本發(fā)明設(shè)計藥物領(lǐng)域，具體的涉及細胞自噬抑制劑的治療氣道粘液高分泌的制劑及其用途。
背景技術(shù)：
：：細胞自噬(autophagy)是機體一種重要的防御和保護機制。細胞可以通過自噬和溶酶體，消除、降解和消化受損、變性、衰老和失去功能的細胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子，為細胞的重建、再生和修復(fù)提供必須原料，實現(xiàn)細胞的再循環(huán)和再利用。從本義上講，細胞自噬是機體保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)微環(huán)境改變的一種重要的自我調(diào)節(jié)和保護機制。然而，在某些特定的條件下，細胞器和各種生物大分子的過量消耗最終會導(dǎo)致細胞自噬死亡。因此，細胞自噬最終促進細胞存活還是死亡，將根據(jù)不同的細胞，不同的微環(huán)境，不同的誘導(dǎo)條件而異。最新的研究表明細胞自噬過程的分子機制至少與30種以上的“Atg”基因和蛋白相關(guān)。其中，Beclin1(BECN1,Atg6)能調(diào)控最初的雙層膜結(jié)構(gòu)的分離和形成，而在該雙層膜結(jié)構(gòu)捕獲細胞器和生物大分子形成細胞自噬體的過程中，LC3B在Atg5-Atg12-Atg16等蛋白酶的作用下，被脂質(zhì)化(lipidation)并被加成到細胞自噬體雙層膜上。因而這些分子在自噬發(fā)生過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。氣道粘液是一種脂質(zhì)、糖復(fù)合物以及蛋白質(zhì)的稀釋溶液，粘液蛋白MUC5AC是氣道粘液的主要成分之一。氣道粘液高分泌是哮喘等慢性氣道疾病的特征性病理生理改變，主要表現(xiàn)為杯狀細胞化生和粘液產(chǎn)生增多。吸煙、過敏原以及其他外界刺激性因子均可引起肺內(nèi)炎癥細胞募集和炎癥介質(zhì)釋放，激活多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，促進MUC5AC等粘液蛋白的高表達。氣道粘液高分泌是哮喘以及囊性肺纖維化等慢性氣道疾病急性發(fā)作并加重的重要原因，但其調(diào)控的分子機制尚未明確。目前臨床上對氣道粘液高分泌尚缺乏有效的治療手段。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)有效治療或緩解氣道粘液高分泌的制劑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效治療或緩解氣道粘液高分泌的制劑。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種細胞自噬抑制劑的用途，用于制備一制劑，所述制劑用于治療氣道粘液高分泌或用于抑制粘液蛋白的表達。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞自噬抑制劑選自下組：(i)巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1)、氯喹(Chloroquine)、或其組合；(ii)特異性抑制自噬相關(guān)蛋白的表達和/或活性的拮抗劑；(iii)上述(i)和(ii)的任意組合。在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑包括iRNA、siRNA、shRNA、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑包括抗體。在另一優(yōu)選例中，所述制劑為藥物組合物、或食品組合物。在另一優(yōu)選例中，所述組合物包含(a)細胞自噬抑制劑；和(b)藥學(xué)上可接受的載體、或食品學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的制劑含有(1)巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1)和/或氯喹(Chloroquine)以及(2)含有用于阻斷細胞自噬的干擾RNA。在另一優(yōu)選例中，所述干擾RNA選自下組：Beclin-1siRNA、LC3BsiRNA、ATG5siRNA、ATG12siRNA、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的粘液蛋白包括MUC5AC。在另一優(yōu)選例中，所述的氣道粘液高分泌由選自下組的因素所誘導(dǎo)的：煙霧、大氣污染顆粒PM、和/或過敏原(如屋塵螨)。在另一優(yōu)選例中，所述的氣道為人或非人哺乳動物的氣道。