本發(fā)明屬制藥領域，涉及中藥單體成分益母草堿在制藥中的新的用途，具體涉及益母草堿在制備視網(wǎng)膜、視神經(jīng)保護作用藥物中的用途，尤其是在制備治療視網(wǎng)膜血管性病變和視神經(jīng)炎癥及退行性病變藥物中的用途。

背景技術：

視覺是人體感知外界刺激最重要的功能之一，視覺障礙直接影響到人類的生存質量，而維持良好的視覺有賴于正常眼球的光路通透和視路靈敏。目前臨床實踐中針對造成視覺障礙的大多數(shù)光路系統(tǒng)病變，如白內障、屈光不正等已經(jīng)有了相對完善的治療措施，由此凸現(xiàn)的是視路系統(tǒng)神經(jīng)變性性疾病難以防治的現(xiàn)狀。隨著社會老齡化等問題而日益嚴重，使得不可逆性進展的視路疾病成為失明的主要危險，其中，青光眼已成為全球第一位不可逆致盲性眼病，據(jù)統(tǒng)計，全球約有7000萬青光眼患者，估計至2020年將達到8000萬，因青光眼引起雙眼失明者將占全球盲人總數(shù)的50％。糖尿病視網(wǎng)膜病變是另一常見的不可逆性致盲性眼病，在西方國家它是成人視力損害的首要原因，世界衛(wèi)生組織預計在2030年全球將有36600萬人患糖尿病(4.4％)，每三個糖尿病患者中就有一個發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變。另外視網(wǎng)膜血管阻塞、眼外傷、缺血性神經(jīng)病變等眼科疾病均可導致視力不可逆性損害。上述眼病的一個共同病理特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)的不可逆性凋亡。越來越多的證據(jù)表明在以上述眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)參與到了其主要病理機制中。視網(wǎng)膜中央動脈和它的分支是營養(yǎng)視網(wǎng)膜內層唯一的血管系統(tǒng)，而且屬于終末動脈，各分支相互之間無毛細血管前的吻合支，因此視網(wǎng)膜內層對極微小的血流循環(huán)障礙都非常敏感。研究表明缺血再灌注損傷能夠導致神經(jīng)元退行性變；另外，視網(wǎng)膜光感受器細胞對缺血缺氧也非常敏感，視網(wǎng)膜缺血短時間即可發(fā)生光 感受器不可逆性死亡。有研究以視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷動物模型探究視網(wǎng)膜、視神經(jīng)退行性疾病，如年齡相關性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性等，結果表明，能對抗缺血再灌注損傷的藥物，往往同時也能同于治療視網(wǎng)膜、視神經(jīng)退行性疾病。研究顯示，造成缺血再灌注損傷的主要機制是細胞在缺血缺氧時能量障礙、自由基生成、線粒體功能障礙、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸釋放等，更為重要的是再灌注后大量的氧自由基以及炎癥因子生成并釋放到組織內，進一步加重了視網(wǎng)膜細胞損傷。研究還顯示，炎癥反應對視網(wǎng)膜、視神經(jīng)具有著損傷與保護兩個相反的效應，因此可以通過干預眼部炎癥反應以達到保護視網(wǎng)膜、視神經(jīng)的目的，其中，TNF-α和IL-1β兩個促炎細胞因子在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，當前兩者與細胞表面死亡受體相結合后，細胞內蛋白凋亡酶被激活，進而導致細胞凋亡；另外，這兩個炎癥因子還可以促進白細胞與內皮細胞黏附，血管內皮損傷，造成血視網(wǎng)膜屏障破壞，最終導致視網(wǎng)膜各層細胞受損。一些眼部炎癥性疾病，如葡萄膜炎、視神經(jīng)炎、視網(wǎng)膜血管炎等，由于長期的炎癥刺激破壞視網(wǎng)膜屏障，也會導致視網(wǎng)膜神經(jīng)元不可逆凋亡。

