本申請(qǐng)要求2014年5月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/987,834號(hào)和2014年6月25日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/016,981號(hào)的優(yōu)先權(quán)，每一臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容由此都以全文引用的方式并入。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明大體上涉及寄生蟲學(xué)領(lǐng)域、瘧疾研究和瘧疾疫苗開發(fā)。更確切地說(shuō)，其涉及人類宿主范圍的瘧原蟲子孢子和體外培養(yǎng)人類宿主范圍感染性瘧原蟲寄生蟲的蚊期，尤其子孢子期，和體外培養(yǎng)的瘧原蟲子孢子作為疫苗與其它試劑的免疫原性組分的用途。

背景技術(shù)：

每年，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum，Pf)瘧疾造成>2億臨床病例，超過(guò)600,000人死亡，并且造成非洲國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值損失超過(guò)$12B[1-3]。瘧疾也是旅行者和軍事人員的重大隱患。在2010-2011期間，在來(lái)自英國(guó)的旅行者中，瘧疾病例的數(shù)目增加了30％[4]。在2011年，美國(guó)的瘧疾病例比過(guò)去40年中任一年都多[5，6]。在過(guò)去150年中美國(guó)在瘧疾高發(fā)區(qū)的所有軍事活動(dòng)中，美國(guó)軍隊(duì)死于瘧疾的人比死于敵方炮火的人更多[7]。在全球健康市場(chǎng)中，高效疫苗將對(duì)大致25億“有風(fēng)險(xiǎn)的”個(gè)體具有顯著影響。

世界團(tuán)體現(xiàn)在每年花費(fèi)大致$20億來(lái)通過(guò)使用殺蟲劑浸漬的蚊帳、殺蟲劑和抗瘧疾藥物來(lái)控制瘧疾。對(duì)出生在非洲的每個(gè)兒童，這相當(dāng)于每年大致$80，并且在一些地方，所花費(fèi)的是所述金額的5到10倍。這些方法在許多區(qū)域具有極佳效果。然而，耐藥性和耐殺蟲劑性仍在發(fā)展，并且捐助人和地方政府維持此努力的能力有限。顯然，在高傳播區(qū)消除瘧疾將需要新工具。如在2010年社論中所描述，高效疫苗將是用于在世界范圍內(nèi)預(yù)防、控制和消除瘧疾的理想工具：

“仍需要的是曾真正克服任何傳染病的唯一工具：有效的……經(jīng)濟(jì)上可承受的疫苗……在這方面，全球瘧疾團(tuán)體太自滿了……葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline)的RTS,S加佐劑AS01是具有適度和時(shí)間受限功效的第一代紅細(xì)胞前期疫苗……我們無(wú)法承受下一代……疫苗要再等20年……”

-匿名,柳葉刀(The Lancet),2010年4月24日

并且如2011年malERA倡議報(bào)告中所描述，理想的疫苗將是紅細(xì)胞前期疫苗，其預(yù)防寄生蟲離開肝臟進(jìn)入血流，由此預(yù)防疾病以及傳播[8]。這已經(jīng)被稱為“中斷瘧疾傳播的疫苗”(‘VIMT’)。

葛蘭素史克公司已經(jīng)開發(fā)出被稱為RTS,S/AS01的疫苗候選物，其使用重組蛋白(其與具有B型肝炎表面抗原的Pf環(huán)子孢子蛋白質(zhì)(circumsporozoite protein，CSP)的一部分融合)與強(qiáng)佐劑(AS01)。最近在5-27月人類齡中的3期試驗(yàn)[9-12]展現(xiàn)，瘧疾發(fā)生率在一年內(nèi)減少36％，并且獲得瘧疾的速率在第一年內(nèi)降低56％，并且嚴(yán)重瘧疾在第一年內(nèi)減少47％。不利的是，在嬰兒中的結(jié)果沒(méi)有這么強(qiáng)。在6-12周齡人類中，所述疫苗展現(xiàn)，瘧疾發(fā)生率在一年內(nèi)減少16％，獲得瘧疾的速率在第一年內(nèi)降低31％，并且嚴(yán)重瘧疾在第一年內(nèi)減少36％(按有意向治療計(jì)，26％)。這些結(jié)果已經(jīng)令人失望，并且將無(wú)法認(rèn)為此疫苗是高效或像VIMT一樣。

在過(guò)去十年中，開發(fā)高效VIMT瘧疾疫苗的焦點(diǎn)已經(jīng)部分地轉(zhuǎn)移到利用瘧原蟲的全寄生蟲子孢子(sporozoite，SPZ)期作為疫苗免疫原。在國(guó)家過(guò)敏癥和傳染病研究院(National Institute of Allergy and Infectious Disease，NIAID)疫苗研究中心(VRC)最近完成的研究中，通過(guò)靜脈內(nèi)(IV)注射投與由輻射減毒Pf SPZ構(gòu)成的 PfSPZ疫苗，并且保護(hù)了6名接受最高劑量的志愿者中的6人(100％)。關(guān)于保護(hù)功效存在劑量反應(yīng)(9名以下一個(gè)較低總劑量受保護(hù)者中的6人)，并且在抗體針對(duì)Pf SPZ的效價(jià)與保護(hù)之間存在顯著相關(guān)性。因此，可論證地， PfSPZ疫苗在人類中具有強(qiáng)效和高保護(hù)性。這些歷史結(jié)果在2013年8月在科學(xué)(Science)中線上出版，并且在2013年9月印刷出版[13]。

SPZ也正用作稱為 PfSPZ-CVac的疫苗接種的感染與治療方法的寄生蟲組分，其中在無(wú)性生殖紅細(xì)胞期抗瘧疾藥(如氯喹)存在下投與活感染性瘧原蟲SPZ[14]。

最后，活感染性Pf SPZ正作為用于測(cè)試瘧疾疫苗和其它治療劑的手段用于受控人類瘧疾感染(CHMI)[15，16]。

由從蚊子中提取的唾液腺制備并且在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的基本上純化的瘧原蟲子孢子描述于美國(guó)專利8,043,625中，其以引入的方式并入本文中。

目前，在上文所描述的疫苗和試劑中所用的全寄生蟲Pf SPZ已經(jīng)通過(guò)以下來(lái)獲得：飼養(yǎng)無(wú)菌按蚊屬(Anopheles)蚊子，用無(wú)菌Pf配子母細(xì)胞使其感染，準(zhǔn)許Pf寄生蟲經(jīng)由在蚊子中進(jìn)行體內(nèi)孢子生殖來(lái)進(jìn)展到子孢子期，并且接著從蚊子中人工解剖唾液腺并分離和純化無(wú)菌子孢子(美國(guó)專利7,229,627；美國(guó)專利8,367,810)[17]。雖然此制造方法能夠產(chǎn)生足夠量的經(jīng)過(guò)無(wú)菌純化的活Pf SPZ以用于這些產(chǎn)物的所有臨床試驗(yàn)中，但所述方法是勞動(dòng)力密集的并且需要用于昆蟲飼養(yǎng)和寄生蟲解剖的大量資源。確切地說(shuō)，由蚊子唾液腺解剖是產(chǎn)生Pf SPZ和其它人類宿主范圍瘧原蟲物種SPZ中專業(yè)并且耗時(shí)的步驟。