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于治療氣道粘液高分泌的制劑，所述制劑包含(a)細胞自噬抑制劑，所述的細胞自噬抑制劑為巴弗洛霉素A1和氯喹；和(b)藥學(xué)上可接受的載體、或食品學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述組合物中含有0.001-99wt％，較佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的細胞自噬抑制劑，按組合物的總重量計。在另一優(yōu)選例中，所述的制劑包括藥物組合物、或食物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的制劑還含有用于阻斷細胞自噬的干擾RNA。在另一優(yōu)選例中，所述干擾RNA選自下組：Beclin-1siRNA、LC3BsiRNA、ATG5siRNA、ATG12siRNA、或其組合。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種非治療性的、體外抑制粘液蛋白表達的方法，包括步驟：在細胞自噬抑制劑存在下，培養(yǎng)氣道上皮細胞，從而抑制所述氣道上皮細胞表達粘液蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的粘液蛋白包括MUC5AC。在另一優(yōu)選例中，所述的氣道上皮細胞為人氣道上皮細胞。在另一優(yōu)選例中，所述細胞自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1)和氯喹(Chloroquine)的濃度分別為10nM、10μM。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞自噬抑制劑選自下組：巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1)、氯喹(Chloroquine)、或其組合在另一優(yōu)選例中，所述的細胞自噬抑制劑為干擾RNA，其選自下組：Beclin-1siRNA、LC3BsiRNA、ATG5siRNA、ATG12siRNA、或其組合。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種非治療性的緩解氣道粘液高分泌的方法，包括步驟：(a)給需要的對象施用細胞自噬抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的對象包括非人哺乳動物。在另一優(yōu)選例中，所述的對象包括嚙齒動物，如小鼠、大鼠。在另一優(yōu)選例中，所述對象是經(jīng)煙霧暴露誘導(dǎo)、大氣污染顆粒PM誘導(dǎo)、或屋塵螨提取物誘導(dǎo)的動物模型。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：(b)檢測所述對象中MUC5AC的mRNA表達、和/或免疫熒光檢測MUC5AC。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了阻斷HBE細胞中的細胞自噬可以顯著降低香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的MUC5AC表達。其中圖1A顯示了MUC5AC的mRNA表達。圖1B顯示了免疫熒光檢測MUC5AC。圖2顯示了應(yīng)用細胞自噬抑制劑可以顯著降低香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的MUC5AC表達。其中圖2A顯示了MUC5AC的mRNA表達。圖2B顯示了免疫熒光檢測MUC5AC。圖3顯示了阻斷HBE細胞中的細胞自噬可以顯著降低大氣污染顆粒PM誘導(dǎo)的MUC5AC表達。其中圖3A顯示了MUC5AC的mRNA表達。圖3B顯示了免疫熒光檢測MUC5AC。圖4顯示了細胞自噬相關(guān)基因缺陷能有效緩解香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌。其中圖4A和4C分別顯示了LC3B小鼠和Beclin-1小鼠煙霧暴露后氣道粘液分泌的代表性圖片。圖4B和4D分別顯示了各組小鼠PAS染色的半定量分析結(jié)果。圖5顯示了細胞自噬相關(guān)基因缺陷可以顯著降低PM干預(yù)誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌和MUC5AC表達。其中圖5A顯示了各組小鼠PM干預(yù)后氣道粘液分泌的代表性圖片。圖5B顯示了各組小鼠PAS染色的半定量分析結(jié)果。