Gro單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子聯(lián)合在治療肝纖維化中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子聯(lián)合在治療肝纖維化中的用途。腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子聯(lián)合能夠改善肝纖維化狀況。本發(fā)明更好地治愈肝纖維化或?yàn)橹委煾卫w維化提供另一種可行的選擇，提高患者的預(yù)后或者生活質(zhì)量。
【專利說(shuō)明】
GRO單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子聯(lián)合在治療肝纖維化中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體設(shè)及白介素-8(化-8)單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子聯(lián)合 在治療肝纖維化中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟疾病嚴(yán)重影響人類的健康和生活質(zhì)量，是人類面臨的重大傳染性疾病之一。 每年中國(guó)有數(shù)W萬(wàn)計(jì)的患者死于各類肝病，因其并發(fā)癥較多且死亡率較高，肝病的治療引 起了全世界的廣泛關(guān)注和研究。肝病主要包括肝損傷，爆發(fā)性肝衰竭，肝纖維化，肝硬化，肝 細(xì)胞癌，膽汁渺積性肝，自身免疫性肝病，酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝等。肝纖維化是 一種應(yīng)對(duì)各種各樣急/慢性刺激物(包括酒精，病毒感染，藥物，毒素，膽汁和代謝物等)的傷 口損傷反應(yīng)，其是各種各樣慢性肝損傷的必經(jīng)之路和共同結(jié)果。伴隨著刺激物的持續(xù)損傷， 導(dǎo)致重新構(gòu)建肝功能的速度跟不上膠原纖維合成和積累的速度，引起了細(xì)胞外基質(zhì)化CM， ex化acellular matrix)的積累，因過度地積累而產(chǎn)生持續(xù)的生理和病理變化。運(yùn)些變化主 要包括炎癥細(xì)胞的募集，肝細(xì)胞的壞死，內(nèi)皮屏障的損傷，肌成纖維細(xì)胞的激活和最終瘤痕 的形成。持續(xù)的肝纖維化將破壞正常的肝臟結(jié)構(gòu)，形成許多的肝小結(jié)，改變血液循環(huán)，最終 引發(fā)肝硬化甚至演變成肝細(xì)胞癌。
[0003] 正常的肝實(shí)質(zhì)包含上皮細(xì)胞(肝細(xì)胞)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞 和K叩ffer細(xì)胞）。正常的肝臟結(jié)構(gòu)：血竇從肝細(xì)胞中W低密度的基底膜樣的基質(zhì)固定于 Disse內(nèi)，運(yùn)樣可W增加新陳代謝的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)交換。當(dāng)發(fā)生損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞被激活，并 分泌大量的ECM，導(dǎo)致隔膜明顯增厚。纖維化的肝臟結(jié)構(gòu)：損傷達(dá)到一定的程度，ECM大量聚 集在Disse內(nèi)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞窗孔樣結(jié)構(gòu)和肝臟微絨毛損失，而且口靜脈血流量和肝細(xì)胞新 陳代謝交換發(fā)生損害，并引起口靜脈血壓過高。
[0004] 當(dāng)前治療肝纖維化最有效的方法是原位肝移植（0LT，odhotopi C 1 i ver transplantation)，但是因肝臟捐獻(xiàn)者的嚴(yán)重不足，使得化Τ的應(yīng)用受到了極大的限制，因 此新的治療手段是迫切解決肝臟供體短缺的一種方式。
[0005] 干細(xì)胞生物學(xué)已經(jīng)變成了最熱口的生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域之一。MSCs作為一類主要的 成體干細(xì)胞，許多的臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)關(guān)注MSCs在疾病方面的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。 MSCs最初發(fā)現(xiàn)于骨髓，隨后在許多組織與器官中均發(fā)現(xiàn)相似特性的MSCs,包括脂肪，肌肉， 結(jié)締組織，廝帶血，月經(jīng)血，子宮內(nèi)膜，羊膜，脾臟，屯、，牙齒，肺，膜腺，肝，腦，腎臟和外周血。
[0006] 目前，人們利用MSCs治療肝纖維化的研究越來(lái)越深入，而且臨床應(yīng)用也正在進(jìn)行 中。例如，中國(guó)專利申請(qǐng)201010551722.8公開了人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗肝纖維化注射液及 其制備方法，該注射液由10 % -50 %人血白蛋白原液和49.5 % -89.5 %的勃脈力A液、0.5 % 肝素巧組成，其中人血白蛋白原液的濃度為10%，lml注射液中含有人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞6 X 105-7 X 105個(gè);其制備方法包括:提供間充質(zhì)干細(xì)胞保存液，預(yù)冷、備用，該間充質(zhì)干細(xì)胞 保存液包括人血白蛋白原液和勃脈力A液、肝素巧;提供人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞并將其加入到 間充質(zhì)干細(xì)胞保存液中；通過重懸的方式，調(diào)整加入到間充質(zhì)干細(xì)胞保存液中的人廝帶間 充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量為6 X 105-7 X ΙΟ5個(gè)細(xì)胞Ami。中國(guó)專利申請(qǐng)201510024090.2公開了一種用 于治療肝纖維化的干細(xì)胞制劑及其制備方法，所述的治療肝纖維化的干細(xì)胞制劑，是由人 經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞與趨化因子CX化8和生理鹽水配制而成。
[0007] 但是，人們關(guān)于MSCs的易感性有些擔(dān)憂，因?yàn)橛醒芯恳呀?jīng)提出MSCs自發(fā)地發(fā)生惡 變。雖然MSCs向惡性轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)較低，最近公布的數(shù)據(jù)表明，人MSCs可能會(huì)顯示基因組的突 變，并表現(xiàn)基因水平的不穩(wěn)定，在高通道端粒缺失(〉170)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定，參與DNA修復(fù)基因 表達(dá)下調(diào)和異質(zhì)性點(diǎn)突變等。雖然人MSC的惡性變換沒有在臨床試驗(yàn)中報(bào)道，也可能是后續(xù) 跟蹤時(shí)間相對(duì)較短，而腫瘤的發(fā)生可能需要較長(zhǎng)時(shí)間才能出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了更好地治愈肝纖維化或?yàn)橹委煾卫w維化提供另一種可行的選擇，提高患者的 預(yù)后或者生活質(zhì)量，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量、堅(jiān)持不懈的篩選，發(fā)現(xiàn)GRO( growth- regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子) 單獨(dú)或者與其他細(xì)胞因子聯(lián)合能夠用于治療肝 纖維化。而且，與其他細(xì)胞因子的聯(lián)合具有顯著較優(yōu)或者協(xié)同作用。
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一種用于治療肝纖維化的藥物，其含有GR0(growth- regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）。任選地，本發(fā)明的藥物還含有藥學(xué)上可接受的 載體。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明的用于治療肝纖維化的藥物還含有其他細(xì)胞因子，例如選自由骨 保護(hù)素（0PG)、單核細(xì)胞趨化蛋白l(MCP-l)、HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，hepatoc}fte growth factor)、白介素-8(化-8)和白介素-6(化-6)的細(xì)胞因子組成的組的細(xì)胞因子中的1個(gè)、2 個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)。
[0011]本發(fā)明的第二方面提供了GRCKgrowth-regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子） 在制備用于治療肝纖維化的藥物中的用途。任選地，用于治療肝纖維化的藥物還含有藥學(xué) 上可接受的載體。優(yōu)選地，用于治療肝纖維化的藥物還含有其他細(xì)胞因子，例如選自由骨保 護(hù)素（0PG)、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)、HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，hepatoc}fte growth factor)、白介素-8(化-8)和白介素-6(化-6)的細(xì)胞因子組成的組的細(xì)胞因子中的1個(gè)、2 個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)。