鑒于目前臨床治療效果有限，最終上述疾病會導致視功能不可逆性損害甚至失明。盡管某些藥物在實驗條件下能夠對抗缺血再灌注損傷，但由于給藥方式、給藥劑量、次數(shù)、藥物副作用等多方面的原因，進入臨床應用還存在有若干限制。因此，目前臨床實踐中尚無系統(tǒng)的、有效的對抗視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的方法。目前臨床實踐中主要治療方案通常是針對原發(fā)疾病，如降低急性期青光眼患者眼壓、調節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜病變者的血糖及抑制視網(wǎng)膜新生血管生成、降低高血壓、減輕外傷后眼局部組織水腫等；除此之外一些抗氧化藥物，如維生素C、維生素E、己酮可可堿和銀杏葉提取物等一些中藥，以及抑制細胞內鈣的藥物，如尼莫地平、倍他洛克等是目前臨床最為常用的對抗視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的干預措施。其中，尤其對視網(wǎng)膜、視神經(jīng)退行性病變的治療措施更為有限，例如目前為止，臨床上并沒有一個對黃斑變性中視網(wǎng)膜神經(jīng)元有確切治療效果的藥物，研究認為長期聯(lián)合服用維生素C、維生素E和葉黃素可以在一定程度上延緩少部分患者的病程進展，但是也只能作為輔助治療措施，效果并不理想。因此尋找有效的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)保護藥物尤其是能夠 調節(jié)炎癥反應的藥物顯得特別重要。

已有報道的具有保護視網(wǎng)膜、視神經(jīng)功能的中藥包括：葛根、丹參、枸杞子、黃芪、刺蒺藜、銀杏葉、燈盞細辛等，方劑有補陽還五湯，中成藥有復方血栓通、復方丹參注射液、青光安顆粒等，但由于傳統(tǒng)中藥成分復雜，全身給藥后存在副作用，藥物作用機制復雜不清等，在臨床上應用存在有爭議，未被國際廣泛認可。

益母草堿提取自傳統(tǒng)中藥益母草，屬于生物堿類，其具有清熱解毒、活血調經(jīng)，水淤互結、治療水腫、小便不暢，瘡癰腫毒、皮膚癮疹等作用；傳統(tǒng)醫(yī)學將益母草及其制劑應用于婦產(chǎn)科疾病，如痛經(jīng)、產(chǎn)后出血等；也有研究發(fā)現(xiàn)益母草可以增加腎血流量，治療腎水腫，大劑量的益母草還能抑制皮膚真菌，臨床用于治療皮膚瘙癢、蕁麻疹等皮膚病變；近年來研究者發(fā)現(xiàn)其主要有效成分益母草堿能夠降低血液粘滯度、增加冠脈血流量、保護心肌細胞，抑制心肌纖維化、降低心肌梗塞面積等，被用于治療心血管系統(tǒng)疾病和血液系統(tǒng)疾病。

迄今為止，尚未見益母草堿用于治療眼部疾病的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供益母草堿在制藥中的新用途，具體涉及益母草堿在制備視網(wǎng)膜、視神經(jīng)保護藥物中的用途，尤其是在制備治療視網(wǎng)膜血管性病變和視神經(jīng)炎癥及退行性病變藥物中的用途。

本發(fā)明所述益母草堿分子式為C₁₆H₂₁N₂O₅，分子量為311.33，熔點為238℃。

本發(fā)明中，采用益母草堿進行了前房生理鹽水灌注急性高眼壓誘導視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的實驗，造模前1小時腹腔注射給藥，并以銀杏葉提取物作為陽性對照藥物，分別比較損傷后RGCs密度，測量視網(wǎng)膜厚度，檢測損傷后第1和3天RGCs凋亡率，以及進一步檢測缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜內炎癥因子TNF-α、IL-1β；