瘧原蟲寄生蟲發(fā)育的蚊子宿主期展示于圖1中。雖然體外確立瘧原蟲生命周期的無(wú)性生殖部分(脊椎動(dòng)物宿主期)的努力已經(jīng)獲得成功[18]，也已經(jīng)為了對(duì)有性生殖部分(蚊子宿主期)和孢子生殖部分實(shí)現(xiàn)相同結(jié)果而進(jìn)行大量努力，但這些成果對(duì)于產(chǎn)生臨床上相關(guān)的人類宿主范圍的感染性瘧原蟲子孢子(尤其Pf SPZ)不成功。雞瘧原蟲(P.gallinaceum)(禽類宿主范圍)和Pf動(dòng)合子的體外轉(zhuǎn)型得到低數(shù)目的卵囊和SPZ，但從未展現(xiàn)這些子孢子的感染性[19-20]。伯氏瘧原蟲(P.berghei)(嚙齒動(dòng)物宿主范圍)的體外轉(zhuǎn)型產(chǎn)生卵囊和SPZ，但所述SPZ的感染性比蚊源性SPZ小得多[21]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提供體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍感染性瘧原蟲子孢子(SPZ)，尤其惡性瘧原蟲(Pf)SPZ，其中從配子母細(xì)胞期到子孢子期的孢子生殖在蚊子外部進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的感染性瘧原蟲子孢子不具有任何伴隨蚊類物質(zhì)。

另外提供體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲的培養(yǎng)物，尤其Pf寄生蟲的培養(yǎng)物，其中所述寄生蟲已經(jīng)進(jìn)行體外孢子生殖發(fā)育。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)物不具有任何伴隨蚊類物質(zhì)。

另外提供在人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的孢子生殖發(fā)育期間體外培養(yǎng)所述子孢子的方法，所述方法包含在小配子形成培養(yǎng)基中在紅細(xì)胞存在下培養(yǎng)人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞，使用凝集素使紅細(xì)胞凝集，收集包含接合子、配子、配子母細(xì)胞和凝集細(xì)胞的混合物(例如團(tuán)塊)，在包含基質(zhì)的襯底(substrate)上并在動(dòng)合子培養(yǎng)基中培養(yǎng)所收集的混合物(例如團(tuán)塊)，更換培養(yǎng)基并在卵囊培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，和采集由此產(chǎn)生的瘧原蟲子孢子。

還提供用于相對(duì)于在蚊子中由相等數(shù)目人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞的卵囊產(chǎn)生而增加人類宿主范圍瘧原蟲卵囊產(chǎn)生的方法，其包含在小配子形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞，收集包含接合子、配子、配子母細(xì)胞和凝集細(xì)胞的混合物(例如團(tuán)塊)，在包含基質(zhì)的襯底上并在動(dòng)合子培養(yǎng)基中培養(yǎng)所收集的混合物(例如團(tuán)塊)，更換培養(yǎng)基并在卵囊培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，和對(duì)瘧原蟲卵囊數(shù)目進(jìn)行量化，其中與在蚊子中由相等數(shù)目瘧原蟲配子母細(xì)胞發(fā)育的相同物種卵囊相比較，所述方法產(chǎn)生更多的體外發(fā)育的卵囊。

還提供在個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)瘧原蟲物種特異性抗原的免疫反應(yīng)的方法，其包含向所述個(gè)體投與人類宿主范圍的瘧原蟲飼養(yǎng)子孢子。

還提供包含體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的疫苗組合物。在一些實(shí)施例中，疫苗不具有任何伴隨蚊類物質(zhì)。

本文所公開的本發(fā)明提供例如以下創(chuàng)新：i)與在蚊子中并且由相等數(shù)目V期配子母細(xì)胞發(fā)育的相同瘧原蟲物種卵囊相比較，得到平均39倍的體外發(fā)育的卵囊；ii)產(chǎn)生體外飼養(yǎng)的感染性Pf SPZ；及iii)由體外產(chǎn)生的Pf SPZ達(dá)到至少與蚊子產(chǎn)生的Pf SPZ同樣高效的人類肝細(xì)胞感染性。

此工作的突出之處在于，在由既定數(shù)目的配子母細(xì)胞體外產(chǎn)生的Pf SPZ數(shù)量方面和在體外產(chǎn)生的Pf SPZ展現(xiàn)全功能感染活性方面具有獨(dú)特性。舉例來(lái)說(shuō)，本文描述體外產(chǎn)生的Pf SPZ成功地侵入人類肝細(xì)胞株HC-04[24，25]，并且發(fā)育成表達(dá)裂體性孢子表面蛋白質(zhì)1(Pf MSP1)(一種展現(xiàn)感染性的蛋白質(zhì))的裂殖體；并且展現(xiàn)此體外感染性至少與蚊子產(chǎn)生的Pf SPZ的感染性同樣高效。

附圖說(shuō)明

圖1繪示惡性瘧原蟲在蚊子中的孢子生殖發(fā)育。

圖2A-2B提供體外產(chǎn)生的惡性瘧原蟲的接合子后期發(fā)育的樣本圖像。(A)展示早期瓶狀體(retort)、中期瓶狀體和晚期瓶狀體(從左到右)，并且(B)展示成熟動(dòng)合子。在誘導(dǎo)后第18天時(shí)從配子母細(xì)胞培養(yǎng)物中取得寄生蟲。在動(dòng)合子培養(yǎng)起始之后約14小時(shí)時(shí)首先發(fā)現(xiàn)早期瓶狀體，并且在24小時(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)動(dòng)合子。展示培養(yǎng)物的吉姆沙(Giemsa)染色涂片。

圖3A-B展示使用針對(duì)血型糖蛋白A和Pfs25的抗體對(duì)(A)配子母細(xì)胞和(B)動(dòng)合子的免疫染色。針對(duì)血型糖蛋白A(指向紅色染色的空心箭頭)的抗體和針對(duì)Pfs25(指向綠色染色的實(shí)心箭頭)的抗體。

圖4展示體外發(fā)育的Pf卵囊的IFA和亮視野圖像。展示使用抗Pfs25和抗PfCSP mAb通過(guò)IFA所檢測(cè)的3天(上部圖)和8天(下部圖)卵囊。對(duì)8天培養(yǎng)物進(jìn)行透化以用于IFA。在8天卵囊中的點(diǎn)狀染色表明出芽的Pf SPZ。中間圖展示在培養(yǎng)物中發(fā)育的7到8天卵囊。箭頭指示卵囊。

圖5A-B展示(A)體外和(B)在汞溴紅染色的蚊子中腸中的7天卵囊。

圖6A-B展示體外產(chǎn)生的Pf SPZ：(A)在使培養(yǎng)物孔固定之后所檢測(cè)的在培養(yǎng)物孔中發(fā)育的Pf SPZ和(B)所提取的Pf SPZ。兩者都使用熒光標(biāo)記的抗Pf CSP mAb通過(guò)IFA檢測(cè)。

圖7繪示體外3D培養(yǎng)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例。

圖8A-C展示通過(guò)離心提取的來(lái)自跨孔插入物(transwell insert)改性3D基質(zhì)的卵囊的樣本圖像：(A和B)在用于量化的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中的卵囊相位襯度圖像和(C)使用熒光標(biāo)記的抗Pf CSP mAb的所提取卵囊在懸浮液(未經(jīng)透化)中的IFA。

圖9A-B展示體外產(chǎn)生和蚊子產(chǎn)生的Pf SPZ在HC-04細(xì)胞中的發(fā)育。在用(A)體外產(chǎn)生的Pf SPZ(上部圖)或(B)蚊子產(chǎn)生的無(wú)菌、經(jīng)過(guò)純化、冷凍保存Pf SPZ(底部圖)感染后，在HC-04細(xì)胞中6天肝臟期的共焦顯微圖。

具體實(shí)施方式

定義

如關(guān)于寄生蟲發(fā)育本文所用，“體外”意味著不依賴于完整宿主生物體(也被稱作全宿主生物體)并且在其外部進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲的體外發(fā)育包括培養(yǎng)經(jīng)由在活動(dòng)物宿主(例如蚊子)外部進(jìn)行并且不依賴于其的發(fā)育期發(fā)展的寄生蟲。

如本文所用，“飼養(yǎng)(rearing)”或“飼養(yǎng)的(reared)”意味著促進(jìn)和支持瘧原蟲生長(zhǎng)和發(fā)育的有序與個(gè)體發(fā)育性進(jìn)展。