[0012] 本發(fā)明的第Ξ方面提供了治療受試者中肝纖維化的方法，其包括向所述受試者中 施用有效量的GRCKgrowth-regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）或者將GRCKgrowth- regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子)聯(lián)合選自由骨保護(hù)素(0PG)、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)、HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，hepatoc}fte growth factor)、白介素-8(比-8)和白介素-6 (比-6)的細(xì)胞因子組成的組的細(xì)胞因子中的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)施用于所述受試者。
[0013] 對(duì)于本發(fā)明所述的受試者，其優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。
[0014] GR0(growth-regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）有Ξ種亞型：GR〇a、GR地、 和GR0 丫。他們分別是CXC趨化因子的一種，GR0與其受體CXCR結(jié)合后，參與機(jī)體的多種病理 生理過程，包括炎癥、感染、創(chuàng)傷愈合和腫瘤發(fā)生。其在惡性腫瘤演進(jìn)中所起的作用是多方 面的，它通過直接促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移W及通過促進(jìn)腫瘤血管形成、白細(xì)胞浸潤(rùn)，共同促進(jìn) 腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，GR0可潛在地作為腫瘤的治療祀點(diǎn)和診斷標(biāo)志物。本領(lǐng)域技術(shù)人員 可W對(duì)GRCKgrowth-regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）作出任何修飾，前提是所述 修飾不負(fù)面影響其活性。例如，可w對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行修飾或裝載在其他載體上，w提高其在 體內(nèi)的半衰期;或者可W與已知的穿透膚連接，W促進(jìn)本發(fā)明化合物的透皮吸收或者越過 血腦屏障等?？傊绢I(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明的所述的細(xì)胞因子進(jìn)行各種修飾W提高遞 送效率或用于其他目的并保持其活性。運(yùn)類修飾也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。
[0015] 在本發(fā)明中，除各種細(xì)胞因子的活性成分外，本發(fā)明的方法、用途和產(chǎn)品還可W包 含合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括促進(jìn)活性成分加工成制劑(例如適于注射或輸注的制 劑)的賦形劑和助劑。
[0016] 適于注射或輸注的制劑可包括水性和非水性無(wú)菌注射液和水性和非水性無(wú)菌混 懸劑，所述無(wú)菌注射液可任選地包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和能使制劑與目的接收者的 血液等壓的溶質(zhì)，所述無(wú)菌混懸劑可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可存在于單位劑量或 多劑量容器中，例如密封的安飯，并且可W保存在凍結(jié)干燥的（凍干)條件，在立即使用前僅 需要加入無(wú)菌液體載體，例如注射用水。
[0017] 本發(fā)明的各種細(xì)胞因子活性成分任選地可與固體賦形劑相組合，且任選地磨碎所 得到的混合物，并且需要時(shí)，在加入合適的助劑后，加工顆粒的混合物，W獲得所需劑型。合 適的賦形劑特別是填充劑例如糖，包括乳糖、薦糖、甘露醇或山梨糖醇;纖維素或淀粉制劑、 明膠、黃著膠、甲基纖維素、徑丙基甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼和/或聚乙締化咯燒酬 (PVP)。需要時(shí)，可W加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙締化咯燒酬、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻 酸鋼。
[0018] 在本發(fā)明中，施用各細(xì)胞因子的量可為能治療或者協(xié)同治療受試者中肝纖維化或 抑制肝纖維化細(xì)胞增殖的任何量，其可W是相當(dāng)于約0.01-15.0mgGR0( growth-regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子），優(yōu)選0.2-2. OmgGRCKgrowth-regulated oncogene，腫瘤生 長(zhǎng)相關(guān)因子)和0.01-20.Omg選自由骨保護(hù)素(0PG)、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)、HGF(肝細(xì) 胞生長(zhǎng)因子，hepatoc}fte growth factor)、白介素-8(化-8)和白介素-6(比-6)的細(xì)胞因子 組成的組的細(xì)胞因子。
[0019] 更優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物的劑量單位包括約l-4mgGR0( growth-regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子)和0.01-20.0 mg選自由骨保護(hù)素(OPG)、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)、HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，hepatoc}fte growth factor)、白介素-8(比-8)和白介素-6 (化-6)的細(xì)胞因子組成的組的細(xì)胞因子。最優(yōu)選地，劑量單位包括約2-3mg的GRCKgrowth- regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）和2.0-6. Omg選自由骨保護(hù)素、單核細(xì)胞趨化蛋 白1 (MCP-1)、HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，hepatoc}fte growth factor)、白介素-8(化-8)和白介 素-6(比-6)的細(xì)胞因子組成的組的細(xì)胞因子。
[0020] 在本發(fā)明中，施用的有效量W及合適的單位劑量的測(cè)定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力 內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的公開內(nèi)容的啟示下。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥學(xué)藥物可任意有效劑量施用給藥受試者。優(yōu)選地，本 發(fā)明的藥物可多次劑量給藥，例如從約2至約15次劑量，更優(yōu)選約4-10次劑量，最優(yōu)選 約6次劑量。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案，在給藥過程中，W每Ξ周給藥約一次的頻率將本發(fā)明 的藥物給藥至受試者，例如注射、輸注或口服。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案，給藥為通過靜脈注 射施用。
[0022] 應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的藥物可W按用于通過任意適宜的途徑給藥的任意適宜的方式 配制。
[0023] 本發(fā)明的藥物的劑量單位是基于常規(guī)進(jìn)行給藥受試者。例如，劑量單位可W基于 給藥頻率為每日一次、每周一次、每月一次等確定。劑量單位也可基于W兩次/周、Ξ次/周 等確定。
[0024] 如本文所使用的，"包含"與"包括"、"含有"或"特征在于"同義，并且是包括在內(nèi)的 或開放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術(shù)語(yǔ)"包含"在本文中的任何表 述，特別是在描述本發(fā)明的方法、用途或產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)理解為包括基本上由所述組分或元件或 步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產(chǎn)品、方法和用途。本文示例性描述的本 發(fā)明適當(dāng)?shù)乜蒞在不存在本文未具體公開的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況 下進(jìn)行實(shí)踐。
[0025] 本發(fā)明的藥物中可包含設(shè)及該藥學(xué)產(chǎn)品的說(shuō)明書，且該說(shuō)明書可W含有如下內(nèi) 容:適應(yīng)癥(例如肝纖維化）、施用劑量(例如上述所示例性說(shuō)明的及可能產(chǎn)生的副作用 AfrAfr 寸寸〇
[0026] 本文已采用的術(shù)語(yǔ)和表述用作描述性而不是限制性術(shù)語(yǔ)，并且在此種術(shù)語(yǔ)和表述 的使用中不預(yù)期排除所示和所述特征或其部分的任何等價(jià)物，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修飾在請(qǐng)求 保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實(shí)施方案和任選 特征具體公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可W采用本文公開的概念的修飾和變化，并且此類修飾 和變化被視為在如由附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0027] 為更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但運(yùn)些實(shí)施例僅僅是 對(duì)本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
