本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定的制劑。
背景技術(shù)：
：表皮生長因子受體(EGFR)是一種上皮生長因子細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的重要受體，EGFR通過與其配體相結(jié)合來產(chǎn)生效應(yīng)。EGFR的特異性配體為EGF和EGF相關(guān)多肽，包括轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、雙調(diào)蛋白和肝素結(jié)合EGF樣生長因子。為了激活EGFR，配體EGF(單體)同時結(jié)合并連接兩個相鄰的受體鏈，使受體的胞內(nèi)激酶局域在多個酪氨酸上相互磷酸化，酪氨酸激酶活性提高從而可以激活數(shù)個信號通路如ras-MAPK通路，PI3激酶通路以及JAK/STAT通路等。EGFR受體過表達(dá)或突變后結(jié)構(gòu)激活(不需要配體)以及自分泌刺激導(dǎo)致的過度EGFR功能與多種癌癥發(fā)生相關(guān)。EGFR的致瘤效應(yīng)包括DNA合成啟動、促進(jìn)細(xì)胞生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移，特異性敲除EGFR可導(dǎo)致細(xì)胞周期俘獲、細(xì)胞凋亡以及癌細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在多種人上皮組織來源的癌癥(如膀胱、乳腺、宮頸、結(jié)腸、頭頸、腎、肺、胰腺、以及前列腺等)中有不同水平的表達(dá)，EGFR在結(jié)腸直腸癌表達(dá)率高達(dá)25－77％，且與腫瘤的惡化以及不良預(yù)后相關(guān)。正因?yàn)镋GFR具有上述特點(diǎn)，以EGFR為靶點(diǎn)的抗體藥物不斷被開發(fā)，有的產(chǎn)品已被用于腫瘤治療的臨床實(shí)踐：(愛必妥、cetuximab、西妥昔單抗)是Imclone公司開發(fā)的一種鼠/人嵌合的單克隆抗EGFR抗體。是一種無菌、澄明、無色液體，pH7.0至7.4，其中可能含小量容易可見、白色、無定形西妥昔單抗微粒。每小瓶Erbitux包含：2mg/mL的cetuximab、8.48mg/mL的氯化鈉、1.88mg/mL的磷酸氫二鈉七水、0.41mg/mL磷酸二氫鈉一水合物，和注射用水(USP)。Cetuximab可 以與EGFR受體以高出內(nèi)源配體約5到10倍的親和力與EGFR特異結(jié)合，從而競爭性拮抗配體與EGFR的結(jié)合，封鎖受體與配體的結(jié)合繼而抑制配體介導(dǎo)的EGFR酪氨酸激酶的激活，從而使腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞中多種由EGFR信號通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞過程被阻斷，包括EGFR下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)信號的抑制，細(xì)胞周期的抑制，凋亡的誘導(dǎo)，DNA修復(fù)的抑制，血管生成的抑制，腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性、侵襲性以及轉(zhuǎn)移性的抑制等等。美國FDA于2004年2月批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌的治療，2006年FDA還批準(zhǔn)其用于治療頭頸部腫瘤。(帕尼單抗、panitumumab)是由Amgen公司開發(fā)的一種用于治療化療失敗后轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的抗EGFR全人源單克隆抗體，是一種無菌、無色、pH5.6至6.0的液體制劑，有5mL、10mL、20mL三種規(guī)格，其中5mL規(guī)格的單次用小瓶含100mg的panitumumab、29mg的氯化鈉、34mg醋酸鈉，和注射用水，USP；10mL規(guī)格的單次用小瓶含200mg的panitumumab、58mg的氯化鈉、68mg的醋酸鈉，和注射用水，USP；20mL規(guī)格的單次用小瓶含400mg帕尼單抗、117mg氯化鈉、136mg醋酸鈉、和注射用水，USP。2006年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌。201010148069.0公開了一種具有高親和力的抗EGFR單克隆抗體和其在制備抗腫瘤藥物中的用途；其中重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列為SEQIDNO：14，輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列為SEQIDNO：6或SEQIDNO：12的抗體與EGFR的親和力和Cetuximab相比提高至少10倍?！牵F(xiàn)有的這些抗EGFR抗體的制劑均是低濃度的制劑，其并不適合于皮下注射，因?yàn)橛糜谄は伦⑸涞乃幬锶芤旱捏w積比靜脈內(nèi)輸注體積小得多，所以其要求抗體制劑濃度通常高達(dá)幾十、甚至幾百mg/ml的水平。而皮下注射給 藥與靜脈注射給藥相比，使用更為方便快捷、安全可靠，且有助于提高患者的生活質(zhì)量、減少病人的就診時間，目前已成為未來的發(fā)展方向。