圖5C顯示了小鼠肺組織MUC5AC的mRNA表達水平。圖6顯示了細胞自噬相關(guān)基因缺陷可以顯著降低HDM干預(yù)誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌。圖6A顯示了各組小鼠HDM干預(yù)后氣道粘液分泌的代表性圖片。圖6B顯示了各組小鼠PAS染色的半定量分析結(jié)果。各圖中，“CTL”或“control”表示對照。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)細胞自噬抑制劑能夠非常有效地治療氣道粘液高分泌。實驗表明，通過抑制細胞自噬，可以顯著地降低動物模型中粘液蛋白MUC5AC的表達，進而顯著緩解氣道粘液高分泌。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語定義如本文所用，“氣道粘液高分泌”即Airwaymucushyperproduction，指在病理過程中，氣道產(chǎn)生大量的粘液(就是通常所說的痰)，導(dǎo)致呼吸氣流受限。氣道粘液高分泌的病癥特點是痰的產(chǎn)生、在氣道內(nèi)腔有大量粘液以及杯狀細胞增生等，其病理后遺癥包括氣道阻塞、氣流受限以及氣體交換減值等。如本文所用，“粘液蛋白MUC5AC”指由人MUC5AC所編碼的粘(液)蛋白 Mucin5AC(Muc5AC)。該蛋白是氣道粘液各種成分中最主要的和最具有代表性的粘液蛋白。如本文所用，“Beclin-1”指細胞自噬發(fā)生過程中一個關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，它直接調(diào)控細胞自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成。Beclin1基因也稱BECN1基因。如本文所用，“LC3B”指細胞自噬發(fā)生過程中一個關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，它是細胞自噬體的關(guān)鍵組成蛋白之一。如本文所用，“ATG5”指細胞自噬發(fā)生過程中一個關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，它與ATG12形成復(fù)合體，聯(lián)合調(diào)控LC3B參與細胞自噬體的形成。如本文所用，“ATG12”指細胞自噬發(fā)生過程中一個關(guān)鍵的調(diào)控蛋白，它與ATG5形成復(fù)合體，聯(lián)合調(diào)控LC3B參與細胞自噬體的形成。細胞自噬抑制劑如本文所用，術(shù)語“細胞自噬抑制劑”指能夠抑制細胞自噬的物質(zhì)，所述抑制劑可以是小分子化合物，也可以是大分子化合物(如抗體)。代表性的細胞自噬抑制劑包括BafilomycinA1、Chloroquine、干擾RNA、抗體等。BafilomycinA1包括巴弗洛霉素A1或其藥學(xué)上可接受的鹽。巴弗洛霉素A1的分子式為C35H58O9(分子量：622.83)，結(jié)構(gòu)式如下：Chloroquine指氯喹或其藥學(xué)上可接受的鹽。氯喹的分子式為C18H26ClN3(分子量：319.87)，其結(jié)構(gòu)式如下RNA干擾(RNAi)在本發(fā)明中，一類有效的細胞自噬抑制劑是干擾RNA。如本文所用，術(shù)語“RNA干擾(RNAinterference，RNAi)”是指：一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，其也稱為RNA干預(yù)或者RNA干涉。RNA干擾是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機制。如本文所用，術(shù)語“小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑(RNAinterferencepathway)。在本發(fā)明中，干擾RNA包括siRNA、shRNA以及相應(yīng)的構(gòu)建物。一種典型的構(gòu)建物為雙鏈，并且其正鏈或負鏈含有式I所示的結(jié)構(gòu)：Seq正向-X-Seq反向式I式中，Seq正向為細胞自噬相關(guān)基因或片段的核苷酸序列；Seq反向為與Seq正向基本上互補的核苷酸序列；X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，Seq正向、Seq反向的長度為19-30bp，較佳地為20-25bp。