【附圖說(shuō)明】
[002引圖1:細(xì)胞上清和細(xì)胞ELISA定量檢測(cè)MCP-1，比-6，HGF，GR0,化-8和OPGdELISA定量 檢測(cè)LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組(co-culture組)培養(yǎng)7化后細(xì)胞上清液W及細(xì)胞的蛋白表 達(dá)量。(A)，細(xì)胞上清液蛋白量。（B)，細(xì)胞的蛋白表達(dá)量。分析及作圖采用GraphPad Prism 5 軟件。數(shù)值代表平均值± SD(η = 4)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0030] 實(shí)施例1:肝纖維化小鼠模型的建立及鑒定
[0031] 本發(fā)明使用本領(lǐng)域常用的通過αη4損傷小鼠肝臟而建立的肝纖維化小鼠模型。
[0032] 將6-8周ICR小鼠（購(gòu)自上海斯萊克(SLAC)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）腹腔注射0^4， 按照ImL CCWkg小鼠體重注射。CC1擬10 %的比例溶解于橄攬油(01 ive 0i 1)中，用ImL微 型注射器(BD Biosciences)每周注射兩次并持續(xù)注射4周，運(yùn)樣就建立了小鼠的早期肝纖 維化模型。通過摘取小鼠肝臟，對(duì)其進(jìn)行Sirius red染色，檢驗(yàn)肝臟組織病理情況；同時(shí)檢 測(cè)小鼠的血清肝功能指標(biāo)，包括ALT，AST，ALB，ALP和TBIL。通過W上指標(biāo)，驗(yàn)證小鼠纖維化 模型是否構(gòu)建成功。
[0033] 實(shí)施例2 :MenSCs的分離和體外培養(yǎng)
[0034] 在經(jīng)期健康女性自愿者月經(jīng)周期時(shí)，利用Divac啡化itchener，0N)收集女性經(jīng)血 樣品。在獲取樣品后的2天之內(nèi)，將樣品小屯、存于4°C。取出運(yùn)些樣品之后，后續(xù)操作程序均 在細(xì)胞房中進(jìn)行處理。將收集到的經(jīng)血進(jìn)行離屯、（1000巧m，10min，4°C)，利用Ficoll-Paque 分離得到液體中的單核細(xì)胞(混合型），隨后將細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)上清液中細(xì)菌數(shù)量， 待各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)標(biāo)后進(jìn)行細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)。細(xì)胞分離之后用PBS洗涂3-5次(盡可能棄去雜 質(zhì)），然后將分離純化的細(xì)胞轉(zhuǎn)到加有DMEM/F1 2培養(yǎng)基（添加了 1 % penicillin/ streptomycin、1 %amphote;ricin B和15%FBS)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning)中繼續(xù)貼壁培養(yǎng)。 將分離后的細(xì)胞培養(yǎng)一周左右，每隔2天換1次液，同時(shí)吸棄未能正常貼壁的懸浮細(xì)胞/死細(xì) 胞。隨后，每隔3天更換新鮮化ang培養(yǎng)基，選取形態(tài)分布均一、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MenSCs進(jìn)行 擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用PBS洗涂3次，而后加入0.25%化ypsin-EDTA(5- lOmin)進(jìn)行細(xì)胞消化，將消化后的細(xì)胞進(jìn)行離屯、并按照1:3的比例進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)(加入 新鮮培養(yǎng)基）。所有培養(yǎng)的細(xì)胞均放置于3 7 Γ恒溫和5 % C〇2的飽和濕度培養(yǎng)箱 (ThermoFisher)中。經(jīng)過約5代的擴(kuò)大培養(yǎng)，其形態(tài)已經(jīng)基本趨于穩(wěn)定和均一，并可W見到 細(xì)胞呈現(xiàn)典型的梭形并呈旋滿狀排列。
[0035] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證MenSCs的特性，利用流式細(xì)胞儀對(duì)MenSCs進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記分子 的鑒定，檢測(cè)的分子包括〔029，〔034，〔045，〔073，〔090，〔0105，〔0117和化4-03。結(jié)果顯示 MenSCs能夠高表達(dá)CD29，CD73，CD90和CD105(均>90%)，低表達(dá)CD45,幾乎不表達(dá)CD：34， CD11 巧陽(yáng) LA-DR(均 <1%)。
[0036] 本文實(shí)施例中所使用的MenSCs為第5到第8代次的細(xì)胞(P5-P8)，除非特別指出。
[0037] 實(shí)施例3:表達(dá)綠色巧光蛋白（GFP)的MenSCs(GFP+MenSCs)的構(gòu)建和篩選
[0038] P2-P3的MenSCs培養(yǎng)于T75培養(yǎng)瓶(Corning)中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到大約50%時(shí)吸 棄培養(yǎng)基，用PBS洗涂3次，添加含有化g/mL的polybrene (漢恒生物科技有限公司）W及GFP- PUR0(漢恒生物科技有限公司）病毒液(M0I = 50 ;M0I，multiplicity of infection)的 lOmLChang氏完全培養(yǎng)基(杭州易文賽生物科技有限公司）。1天后更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞 培養(yǎng)2-3天后再次更換新鮮培養(yǎng)基，并用化g/mL的pu;romycin(Sigma)進(jìn)行細(xì)胞篩選。對(duì)篩選 后的細(xì)胞(GFP+MenSCs)進(jìn)行GFP陽(yáng)性檢測(cè)W及細(xì)胞表面標(biāo)記分子（包括CD29，CD34，CD45， 〔073，〔090，〔0105，〔0117和化4-01〇的表達(dá)與鑒定。
[0039] 取篩選兩周后的部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，可W看出，與正常MenSCs相比，GFP+MenSCs并 沒有發(fā)生明顯的形態(tài)變化，而通過GFP巧光直觀觀察，發(fā)現(xiàn)幾乎全部的細(xì)胞(>99%)已經(jīng)感 染上了慢病毒，運(yùn)樣的結(jié)果通過流式細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步確認(rèn)。
[0040] 為了驗(yàn)證GFP+MenSCs的表面標(biāo)志物是否發(fā)生變化，檢測(cè)了和MenSCs相對(duì)應(yīng)的表面 分子。結(jié)果顯不與正常MenSCs相比，GFP+MenSCs并沒有發(fā)生明顯的表面標(biāo)記分子改變，而且 表面標(biāo)記分子特性和MenSCs-致。運(yùn)進(jìn)一步表明化ro-GFP慢病毒對(duì)于經(jīng)血干細(xì)胞的形態(tài)及 表面標(biāo)記分子并無(wú)明顯的影響。
[0041 ] 實(shí)施例4:活體成像檢測(cè)GFP+MenSCs移植小鼠后的組織分布
[0042] 為了驗(yàn)證MenSCs具有向肝損傷部位趨化的功能，將穩(wěn)定篩選的GFP+MenSCs移植到 小鼠體內(nèi)，一共分為5個(gè)組別：
[0043] (1)正常對(duì)照組(normal control):對(duì)小鼠不做任何處理；
[0044] (2)GFP+MenSCs移植到正常小鼠 （normal mice)l周組(命名為GFP+1W in NM);
[0045] (3)GFP+MenSCs移植到肝纖維化模型小鼠 （liver f化rosis mice)l周組（命名為 GFP+IW in LFM);
[0046] (4)GFP+MenSCs移植到正常小鼠2周組(命名為GFP+2W in NM);
[0047] (5)GFP+MenSCs移植到肝纖維化模型小鼠2周組(命名為GFP+2W in LFM)。
[0048] 上述各組別的小鼠均采用麻醉處死，然后利用手術(shù)剪刀和眼科綴子將主要的幾個(gè) 器官進(jìn)行分離，運(yùn)些臟器包括肝（liver)，肺（lung)，脾（spleen)，腎化idney)和屯、化ea;rt)。 分離得到的器官用PBS清洗3次(每次3min)，運(yùn)樣就能完全的去除殘留的血塊和雜貨(減少 或去除活體成像產(chǎn)生的干擾）。每個(gè)組平行處理6只小鼠 （n = 6)。運(yùn)些分離得到的器官在 IVIS SPECTRUM小鼠活體成像系統(tǒng)（Caliper Life Sciences)下拍照，并用相關(guān)軟件 (；Living Image 4.3.1 software)對(duì)巧光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0049] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組幾乎不表達(dá)GFP蛋白，GFP+1W/2W in醒組和GFP+1W/2W in LFM組能夠在肝臟中表達(dá)GFP蛋白。GFP+1W/2W in LFM組的巧光強(qiáng)度明顯高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的 GFP+1W/2W in NM組。更重要的是，GFP+1W/2W in LFM組中大部分MenSCs遷移到了肝臟部位。 運(yùn)些結(jié)果顯示MenSCs能夠定向遷移到損傷部位。此外，巧光強(qiáng)度分析軟件進(jìn)一步確認(rèn)了該 結(jié)果。
[(K)加]實(shí)施例5:肝組織CK-18免疫巧光檢測(cè)