如本文所用，“孢子生殖”(或孢子生殖發(fā)育)意味著瘧原蟲發(fā)育經(jīng)由特征性有性生殖期從配子母細(xì)胞到子孢子的有序與個(gè)體發(fā)育性進(jìn)展。

如本文所用，“人類宿主范圍的瘧原蟲物種”(與人類宿主范圍瘧原蟲物種、人類宿主范圍的瘧原蟲寄生蟲和人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲可互換使用)包括以下物種的瘧原蟲：惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、卵形瘧原蟲(P.ovale)、三日瘧原蟲(P.malariae)和諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)。

如本文所用，“培養(yǎng)物”在體外飼養(yǎng)人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲的情形下意味著在活動(dòng)物宿主(例如蚊子)外部進(jìn)行的包含培養(yǎng)基和人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲的系統(tǒng)。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)物進(jìn)一步包含襯底。

如本文所用的“襯底”意味著生長(zhǎng)表面。在一些實(shí)施例中，襯底包含細(xì)胞培養(yǎng)物基質(zhì)，例如包含聚苯乙烯基質(zhì)和/或基質(zhì)膠(Matrigel)[27，28]。

如本文所用的“培養(yǎng)基”意味著營(yíng)養(yǎng)組合物。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)基是小配子形成培養(yǎng)基，其促進(jìn)由配子母細(xì)胞生成配子，所述配子接著進(jìn)行繁殖成為接合子，例如通過(guò)模擬吸血之后的蚊子內(nèi)腔條件。在某些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基是動(dòng)合子培養(yǎng)基，其促進(jìn)接合子分化為動(dòng)合子。在某些實(shí)施例中，培養(yǎng)基是卵囊培養(yǎng)基，其提供用于體外孢子生殖達(dá)到子孢子期的營(yíng)養(yǎng)物。

如本文所用的“適合于人類醫(yī)藥使用”是指具有足以用于在人類中批準(zhǔn)臨床使用的數(shù)量、滅菌性(無(wú)菌性)和純度，例如根據(jù)FDA或USP標(biāo)準(zhǔn)可接受。

如本文所用的“無(wú)菌”意味著不引入或存在可檢測(cè)的微生物污染，如細(xì)菌、真菌、病理性病毒等。子孢子制備的無(wú)菌方法得到子孢子的滅菌制劑，其不含任何其它類型的微生物或感染物。臨床和醫(yī)藥使用需要滅菌組合物的無(wú)菌制劑。用于監(jiān)測(cè)無(wú)菌方法的微生物分析評(píng)定存在或不存在污染。其包括(但不限于)以引入的方式并入本文中的微生物限制測(cè)試(目前USP<61>)和滅菌性測(cè)試(目前USP<71>)。

如本文所用的“伴隨物質(zhì)”是指子孢子培養(yǎng)物或制劑中的物質(zhì)，其不是培養(yǎng)基或培養(yǎng)基組分或載體或賦形劑并且對(duì)子孢子本身不具有特異性。在某些實(shí)施例中，伴隨物質(zhì)包括例如生物碎片。在一些實(shí)施例中，伴隨物質(zhì)是用以產(chǎn)生子孢子的手段的結(jié)果。

如本文所用的“伴隨蚊類物質(zhì)”是來(lái)源于蚊子并對(duì)蚊子具有特異性的生物物質(zhì)或碎片。

如本文所用的“賦予保護(hù)性免疫”是指向群體或宿主(即，個(gè)體)提供產(chǎn)生針對(duì)由病原體(例如惡性瘧原蟲)造成的疾病(例如瘧疾)進(jìn)行保護(hù)的免疫反應(yīng)的能力，以使得在攻擊時(shí)，宿主中疾病的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)或癥狀與未經(jīng)治療的宿主相比減輕，或以使得在群體內(nèi)出現(xiàn)感染、或疾病的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)或癥狀的速率與未經(jīng)治療的宿主相比降低。

如本文所用的“免疫反應(yīng)”在瘧原蟲特異性抗原的情形下意味著在接受者中對(duì)引入子孢子的反應(yīng)，其特征一般在于(但不限于)產(chǎn)生抗體和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，免疫反應(yīng)可以是細(xì)胞反應(yīng)，如對(duì)瘧原蟲物種抗原決定基具有特異性的CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)或活化；對(duì)瘧原蟲特異性抗體產(chǎn)生增加的體液反應(yīng)；或細(xì)胞和體液反應(yīng)兩者。關(guān)于瘧疾疫苗，由包含子孢子的疫苗確立的免疫反應(yīng)包括(但不限于)在寄生蟲進(jìn)入宿主細(xì)胞(尤其肝細(xì)胞和單核細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞)之后，對(duì)由細(xì)胞外子孢子所表達(dá)或由寄生蟲其它期所表達(dá)的蛋白質(zhì)的反應(yīng)和/或?qū)λ黾纳x的組分的反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，免疫反應(yīng)是針對(duì)子孢子特異性抗原的可測(cè)量抗體和/或細(xì)胞反應(yīng)。在其它實(shí)施例中，在由感染性生物體后續(xù)攻擊時(shí)，免疫反應(yīng)預(yù)防病原性寄生蟲發(fā)育到造成疾病的紅細(xì)胞期。

如本文所用的“疫苗”是包含免疫原性藥劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑(可能與賦形劑、佐劑和/或添加劑或保護(hù)劑組合)的制劑。免疫原可以包含全感染物或所述感染物的分子子集(由所述感染物合成地或重組地產(chǎn)生)。當(dāng)向個(gè)體投與疫苗時(shí)，免疫原刺激將在用感染物后續(xù)攻擊時(shí)保護(hù)個(gè)體不生病或減輕由所述感染物造成的病理學(xué)、癥狀或臨床表現(xiàn)的免疫反應(yīng)。治療性(治療)疫苗在感染之后給予，并且打算減輕或遏制疾病進(jìn)展。預(yù)防性(preventive/prophylactic)疫苗打算預(yù)防初始感染或降低感染的速率或負(fù)荷。在針對(duì)寄生蟲疾病(如瘧疾)的疫苗中所用的藥劑可以是完整的死(無(wú)活性)寄生蟲、活寄生蟲、活減毒寄生蟲(不能完全進(jìn)展通過(guò)其生命周期)、或經(jīng)過(guò)純化或人工制造的與寄生蟲相關(guān)聯(lián)的分子，例如重組蛋白、合成肽、DNA質(zhì)體和表達(dá)瘧原蟲蛋白質(zhì)的重組病毒或細(xì)菌。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解的，疫苗可以包含子孢子以及其它組分，如賦形劑、稀釋劑、載體、防腐劑、佐劑或其它免疫增強(qiáng)劑或其組合。

如本文所用的“減毒”意味著對(duì)生物體(如瘧原蟲寄生蟲)進(jìn)行基因改變或突變以使得其失去其完成其正常生命周期的能力，而使其停滯在特定發(fā)育期。在本發(fā)明的瘧原蟲生物體中，輻射減毒寄生蟲或基因減毒寄生蟲(genetically attenuated parasite，GAP)的一或多種基因的功能受到破壞，以使得減毒突變體保留感染宿主和侵入肝臟內(nèi)肝細(xì)胞的能力但在肝臟期使發(fā)育停滯。

如本文所用的“肝細(xì)胞侵入”是指子孢子期的瘧原蟲寄生蟲在初始引入到宿主循環(huán)系統(tǒng)中之后尋求并進(jìn)入特定目標(biāo)細(xì)胞的能力，在此情況下，所述目標(biāo)細(xì)胞是宿主肝細(xì)胞，即培養(yǎng)物中的肝細(xì)胞[24，25]或體內(nèi)肝細(xì)胞。非減毒寄生蟲將接著進(jìn)行進(jìn)一步時(shí)期特異性發(fā)育。