在本發(fā)明中，一種典型的shRNA如式II所示，式中，Seq’正向為Seq正向序列對應(yīng)的RNA序列或序列片段；Seq’反向為與Seq’正向基本上互補的序列；X’為無；或為位于Seq’正向和Seq’反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq’正向和Seq’反向不互補，||表示在Seq正向和Seq反向之間形成的氫鍵。在另一優(yōu)選例中，所述的間隔序列X的長度為3-30bp，較佳地為4-20bp。其中，Seq正向序列所針對的靶基因包括(但并不限于)：Beclin-1、LC3B、ATG5、ATG12、或其組合。組合物和施用方法本發(fā)明還提供了一種含有細胞自噬抑制劑作為活性成分的用于治療或緩解所述氣道粘液高分泌的組合物。所述的組合物包括(但并不限于)：藥物組合物、食品組合物、膳食補充劑、飲料組合物等。在本發(fā)明中，細胞自噬抑制劑可直接用于疾病治療，例如，用于氣道粘液高分泌方面的治療。在使用本發(fā)明細胞自噬抑制劑時，還可同時使用其他治療劑，如有助于排痰的藥物等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明細胞自噬抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉劑、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。本發(fā)明的藥物組合也可以被制成粉劑用于霧化吸入?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明細胞自噬抑制劑還可與其他治療劑一起使用。對于本發(fā)明的藥物組合物，可通過常規(guī)的方式施用于所需的對象(如人和非人哺乳動物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、霧化吸入等。使用藥物組合物時，是將安全有效量的細胞自噬抑制劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的的主要優(yōu)點包括：(a)細胞自噬抑制劑緩解氣道粘液高分泌效果顯著。(b)抑制細胞自噬對大氣污染等原因誘發(fā)的氣道粘液高分泌防治均效果。(c)細胞自噬可以作為多種原因誘發(fā)的氣道疾病粘液高分泌防治的全新靶點。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。通用方法和材料1.細胞培養(yǎng)實施例中用到的人體氣道上皮細胞系(HBE)均購于中國科學(xué)院上海細胞庫，用含有10％胎牛血清，50U/ml盤尼西林和50U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。復(fù)蘇后3-12代用于細胞實驗。2.香煙煙霧提取物(CSE)的制備實施例中用到的CSE均采用標(biāo)準(zhǔn)的研究性香煙(2R1F，產(chǎn)自TheTobaccoResearchInstitute,UniversityofKentucky,Lexington,KY)制備，剪下香煙的過濾嘴，每根香煙煙霧燃燒6分鐘，煙霧被緩慢泵入10毫升RPMI1640培養(yǎng)基，所得溶液調(diào)整PH值至7.4，再用0.22μm過濾器除菌,即100％CSE，儲存于﹣80℃冰箱。3.PM顆粒制備實施例中用到的PM顆粒均由美國路易斯安娜州立大學(xué)Cormier教授提供，經(jīng)高溫燃燒人工合成，粒徑在0.2μm左右，包含穩(wěn)定的自由基。4.siRNA轉(zhuǎn)染實施例中用到的siRNA為市售產(chǎn)品，均購自Santacruz公司(ATG5-siRNA,SC-41445；ATG12-siRNA,SC-72578；LC3B-siRNA,SC-29390；Beclin-1-siRNA,sc-29797)。這些siRNA分別特異性地抑制ATG5、ATG12、LC3B、Beclin-1。轉(zhuǎn)染試劑為GenMuteTM轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染方法參考轉(zhuǎn)染試劑的說明書。轉(zhuǎn)染48小時后，檢測基因的沉默效率。5.RNA提取和Q-PCR所有實施例中均使用常規(guī)Trizol試劑提取細胞RNA。取1g提取的總RNA，采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，應(yīng)用SYBRGreenExTagTM系統(tǒng)進行Q-PCR研究，最終采用2-ΔΔCt法確定靶基因的mRNA的相對表達量，ΔΔCt的計算公式如下：ΔΔCt＝ΔCt,q–ΔCt,cb；ΔCt,q表示待測樣本q靶基因的Ct值與同一樣本管家基因(β-actin)的Ct值得差值，ΔCt,b表示對照組靶基因的Ct值與管家基因Ct值的差值。