實驗結果顯示，實驗大鼠RIRI后第7天假灌注組(進行前房穿刺，但不進行前房生理鹽水灌注)RGCs存活率為63％，銀杏葉提取物組RGCs存活率提高到89％，益母草堿15mg/kg、30mg/kg兩個劑量組RGCs存活率分別為97％、91％，分別較損傷組 提高了34％和28％；RIRI后第14天RGCs存活率為64％，銀杏葉提取物組RGCs存活率提高到85％，益母草堿15mg/kg、30mg/kg兩個劑量組RGCs存活率分別為87％、82％；且益母草堿15mg/kg、30mg/kg兩個劑量組相互之間RGCs存活率無顯著差異(如表1所示)。

表1是視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后第7、14天各組RGCs平均密度。

表1

視網(wǎng)膜厚度的測量結果如表2-4所示，缺血再灌注后7天，相對假灌注組視網(wǎng)膜全層厚度，損傷組為81％,銀杏葉組為87％，益母草堿15mg/kg、30mg/kg組分別為97％、92％；14天時損傷組為75％,銀杏葉組為87％，益母草堿15mg/kg、30mg/kg組分別為97％、92％；21天時損傷組為71％,銀杏葉組為84％，益母草堿15mg/kg、30mg/kg組分別為93％、93％；分別對視網(wǎng)膜各層進一步分析發(fā)現(xiàn)，內叢狀層在損傷后第7天出現(xiàn)了變薄的現(xiàn)象，相對于假灌注組厚度，損傷組為72％，銀杏葉組為80％，益母草堿15mg/kg組為91％；損傷后第14天，損傷組為66％，益母草堿15mg/kg組為83％；損傷后第21天，損傷組為63％，銀杏葉組為72％，益母草堿15mg/kg組為80％；損傷后第7天各組視網(wǎng)膜外核層無顯著差異；損傷后14天外核層顯著變薄，相對于假灌注組，損傷組為69％，益母草堿15mg/kg組為88％；損傷后21天，相對于假灌注組，損傷組為62％，銀杏葉組為79％，益母草堿15mg/kg組為90％；結果表明，益母草堿具有較好的、長期持續(xù)的視網(wǎng)膜保護作用，能減輕前房灌注對視網(wǎng)膜內叢狀層的損傷作用，另外，在缺血再灌注損傷后14、21天視網(wǎng)膜外核層變薄，而益母草堿同時能改善外核層厚度，表明益母草堿對視網(wǎng)膜各層細胞均有保護作用。

表2顯示損傷后第7、14、21天各組視網(wǎng)膜全層厚度。

表3顯示損傷后第7、14、21天各組視網(wǎng)膜內從狀層厚度。

表4顯示損傷后第7、14、21天各組視網(wǎng)膜外核層厚度。

表2

表3

表4

本發(fā)明中對損傷后第1和3天RGCs凋亡率檢測結果顯示，在RIRI急性期(損傷后第3天)益母草堿對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后RGCs的保護作用顯著優(yōu)于銀杏葉提取物，益母草堿組RGCs凋亡比例顯著低于銀杏葉組(如表5所示)。

表5

進一步，本發(fā)明對缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜內炎癥因子TNF-α、IL-1β進行檢測，結果顯示，益母草堿能降低缺血再灌注損傷后急性期視網(wǎng)膜內TNF-α、IL-1β表達量，其通過減輕炎癥反應、抗凋亡、減輕血-視網(wǎng)膜屏障損傷實現(xiàn)對視網(wǎng)膜的保 護作用。

本發(fā)明提供了益母草堿在制備治療視網(wǎng)膜損傷藥物中的新的用途，尤其是在制備治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷和視神經(jīng)退行性變疾病藥物中的用途。所述的益母草堿可作為治療藥物用于治療視網(wǎng)膜損傷及視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病；所述的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷包括視網(wǎng)膜動脈阻塞、視網(wǎng)膜經(jīng)脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、高血壓視網(wǎng)膜病變、青光眼急性大發(fā)作、眼外傷或前部缺血性視神經(jīng)病變；所述的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)退行性變疾病包括青光眼、年齡相關性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性或高度近視眼視網(wǎng)膜變性；

本發(fā)明還提供了益母草堿對眼部炎癥的調節(jié)作用，進一步，所述的益母草堿可作為治療藥物用于治療視網(wǎng)膜、視神經(jīng)炎癥性疾病包括巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎或眼內其它部位炎癥累及視網(wǎng)膜的疾病，如視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、葡萄膜炎、視神經(jīng)炎等。