但是，高濃度的抗體溶液相對于低濃度的制劑來說更不穩(wěn)定，易發(fā)生蛋白質(zhì)聚集，而聚集易造成活性抗體的生物利用率減少、藥物代謝動力學(xué)改變、不利的免疫原性等問題的發(fā)生(Frokjaer，S.和Otzen，D.Ε.，Nat.Rev.Drug.Discov.4:298_306(2005)；Jiskoot,W.和Crommelin，D.J.A.，EJHPPractice12：20-21(2006))。目前防止聚集常見策略一是通過添加賦形劑至蛋白質(zhì)溶液，常使用的穩(wěn)定劑包括糖、鹽、游離氨基酸、多元醇、聚乙二醇(PEG)和可以減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的其他聚合物，如聚山梨酯(polysorbates)或泊洛沙姆(Nema,S.^A,PDAJournalofPharmaceuticalScienceandTechnology51:166-171(1997))；或者通過加入適當(dāng)?shù)馁x形劑(包括凍干保護(hù)劑)低壓凍干來防止蛋白質(zhì)聚集。但是，這些策略應(yīng)用于需要上百mg/ml以上的高濃度注射制劑時，效果不是很理想。因此，如何開發(fā)一種適于皮下注射用的高濃度的穩(wěn)定的抗體制劑仍是非常必要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的申請人經(jīng)過大量的研究實(shí)驗(yàn)，開發(fā)了一種高濃度的穩(wěn)定的抗體制劑，該制劑包含玻璃酸酶和環(huán)糊精；該制劑配方尤其適合于制備注射用的高濃度抗EGFR抗體制劑。具體地，本發(fā)明公開了：1、一種穩(wěn)定的高濃度抗體制劑，其包含：抗體、玻璃酸酶和環(huán)糊精。2、上述1所述的制劑，其還包括一種或多種穩(wěn)定劑、非離子型表面活性劑或緩沖劑。3、一種穩(wěn)定的高濃度抗體制劑，其包含：a.濃度50mg/ml以上的抗體；b.1至150mM緩沖劑；c.15至250mM糖；d.0.01至0.1％的非離子型表面活性劑；e.40000個U/ml以上的玻璃酸酶；和f.20％至50％的環(huán)糊精。4、上述1-3任一所述制劑，其特征在于，所述玻璃酸酶為rHuPH20。5、上述1-4任一所述制劑，所述環(huán)糊精為HP-β環(huán)糊精。6、上述1-4任一所述制劑，所述糖為80至150mM蔗糖。7、上述1-6任一所述制劑，所述非離子型表面活性劑選自下組：聚山梨酯20、聚山梨酯80、和聚乙烯-聚丙烯共聚物。8、上述7所述的非離子型表面活性劑為濃度是0.02％至0.08％的聚山梨酯80。9、上述1-5任一所述制劑，所述抗體為濃度100至250mg/ml的抗EGFR抗體。10、一種穩(wěn)定的高濃度抗體制劑，其包含：a.濃度100到300mg/ml的抗EGFR抗體；b.50至150mM的組氨酸緩沖劑；c.100至150mM蔗糖；d.0.02％至0.08％的聚山梨酯80；e.40000個U/ml至70000個U/ml的rHuPH20；和f.15％至40％的HP-β環(huán)糊精。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的制劑可有效防止高濃度抗體在長期儲存過程中發(fā)生聚集，從而提供了一種具有良好穩(wěn)定性的抗體制劑，該制劑即使在常溫下也具有較好的穩(wěn)定性，保證制劑合理的保質(zhì)期。本發(fā)明的抗EGFR抗體制劑，其可用于治療人的頭頸部鱗狀上皮癌、結(jié)腸直 腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等。優(yōu)選地可作為注射用水性溶液制劑使用，更優(yōu)選的可將溶液充裝在預(yù)充式注射器中通過皮下注射使用。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例是為了舉例說明本發(fā)明并幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行和使用本發(fā)明，不應(yīng)理解為是對本發(fā)明的限制。以下實(shí)施例中，抗EGFR抗體(參照中國專利號201010148069.0中公開的方法制備得到)，其它實(shí)驗(yàn)用材料均是通過商業(yè)渠道得到，如HP-β環(huán)糊精(購自源葉生物)、rHuPH20(Halozyme)、組氨酸(江萊生物)、蔗糖(諾辰生物)、聚山梨酯80(盛天恒創(chuàng))等。任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會理解的是，將被包括在組合物中的各種組分的組合可以以任何適當(dāng)?shù)捻樞騺硗瓿?，即，可以首先添加、在中間添加或在最后添加緩沖劑，并且也以可首先添加、在中間添加或在最后添加表面活性劑等。同樣，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會理解的是，在某些組合中這些化學(xué)物質(zhì)中的一些是不相容的，并且因此，它們可以容易地被具有相似性質(zhì)但在有關(guān)混合物中是相容的不同的化學(xué)物質(zhì)取代。除特別注明外，制劑中的含量％比均為質(zhì)量體積百分比濃度(w/v),溶液PH可根據(jù)需要調(diào)節(jié)，優(yōu)選4-8。