如本文所用的“代謝活性”意味著存活并且能夠進(jìn)行生命維持功能和一些壽命周期過(guò)程。關(guān)于減毒子孢子，這包括(但不限于)能夠侵入培養(yǎng)物中和體內(nèi)的肝細(xì)胞、潛在地具有有限的在肝臟內(nèi)分裂并進(jìn)展通過(guò)一些發(fā)育期的能力、并且重新表達(dá)時(shí)期特異性蛋白質(zhì)的子孢子。

體外子孢子

公開體外飼養(yǎng)的活感染性子孢子，尤其瘧原蟲子孢子(減毒子孢子以及病原性子孢子)的組合物。在某些實(shí)施例中，本申請(qǐng)是有關(guān)體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的培養(yǎng)物，其中從配子母細(xì)胞期到子孢子期的孢子生殖在蚊子外部進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的感染性瘧原蟲子孢子不具有任何伴隨蚊類物質(zhì)。在某些實(shí)施例中，從配子母細(xì)胞期到子孢子期的孢子生殖已經(jīng)在蚊子外部進(jìn)行。

在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子對(duì)人類肝細(xì)胞的感染性是在蚊子中飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的至少70％、80％或90％。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子對(duì)人類肝細(xì)胞的感染性是在蚊子中飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的70％-100％、80％-100％或90％-100％之間。在一些實(shí)施例中，在體外或體內(nèi)測(cè)量感染性。

在一些實(shí)施例中，使用體外Pf 6天肝細(xì)胞效力分析來(lái)測(cè)量感染性，所述分析用于測(cè)定體外Pf SPZ感染HC-04(1F9)細(xì)胞(人類肝細(xì)胞株)[24，25]并且發(fā)育成表達(dá)PfMSP-1的肝臟晚期寄生蟲[15]的能力。此類方法的一個(gè)實(shí)例可以包括：

a.ECL涂布的Lab-Tek載玻片的細(xì)胞培養(yǎng)和接種。在37±2℃下用ECL細(xì)胞附著基質(zhì)涂布8孔Permanox Lab-Tek腔式載玻片持續(xù)1-2小時(shí)。用完全DMEM/F-12培養(yǎng)基(CM)稀釋HC-04(1F9)細(xì)胞，以每孔0.3mL中4×10⁴個(gè)活細(xì)胞接種。洗滌，并且在37±2℃和5±2％CO₂下培育24±4小時(shí)；

b.感染和每孔所添加SPZ數(shù)目的計(jì)算：在22±2℃下使用固定角度轉(zhuǎn)子以13,200rpm(相對(duì)離心力16,100)離心體外產(chǎn)生的Pf子孢子持續(xù)2分鐘。棄去上清液，并且將團(tuán)塊再懸浮于CM中。從Lab Tek載玻片的每一孔中抽吸并棄去培養(yǎng)基。一式三份地添加每孔50μL體外SPZ懸浮液。在CM中1:10稀釋感染性子孢子懸浮液，并且使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Cellometer)和相位襯度顯微鏡對(duì)子孢子數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且計(jì)算每孔添加的SPZ數(shù)目。在37±2℃和5±2％CO₂下培育腔式載玻片持續(xù)3小時(shí)±10分鐘。通過(guò)使用1000μL移液管尖端從每一孔輕輕地抽吸含有子孢子的過(guò)量培養(yǎng)基來(lái)用0.3mL DMEM/F-12完全培養(yǎng)基洗滌單層3次，小心避免用Pf SPZ污染對(duì)照孔。在最終洗滌之后，向每一孔中添加0.3mL DMEM/F-12完全培養(yǎng)基；

c.培養(yǎng)物的維持：每日更換培養(yǎng)基以確保肝臟期成功發(fā)育并維持培養(yǎng)物。在感染后6天時(shí)用冰冷甲醇固定腔式載玻片培養(yǎng)物。在4±2℃下儲(chǔ)存；

d.染色用于間接免疫熒光分析(IFA)：從載玻片棄去PBS，接著向每一孔中添加2-3滴圖像iT-FX信號(hào)增強(qiáng)劑，并且在37±2℃下培育30±3分鐘。棄去圖像增強(qiáng)劑溶液，并且用PBS洗滌培養(yǎng)物3次。向一式三份的孔中添加100μL經(jīng)過(guò)稀釋的抗PfMSP-1單克隆小鼠抗體，并且在37±2℃下培育60-70分鐘。在培育時(shí)段結(jié)束時(shí)，棄去抗體溶液并且用PBS洗滌。以1:200將Alexa Fluor 488抗小鼠IgG稀釋于含0.02％伊文氏藍(lán)(Evan's blue)的PBS中。向一式三份的孔中添加100μL經(jīng)過(guò)稀釋的Alexa 488小鼠IgG。在37±2℃下培育載玻片60-70分鐘。使用含DAPI的Vectashield封固劑(mounting medium)封固蓋玻片，并且遠(yuǎn)離光線儲(chǔ)存在2℃-8℃下，直到觀察時(shí)間為止；以及

e.Pf肝臟期的評(píng)估和計(jì)數(shù)：以400×放大率使用落射熒光顯微鏡，評(píng)估每孔中展示抗體反應(yīng)性的Pf肝臟期并且記錄其數(shù)目。對(duì)所有三個(gè)孔中的肝臟期寄生蟲數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且報(bào)告平均值。

在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子是無(wú)菌的。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子受來(lái)自宿主生物體(例如蚊子)的伴隨物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)降低(如可能是從宿主蚊子唾液腺解剖的子孢子的情況)。

在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子是人類宿主范圍的。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子的物種是惡性瘧原蟲。

在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子適合于醫(yī)藥使用。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子用于疫苗中。在一些實(shí)施例中。體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子是減毒的。

測(cè)試體外飼養(yǎng)的Pf SPZ在培養(yǎng)物中侵入人類肝細(xì)胞并在其中發(fā)育的能力。也可以體內(nèi)測(cè)試體外飼養(yǎng)的PfSPZ完成Pf生命周期的能力。這可以通過(guò)使用輸注有人類血液的人類肝臟嵌合小鼠來(lái)進(jìn)行。

培養(yǎng)物

在某些實(shí)施例中，本申請(qǐng)是有關(guān)體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲的培養(yǎng)物，其中所述寄生蟲進(jìn)行或已經(jīng)進(jìn)行體外孢子生殖發(fā)育。

在某些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)物包含處于孢子生殖發(fā)育等效期的人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲。在某些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)物能夠維持人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲的持續(xù)孢子生殖發(fā)育。

在一些實(shí)施例中，所述寄生蟲已經(jīng)到達(dá)發(fā)育的子孢子期。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的肝細(xì)胞感染性是在蚊子中飼養(yǎng)的相同物種瘧原蟲子孢子的至少70％、80％或90％。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的人類肝細(xì)胞感染性是在蚊子中飼養(yǎng)的相同物種瘧原蟲子孢子的70％-100％、80％-100％或90％-100％之間。在一些實(shí)施例中，在HC-04細(xì)胞中測(cè)量感染性，在一些實(shí)施例中，通過(guò)體內(nèi)肝感染測(cè)量感染性。

一些實(shí)施例是針對(duì)體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍感染性瘧原蟲子孢子的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物不具有任何伴隨蚊類物質(zhì)，并且其中所述體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子的人類肝細(xì)胞感染性是在蚊子中飼養(yǎng)的相同物種的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的至少70％、80％或90％。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子的人類肝細(xì)胞感染性是在蚊子中飼養(yǎng)的相同物種的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子的70％-100％、80％-100％或90％-100％之間。