附圖說明

圖1顯示了損傷后第7天，各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞密度，其中，

*表示與損傷組相比有顯著差異，*表示P<0.05,**表示P<0.01；##表示兩組間有顯著差異p<0.01。

圖2顯示了損傷后第14天，各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞密度，其中，

*表示與損傷組相比有顯著差異，P<0.05，**表示P<0.01；#表示兩組間有顯著差異P<0.05，##表示P<0.01。

圖3顯示了各組視網(wǎng)膜全層厚度比較結果，其中，

*表示與損傷組相比有差異p<0.05，**表示p<0.01。

圖4顯示了各組視網(wǎng)膜內叢狀層比較結果，其中，

*表示與損傷組相比有差異p<0.05，**表示p<0.01，#表示兩組有顯著差異p<0.05。

圖5顯示了各組視網(wǎng)膜外核層厚度比較結果，其中，

*表示與損傷組相比有差異p<0.05，**表示p<0.01，#表示兩組有顯著差異p<0.05，##p<0.01。

圖6顯示了視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后第1天，TUNEL檢測各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)凋亡情況，其中，*表示與損傷組相比有顯著差異，P<0.05,**表示P<0.01。

圖7顯示了視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后第3天，TUNEL檢測各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)凋亡情況，其中，**表示與損傷組相比有顯著差異，P<0.01，#表示兩組間有差異P<0.05。

圖8顯示了損傷后第12、24、72小時，Western blot檢測各組TNF-α表達情況，其中，*表示與損傷組相比有顯著差異P<0.05，**P<0.01，#表示兩組間有差異P<0.05。

圖9顯示了損傷后第12、24、72小時，Western blot檢測各組IL-1β表達情況，其中，**表示與損傷組相比有顯著差異P<0.01，##表示兩組間有顯著差異P<0.01。

具體實施方式

實施例1：益母草堿提高損傷的RGCs存活率

(1)動物模型建立

a.造模前1小時腹腔注射給藥。陽性對照組予以銀杏葉提取物100mg/kg，益母草堿組分三個劑量組，分別為7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg，損傷組予以同體積生理鹽水；

b.氯胺酮(80mg/kg)甲苯噻嗪(12mg/kg)肌肉注射，全身麻醉動物后，眼周局部清潔消毒，倍諾喜滴眼液局部麻醉，復方托比卡按滴眼液擴瞳，林可霉素滴眼液沖洗眼部；

c.眼科手術顯微鏡下，對損傷組、陽性對照組以及益母草堿組進行前房灌注。以連接0.9％生理鹽水袋的4.5mm頭皮靜脈針進行前房穿刺，避開3、9點鐘血管，將生理鹽水袋提至距離大鼠150cm高度，觀察到大鼠眼前部蒼白，虹膜血供終斷，眼底血管閉塞，紅光反射消失，且灌注針處無滲漏，迪可羅眼用凝膠覆蓋角膜，避免角膜干燥損傷及穿刺孔直接暴露，假灌注組予以前房穿刺，不進行灌注；

d.灌注時間持續(xù)60分鐘，期間保證大鼠深度麻醉無蘇醒，保持體溫37℃預防大鼠死亡，60分鐘后去除前房灌注針，待眼前節(jié)血供恢復、虹膜血管充血、檢查眼底無視網(wǎng)膜脫離和出血，并且視網(wǎng)膜血管再通血流恢復，眼底紅光反射出現(xiàn)；

