穴位，并在其穴 位處涂少量白凡士林固定艾炷，后開始采用麥粒灸，將提前自制好的麥粒灸放其穴位處，左 手固定大鼠下部三分之二處，右手施灸，左右交替施灸（以不灼傷其皮膚為度）。每穴3壯， 每壯重5mg。每天治療一次,10次為1療程,共治療3個(gè)療程，療程間休息1天。
[0071] 3、指標(biāo)檢測(cè)與方法
[0072] 肉眼觀察一般情況（觀察大鼠的食欲、神態(tài)、反應(yīng)能力、被毛、肌肉及呼吸情況）及 肺組織的情況，計(jì)算各組大鼠肺系數(shù)[肺系數(shù)（LC)=肺濕重（g)/體重（kg)X100% ]，光 鏡觀察肺組織病理學(xué)改變。
[0073] 3. 1標(biāo)本的采集與處理
[0074] 最后一次治療后，稱取體重，斷頸處死大鼠，開胸取其肺組織，肉眼觀察其肺組 織的形狀、色澤、表面的狀態(tài)、病灶的特征。分別取150mg肺組織，按比例放入RNAstore reagent樣本保存液，Parafim封口膜迅速封口，放入四度冰箱保存待檢。常規(guī)石蠟包埋、固 定、切片。
[0075] 3. 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP-3
[0076] 檢測(cè)步驟：⑴勻漿處理，研磨，56度10-20分鐘。
[0077] ⑵ 12000rpm(_13, 400xg)離心 2-5 分鐘，取上清。
[0078] ⑶加入無(wú)水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，12000rpm(-13, 400xg)離心30-60秒。
[0079] ⑷向 CR3 中加入 350ul 去蛋白液 RW1，12000rpm(-13, 400xg)離心 30-60 秒。
[0080] (5) DNase I 工作液。
[0081] (6)向吸附柱CR3中央加入80ul的DNase I工作液，室溫放置15分鐘。
[0082] (7)向吸附柱 CR3 中加入 350ul 去蛋白液 RW1，12000rpm(-13, 400xg)離心 30-60 秒。
[0083] (8)向吸附柱CR3中加入500ul漂洗液RW,室溫靜置2分鐘，12000rpm(-13, 400xg) 離心30-60秒。
[0084] ⑶重復(fù)步驟8。
[0085] (1Φ 12000rpm(-13, 400xg)離心2分鐘，將吸附柱CR3置于室溫，徹底晾干
[0086] (11)將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴 加 30-100ul RNase-free ddH20,室溫放置 2 分鐘，12000rpm(-13,400xg)離心 2 分鐘，得到 RNA溶液（-70度保存）。
[0087] 〇2)依據(jù)RNA prep pure Tissue Kit說(shuō)明書進(jìn)行RNA純度及濃度檢測(cè)。
[0088] (13)依據(jù) AccuPower?RocketScriptTMRT PreMix 說(shuō)明書進(jìn)行 RNA 逆轉(zhuǎn)錄分 析。
[0089] 3. 3Western Blot 檢測(cè) MMP-3
[0090] (1)樣本總蛋白的提取及定量
[0091] ?切取冰凍組織約100mg置1. 5mlEP管中，PBS漂洗兩遍同時(shí)充分剪碎，離心去上 清。然后每管加4°C裂解液lml，繼續(xù)剪碎、混勻，冰上孵育20分鐘；14000轉(zhuǎn)離心，五分鐘， 取上清備用
[0092] ?取上清5ul，依據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書操作；
[0093] (2)蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜
[0094] ?樣品煮沸5min，冷卻后取50ug上樣；
[0095] ?電泳條件：SDS-PAGE膠，電壓100V，90?120分鐘。
[0096] · PVDF 膜轉(zhuǎn)印條件：300-400mA，10 分鐘；
[0097] · Western封閉液封閉抗體，加入Western封閉液使其充分覆蓋膜，室溫下輕微震 蕩一小時(shí)，即完成；
[0098] (3)抗體孵育及化學(xué)發(fā)光
[0099] · 一抗孵育（Rabbit Anti-MMP-3 antibody 1 :500 稀釋），4°C過(guò)夜；
[0100] ?二抗孵育（辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgGl :500稀釋），37°C，1小時(shí)；
[0101] ?化學(xué)發(fā)光使用Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作；X片擴(kuò)大
[0102] ?以MMP-3蛋白/ β -actin灰度值表示
[0103] 4.數(shù)據(jù)處理
[0104] 采用SPSS18. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差@ 土 S)表示。組間 比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SD-t法檢驗(yàn)，P < 0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0105] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0106] 5. 1肉眼觀察
[0107] 5. 1. 1 -般情況觀察見(jiàn)表1
[0108] 表1大鼠一般情況觀察結(jié)果
[0109]

【權(quán)利要求】
1. 一種治療器官纖維化的藥物組合物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料藥制 備而成的制劑： 菟絲子17-23份，女貞子17-23份，巴戟天10-15份，山萸肉10-15份，五味子3-7份， 百合17-23份，玉竹12-18份，石斛12-18份，沙參12-18份，黨參15-20份，黃芪15-20份， 白術(shù)10-15份，蘇葉2-4份，蘇子10-15份，栝萎15-20份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料藥制 備而成的制劑： 菟絲子20份，女貞子20份，巴戟天12份，山萸肉10份，五味子5份，百合20份，玉竹 15份，石斛15份，沙參15份，黨參18份，黃芪18份，白術(shù)12份，蘇葉3份，蘇子12份，栝萎 18份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或所述的藥物組合物，其特征在于：所述栝萎同時(shí)含有栝萎殼和栝 萎仁。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于：所述藥物組合物是由所述重 量配比的原料藥的水或/和乙醇提取物為活性成分，加上藥學(xué)上常用的輔料或者輔助性成 分制備而成的制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1?4任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于：所述制劑為經(jīng)胃腸 道吸收制劑。
6. 權(quán)利要求1?5任意一項(xiàng)所述藥物組合物的制備方法，其特征在于：它包括如下步 驟： (1) 按所述重量配比稱取原料藥； (2) 將各藥加水煎煮，合并水煎液，加上藥學(xué)上可用的輔料或輔助性成分制備成常規(guī)制 劑。
7. 權(quán)利要求1?5任意一項(xiàng)所述藥物組合物在制備治療器官纖維化的藥物中的用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述用途，其特征在于：所述藥物是治療肺纖維化的藥物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述用途，其特征在于：所述藥物是降低肺組織內(nèi)金屬蛋白酶-3含 量的藥物。
【文檔編號(hào)】A61K36/8984GK104056072SQ201410338459
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】李戎, 程琳, 趙榮光, 彭彩鈺 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)