具體實施例中人源的MUC5AC引物為：sense:5′-CAGCACAACCCCTGTTTCAAA-3′(SEQIDNO.:1)，antisense:5′-GCGCACAGAGGATGACAGT-3′(SEQIDNO.:2)；具體實施例中小鼠的MUC5AC引物為：sense:5′-CTGTGACATTATCCCATAAGCCC-3′(SEQIDNO.:3)，antisense:5′-AAGGGGTATAGCTGGCCTGA-3′(SEQIDNO.:4)。6.免疫熒光檢測MUC5AC細胞種植于載玻片上，經(jīng)干預(yù)后，用PBS沖洗，用4％福爾馬林固定，用0.1％Triton-X100破膜處理，后進行抗體染色。ZeissLSM激光共聚焦顯微鏡檢測MUC5AC免疫熒光表達。7.小鼠香煙煙霧暴露模型采用美國TeagueEnterprises的小動物煙霧暴露裝置，將研究小鼠給予煙霧暴露(100支煙/天，5天/周)，對照組小鼠暴露于空氣中，持續(xù)12周。8.小鼠PM干預(yù)模型每只小鼠以每天100μgPM(溶解于50μLPBS)劑量連續(xù)氣道滴注4天，對照小鼠只滴注相同劑量PBS。末次干預(yù)24小時后取小鼠肺組織進行分析。9.小鼠屋塵螨提取物(HDM)干預(yù)模型以HDM致敏并激發(fā)建立哮喘模型。致敏：第0天,第3天和第5天每只哮喘模型組小鼠分別氣道滴注10μgHDM(溶解于50μLPBS)。激發(fā)：第10天，第12天和第14天，每只哮喘模型組小鼠每只哮喘模型組小鼠同樣氣道滴注10μgHDM(溶解于50μLPBS)。對照小鼠只滴注相同劑量PBS。末次干預(yù)24小時后取 小鼠肺組織進行分析。10.肺組織處理通過氣管插管向左肺灌注4％福爾馬林內(nèi)固定，后放入裝有4％福爾馬林的5ml試管中外固定，標(biāo)本常溫送病理作PAS染色。11.統(tǒng)計分析所有實施例中的實驗數(shù)據(jù)均采用GraphPadPrism5.0軟件進行統(tǒng)計，所得結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SEM)表示，進行獨立樣本的t檢驗或者one-wayANOVA檢驗。P<0.05表示有顯著性差異。實施例1阻斷細胞自噬對降低CSE誘導(dǎo)的HBE細胞中MUC5AC表達的作用在實施例中，在HBE細胞中，利用細胞自噬相關(guān)基因如ATG5、ATG12、或LC3B的siRNA阻斷細胞自噬，香煙煙霧提取物CSE誘導(dǎo)，檢測MUC5AC的表達情況。方法如下：HBE細胞首先給與不同siRNA干預(yù)24小時，隨后給與1％CSE后續(xù)干預(yù)24小時，收集細胞，分別提取RNA或者做免疫熒光檢測MUC5AC的mRNA或者蛋白表達。結(jié)果見圖1所示，阻斷HBE細胞中的細胞自噬可以顯著降低香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的MUC5AC表達。其中圖1A顯示了MUC5AC的mRNA表達，圖1B顯示了免疫熒光檢測MUC5AC。(***，p<0.001)實施例2施用細胞自噬抑制劑對降低CSE誘導(dǎo)的HBE細胞中MUC5AC表達的作用在實施例中，在HBE細胞中，應(yīng)用細胞自噬抑制劑BafilomycinA1(BafA1)和Chloroquine(CQ)，香煙煙霧提取物CSE誘導(dǎo)，檢測MUC5AC的表達情況。方法如下：HBE細胞給與BafA1(10nM)或者CQ(10μM)與1％CSE同時干預(yù)24小時，收集細胞，分別提取RNA或者做免疫熒光檢測MUC5AC的mRNA或者蛋白表達。結(jié)果見圖2所示，應(yīng)用細胞自噬抑制劑可以顯著降低香煙煙霧提取物誘導(dǎo) 的MUC5AC表達。其中圖2A顯示了MUC5AC的mRNA表達，圖2B顯示了免疫熒光檢測MUC5AC。(**，p<0.01；***，p<0.001)實施例3阻斷細胞自噬對降低PM誘導(dǎo)的HBE細胞中MUC5AC表達的作用在實施例中，在HBE細胞中，利用細胞自噬相關(guān)基因Beclin-1、或ATG5的siRNA阻斷細胞自噬，大氣污染顆粒PM誘導(dǎo)，檢測MUC5AC的表達情況。方法如下：HBE細胞首先給與不同siRNA干預(yù)24小時，隨后給與PM(100μg/ml)后續(xù)干預(yù)24小時，收集細胞，分別提取RNA或者做免疫熒光檢測MUC5AC的mRNA或者蛋白表達。結(jié)果見圖3所示，阻斷HBE細胞中的細胞自噬可以顯著降低大氣污染顆粒PM誘導(dǎo)的MUC5AC表達。其中圖3A顯示了MUC5AC的mRNA表達，圖3B顯示了免疫熒光檢測MUC5AC。