[0051] 在干細(xì)胞移植后的1周和2周，分別取MenSCs組(MenSCs 2W)和GFP+MenSCs組(GFP+ MenSCs 1W和GFP+MenSCs 2W)小鼠的肝臟，每個(gè)組別有6個(gè)樣品（n = 6)。將收集的肝組織用 錫錐紙包起來(lái)，快速凍存于-80°C冰箱。具體的免疫巧光操作步驟如下：
[0化2] (1)迅速?gòu)?80 °C冰箱取出冰凍組織并用Tissue-Tek 0CT包埋劑（Sakura)將樣品 進(jìn)行包埋；
[0053] (2)將樣品放置于冰凍切片機(jī)(CryoStar NX50，Thermo)切片，厚度為4-6皿；
[0054] (3)在室溫放置30min，然后加入4°C預(yù)冷的丙酬（固定樣品lOmin)，接著用PBS清洗 3次(每次5min);
[0055] (4)阻斷內(nèi)源性過過氧化氨化2〇2)酶:加入3%的此化（約lOmin)，然后用蒸饋水進(jìn) 行水洗3min，之后再用PBS(0.01M PH=7.5)清洗切片Ξ次(每次約5min);
[0056] (5)封閉：用5%的正常山羊血清（用PBS進(jìn)行稀釋），然后在室溫解育20min，接著再 用PBS清洗切片Ξ次(每次約5min);
[0057] (6)滴加適當(dāng)比例稀釋的特異性抗人CK-18-抗，4°C解育過夜，接著再用PBS清洗 切片Ξ次(每次約5min);
[005引（7)滴加適當(dāng)比例稀釋的Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗（稀釋比例1:400)，室溫解育 60min;
[0059] (8)用DAPI復(fù)染20minW標(biāo)記細(xì)胞核，然后用PBS清洗切片Ξ次(每次約5min);
[0060] (9)封片，用巧光顯微鏡(U-HGLGPS光源，Olympus)觀察并拍照。
[0061 ] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MenSCs 2W組幾乎不表達(dá)GFP;相比于MenSCs 2W組，GFP+MenSCs組能夠 明顯的表達(dá)GFP，并且GFP+MenSCs 2W的巧光強(qiáng)度高于GFP+MenSCs 1W組。400倍放大的圖片更 加清晰的展示了運(yùn)一結(jié)果（圖略）。運(yùn)些進(jìn)一步驗(yàn)證了 MenSCs具有向損傷部位趨化的作用。 特異性抗人CK-18的表達(dá)用于檢測(cè)MenSCs移植到小鼠肝臟后，MenSCs是否有部分細(xì)胞分化 成肝樣細(xì)胞。結(jié)果表明，MenSCs并未分化成肝樣細(xì)胞。
[0062] 實(shí)施例6:移植經(jīng)血干細(xì)胞改善小鼠的肝纖維化
[0063] 實(shí)施例6.1:小鼠尾靜脈移植
[0064] 使細(xì)胞濃度為5Xl〇VmL，用ImL微型注射器通過尾靜脈注射到已經(jīng)構(gòu)建好的纖維 化模型小鼠中（每只小鼠移植約5 X 105細(xì)胞/100化）。將GFP+MenSCs/MenSCs移植到肝纖維化 模型小鼠命名為GFP+MenSCs組/MenSCs組，同時(shí)將只注射等量PBS的肝纖維化模型小鼠命名 為PBS組。為了防止發(fā)生小鼠纖維化自發(fā)性恢復(fù)的情況，在干細(xì)胞移植的兩周中，小鼠持續(xù) 注射αη4。
[00化]實(shí)施例6.2: SR染色
[0066] 在干細(xì)胞移植到小鼠后的第1周和第2周，分別麻醉并脫頸處死小鼠，分別取 MenSCs組(MenSCs 1W和MenSCs 2W)和PBS組(PBS 1W和PBS 2W)小鼠的肝臟，每個(gè)組別有6個(gè) 樣品(n = 6)。具體的組織處理步驟如下：
[0067] (1)固定:組織加入到10%的中性福爾馬林中，固定大概1天；
[0068] (2)脫水:取出固定好的組織，將其依次放入梯度酒精進(jìn)行脫水(分別是70%酒精 化，80%酒精化，95%酒精化和100%酒精化）；
[0069] (3)透明：先用二甲苯I浸泡lOmim，然后用二甲苯II浸泡20min;
[0070] (4)浸蠟:先用軟蠟在60°C下化，然后用硬蠟在60°C下化；
[0071] (5)包埋:硬蠟包埋；
[0072] (6)切片：在石蠟切片機(jī)(歷325型輪轉(zhuǎn)式）上進(jìn)行組織切片，切片的厚度大概為扣 m;
[0073] (7)烤片:在60°C條件下，烤約地。
[0074] 將干燥的石蠟切片放置于二甲苯中，依次在梯度酒精中（100 %酒精3min，95%酒 精3min，80 %酒精3min，70%酒精3min)進(jìn)行脫蠟處理。用事先配好的0.1 % SR(0.1 g SR溶于 lOOmL picric acid中）進(jìn)行解育30min，使用蒸饋水沖洗1-2次，使用梯度酒精脫水，中性樹 脂進(jìn)行封片，利用顯微鏡（Olympus 1X83)進(jìn)行圖像采集。利用IPP 6software(Image Pro Plus 6，Media Cybernetics)分析膠原纖維面積(膠原面積/總的面積）。
[0075] MenSCs移植到纖維化小鼠1周和2周后，觀察并檢測(cè)膠原纖維面積。結(jié)果表明，盡管 MenSCs 1W組（1.9% )的膠原積累面積低于PBS 1W組(2.4% )，但其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒有顯著 性差異；相反，MenSCs 2W組(2.2 % )的膠原纖維面積相比于PBS 2W組(3.4% )有明顯減少， 說(shuō)明肝纖維化在MenSCs移植2周后病理指標(biāo)上得到了改善。
[0076] 實(shí)施例6.3:小鼠血清肝功能指標(biāo)檢測(cè)
[0077] 在干細(xì)胞移植到小鼠后的第1周和第2周，分別麻醉并脫頸處死小鼠，分別收集 MenSCs組(MenSCs 1W和MenSCs 2W)和PBS組(PBS 1W和PBS 2W)小鼠的血清，每個(gè)組別有6個(gè) 樣品(n = 6)。具體的血清收集步驟如下：
[0078] (1)將麻醉的小鼠平穩(wěn)放置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使用眼科手術(shù)綴子進(jìn)行小鼠眼球取血，傾斜 小鼠，讓其血液自然流出，放入到1.5mL的EP管中；
[0079] (2)將傾斜管壁，常溫放置90min;
[0080] (3)輕柔操作，放入離屯、機(jī)中離屯、:4Γ，4000巧m，15min;
[0081] (4)用10化L槍頭緩慢吸取上清液(注意不要碰到下層的血塊）；
[0082] (5)將上清液冰浴2min，然后-20°C凍存?zhèn)溆茫?br>[0083] 利用南京建成試劑盒，檢驗(yàn)血清學(xué)中肝功能常見指標(biāo)(41；1'，451'，41^8,41?和了8比）。
[0084] MenSCs細(xì)胞移植到纖維化小鼠1周和2周后，分別取樣檢測(cè)血清ALT, AST, ALB, ALP 和TBIL(表1)。結(jié)果表明，除了ALT之外，MenSCs IW組(相比于PBS IW組）的血清學(xué)指標(biāo)并沒 有顯著性差異;相反，MenSCs2W組(相比于PBS 2W組）的血清學(xué)指標(biāo)有較顯著的降低(ALB除 外），說(shuō)明肝纖維化在生理指標(biāo)上得到了改善。
[0085] 表1小鼠常見肝功能血清指標(biāo)檢測(cè)
[0086]
[0087] 注:ALT,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;AST,天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;ALB，白蛋白；ALP，堿性憐 酸酶;TBIL，總膽紅素/V'代表P<0.05，"**"代表P<0.01。
[0088] 實(shí)施例6.4:服Cs活化指標(biāo)及促纖維化因子檢測(cè)
[0089] 實(shí)施例6.4.1 :qRT-PCR檢測(cè)服Cs活化相關(guān)基因表達(dá)
[0090] 實(shí)時(shí)巧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)MenSCs移植 后肝臟中服Cs活化相關(guān)標(biāo)志基因 a-SMA和促纖維化因子TGF-化的表達(dá)變化。
[0091] 在a-SMA表達(dá)中，肝纖維化模型組的表達(dá)量(6.6倍，相對(duì)于注射了橄攬油的正常小 鼠組，下同）相比于注射了橄攬油的正常小鼠組有極顯著上升;將MenSCs移植至肝纖維化小 鼠模型后一周（7.1倍）的表達(dá)量相比于將PBS移植至肝纖維化小鼠模型后1周的PBS 1W組 (8.1倍）有顯著下降趨勢(shì)，同樣，將MenSCs移植至肝纖維化小鼠模型后2周的MenSCs2W組 (9.1倍)的表達(dá)量相比刊尋PBS移植至肝纖維化小鼠模型后2周的PBS 2W組（12.3倍)也有顯 著下調(diào)趨勢(shì)。類似地，在TGF-βΙ表達(dá)中，肝纖維化模型組的表達(dá)量(2.2倍)相比于注射了橄 攬油的正常小鼠組有極顯著上升;將MenSCs移植至肝纖維化小鼠模型后1周的MenSCs 1W組 和將PBS移植至肝纖維化小鼠模型后1周的PBS 1W組的表達(dá)并沒有顯著性差異，然而，將 MenSCs移植至肝纖維化小鼠模型后兩周后(4.6倍）的表達(dá)相比于將PBS移植至肝纖維化小 鼠模型后2周的PBS 2W組(3倍)有顯著的下調(diào)。
[0092] 實(shí)施例6.4.2:免疫組織化學(xué)檢測(cè)a-SMA和TGF-化的蛋白表達(dá)水平
[0093] 在經(jīng)血干細(xì)胞移植到小鼠后的第1周和第2周，分別麻醉并脫頸處死小鼠，分別取 MenSCs組(MenSCs 1W和MenSCs 2W)和PBS組(PBS 1W和PBS 2W)小鼠的肝臟，每個(gè)組別有6個(gè) 樣品(η = 6)。將肝臟組織制作成干燥的石蠟切片(參照2.1.3.3.2.2)，利用化Vi S ion (Dako) 二步法來(lái)檢測(cè)α-SMA和TGF-化的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)具體的操作步驟如下：
[0094] (1)脫蠟:先用二甲苯I浸泡lOmim，然后用二甲苯II浸泡lOmin;
[00M] (2)將干燥的石蠟切片放置于二甲苯中，依次在梯度酒精中（100%酒精3min，95% 酒精3min，80 %酒精3min，70 %酒精3min)進(jìn)行脫蠟處理，然后水洗2min;
[0096] (3)抗原修復(fù):切片放入到已經(jīng)預(yù)熱好的O.OlM(moVL)巧樣酸緩沖液(PH = 6.0) 中，將其煮沸(約20min)，然后取出切片讓其自然的冷卻；