e.抗生素眼膏涂眼，回納眼球，麻醉蘇醒后送回，各組造模后每天腹腔注射給藥一次。實驗中前房灌注時若有損傷虹膜及晶體的個體予以剔除；

(2)上丘逆行標記

a.處死前5天，將SD大鼠固定于立體定位儀頭架上，消毒后切開頭頂部皮膚，刮除顱骨上骨膜；

b.利用實驗動物腦立體定位儀對大鼠雙側上丘定位：距離后囟前2.0mm，雙側旁開1.2mm定位，用動物實驗電動顱骨鉆(直徑1.0mm)鉆孔；

c.微量注射器進針3.2mm，雙側分別緩慢注射5μL 3％的熒光金，滯留5分鐘后緩慢拔出；

d.縫合后涂抹抗生素，保持體溫37℃，麻醉蘇醒后送回鼠籠。

(3)視網(wǎng)膜鋪片RGCs計數(shù)

a.分別于造模后第7天、14天以水合氯醛深度麻醉大鼠后，用過濾后的4％多聚甲醛200ml，經(jīng)心臟灌注固定后取出眼球，角膜縫線標記顳側，將眼球浸泡于4％多聚甲醛中固定1小時；

b.將眼球浸于0.01MPBS液中，沿角膜緣后1mm剪除眼前節(jié)和玻璃體組織，分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜平鋪于防脫片化的載玻片上，在視網(wǎng)膜邊緣做4個切口將視網(wǎng)膜分為上、下、鼻、顳四個象限后將視網(wǎng)膜鋪平，以不含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片；

c.熒光顯微鏡下觀察，對每個象限距離視乳頭1mm、2mm、3mm處拍攝200倍照片各1張；

d.結合ImageJ軟件及人工手動方法對每張照片中RGCs進行計數(shù)，求RGCs密度平均值(個/mm²)，利用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。

結果如圖1-2所示：損傷后第7天，雙上丘逆行標記RGC計數(shù)：假灌注組視網(wǎng)膜鋪片平均RGCs密度為1842.75±119.71(個/m㎡)。其他各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞密度分別為：損傷組1164.33±21.94、銀杏葉提取物組1645.75±91.69、益母草堿(Leo)7.5mg/kg1431.6±198.61、Leo15mg/kg1795.4±93.28、Leo30mg/kg1693±149.92，損傷組與假灌注組有差異P＝0.000，損傷組與銀杏葉提取物組、益母草 堿7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg組存在差異，分別P＝0.002、0.046、0.001、0.034，益母草堿組15mg/kg與7.5mg組、30mg組有差異，分別P＝0.002、0.001；

損傷后第14天，各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞密度分別為：損傷組1187±61.59、銀杏葉提取物組1578.25±147.3033、Leo7.5mg/kg1401.75±326.06、Leo15mg/kg1619.5±102.5882、Leo30mg/kg1511.5±183.6346，損傷組與假灌注組有差異P＝0.000，損傷組與銀杏葉提取物組、益母草堿15mg/kg、30mg/kg均有差異，分別P＝0.006、0.003、0.02。