在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)物包含第一(稱為小配子形成)培養(yǎng)基，其促進(jìn)由配子母細(xì)胞生成配子，例如通過(guò)模擬吸血之后的蚊子內(nèi)腔條件。在一些實(shí)施例中，小配子形成培養(yǎng)基包含胎牛血清(FBS)、葡萄糖、碳酸氫鈉和黃尿酸(xanthruenic acid)。在一些實(shí)施例中，小配子形成培養(yǎng)基包含10％-30％、15％-25％或18％-22％FBS。在一些實(shí)施例中，小配子形成培養(yǎng)基包含0.05％到0.5％、0.075％到0.5％或0.075％到0.25％葡萄糖。在一些實(shí)施例中，小配子形成培養(yǎng)基包含0.05％到0.5％、0.075％到0.5％或0.075％到0.25％碳酸氫鈉。在一些實(shí)施例中，小配子形成培養(yǎng)基包含0.01％到0.05％、0.01％到0.04％或0.02％到0.04％黃尿酸。在一些實(shí)施例中，小配子形成培養(yǎng)基包含F(xiàn)BS、0.05％到0.5％葡萄糖(例如0.1％)、0.05％到0.5％碳酸氫鈉(例如0.1％)和0.01％到0.05％黃尿酸(例如0.022％)。

在一些實(shí)施例中，去除第一培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)物包含第二(稱為動(dòng)合子)培養(yǎng)基，其促進(jìn)接合子分化為動(dòng)合子和動(dòng)合子侵入至3D基質(zhì)襯底中。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基包含F(xiàn)BS、RPMI和海藻糖。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基包含10％-30％、15％-25％或18％-22％FBS。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基包含0.1％到0.5％、0.15％到0.3％或0.2％到0.3％海藻糖。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基包含0.1％到0.5％、0.15％到0.3％或0.2％到0.3％右旋糖。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基包含0.01％到0.08％、0.02％到0.06％、0.03％到0.05％碳酸氫鈉。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基進(jìn)一步包含抗生素。在一些實(shí)施例中，抗生素是青霉素、鏈霉素或其組合。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基包含1到50單位/毫升、1到40單位/毫升、5到30單位/毫升或10到20單位/毫升的抗生素。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基包含1到50μg/mL、1到40μg/mL、5到30μg/mL或10到20μg/mL的抗生素。在一些實(shí)施例中，動(dòng)合子培養(yǎng)基由含有10％-30％FBS(例如20％)、0.1％到0.5％海藻糖(例如0.25％)、0.1％到0.5％右旋糖(例如0.25％)、0.01％到0.08％碳酸氫鈉(例如0.04％)、1到50單位/毫升青霉素(例如10單位/毫升)和1到50μg/mL鏈霉素(例如10μg/mL)的RPMI培養(yǎng)基組成。

在一些實(shí)施例中，去除第二培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)物包含第三(稱為卵囊)培養(yǎng)基，其提供用于瘧原蟲寄生蟲體外孢子生殖達(dá)到子孢子期的營(yíng)養(yǎng)物。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含施奈德氏果蠅培養(yǎng)基(Schneider's Drosophila medium)[26]、FBS、碳酸氫鈉、海藻糖、次黃嘌呤、HEPES、必需氨基酸、對(duì)氨基苯甲酸(PABA)、抗生素(例如青霉素和鏈霉素)、脂蛋白、膽固醇和維生素。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含10％-30％、15％-25％或18％-22％FBS。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含0.01％到0.08％、0.02％到0.06％、0.03％到0.05％碳酸氫鈉。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含0.1％到0.5％、0.15％到0.3％或0.2％到0.3％海藻糖。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含10到100μg/mL、20到100μg/mL、25到75μg/mL或40到60μg/mL次黃嘌呤。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含0.05M到0.25M、0.075M到0.2M或0.075M到1.5M HEPES。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含0.01％到0.08％、0.02％到0.06％、0.03％到0.05％PABA。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基進(jìn)一步包含抗生素。在一些實(shí)施例中，抗生素是青霉素、鏈霉素或其組合。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含1到50單位/毫升、1到40單位/毫升、5到30單位/毫升或10到20單位/毫升的抗生素。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含1到50μg/mL、1到40μg/mL、5到30μg/mL或10到20μg/mL的抗生素。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含0.05％到0.5％、0.075％到0.5％或0.075％到0.25％脂蛋白。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含0.05％到0.5％、0.075％到0.5％或0.075％到0.25％膽固醇。在一些實(shí)施例中，卵囊培養(yǎng)基包含施奈德氏果蠅培養(yǎng)基、10％-30％FBS(例如20％)、0.01％到0.08％碳酸氫鈉(例如0.04％)、0.1％到0.5％海藻糖(例如0.25％)、10到100μg/mL次黃嘌呤(例如50μg/mL)、0.05M到0.25M HEPES(例如0.1M)、必需氨基酸(例如1×，吉畢科公司(GIBCO))、0.01％到0.08％對(duì)氨基苯甲酸(PABA，例如0.04μg/mL)、1到50單位/毫升青霉素(例如10單位/毫升)和1到50μg/mL鏈霉素(例如10μg/mL)、0.05％到0.5％脂蛋白(例如1.5％)、0.05％到0.5％膽固醇(例如0.1％)和維生素(例如1×，吉畢科公司)。

在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)襯底包含3D培養(yǎng)基質(zhì)。在一些實(shí)施例中，3D培養(yǎng)基質(zhì)預(yù)接種有果蠅施奈德S2細(xì)胞[26]。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)物基質(zhì)包含涂布有基質(zhì)膠的聚苯乙烯基質(zhì)(例如英國(guó)AMS生物技術(shù)有限公司(AMS Biotechnology Ltd,UK))[27，28]。舉例來(lái)說(shuō)，聚苯乙烯基質(zhì)可以涂布有基質(zhì)膠，其通過(guò)將1mg/mL基質(zhì)膠小心地層疊在聚苯乙烯基質(zhì)的頂部上，接著在37℃下培育來(lái)進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基質(zhì)包含聚苯乙烯基質(zhì)、基質(zhì)膠和果蠅施奈德S2細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，基質(zhì)涂布有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，例如層粘連蛋白、膠原蛋白或其組合。

在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)物是無(wú)菌的。在一些實(shí)施例中，來(lái)源于培養(yǎng)物的子孢子適合于醫(yī)藥使用。

培養(yǎng)瘧原蟲寄生蟲的方法

公開培養(yǎng)瘧原蟲寄生蟲和/或制造體外飼養(yǎng)的活感染性瘧原蟲子孢子的培養(yǎng)物的方法，以及培養(yǎng)和/或制造體外飼養(yǎng)的減毒瘧原蟲子孢子的組合物的方法。

在某些實(shí)施例中，本申請(qǐng)時(shí)有關(guān)在人類宿主范圍瘧原蟲寄生蟲的孢子生殖發(fā)育期間體外培養(yǎng)所述寄生蟲的方法，其包含：

a.在小配子形成培養(yǎng)基中在紅細(xì)胞存在下培養(yǎng)人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞，

b.使用凝集素使紅細(xì)胞凝集，

c.收集包含接合子、配子、配子母細(xì)胞和凝集細(xì)胞的混合物(在一些實(shí)施例中，這通過(guò)離心和收集團(tuán)塊來(lái)實(shí)現(xiàn))，

d.在包含基質(zhì)的襯底上并在動(dòng)合子培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述混合物，其中所述寄生蟲分化為動(dòng)合子，并且所述動(dòng)合子進(jìn)入所述基質(zhì)并分化到卵囊期，