[0097] (4)阻斷內(nèi)源性過過氧化氨化2〇2)酶:加入3%的此化（約lOmin)，然后用蒸饋水進(jìn) 行水洗3min，之后再用PBS(0.01M PH=7.5)清洗切片Ξ次(每次約5min);
[0098] (5)滴加 a-SMA和TGF-m-抗，工作濃度為1:100，將切片放置在濕盒中，于4°C冰箱 內(nèi)解育過夜；
[0099] (6)PBS清洗切片Ξ次（每次約5min)，然后滴加 HRP共輛的抗鼠或抗兔IgG二抗 化nVision工作液），將其放置于室溫30min;
[0100] (7)PBS清洗切片Ξ次(每次約5min)，然后加入DAB顯色液解育20min;
[0101] (8)蒸饋水洗，終止顯色；
[0102] (9)用化rris蘇木精來(lái)復(fù)染切片30s，然后用蒸饋水清洗切片（約lOmin，是為了進(jìn) 行蘭化）；
[0103] (10)依次在梯度酒精中（100%酒精3min，95%酒精3min，80%酒精3min，70%酒精 3min)處理，然后用二甲苯透明，接著用中性樹脂進(jìn)行封片；
[0104] (11)驚干，在顯微鏡（1X83，Olympus)下觀察并拍照。
[0105] 分別收集四個(gè)組(0^4組，Vehicle組，MenSCs組和PBS組）小鼠的肝組織，利用免疫 組化檢測(cè)Q-SMA和TGF-β?的蛋白表達(dá)情況。纖維化模型組命名為αη4組;將只注射橄攬油的 正常組小鼠命名為Vehicle組;將MenSCs移植到肝纖維化模型小鼠命名為MenSCs組；W及將 PBS注射到肝纖維化模型小鼠命名為PBS組。在Vehicle組中a-SMA的表達(dá)僅限于血管平滑肌 細(xì)胞和中央靜脈周圍；而在ecu組中a-SMA能夠表達(dá)于竇周間隙，表明HSCs被激活了。 MenSCs移植到纖維化小鼠1周和2周后，MenSCs 1W組（相比于PBS 1W組）和MenSCs 2W組（相 比于PBS 2W組）的a-SMA表達(dá)明顯受到了抑制，說(shuō)明MenSCs移植能夠降低HSCs的激活。類似 地，在Vehicle組中TGF-βΙ表達(dá)于細(xì)胞漿中且?guī)缀跞勘磉_(dá)，而在0^4組中TGF-m的表達(dá)也 是全部表達(dá)于所有細(xì)胞中，但是其表達(dá)量明顯增強(qiáng)。MenSCs移植到纖維化小鼠1周和2周后， MenSCs 1W組的TGF-m表達(dá)與PBS 1W組相比，并沒有顯著性差異，而MenSCs 2W組（相比于 PBS 2W組）的TGF-化表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱。
[0106] 實(shí)施例6.4.3:Western blot檢測(cè)a-SMA的蛋白表達(dá)
[0107] 麻醉處死小鼠后，分別收集四個(gè)組(ecu組，Vehi cle組，MenSCs組和PBS組，各組的 命名同實(shí)施例6.4.2)小鼠的肝臟組織，取米粒大小的肝臟，用小型勻漿器破碎組織。首先加 入50化1的蛋白裂解液(按照比例RIPA裂解液:PMSF=100:1進(jìn)行配制），然后在冰上進(jìn)行裂 解(約60min)，接著4°C離屯、（12000巧m，5min)，將離屯、所得的上清液轉(zhuǎn)移到1.5血的EP管中。 利用BCA試劑盒測(cè)定肝組織樣品的蛋白濃度，做好記錄并保存于-80°C冰箱備用。
[0108] 每個(gè)組別取20yg蛋白上清液，western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)a-SMA蛋白表達(dá)。具體步驟如 下：
[0109] (1)蛋白上清液按照 1:4的比例混合于4X loading buffer(Life Technologies) 中，將混合后的樣品放入到98°C金屬加熱儀(加熱5min)，使樣品中的蛋白質(zhì)得到充分的變 性；
[0110] (2)把10%預(yù)制膠化ife Technologies)放入電泳槽中，將樣品加入新鮮的電泳緩 沖液化ife Technologies)中跑膠，W電壓為120V的強(qiáng)度進(jìn)行電泳(大約70min，W藍(lán)色指示 劑到達(dá)預(yù)制膠3/4處為宜）；
[0111] (3)用?？诘那心z器進(jìn)行切膠，然后依次鋪上Ξ層海綿，四層過濾濾紙，切下來(lái)的 凝膠，PVDF膜(Millipore)，四層過濾濾紙，Ξ層海綿，隨后將配制好的轉(zhuǎn)膜緩沖液倒入 western blot電泳槽(；Life Technologies)中，接著將其轉(zhuǎn)入4°C冰箱中且W恒定的電流 (200mA)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜化；
[0112] (4)用0.5%的BSA溶液(生工生物科技有限公司），并放置于搖床上室溫平搖封閉 化左右；
[0113] (5)用TBST洗膜2次(每次洗膜約lOmin，置于搖床上進(jìn)行），然后加入一抗于4°C解 育過夜；
[0114] (6) -抗回收，用TBST洗膜3次(每次洗膜約lOmin，置于搖床上進(jìn)行）；
[0115] (7)加入相應(yīng)的二抗，然后在室溫下放置于搖床中解育化；
[0116] (8)用TBST洗膜3次（每次洗膜約lOmin，置于搖床上進(jìn)行），加入ECL化學(xué)發(fā)光液 (Bio-Rad)，在全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-4500智能轉(zhuǎn)換型)下進(jìn)行掃膜并拍照。
[0117] 其中，轉(zhuǎn)膜緩沖液的配方:甘氨酸為2.9g，Tris為5.8g，SDS為0.37g，甲醇200mL，加 (1地2〇定容至lOOOmL; TBST的配方：Tris-base為24.知和化Cl為80g，用濃HC1調(diào)整PH至7.4 (P巧旨示劑），然后加0.05%的Tween 20(Sigma)。
[0118] 結(jié)果表明，Vehicle組幾乎不表達(dá)a-SMA，〇n4組的表達(dá)量呈顯著上升;MenSCs IW 組的蛋白表達(dá)量相比于PBS IW組有顯著下降趨勢(shì)，同樣地，MenSCs 2W組的蛋白表達(dá)量相比 于PBS 2W組也有顯著下調(diào)趨勢(shì)。
[0119] 為了進(jìn)一步調(diào)查經(jīng)血干細(xì)胞是如何改善肝纖維化，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了一下實(shí) 施例。
[0120] 實(shí)施例7:MenSCs和LX-2細(xì)胞Transwell模型的建立
[0121] 為了研究MenSCs對(duì)LX-2細(xì)胞的影響，利用Transwel 1小室(濾膜直徑：24mm，濾膜孔 徑:0.4皿;Crning)，將本研究分為3個(gè)組別，即LX-2組(n = 4)，2X lOVwell的LX-2細(xì)胞鋪于 Transwell小室的下層;MenSC組(n = 4)，2 X l〇5/well的MenSCs鋪于Transwell小室的上層； 共培養(yǎng)組（CO-州l1:ure組）（n = 4)，2 X l〇5/well的LX-2細(xì)胞鋪于Transwell小室的下層并且 2 Xl〇5/well的MenSCs鋪于Transwell小室的上層。每個(gè)小室均加3mL的DMEM培養(yǎng)基（10% FBS)。
[0122] 實(shí)施例8 :MenSCs對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響
[0123] 為了研究MenSCs對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響，采CCK-8(Dojindo)試劑盒檢測(cè)LX-2組和 共培養(yǎng)組(co-culture組）中LX-2細(xì)胞增殖情況，具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0124] (1)LX-2組(n = 4)和共培養(yǎng)組（co-culUire組）（n = 4)共培養(yǎng)2地，4她和7化；
[0125] (2)按照說(shuō)明書，分別向其底層加入一定量的CCK-8試劑（同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組；
[0126] (3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)解育化(視情況1-化）；
[0127] (4)用多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，Molecular Devices)測(cè)定在450nm處的0D 值；
[0128] (5)計(jì)算，將所得到的OD值減去相應(yīng)的空白對(duì)照。所得結(jié)果即為該組別的OD450。
[0129] 2.2.4. IMenSCs抑制LX-2細(xì)胞增殖
[0130] 在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前，驗(yàn)證了 LX-2細(xì)胞。通過細(xì)胞免疫巧光染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LX-2 細(xì)胞幾乎全部表達(dá)a-SM(>95 % )，同時(shí)放大400倍后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，基本骨架清晰 正常。說(shuō)明LX-2細(xì)胞已經(jīng)處于激活狀態(tài)，能夠作為后續(xù)的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
[0131] 在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，觀測(cè)了LX-2組和共培養(yǎng)組（co-culture組)在共培養(yǎng)2地，4她和 7化之后，LX-2細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目。發(fā)現(xiàn)，雖然在細(xì)胞培養(yǎng)24h后，LX-2組和共培養(yǎng)組 (CO-州Iture組）中的LX-2細(xì)胞數(shù)目差異不顯著；在細(xì)胞共培養(yǎng)4她和7化后，共培養(yǎng)組（CO- culture組）中的LX-2細(xì)胞的數(shù)目明顯少于LX-2組。更進(jìn)一步，用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并驗(yàn)證了 LX-2細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)4她和72h的共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)組(co-culture組）中的0D值明顯低 于LX-2組，也就是說(shuō)共培養(yǎng)使得LX-2細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖明顯受到抑制。