實施例2：益母草堿減輕缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜全層損傷

(1)按實施例1中的方法對各組進行處理；

(2)制作石蠟切片

a.分別于造模后第7天、14天、21天處死大鼠，取眼球固定于眼球固定液中48小時，沖洗2小時；

b.脫水：50％酒精、70％酒精、85％酒精、95％酒精、100％酒精、100％酒精每級2小時；

c.透明：移入1/2二甲苯+無水乙醇2小時，移入純二甲苯1.5小時，純二甲苯1.5小時；

d.浸蠟：將處理的標本置于1/2粉末狀石蠟+1/2二甲苯中，置于40℃溫箱過夜；

e.包埋：將溫箱溫度提高至60℃，提存蠟3次，每次1-2小時，將材料倒入置于燙板上的模具中，后置于冷水中，凝固好去出晾干；

f.切片：厚度5μm沿眼球矢狀面、通過視神經(jīng)部位切片，粘片劑粘片，吸出水分置于溫箱30-40℃過夜。

(3)H-E染色

a.脫蠟：將載玻片置于二甲苯染缸中2次，每次10分鐘；

b.蘇木精染液染5分鐘，后沖洗，鹽水酒精分化15秒，沖洗15分鐘，依次移入75％酒精、85％酒精；

c.伊紅染色1分鐘，于95％酒精脫水2次，每次5分鐘，100％酒精脫水2次，每次5分鐘，后依次移入二甲苯I、二甲苯II各5分鐘；

d.中性樹脂封片；

e.每個眼球隨機選通過視神經(jīng)的切片5張，每張切片于視網(wǎng)膜上均勻拍攝200倍照片18張；

f.應用Image-pro-plus軟件進行圖片分析，SPSS統(tǒng)計學分析。

結果如圖3-5所示：

全層視網(wǎng)膜厚度比較：假灌注組視網(wǎng)膜全層厚度156.34±14.25μm。損傷后第7天，各組全層視網(wǎng)膜厚度分別為：損傷組127.02±11.52μm，陽性對照136.63±14.17μm，Leo7.5mg/kg 149.62±11.27μm，Leo15mg/kg 152.19±13.77μm，Leo30mg/kg 144.44±26.47μm，假灌注組與損傷組相比有顯著差異P＝0.021，Leo15mg/kg組視網(wǎng)膜全層厚度高于損傷組P＝0.043，其余各組與損傷組相比無顯著差異；損傷后第14天，視網(wǎng)膜全層厚度分別為：損傷組118.64±5.94μm，陽性對照136.78±2.22μm，Leo7.5mg/kg 143.23±34.29μm，Leo15mg/kg 153.71±8.71μm，Leo 30mg/kg 145.67±3.49μm，損傷組視網(wǎng)膜厚全層度顯著小于假灌注組P＝0.000，陽性對照組與損傷組有差異P＝0.047，Leo7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg組均與損傷組有差異，分別為P＝0.01、0.003、0.005；損傷后第21天，視網(wǎng)膜全層厚度分別為：損傷組112.67±14.25μm，陽性對照132.45±10.64μm，Leo7.5mg/kg 124.32±10.32μm，Leo15mg/kg 146.68±9.31μm，Leo 30mg/kg 146.99±16.52μm，假灌注組顯著高于損傷組P＝0.000，陽性對照組與損傷組有差異P＝0.047，Leo15mg/kg/、30mg/kg組均高于損傷組，分別為P＝0.000、0.000；

各組視網(wǎng)膜內叢狀層比較：假灌注組視網(wǎng)膜內叢狀層厚度為36.6979±2.56μm。損傷后7天，各組視網(wǎng)膜內叢狀層厚度分別為：損傷組26.74±1.04μm，陽性對照組29.06±5.17μm，Leo7.5mg/kg 25.41±2.61μm，Leo15mg/kg 33.08±4.29μm，Leo 30mg/kg 31.66±1.88μm，損傷組內從狀層厚度低于對照組P＝0.034，益母草堿15mg/kg組顯著高于損傷組P＝0.008，且益母草堿7.5mg/kg與15mg/kg組相比有差異P＝0.018；損傷后第14天，各組視網(wǎng)膜內叢狀層厚度分別為：損傷組24.77 ±1.41μm，陽性對照組26.18±0.77μm，Leo7.5mg/kg 25.22±10.45μm，Leo15mg/kg 30.74±2.69μm，Leo 30mg/kg 31.24±2.08μm，Leo15mg/kg、30mg/kg組內叢狀層均厚于損傷組，分別為P＝0.010、0.031，兩組間無顯著差異；損傷后第21天：Leo15mg/kg組內叢狀層厚于損傷組P＝0.014，陽性對照組與Leo15mg/kg組有差異P＝0.021；

各組視網(wǎng)膜外核層厚度比較：假灌注組外核層厚度為43.75±3.79μm。損傷后7天，各組外核層厚度無顯著差異；損傷后14天，各組外核層厚度分別為：損傷組36.59±5.87μm，陽性對照組35.75±5.16μm，Leo7.5mg/kg 35.82±8.19μm，Leo15mg/kg 38.86±0.55μm，Leo 30mg/kg 40.08±2.04μm，損傷組視網(wǎng)膜外核層厚度顯著小于假灌注組P＝0.000，陽性對照組與假灌注組有差異P＝0.006，Leo15mg/kg、30mg/kg組顯著高于損傷組，分別P＝0.002、0.001，且兩組無顯著差異；損傷后第21天，各組外核層厚度分別為：損傷組27.78±1.98μm，陽性對照組34.35±1.44μm，Leo7.5mg/kg 30.32±1.60μm，Leo15mg/kg 39.77±9.01μm，Leo 30mg/kg 37.39±1.75μm，損傷組與假灌注組有差異P＝0.000，損傷組與陽性對照、Leo15mg/kg、30mg/kg有差異，分別P＝0.033、0.000、0.003。