e.用卵囊培養(yǎng)基替換所述動(dòng)合子培養(yǎng)基，和

f.采集由此產(chǎn)生的瘧原蟲子孢子期寄生蟲。

舉例來(lái)說(shuō)，用于培養(yǎng)的方法可以包括：(a)將V期配子母細(xì)胞懸浮于小配子形成培養(yǎng)基中(1小時(shí))(在此步驟中，雄性和雌性配子由小配子母細(xì)胞和大配子母細(xì)胞生成，并且相互作用(繁殖)以形成接合子)；(b)通過(guò)添加凝集素使紅細(xì)胞凝集，例如麥胚凝集素，一種由小麥純化的凝集素(1小時(shí))；(c)離心培養(yǎng)物懸浮液以收集團(tuán)塊，其含有接合子、紅細(xì)胞碎片和任何未進(jìn)行分化的配子母細(xì)胞和配子；(d)將團(tuán)塊懸浮于動(dòng)合子培養(yǎng)基中并且接種到預(yù)接種有果蠅施奈德S2細(xì)胞的3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)上[26]。在8孔培養(yǎng)板中或在其它組織培養(yǎng)小瓶或跨孔培養(yǎng)插入物中使用基質(zhì)膠使3D培養(yǎng)基質(zhì)發(fā)育[27，28]。經(jīng)過(guò)發(fā)育的動(dòng)合子接著在接下來(lái)的20-24小時(shí)內(nèi)侵入基質(zhì)中，這是因?yàn)樗鰟?dòng)合子是運(yùn)動(dòng)性的(與不具運(yùn)動(dòng)性的配子母細(xì)胞、配子和接合子不同)；(e)20-24小時(shí)后，洗滌跨孔插入物或8孔培養(yǎng)板以去除任何未已侵入基質(zhì)中的動(dòng)合子以及殘余配子母細(xì)胞、配子和接合子(其未發(fā)育成動(dòng)合子)，并且用卵囊培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基。在侵入之后12-24小時(shí)內(nèi)?；|(zhì)中的動(dòng)合子轉(zhuǎn)型為卵囊。(f)每2-3天更換卵囊培養(yǎng)基一次；(g)在起始培養(yǎng)后第7天、第8天和第11天測(cè)定第7、8和11天卵囊；(h)在培養(yǎng)起始后第15、18和21天從培養(yǎng)基中采集SPZ，其通過(guò)從8孔或跨孔培養(yǎng)板上收集培養(yǎng)基，接著濕磨來(lái)進(jìn)行。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)PfSPZ進(jìn)行計(jì)數(shù)；可以接著將所采集的SPZ接種在HC-04細(xì)胞上以用于使用6天肝細(xì)胞效力分析來(lái)確定效力。

在某些實(shí)施例中，人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞來(lái)源于人類宿主范圍瘧原蟲在紅細(xì)胞(red blood cell/erythrocyte)中的培養(yǎng)物，例如特拉格(Trager)W和延森(Jensen)JB.科學(xué)193:673-675,1976中所公開的，其以引入的方式并入本文中。

瘧原蟲卵囊產(chǎn)生增加的方法

在某些實(shí)施例中，本申請(qǐng)是有關(guān)一種用于與相同物種并在蚊子中由相等數(shù)目人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞發(fā)育的卵囊相比較，增加瘧原蟲卵囊產(chǎn)生的體外方法，其包含：

a.在小配子形成培養(yǎng)基中在紅細(xì)胞存在下培養(yǎng)人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞，

b.使用凝集素使所述紅細(xì)胞凝集，

c.收集包含接合子、配子、配子母細(xì)胞和凝集細(xì)胞的混合物(在一些實(shí)施例中，這通過(guò)離心和收集團(tuán)塊來(lái)實(shí)現(xiàn))，

d.在包含基質(zhì)的襯底上并在動(dòng)合子培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述混合物，其中所述寄生蟲分化為動(dòng)合子，并且所述動(dòng)合子進(jìn)入所述基質(zhì)并分化到卵囊期，

e.用卵囊培養(yǎng)基替換所述動(dòng)合子培養(yǎng)基，

f.通過(guò)每40-80小時(shí)(較佳地，48-72小時(shí))用含有S2細(xì)胞(添加S2細(xì)胞以補(bǔ)充細(xì)胞在培養(yǎng)基更換期間的損失)的卵囊培養(yǎng)基替換所述卵囊培養(yǎng)基來(lái)繼續(xù)寄生蟲培養(yǎng)，和

g.對(duì)人類宿主范圍卵囊期瘧原蟲寄生蟲進(jìn)行定量；

h.其中與在蚊子中由相等數(shù)目人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞發(fā)育的相同物種卵囊相比較，所述方法產(chǎn)生更多的體外發(fā)育的人類宿主范圍瘧原蟲卵囊。

在某些實(shí)施例中，人類宿主范圍瘧原蟲配子母細(xì)胞來(lái)源于人類宿主范圍瘧原蟲在紅細(xì)胞中的培養(yǎng)物，例如特拉格(1976)中所公開的。

在一些實(shí)施例中，V期配子母細(xì)胞體外轉(zhuǎn)型為動(dòng)合子的效率在1％-25％、5％-25％、5％-21％或8％-21％范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施例中，V期配子母細(xì)胞體外轉(zhuǎn)型為第7、8或11天卵囊的效率在1％-15％、2％-14％、2％-25％或2.4％-12.5％范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施例中，與在蚊子中由相等數(shù)目V期配子母細(xì)胞發(fā)育的卵囊相比較，體外發(fā)育至少10到20、10到30、10到39或10到60倍的卵囊。在一些實(shí)施例中，與在蚊子中由相等數(shù)目V期配子母細(xì)胞發(fā)育的卵囊相比較，體外發(fā)育10到20、10到30、10到39或10到60倍的卵囊。

使用方法

公開使用體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子和減毒的體外飼養(yǎng)的瘧原蟲子孢子的方法(參見(jiàn)例如：U.S.7,229,627；USSN 61/783,326，其兩者都以引入的方式并入本文中)，其作為免疫原在疫苗中預(yù)防瘧疾。還公開使用體外飼養(yǎng)的病原性寄生蟲的方法，其適用于評(píng)定抗瘧疾藥物和疫苗的有效性，并且與抗瘧疾藥劑(尤其以瘧原蟲感染的無(wú)性生殖紅細(xì)胞期為目標(biāo)的抗瘧疾藥，如氯喹)結(jié)合適用于賦予保護(hù)性免疫的疫苗療程。

在某些實(shí)施例中，本申請(qǐng)的體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子用于疫苗組合物中。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子是減毒的。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子是未減毒的。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子是未減毒的并且與抗瘧疾藥劑(例如氯喹)一起使用。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子在人類個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)瘧原蟲子孢子的免疫反應(yīng)，并且在一些實(shí)施例中，體外飼養(yǎng)的人類宿主范圍瘧原蟲子孢子為人類個(gè)體提供保護(hù)性免疫。