實(shí)施例1玻璃酸酶和環(huán)糊精對抗體制劑的影響25℃含有玻璃酸酶和環(huán)糊精的抗EGFR抗體制劑的穩(wěn)定性研究。所述制劑除玻璃酸酶和環(huán)糊精外還可含有其它的按照在表1中所給出的賦形劑。表1：抗EGFR抗體制劑配方上述樣品制劑在35℃下孵育60天，然后分別在第0、20、40、60天時間點(diǎn)通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。SDS-PAGE被用作一種分析技術(shù)，可以根據(jù)分子量從天然蛋白質(zhì)中分離出游離的和高分子量的種類。由于在高濃度的抗體制劑中，大分子抗體具有高的聚集傾向，非還原SDS-PAGE被用來評定共價聚集體。表2：不同配方抗EGFR抗體制劑聚集體SDS-PAGE分析結(jié)果SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，沒有添加玻璃酸酶和環(huán)糊精的F1、F2制劑更易產(chǎn)生抗體聚集體，加有玻璃酸酶和環(huán)糊精兩種輔料的制劑F5、F6、F7、F8幾乎沒有產(chǎn)生聚集體，具有更好的穩(wěn)定性。實(shí)施例2糖對抗體制劑的影響評價不同水平的糖對抗EGFR抗體制劑穩(wěn)定性的影響。我們將樣品放置于-20℃、8℃和45℃，60％濕度的條件下并在不同時間點(diǎn)通過SE-HPLC方法檢測抗EGFR抗體制劑中抗體的聚集情況。表3:抗EGFR抗體制劑配方表序號成分F9F10F11F121抗EGFR抗體(mg/ml)2002002002002蔗糖(mM)201002004003組氨酸緩沖劑(mM)1501501501504聚山梨酯80(％)0.020.020.020.025rHuPH20(個U/ml)500005000050000500006HP-β環(huán)糊精(％)35353535表4:糖對抗EGFR抗體制劑穩(wěn)定性的影響由表4所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，糖對抗EGFR抗體制劑穩(wěn)定性有一定影響，優(yōu)選地，當(dāng)蔗糖為100-200mM時，制劑穩(wěn)定性較佳。實(shí)施例3表面活性劑對抗體制劑的影響從非離子表面活性劑聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)和帕洛沙姆(例如帕洛沙姆188或168)中篩選出在穩(wěn)定性方面最適合的候選物。我們主要通過對比分析不同含量的聚山梨酯20和帕洛沙姆188的抗EGFR抗體制劑在儲存過程中的聚集情況，從而分析不同表面活性劑對制劑穩(wěn)定性的影響。我們將樣品放置于30℃、60％濕度的條件下并在不同時間點(diǎn)通過SE-HPLC方法檢測抗EGFR抗體制劑中抗體的聚集情況。表5:抗EGFR抗體制劑配方表表6：:表面活性劑對抗EGFR抗體制劑穩(wěn)定性的影響由上表6可知，與含有帕洛沙姆188表面活性劑的制劑相比，聚山梨酯80具有更少的聚集體，優(yōu)選地，含有0.06％聚山梨酯80的抗EGFR抗體制劑具有更好的穩(wěn)定性。實(shí)施例4抗EGFR抗體制劑的配制及穩(wěn)定性試驗(yàn)表7抗EGFR抗體制劑優(yōu)選配方抗EGFR抗體200mg/ml蔗糖120mM組氨酸緩沖劑100mM聚山梨酯800.06％rHuPH2055000個U/mlHP-β環(huán)糊精35％PH5.5-8參考ZL200610147281.9中所述溶液制劑配制方法制備表7所述配方的抗EGFR抗體溶液制劑。然后在-20℃、5℃和25℃下儲存抗EGFR抗體溶液制劑在儲存開始、1個月、3個月以及6個月之后的聚集體情況，通過SE-HPLC分析抗EGFR抗體溶液制劑的穩(wěn)定性。結(jié)果見表8。表8：抗EGFR抗體溶液制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(備注：每個溫度測定3組平行制劑取平均值)另外，我們還將配制好的表9所述配方的抗EGFR抗體溶液制劑在空氣層流下用0.2μm過濾器滅菌并在60℃下儲存。通過SE-HPLC分析該制劑在儲存開始、10天、20天、30天之后的穩(wěn)定性。結(jié)果見表9。表9:抗EGFR抗體溶液制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果測定a0天10天20天30天SE-HPLC測定的聚集化％0.511.201.952.75(備注：每個溫度測定3組平行制劑取平均值)由上述表8-9可知，本發(fā)明的抗EGFR抗體溶液制劑穩(wěn)定性較好，即使在常溫或更高溫度的情況下仍具有較好的穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明的研究人員還對其它商業(yè)化的cetuximab、panitumumab等抗EGFR抗體進(jìn)行上述1-5實(shí)驗(yàn)，制劑穩(wěn)定性與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，均具有較好的穩(wěn)定性。本發(fā)明的抗EGFR抗體制劑，其被用于治療人的頭頸部鱗狀上皮癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等。優(yōu)選地作為注射用水性溶液而被使用，更優(yōu)選的可將溶液充裝在預(yù)充式注射器中通過皮下注射使用。當(dāng)前第1頁1 2 3