實施例3：益母草堿降低缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率

(1)按實施例1的方法對各組進行處理；

(2)冰凍切片制作

a.分別于造模后第1天、3天，水合氯醛深度麻醉大鼠后，用過濾后的4％多聚甲醛200ml，經(jīng)心臟灌注固定后取出眼球，浸泡于4％多聚甲醛中固定2小時；

b.依次于10％、20％、30％蔗糖中脫水；

c.待脫水后，于角膜緣1mm處剪去角膜，去除晶狀體和玻璃體組織，吸去眼杯內液體，在模具中以OCT包埋劑包埋，后置于-20℃冰箱，待成型后移入-80℃冰箱，冷凍1小時；

d.利用冰凍切片機沿眼球矢狀面進行切片，切片厚度為10μm，貼于防脫片載玻片上晾干，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)TUNEL染色

a.每組3個眼球，每個眼球選取經(jīng)過視神經(jīng)的切片5張，從-20℃冰箱取出后，室溫下20分鐘晾干；

b.4％多聚甲醛室溫固定20分鐘；

c.0.01MPBS沖洗30分鐘；

d.用4℃新鮮配制的1％Triton X-100(用0.01MPBS配制的0.1％檸檬酸鈉進行配制)浸泡2分鐘；

e.0.01MPBS沖洗2次，共5分鐘；

f.吸去標本邊緣載玻片上的液體，加TUNEL混合反應液，于37℃孵育60分鐘；

g.0.01MPBS沖洗3次，共10分鐘；

h.吸去標本邊緣載玻片上的液體后，用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片；

i.熒光顯微鏡觀察、拍照，每張切片拍攝200倍照片4張；

j.用ImageJ軟件進行照片分析，SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

結果如圖6-7所示：視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后第1天，TUNEL檢測各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)凋亡情況：損傷組為28.87％±10.34％，銀杏葉提取物組(陽性對照組)20.08％±2.43％，益母草堿組13.40％±2.65％。銀杏葉提取物組RGCs凋亡比例低于損傷組P＝0.04，益母草堿15mg/kg組顯著低于損傷組P＝0.001，銀杏葉提取物組與益母草堿組無顯著差異P＝0.93；

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后第3天，TUNEL檢測各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)凋亡情況：損傷組為38.16％±9.62％，銀杏葉提取物組24.12％±4.39％益母草堿組16.64％±2.56％。銀杏葉提取物組和益母草堿15mg/kg組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡比例顯著較損傷組低，分別為P＝0.004，P＝0.000，且益母草堿組RGCs凋亡比例低于銀杏葉提取物組，P＝0.02。

實施例4：益母草堿降低缺血再灌注損傷后視網(wǎng)膜內TNF-α、IL-1β表達量

(1)按實施例1的方法對各組進行處理；

(2)蛋白提取

a.分別于造模后12、24、72小時處死大鼠，取眼球，分離視網(wǎng)膜，用預冷的PBS液漂洗3次；

b.每個眼球的視網(wǎng)膜稱重后，按照組織凈重(g)：裂解液(ml)＝1:10比例加入RIPA組織裂解液，用小梁剪剪碎組織，超聲粉碎10秒，間隔5秒，重復超聲3次，冰上裂解半小時；

c.低溫高速離心機12000rpm離心10分鐘，取上清液，置于-80℃冰箱保存。(3)BCA法蛋白濃度測定

a.取1.2ml蛋白標準準配制液加入一管蛋白標準(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml蛋白標準液；