實(shí)例

實(shí)例1

用于可再現(xiàn)地體外產(chǎn)生和純化較大數(shù)目惡性瘧原蟲動(dòng)合子的優(yōu)化方法

評(píng)定來(lái)自不同年齡的配子母細(xì)胞培養(yǎng)物并且在高配子母細(xì)胞密度和低配子母細(xì)胞密度下的動(dòng)合子產(chǎn)生。在配子母細(xì)胞誘導(dǎo)后14-22天時(shí)由高密度和低密度培養(yǎng)物可再現(xiàn)地產(chǎn)生動(dòng)合子和晚期瓶狀體(圖2A-2B)(表1)。瓶狀體是寄生蟲在其由接合子發(fā)育成動(dòng)合子期間的中間形式，并且動(dòng)合子和晚期瓶狀體兩者(圖2A-2B)在蚊子中轉(zhuǎn)型為卵囊。在誘導(dǎo)后第18天時(shí)從配子母細(xì)胞培養(yǎng)物中取得寄生蟲。在動(dòng)合子培養(yǎng)起始之后約14小時(shí)時(shí)首先發(fā)現(xiàn)早期瓶狀體(圖2A)，并且在24小時(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)動(dòng)合子。通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查培養(yǎng)物的吉姆沙染色涂片展示圓形大配子和接合子以及新月形配子母細(xì)胞和動(dòng)合子在培養(yǎng)物中的混合物。接合子由于存在突出的核而與大配子區(qū)分。動(dòng)合子由于存在突出的核以及缺少周圍紅細(xì)胞膜而與配子母細(xì)胞區(qū)分。兩種其它方法用于提供轉(zhuǎn)化率和純化率的估算值。首先，篩選針對(duì)寄生蟲不同時(shí)期所表達(dá)的以下分子的單克隆抗體(mAb)：在成熟大配子母細(xì)胞和大配子上表達(dá)的Pfs 48/45，在大配子和接合子上的Pfs 230，在配子和動(dòng)合子上的Pfs25，以及在動(dòng)合子和PfSPZ上的PfCelTOS(未展示數(shù)據(jù))。Pfs230定位于配子母細(xì)胞和大配子上，而Pfs48/45定位于配子和瓶狀體。Pfs25可變地定位于配子母細(xì)胞，但在瓶狀體和動(dòng)合子上大量表達(dá)。通過(guò)分別用針對(duì)Pfs25(指向綠色染色的實(shí)心箭頭))和紅細(xì)胞抗原血型糖蛋白A(指向紅色染色的空心箭頭)的抗體標(biāo)記所培養(yǎng)的寄生蟲(圖3A-3B)，基于存在或不存在紅細(xì)胞膜來(lái)區(qū)分配子母細(xì)胞與動(dòng)合子。

進(jìn)行若干方法以從未感染的紅細(xì)胞中純化和富集出所培養(yǎng)的動(dòng)合子。可以使用Lympholyte-H梯度離心去除大致90％的未感染紅細(xì)胞，但動(dòng)合子與配子母細(xì)胞、配子和接合子一起共純化。開發(fā)3步驟程序來(lái)純化和富集。此程序是成功的并且實(shí)現(xiàn)>70％富集。V期配子母細(xì)胞體外轉(zhuǎn)型為動(dòng)合子的平均效率是13％(范圍＝8％-21％，表1)。

實(shí)例2

由動(dòng)合子體外產(chǎn)生惡性瘧原蟲子孢子

第一步是高效地產(chǎn)生卵囊。簡(jiǎn)言之，將V期配子母細(xì)胞從體外培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到小配子形成培養(yǎng)基(FBS、0.1％葡萄糖、0.1％碳酸氫鈉和0.022％黃尿酸)中，并且在培育之后，將接合子轉(zhuǎn)移到改性動(dòng)合子培養(yǎng)基(20％FBS、RPMI培養(yǎng)基、0.25％海藻糖、0.25％右旋糖、0.04％碳酸氫鈉、10單位/毫升青霉素和10μg/mL鏈霉素)中并且層疊到改性基質(zhì)膠涂布的8孔載玻片上。為了涂布8孔載玻片，用RPMI培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，并且將其倒入8孔載玻片中。將這些載玻片在37℃下培育2小時(shí)，并且去除過(guò)量培養(yǎng)基。通過(guò)在基質(zhì)膠頂部上接種果蠅施奈德S2細(xì)胞，隨后層疊接合子來(lái)對(duì)基質(zhì)膠涂布的載玻片進(jìn)行改性。分化的動(dòng)合子侵入基質(zhì)膠中。在培育之后24小時(shí)時(shí)，在將動(dòng)合子培養(yǎng)基更換為卵囊培養(yǎng)基(施奈德氏果蠅培養(yǎng)基、20％FBS、0.04％碳酸氫鈉、0.25％海藻糖、50μg/mL次黃嘌呤、0.1M HEPES、必需氨基酸(1×，吉畢科公司)、0.04μg/mL對(duì)氨基苯甲酸(PABA)、10單位/毫升青霉素和10μg/mL鏈霉素、1.5％脂蛋白、0.1％膽固醇和維生素(1×，吉畢科公司))期間洗掉未侵入基質(zhì)膠中的未分化接合子和動(dòng)合子。在動(dòng)合子和卵囊培養(yǎng)基兩者中，添加S2細(xì)胞(圖4)。展示使用抗Pfs25和抗PfCSP mAb通過(guò)IFA所檢測(cè)的3天(圖4，上部圖)和8天(圖4，下部圖)卵囊。對(duì)八天培養(yǎng)物進(jìn)行透化以用于IFA。在8天卵囊中的點(diǎn)狀染色表明出芽的PfSPZ。在中間圖(圖4)中，箭頭指示在培養(yǎng)物中發(fā)育的7到8天卵囊。在初始實(shí)驗(yàn)之后，改變培養(yǎng)條件，如用于涂布的基質(zhì)膠濃度和向每一孔中接種的接合子數(shù)目，以顯著地增加V期配子母細(xì)胞發(fā)育成8天卵囊的轉(zhuǎn)型效率。使用此改變的體外培養(yǎng)方案，始終實(shí)現(xiàn)V期配子母細(xì)胞向8天卵囊的2.4％到12.5％(平均8.3％)轉(zhuǎn)型(表2)。對(duì)于在改變體外培養(yǎng)方案之前最初記錄的0.13％，這是大改進(jìn)。在薩那利亞公司(Sanaria)進(jìn)行的74個(gè)獨(dú)立膜喂飼分析中，V期配子母細(xì)胞在蚊子中向卵囊的轉(zhuǎn)型效率是0.22％(李(Li)等人的制備)。此轉(zhuǎn)型效率與文獻(xiàn)中所報(bào)告的效率相當(dāng)[22，23]。8.3％體外轉(zhuǎn)型效率是在蚊子中所觀察到的39倍(表2、3)。體外(圖4、5A、8A-C)和在蚊子中(圖5B)發(fā)育的卵囊的大小和結(jié)構(gòu)類似。圖5A展示用抗PfCSP mAb染色的體外培養(yǎng)的7天卵囊和汞溴紅染色的蚊子中腸7天卵囊(圖5B)的IFA。

在第15天和/或第18天通過(guò)從孔中收集包括未附著的S2細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液來(lái)采集體外培養(yǎng)物。在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中對(duì)形態(tài)上發(fā)育的PfSPZ的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且使用熒光抗PfCSP mAb對(duì)等分試樣染色以用于確認(rèn)(圖6B，表4)。在使用熒光抗Pf CSP mAb染色的孔固定之后，檢測(cè)培養(yǎng)孔中發(fā)育的Pf SPZ(圖6A)。在7個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每批來(lái)自十個(gè)8孔載玻片的采集物產(chǎn)生介于180,000與350,000個(gè)之間的成熟Pf SPZ。在所有實(shí)驗(yàn)中，存在兩種形態(tài)上不同形式的Pf SPZ。形態(tài)上成熟的Pf SPZ看起來(lái)與唾液腺Pf SPZ一致，具有運(yùn)動(dòng)性，10-13μm長(zhǎng)并且對(duì)抗Pf CSP mAb具有高度反應(yīng)性(圖6A-B，表4)。短形、不成熟的Pf SPZ<10μm長(zhǎng)，但仍具有運(yùn)動(dòng)性并且對(duì)抗Pf CSP mAb具有高度反應(yīng)性。在所報(bào)告的所有實(shí)驗(yàn)中，僅量化形態(tài)上成熟的Pf SPZ。在第15和18天從相同培養(yǎng)物采集使收率增加到每十個(gè)載玻片約500,000個(gè)PfSPZ。