[0132] 實(shí)施例9:MenSCs對(duì)LX-2細(xì)胞周期的影響
[0133] 為了研究MenSCs對(duì)LX-2細(xì)胞周期的影響，利用細(xì)胞周期試劑盒(Sigma)檢測(cè)LX-2 組和共培養(yǎng)組k〇-culture組）中LX-2細(xì)胞培養(yǎng)4她和7化的細(xì)胞周期情況。具體的細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0134] (1) LX-2組(η = 4)和共培養(yǎng)組(CO-CU1化re組）（η = 4)共培養(yǎng)4她和7 2h;
[0135] (2)將細(xì)胞消化于15mL離屯、管中，用70%預(yù)冷的乙醇固定，隨后室溫沉淀細(xì)胞 (1000巧m，5min)，去上清；
[0136] (3)加 lmL7令PBS重懸細(xì)胞，隨后沉淀細(xì)胞（1000巧m，5min)，倒掉PBS;
[0137] (4)配制PI染色液，按照下列比例配制，包括緩沖液(475化），20XPI染色液(2扣L) 和50XRNAase A(10yL);
[0138] (5)每管細(xì)胞加入5(Κ)化的PI染色液，然后緩慢并充分地重懸細(xì)胞；
[0139] (6)37°C避光解育30min，然后用300目的細(xì)胞篩過濾細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀 (Beckman)檢測(cè)細(xì)胞周期。
[0140] 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了 LX-2組和共培養(yǎng)組（co-cul ture組）中LX-2細(xì)胞4她和72h 的細(xì)胞周期情況。共培養(yǎng)4她后，LX-2組和共培養(yǎng)組(co-culture組）中的LX-2細(xì)胞G0/G1期， S 期和 G2/M 期分別是 47 ± 2 % (G0/G1)，35±3%(S)，18±1% (G2/M)和 62 ± 3 % (G0/G1)，23 ± 2% (S)，15 ± 1 % (G2/M)。類似地，共培養(yǎng)7化后，LX-2組和共培養(yǎng)組ko-culture組）中的LX- 2細(xì)胞 G0/G1 期，S期，G2/M 期分別是 71±3%(G0/G1)，15±2%(S)，14±1%(G2/MWP83±3% (60/61)，8±2%(5)，9±1%(62/]\〇。也就是說(shuō)在4她和7化時(shí)，共培養(yǎng)組山〇-州1化的組）中， 處于G0/G1期的LX-2細(xì)胞顯著高于LX-2組。說(shuō)明MenSCs能夠?qū)X-2細(xì)胞阻滯于G0/G1期，并 能抑制其增殖。
[0141 ]實(shí)施例10:抗體忍片檢測(cè)細(xì)胞上清液的蛋白表達(dá)
[0142] 為了進(jìn)一步探究MenSCs分泌哪些因子來(lái)對(duì)LX-2細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，利用人細(xì) 胞因子G1000忍片（AAH-CYT-G1000，RayBiotech)來(lái)檢測(cè)LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組（CO- 州1化re組)培養(yǎng)7化后120個(gè)細(xì)胞因子的上清。細(xì)胞上清采用上下層培養(yǎng)液混合后統(tǒng)一收集 的方式。具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0143] (1)將新的玻片忍片(保存于-20°C)從盒子中取出來(lái)，在室溫下平衡30min，然后將 忍片放置于干燥器中化，W保證忍片完全干燥；
[0144] (2)每個(gè)忍片孔中加入1(Κ)化的IX封閉液，然后在室溫?fù)u床上解育30min(主要是 為了避免產(chǎn)生氣泡而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）；
[0145] (3)將封閉液倒掉，在每個(gè)孔中添加10化L細(xì)胞上清樣品（LX-2組，MenSC組和共培 養(yǎng)組(co-culture組），n = 4)，一個(gè)陣列加入一個(gè)樣品(n = 4)，將忍片平穩(wěn)放置并于4°C解育 過夜；
[0146] (4)使用Tliermo Scientific Wellwash Versa忍片洗板機(jī)清洗玻片；
[0147] (5)配制生物素標(biāo)記的抗體，然后快速離屯、標(biāo)記有生物素抗體的小管，每個(gè)小管中 加入3(Κ)化的IX封閉液，混合均勻后再每孔加入TOliL的生物素標(biāo)記抗體；
[0148] (6)每孔加入等量的（7化L)巧光劑-鏈霉親和素（1500倍稀釋比例），然后快速離屯、 并加入1.5mL的封閉液到小管中，接著用密封條將玻璃忍片貼住，然后再用侶錐紙包住玻璃 忍片并在避光條件下室溫解育化；
[0149] (7)巧光檢測(cè)：采用激光掃描儀(GenePix 4000B Microarray Scanner)掃描信號(hào)， 采用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)因子進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析（具體篩選因子的條件：共培養(yǎng)組（CO- 州1化re組)與LX-2組/MenSC組均有顯著性差異，巧光強(qiáng)度值不低于300)。
[0150] 2.2.4.3抗體忍片檢測(cè)差異表達(dá)的因子
[0151] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCP-1，化-6，服。，630，化-8和0?6高表達(dá)于共培養(yǎng)組（(3〇-(3111村'6組） (相比較LX-2組和MenSC組）。此外，對(duì)所有差異表達(dá)的因子(詳見表2)進(jìn)行了熱圖分析。進(jìn)一 步確信MCP-1，比-6,服F，GR0,比-8和0PG是運(yùn)些差異因子中更為顯著的。運(yùn)些因子中，MCP-1 和化-6的上升倍數(shù)最顯著，其次是HGF，GR0和化-8。有趣的是，0PG因子在MenSC組和共培養(yǎng) 組(co-culture組)均能高表達(dá)，而在LX-2組幾乎不表達(dá)。
[0152] 表2差異表達(dá)的因子和編號(hào)
[0153]
[0154]
[01W]實(shí)施例11 :ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液w及細(xì)胞裂解液的蛋白表達(dá)
[0156] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證運(yùn)些抗體忍片中得到的差異較明顯的因子(MCP-1，化-6，HGF， GR0,化-8和0PG)，利用化ISA試劑盒(RayBiotech)，定量檢測(cè)LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組 (co-cul ^re組)培養(yǎng)72h后細(xì)胞上清液W及細(xì)胞的蛋白表達(dá)量。細(xì)胞的測(cè)定是通過細(xì)胞裂 解液(CST)來(lái)收集并檢測(cè)，其中的共培養(yǎng)-LX-2代表共培養(yǎng)組ko-culture組）中下層的LX-2 細(xì)胞;共培養(yǎng)-MenSC代表共培養(yǎng)組（co-culture組）中上層的MenSCs。具體的化ISA實(shí)驗(yàn)步驟 如下：
[0157] (1)將忍片放置在試劑盒W及樣品平衡至室溫（18-25°C)，所有標(biāo)準(zhǔn)品W及樣品使 用單孔檢測(cè)；
[0158] (2)將已經(jīng)包被抗體的化ISA板放置于室溫下平衡30min，隨后在對(duì)應(yīng)的孔中加入 100化配制好的標(biāo)準(zhǔn)品（Raybiotech)及樣品（細(xì)胞上清或細(xì)胞裂解液），接著用封板膜封住 板條并于4 °C解育過夜；
[0159] (3)將配制好的IX洗液放置于洗板機(jī)上，用洗板機(jī)來(lái)清洗板條（清洗4次，每次 lOmin)，隨后在每個(gè)忍片孔中加入3(Κ)化的洗液；
[0160] (4)將洗板清洗干凈后，再在每個(gè)忍片孔中加入10化L配制好的檢測(cè)抗體(用生物 素抗體進(jìn)行標(biāo)記)并于室溫下解育化；
[0161] (5)每個(gè)忍片孔中加入10化L配制好的皿Ρ-鏈霉親和素并于室溫下解育45min，然 后繼續(xù)清洗板條步驟同（3);
[0162] (6)加入100μΙ TMB(3,3'，5,5'-Tetramethy化enzidine)顯色液到每個(gè)忍片孔中 并于室溫下避光解育30min;
[0163] (7)加入50化終止液到每個(gè)忍片孔中，然后用多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices) 測(cè)定在450nm處的OD值，采用Sigmaplot 12.0軟件來(lái)計(jì)算樣品中的蛋白濃度值。
[0164] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證運(yùn)些抗體忍片中得到的差異較明顯的因子(MCP-1，化-6，HGF， GR0，化-8和0PG)，利用化ISA定量檢測(cè)LX-2組，MenSC組和共培養(yǎng)組（co-cul ture組）培養(yǎng)72h 后細(xì)胞上清液W及細(xì)胞的蛋白表達(dá)量。在細(xì)胞上清的結(jié)果中，其表達(dá)量雖然和抗體忍片不 一致，但是其趨勢(shì)和抗體忍片一致，進(jìn)一步確認(rèn)MCP-1，化-6，HGF，GR0，比-8和0PG因子的重 要作用（圖1A)。