b.取適量以上配置的蛋白標準液，用PBS稀釋至最終濃度0.5mg/ml；

c.按BCA試劑A：BCA試劑B＝50:1，配制成BCA工作液；

d.將標準品按照0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板，加標準品稀釋液補至20μl；

e.加適量體積樣品到96孔板，加標準液品稀釋液到20μl；

f.各孔均加入200μl BCA工作液，37℃放置30分鐘；

g.測定A562，根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度；

(4)Western Blot

a.裂解好的蛋白樣品加入5×loading buffer；

b.儀器block heater干浴器，95℃蛋白變性5min；

c.配制12％分離膠后，加入TEMED后迅速灌膠，ddH₂O封面；

d.靜置待分離膠聚合后，傾出上層水，以濾紙吸除殘留液體；

e.配制5％濃縮膠后，加入TEMED后迅速灌膠，并插入齒梳，靜置等待聚合；

f.組裝電泳槽，倒入電泳緩沖液，去掉梳齒；

g.上樣及電泳：按照每個孔60ug總蛋白進行上樣，預染maker標記蛋白位置，濃縮膠80V，分離膠100V進行SDS-PAGE電泳2小時左右；

h.轉膜：將包含待測蛋白條帶(TNF-α17kd、IL-1kd)及內參考β-actin的分離膠切下，PVDF膜用甲醇浸泡30秒后轉膜液浸泡10分鐘，按照陽極、濾紙、PVDF 膜、凝膠、濾紙、陰極的順序制作“三明治”，0.35A恒流轉膜1小時，根據(jù)Maker指示將目的蛋白和內參剪開；

i.封閉：轉膜結束后，將膜放到T-TBS(含5％脫脂奶粉)，室溫封閉1小時，然后T-TBS漂洗3次，每次5分鐘；

j.一抗孵育：一抗兔抗鼠anti-TNF-α或者兔抗鼠anti-IL-1β以1:1000溶于T-TBS(含3％脫脂奶粉)，將膜浸泡其中，4℃孵育過夜；然后T-TBS漂洗4次，每次5分鐘；

k.二抗結合：二抗小鼠抗兔以1:5000溶于T-TBS(含3％脫脂奶粉)，將膜浸泡其中，室溫孵育1小時，然后T-TBS漂洗5次，每次5分鐘；

l.顯色：配制適量顯色液(Thermo SuperSingle West Femoto Trial Kit)，滴于PVDF膜上，將其蛋白面朝下，使PVDF膜與顯色液充分接觸，反應1分鐘，增強30秒，曝光5次；

m.用ImageJ分析灰度值，采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析；

結果如圖8-9所示：Western blot檢測TNF-α表達情況：損傷后12小時，損傷組與益母草堿組TNF-α表達量分別是假灌注組的6.95±1.57倍P＝0.001、4.82±1.08P＝0.005倍，且益母草堿組TNF-α表達較損傷組少P＝0.045；損傷后24小時，損傷組、益母草堿組TNF-α表達分別是假灌注組的6.39±1.52倍P＝0.001、4.13±1.15倍P＝0.013，且益母草堿組TNF-α表達較損傷組少P＝0.046；損傷后72小時，損傷組、益母草堿組表達量仍然高于假灌注組，分別5.11±1.57倍P＝0.002、3.27±0.92倍P＝0.029，兩組之間無顯著差別P＝0.064；

Western blot檢測IL-1β表達情況：損傷后12小時，損傷組與益母草堿組IL-1β表達量分別是假灌注組的8.54±1.23倍P＝0.000、6.40±1.01倍P＝0.001，兩組相互間無顯著差異P＝0.087；損傷后24小時，損傷組與益母草堿組IL-1β表達量分別是假灌注組的7.67±1.23倍P＝0.000、4.21±0.40倍P＝0.005，且益母草堿組顯著少于損傷組P＝0.003；損傷后72小時，損傷組IL-1β表達量是假灌注組的7.16±1.29倍P＝0.000，益母草堿組與假灌注組無顯著差異P＝0.106，且顯著低于損傷組P＝0.002。