隨后，測(cè)試3D跨孔系統(tǒng)。在兩個(gè)使用此途徑的獨(dú)立培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)中，從一個(gè)6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)物中采集到228,000個(gè)和208,000個(gè)形態(tài)上成熟的Pf SPZ。最初，使用被發(fā)現(xiàn)適合于體外培養(yǎng)卵囊的兩種可商購(gòu)的3D基質(zhì)。3D Life水凝膠(德國(guó)賽蘭德斯有限公司(Cellendes GmbH,Germany))用于在仿生3D環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，而AlgiMatrix^TM 3D培養(yǎng)系統(tǒng)(吉畢科公司/英杰公司(Invitrogen))是促進(jìn)3D細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源生物骨架。兩者都支持Pf孢子生殖。3D Life水凝膠需要半乳糖苷酶消化以用于從基質(zhì)中釋放Pf SPZ，而成熟Pf SPZ截留在Algimatrix基質(zhì)中。因此，作為一個(gè)替代方案，我們基于與Alvetex3D培養(yǎng)技術(shù)(英國(guó)AMS生物技術(shù)(歐洲)有限公司)結(jié)合的培養(yǎng)系統(tǒng)開發(fā)一種跨孔插入物?？缈撞迦胛镌谄洳迦氲脚囵B(yǎng)板孔中時(shí)允許雙隔室培養(yǎng)(圖7)。在此系統(tǒng)中，將涂布有基質(zhì)膠的惰性200μm厚多孔聚苯乙烯骨架放置在插入物的多孔膜上。接種到此3D基質(zhì)上的接合子分化為動(dòng)合子，侵入基質(zhì)膠涂布的聚苯乙烯骨架，并且轉(zhuǎn)型為卵囊。上部隔室接種有S2細(xì)胞。卵囊在此基質(zhì)中發(fā)育，并且PfSPZ釋放到下部隔室中并從下部隔室中收集。在初步實(shí)驗(yàn)中，此系統(tǒng)支持Pf孢子生殖發(fā)育(表5)，并且卵囊發(fā)育和保留與腔室載玻片培養(yǎng)極類似(表2、3)。為了評(píng)定孢子生殖發(fā)育，移出多孔膜以及基質(zhì)，并且通過(guò)離心收集卵囊。V期配子母細(xì)胞向7天和11天卵囊(圖8A-C)的轉(zhuǎn)型效率分別是10.3％(范圍9％-11.5％)和9.0％(范圍7.8％-10.7％)(表5)。11天卵囊的數(shù)目表示極大增加，并且指示卵囊在培養(yǎng)期間顯著保留此外，所提取的卵囊在外觀上類似于在蚊子中腸中發(fā)育11天的卵囊，并且這些體外形成的卵囊表達(dá)PfCSP(圖8C)。圖8A-B展示在用于量化的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中的卵囊相位襯度圖像(圖8A和B)和使用熒光標(biāo)記的抗Pf CSP mAb的所提取卵囊在懸浮液(未經(jīng)透化)中的IFA(圖8C)。卵囊的染色在未經(jīng)透化的懸浮液中進(jìn)行，并且因此，PfCSP染色的卵囊具有均勻而非點(diǎn)狀的PfCSP表達(dá)圖案(圖8C)。

在兩個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，從一個(gè)使用6個(gè)改性插入物的6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)物中采集到228,000個(gè)和208,000個(gè)形態(tài)上發(fā)育的PfSPZ。與用8孔載玻片獲得的數(shù)目相比較，這是最低3倍收率增加(表4、5)。確切地說(shuō)，表4展示8孔培養(yǎng)物的結(jié)果，而表5展示跨孔培養(yǎng)的結(jié)果。此跨孔插入物培養(yǎng)條件提供若干優(yōu)點(diǎn)，這是由于其：i)減少基質(zhì)膠在培養(yǎng)基更換期間的損失，ii)準(zhǔn)許從單個(gè)培養(yǎng)物中重復(fù)采集PfSPZ，iii)能夠用不同細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(如層粘連蛋白和膠原蛋白)涂布基質(zhì)，和iv)適合于使用合適的液體處理系統(tǒng)來(lái)按比例放大和自動(dòng)化。

與先前實(shí)驗(yàn)相比，此結(jié)果表示從卵囊采集的成熟Pf SPZ數(shù)目的最低3倍增加。

實(shí)例3

展現(xiàn)體外飼養(yǎng)的惡性瘧原蟲子孢子和在斯氏按蚊(Anopheles stephensi)中發(fā)育的惡性瘧原蟲子孢子以類似效率各自侵入人類肝細(xì)胞細(xì)胞株(HC-04)并在其中發(fā)育。

測(cè)試體外飼養(yǎng)的PfSPZ在6天肝細(xì)胞分析中的感染性，所述分析常規(guī)地用于評(píng)定效力。分析通常用冷凍保存前后的Pf SPZ進(jìn)行。新鮮和冷凍保存的Pf SPZ產(chǎn)生在形態(tài)上一致的6天肝臟期寄生蟲，但由于冷凍保存而存在5％-25％效力損失[5]。體外飼養(yǎng)的PfSPZ更類似于新鮮蚊子源性PfSPZ，因此相對(duì)于來(lái)自在制造活動(dòng)期間產(chǎn)生的新鮮PfSPZ的讀數(shù)進(jìn)行比較。在7個(gè)連續(xù)產(chǎn)生活動(dòng)中，由50,000只蚊子產(chǎn)生的新鮮Pf SPZ發(fā)育出20.7-32.7的表達(dá)Pf MSP-1的成熟6天寄生蟲(表4)。將體外飼養(yǎng)的PfSPZ接種到3個(gè)接種有HC-04細(xì)胞(一種對(duì)體內(nèi)產(chǎn)生的Pf SPZ的感染展示支持的人類肝細(xì)胞)的孔中[24，25]，并且培育6天(圖9A上部圖，表4)。圖9A-9B展示在用體外飼養(yǎng)的Pf SPZ(圖9A上部圖)或蚊子產(chǎn)生的無(wú)菌、經(jīng)過(guò)純化、冷凍保存Pf SPZ(圖9B下部圖)感染后，在HC-04細(xì)胞中6天肝臟期的共焦顯微圖。在4個(gè)獨(dú)立6天肝細(xì)胞分析中，以56,598±7,294Pf SPZ/孔接種的體外產(chǎn)生的Pf SPZ產(chǎn)生28.6±7.0Pf MSP1表達(dá)性6天寄生蟲(表4)。這與用新鮮、無(wú)菌、經(jīng)過(guò)純化的Pf SPZ在此分析中所見(jiàn)的25.7±4.1Pf MSP1表達(dá)性寄生蟲(表4)相當(dāng)，并且略微超過(guò)用冷凍保存Pf SPZ的情況(數(shù)據(jù)未展示)。這些數(shù)據(jù)還表明18天體外產(chǎn)生的Pf SPZ比15天體外飼養(yǎng)的Pf SPZ更具感染性。在HC-04細(xì)胞中由體外和體內(nèi)(蚊子)產(chǎn)生的Pf SPZ發(fā)育的6天寄生蟲的大小類似(圖9A-9B)。作為顯微照片的陽(yáng)性對(duì)照，在HC-04細(xì)胞中培育來(lái)自蚊子唾液腺的無(wú)菌、經(jīng)過(guò)純化、冷凍保存Pf SPZ，并且評(píng)定其Pf MSP1表達(dá)(圖9B)。這些數(shù)據(jù)展現(xiàn)，體外產(chǎn)生的Pf SPZ在肝細(xì)胞培養(yǎng)物中的感染性與新鮮蚊子產(chǎn)生的Pf SPZ相同。

ND；未測(cè)定。6天肝細(xì)胞分析正在進(jìn)行中。

這些結(jié)果展示用于以在蚊子中產(chǎn)生卵囊的39倍效率體外產(chǎn)生Pf卵囊的方法。體外飼養(yǎng)的Pf SPZ以與從宿主蚊子新鮮解剖的Pf SPZ至少同樣良好的效率侵入并發(fā)育成表達(dá)Pf裂體性孢子表面蛋白質(zhì)1的成熟6天肝臟期裂殖體。

在前文中，已經(jīng)參考合適的實(shí)施例描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅用于理解本發(fā)明的目的，并且各種改變或修改都是可能的。

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