[01化]此外，為了確認(rèn)運(yùn)些因子中的主要分泌者是MenSCs還是LX-2細(xì)胞，使用細(xì)胞化ISA 來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。Ξ個(gè)組別的細(xì)胞(LX-2組，LX-2細(xì)胞;共培養(yǎng)組ko-culture組），共培養(yǎng)-LX- 2和共培養(yǎng)-MenSC ;MenSC組，MenSCs)用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，然后進(jìn)行化ISA檢測(cè)。從結(jié)果 可知（圖 1B)，共培養(yǎng)-MenSC 組相比于單一的 MenSC 組：MCP-l(361±33vs.29±5pg/mg;12 倍），化-6(967±104vs.90±23pg/mg;ll倍），HGF(927±204vs.l76±48pg/mg;5倍），GR0 (432±96￥3.224±699邑/111邑；2倍），化-8(1033±163￥3.403±759邑/111邑；3倍）和0?6(1338± 270vs.510±103pg/mg;3倍）。類似地，共培養(yǎng)-LX-2組相比于單一的LX-2組：GR0(94± 25vs. 12 ±6pg/mg; 8倍）和比-8(165 ±46vs. 24± 9pg/mg; 7倍），而剩下的MCP-1，比-6，HGF和 0PG無(wú)顯著性差異。
[0166] 實(shí)施例12:GR0(growth-regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）改善小鼠的肝 纖維化
[0167] 如實(shí)施例6.1和6.2所示，W 2mg/Kg的劑量通過尾靜脈注射重組人GROa (growth- regulated oncogene al曲a,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）（R&D Systems公司巧Ij已經(jīng)構(gòu)建好的纖維 化模型小鼠中（GROa組），對(duì)照為只注射等量PBS的肝纖維化模型小鼠（PBS組）。在注射后的 第1周和第2周，處死小鼠并進(jìn)行SR染色，觀察并檢測(cè)膠原纖維面積。結(jié)果表明，盡管在第1周 GROa組（1.6%)的膠原積累面積低于PBS組(2.4%)，但其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒有顯著性差異;相 反，在第2周GROa組（1.2% )的膠原纖維面積相比于PBS組(3.4% )有明顯減少，說(shuō)明肝纖維 化在GROa的作用下，其狀況得到了顯著改善。
[0168] 與此同時(shí)，發(fā)明人按照實(shí)施例6.4進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)〇-5魁和了6。-01的蛋白 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射GROa到纖維化小鼠1周和2周后，相對(duì)于PBS組而言GROa組的α-SMA 和TGF-m的表達(dá)明顯受到了抑制。運(yùn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 GROa在改善或治療肝纖維化方面的作 用。
[0169] 用重組人GROP蛋白（R&D Systems公司）和重組人GR0 丫蛋白（R&D Systems公司）分 別替換上述的重組人GROa蛋白（R&D Systems公司），也均顯示出肝纖維化在GR0作用下肝纖 維化狀況得到了更顯著改善（其中與重組人GR0i3蛋白的聯(lián)合下效果最優(yōu)），W及a-SMA和 TGF-化的表達(dá)受到了更明顯的抑制。
[0170] 運(yùn)說(shuō)明了不同形式的重組人GR0蛋白在改善或治療肝纖維化方面的作用。
[0171 ] 實(shí)施例13 :GRO(g;rowth-regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）和骨保護(hù)素 (0PG)的組合改善小鼠的肝纖維化
[0172] 如實(shí)施例6.1和6.2所示，分別^2111肖/蛇和5111肖/蛇的劑量通過尾靜脈注射重組人 GR〇a(R&D Systems公司）和重組人骨保護(hù)素(R&D Systems公司）到已經(jīng)構(gòu)建好的纖維化模 型小鼠中（聯(lián)合組），對(duì)照為注射等量重組人GROa和與重組人骨保護(hù)素等量的PBS的肝纖維 化模型小鼠（對(duì)照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進(jìn)行SR染色，觀察并檢測(cè)膠原 纖維面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組(0.8%)的膠原積累面積顯著低于對(duì)照組(2.1%)，在 第2周聯(lián)合組(0.5%)的膠原纖維面積相比于對(duì)照組（1.2%)有明顯減少，說(shuō)明肝纖維化在 GROa和骨保護(hù)素(0PG)聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善。
[0173] 與此同時(shí)，發(fā)明人按照實(shí)施例6.4進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)〇-5魁和了6。-01的蛋白 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對(duì)于對(duì)照組而言α-SMA和TGF-m的表達(dá)受到了更明顯的抑 審IJ。運(yùn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 GROa和骨保護(hù)素(0PG)的組合在改善或治療肝纖維化方面的更加優(yōu)異 的作用。
[0174] 用重組人GROP蛋白（R&D Systems公司）和重組人GR0 丫蛋白（R&D Systems公司）分 別替換上述的重組人GROa蛋白（R&D Systems公司），也均顯示出肝纖維化在GR0和骨保護(hù)素 聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善(其中與重組人GR0i3蛋白的聯(lián)合下效果最優(yōu)）， W及a-SMA和TGF-化的表達(dá)受到了更明顯的抑制。
[0175] 運(yùn)說(shuō)明了不同形式的重組人GR0蛋白和骨保護(hù)素的組合在改善或治療肝纖維化方 面的作用。
[0176] 實(shí)施例14:GR0(growth-regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）和單核細(xì)胞趨 化蛋白1 (MCP-1)的組合改善小鼠的肝纖維化
[0177] 如實(shí)施例6.1和6.2所示，分別^2111肖/蛇和4111肖/蛇的劑量通過尾靜脈注射重組人 GR〇a(R&D Systems公司）和重組人單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)(R&D Systems公司巧Ij已經(jīng) 構(gòu)建好的纖維化模型小鼠中（聯(lián)合組），對(duì)照為注射等量重組人GROa和與重組人單核細(xì)胞趨 化蛋白l(MCP-l)等量的PBS的肝纖維化模型小鼠（對(duì)照組）。在注射后的第1周和第2周，處死 小鼠并進(jìn)行SR染色，觀察并檢測(cè)膠原纖維面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組（1.4%)的膠原積 累面積顯著低于對(duì)照組（2.0%)，在第2周聯(lián)合組（0.8%)的膠原纖維面積相比于對(duì)照組 (1.5%)有明顯減少，說(shuō)明肝纖維化在GROa和單核細(xì)胞趨化蛋白l(MCP-l)聯(lián)合作用下肝纖 維化狀況得到了更顯著改善。
[0178] 與此同時(shí)，發(fā)明人按照實(shí)施例6.4進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)〇-5魁和了6。-01的蛋白 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對(duì)于對(duì)照組而言α-SMA和TGF-m的表達(dá)受到了更明顯的抑 審IJ。運(yùn)進(jìn)一步驗(yàn)證了GROa和單核細(xì)胞趨化蛋白l(MCP-l)的組合在改善或治療肝纖維化方面 的更加優(yōu)異的作用。
[01巧]用重組人GROP蛋白（R&D Systems公司）和重組人GR0 丫蛋白（R&D Systems公司）分 別替換上述的重組人GROa蛋白（R&D Systems公司），也均顯示出肝纖維化在GR0和單核細(xì)胞 趨化蛋白l(MCP-l)聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善(其中與重組人GRW3蛋白的 聯(lián)合下效果最優(yōu)），W及Q-SMA和TGF-化的表達(dá)受到了更明顯的抑制。
[0180]運(yùn)說(shuō)明了不同形式的重組人GR0蛋白和單核細(xì)胞趨化蛋白l(MCP-l)的組合在改善 或治療肝纖維化方面的作用。
[0181 ] 實(shí)施例15:GR0(growth-regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）和肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(HG巧的組合改善小鼠的肝纖維化
[0182] 如實(shí)施例6.1和6.2所示，分別^2111肖/蛇和1111肖/蛇的劑量通過尾靜脈注射重組人 GR〇a(R&D Systems公司）和重組人HGF蛋白（R&D Systems公司）到已經(jīng)構(gòu)建好的纖維化模型 小鼠中（聯(lián)合組），對(duì)照為注射等量重組人GROa和與重組人HGF蛋白等量的PBS的肝纖維化模 型小鼠（對(duì)照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進(jìn)行SR染色，觀察并檢測(cè)膠原纖維 面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組(0.8%)的膠原積累面積顯著低于對(duì)照組(2.1%)，在第2周 聯(lián)合組(0.4% )的膠原纖維面積相比于對(duì)照組（1.5% )有明顯減少，說(shuō)明肝纖維化在GROa和 服F聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善。