(*，p<0.05)實施例4細胞自噬相關(guān)基因缺陷對降低煙霧誘導(dǎo)的小鼠氣道粘液高分泌的作用在實施例中，香煙煙霧暴露模型誘導(dǎo)細胞自噬相關(guān)的Beclin-1、或LC3B基因缺陷小鼠，檢測小鼠肺組織中的氣道粘液分泌情況，上皮細胞中PAS染色陽性提示上皮細胞杯狀化生和粘液高分泌。方法如下：各組小鼠利用TeagueE10小動物煙霧暴露裝置給與香煙煙霧暴露(每周5天，每天2小時)連續(xù)3個月后，處死小鼠，肺組織PAS染色檢測氣道上皮細胞杯狀化生和粘液高分泌。結(jié)果見圖4所示，細胞自噬相關(guān)基因缺陷可以有效緩解香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌。其中圖4A和4C分別顯示了LC3B小鼠和Beclin-1小鼠煙霧暴露后氣道粘液分泌的代表性圖片，圖4B和4D分別顯示了各組小鼠PAS染色的半定量分析結(jié)果。(***，p<0.001；N.D.，notdetectable，沒有檢測到)實施例5細胞自噬相關(guān)基因缺陷對降低PM干預(yù)誘導(dǎo)的小鼠氣道粘液高分泌的作用在實施例中，PM干預(yù)誘導(dǎo)細胞自噬相關(guān)的Beclin-1基因缺陷小鼠，檢測小鼠肺組織中的氣道粘液分泌情況。方法如下：每只小鼠以每天100μgPM(溶解于50μLPBS)劑量連續(xù)氣道滴注4天，對照小鼠只滴注相同劑量PBS。末次干預(yù)24小時后取小鼠肺組織，檢測其MUC5AC的mRNA表達水平，肺組織PAS染色檢測氣道上皮細胞杯狀化生和粘液高分泌。結(jié)果見圖5所示，細胞自噬相關(guān)基因缺陷可以顯著降低PM干預(yù)誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌和MUC5AC表達。其中圖5A顯示了各組小鼠PM干預(yù)后氣道粘液分泌的代表性圖片，圖5B顯示了各組小鼠PAS染色的半定量分析結(jié)果，圖5C顯示了小鼠肺組織MUC5AC的mRNA表達水平。(**，p<0.01；N.D.，notdetectable，沒有檢測到)。實施例6細胞自噬相關(guān)基因缺陷對降低HDM干預(yù)誘導(dǎo)的小鼠氣道粘液高分泌的作用在實施例中，HDM干預(yù)誘導(dǎo)細胞自噬相關(guān)的LC3B基因缺陷小鼠，檢測小鼠肺組織中的氣道粘液分泌情況。方法如下：小鼠經(jīng)第0、3、5天3次致敏和第10、12、14天3次HDM激發(fā)，末次激發(fā)24小時后取小鼠肺組織，PAS染色檢測氣道上皮細胞杯狀化生和粘液高分泌。結(jié)果見圖6所示，細胞自噬相關(guān)基因缺陷可以顯著降低HDM干預(yù)誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌。其中圖6A顯示了各組小鼠HDM干預(yù)后氣道粘液分泌的代表性圖片，圖6B顯示了各組小鼠PAS染色的半定量分析結(jié)果。(***，p<0.001；N.D.，notdetectable，沒有檢測到)討論氣道粘液高分泌是很多慢性氣道疾病如哮喘的主要臨床特征之一，這些疾病的急性加重包括死亡常常伴有大量的呼吸道粘液栓。目前臨床上對于慢性氣道疾病患者粘液高分泌尚缺乏有效的防治辦法，因此，如何抑制氣道粘液高分泌是慢性氣道疾病防治所面臨的挑戰(zhàn)和機遇。本發(fā)明人的上述實驗提示，細胞自噬是慢性氣道疾病粘液高分泌發(fā)生發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵因素。在體外培養(yǎng)的氣道上皮HBE細胞中，本發(fā)明人利用不同自噬相關(guān)分子如Beclin-1，ATG5，ATG12等的siRNA阻斷細胞自噬，能有效 降低CSE或者PM誘導(dǎo)的MUC5AC的表達。此外，在HBE細胞中，細胞自噬抑制劑BafA1和CQ也能顯著抑制CSE誘導(dǎo)的MUC5AC的表達。同時，利用細胞自噬相關(guān)Beclin-1和LC3B基因缺陷的小鼠，本發(fā)明在煙霧暴露誘導(dǎo)模型、在PM誘導(dǎo)的氣道損傷模型、以及在HDM誘導(dǎo)的哮喘模型中都發(fā)現(xiàn)，自噬缺陷小鼠中氣道粘液高分泌的水平均顯著降低。這些不同疾病模型的研究結(jié)果均提示同一結(jié)論，即抑制細胞自噬能有效緩解氣道粘液高分泌，細胞自噬有望成為臨床上防治氣道粘液高分泌的全新靶點。本發(fā)明的實驗結(jié)果提示，無論是對于香煙煙霧誘導(dǎo)的模型、還是過敏原誘導(dǎo)的哮喘、抑或是大氣顆粒污染誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌，細胞自噬均能作為一個有效的防治粘液高分泌的關(guān)鍵靶點。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3