[0183] 與此同時(shí)，發(fā)明人按照實(shí)施例6.4進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)〇-5魁和了6。-01的蛋白 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對(duì)于對(duì)照組而言Q-SMA和TGF-m的表達(dá)受到了更明顯的抑 審IJ。運(yùn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 GROa和HGF的組合在改善或治療肝纖維化方面的更加優(yōu)異的作用。
[0184] 用重組人GROP蛋白（R&D Systems公司）和重組人GR0 丫蛋白（R&D Systems公司）分 別替換上述的重組人GROa蛋白（R&D Systems公司），也均顯示出肝纖維化在GR0和肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子化GF)聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善(其中與重組人GR0i3蛋白的聯(lián)合 下效果最優(yōu)），W及Q-SMA和TGF-化的表達(dá)受到了更明顯的抑制。
[0185] 運(yùn)說(shuō)明了不同形式的重組人GR0蛋白和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子化GF)的組合在改善或治 療肝纖維化方面的作用。
[01化]實(shí)施例16:GR0(growth-regulated oncogene，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）和IL-8的組合 改善小鼠的肝纖維化
[0187] 如實(shí)施例6.1和6.2所示，分別W 2mg/Kg和1.5mg/Kg的劑量通過尾靜脈注射重組人 GR〇a(R&D Systems公司）和重組人化-8蛋白（R&D Systems公司巧Ij已經(jīng)構(gòu)建好的纖維化模 型小鼠中（聯(lián)合組），對(duì)照為注射等量重組人GROa和與重組人IL-8等量的PBS的肝纖維化模 型小鼠（對(duì)照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并進(jìn)行SR染色，觀察并檢測(cè)膠原纖維 面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組（1.0%)的膠原積累面積顯著低于對(duì)照組(2.2%)，在第2周 聯(lián)合組(0.5%)的膠原纖維面積相比于對(duì)照組（1.4%)有明顯減少，說(shuō)明肝纖維化在GROa和 IL-8聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善。
[0188] 與此同時(shí)，發(fā)明人按照實(shí)施例6.4進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)〇-5魁和了6。-01的蛋白 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對(duì)于對(duì)照組而言Q-SMA和TGF-m的表達(dá)受到了更明顯的抑 審IJ。運(yùn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 GROa和IL-8的組合在改善或治療肝纖維化方面的更加優(yōu)異的作用。
[0189] 用重組人GROP蛋白（R&D Systems公司）和重組人GR0 丫蛋白（R&D Systems公司）分 別替換上述的重組人GROa蛋白（R&D Systems公司），也均顯示出肝纖維化在GRO和化-8聯(lián)合 作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善(其中與重組人GRW3蛋白的聯(lián)合下效果最優(yōu)），W及 a-SMA和TGF-化的表達(dá)受到了更明顯的抑制。
[0190]運(yùn)說(shuō)明了 GR0和IL-8的組合在改善或治療肝纖維化方面的作用。
[0191 ] 實(shí)施例17:GR0(g;rowth-regulated oncogene,腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子）和白介素-6 (比-6)的組合改善小鼠的肝纖維化
[0192] 如實(shí)施例6.1和6.2所示，分別W 2mg/Kg和1.5mg/Kg的劑量通過尾靜脈注射重組人 GR〇a(g;rowth-regulated oncogene al地日，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子a)(R&D Systems公司）和重 組人化-6蛋白（R&D Systems公司巧Ij已經(jīng)構(gòu)建好的纖維化模型小鼠中（聯(lián)合組），對(duì)照為注 射等量重組人GROa(growth-regulated oncogene al地a，腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子α)和與重組人 IL-6蛋白等量的PBS的肝纖維化模型小鼠（對(duì)照組）。在注射后的第1周和第2周，處死小鼠并 進(jìn)行SR染色，觀察并檢測(cè)膠原纖維面積。結(jié)果表明，在第1周聯(lián)合組(0.9%)的膠原積累面積 顯著低于對(duì)照組(2.4 % )，在第2周聯(lián)合組(0.2 % )的膠原纖維面積相比于對(duì)照組（1.5 % )有 明顯減少，說(shuō)明肝纖維化在GROa和IL-6聯(lián)合作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善。
[0193] 與此同時(shí)，發(fā)明人按照實(shí)施例6.4進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)〇-5魁和了6。-01的蛋白 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組相對(duì)于對(duì)照組而言Q-SMA和TGF-m的表達(dá)受到了更明顯的抑 審IJ。運(yùn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 GROa和IL-6的組合在改善或治療肝纖維化方面的更加優(yōu)異的作用。
[0194] 用重組人GROP蛋白（R&D Systems公司）和重組人GR0 丫蛋白（R&D Systems公司）分 別替換上述的重組人GROa蛋白（R&D Systems公司），也均顯示出肝纖維化在GR0和化-6聯(lián)合 作用下肝纖維化狀況得到了更顯著改善(其中與重組人GRW3蛋白的聯(lián)合下效果最優(yōu)），W及 a-SMA和TGF-化的表達(dá)受到了更明顯的抑制。
[01M]運(yùn)說(shuō)明了不同形式的重組人GR0蛋白和IL-6的組合在改善或治療肝纖維化方面的 作用。
[0196]雖然用上述實(shí)施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前 提下，本發(fā)明可進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和變動(dòng)，且運(yùn)些修飾和變動(dòng)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于治療肝纖維化的藥物，其含有腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO,以及任選地，藥學(xué)上 可接受的載體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，其中所述的藥物還含有選自由單核細(xì)胞趨化蛋白1、肝 細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白介素-8和白介素_6組成的組中的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的藥物，其為適于注射、輸注或口服的劑型。4. 根據(jù)權(quán)利要求2的藥物，其中藥物的包裝形式適于腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO和其他活性 成分被同時(shí)施用或按序先后施用。5. 腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO在制備用于治療受試者中肝纖維化的藥物中的用途。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的藥物還含有選自由單核細(xì)胞趨化蛋白1、肝 細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白介素-8和白介素_6組成的組中的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的用途，其中所述藥物為適于注射、輸注或口服的劑型。8. 根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中藥物的包裝形式適于腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO和其他活性 成分被同時(shí)施用或按序先后施用。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的受試者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的藥物或根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)所述的用途， 其中所述的腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO為天然的腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子GRO或人重組腫瘤生長(zhǎng)相關(guān) 因子GRO。
【文檔編號(hào)】A61K38/19GK105920579SQ201610413906
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】余艷春
【申請(qǐng)人】浙江生創(chuàng)精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司