惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測試劑盒及核苷酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列，設(shè)計(jì)了惡性瘧原蟲特異的引物和探針，優(yōu)化了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系；針對惡性瘧原蟲的一對引物，結(jié)合普通PCR技術(shù)和分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了惡性瘧原蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立了目的基因拷貝數(shù)與熒光檢測信號(hào)之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)了惡性瘧原蟲的實(shí)時(shí)熒光定量檢測。本試劑盒將納米磁微粒分離瘧原蟲核酸技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有機(jī)結(jié)合，在標(biāo)本核酸提取方面具有操作方便、價(jià)廉、快捷、高效的特點(diǎn)，尤其在濾紙干血片核酸提取和提取微量全血核酸方面具有很大優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)大檢測范圍、最大程度降低漏檢率的目標(biāo)，本試劑盒的檢測限為25copies/μL。
【專利說明】惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，但不限于該領(lǐng)域，涉及檢測臨床樣品中惡性瘧原蟲，是一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002]瘧疾是對人類健康危害最嚴(yán)重的傳染病之一，瘧疾病例中有86%發(fā)生在非洲地區(qū)，非洲以外地區(qū)的瘧疾病例80%集中在印度、蘇丹、緬甸、孟加拉、印度尼西亞、巴布亞新幾內(nèi)亞和巴基斯坦等國。非洲以惡性瘧為主，間日瘧分布最廣，遍及熱帶、亞熱帶、溫帶的國家和地區(qū)，以中美洲和東南亞為多見。[0003]我國自2000年以來瘧疾疫情出現(xiàn)回升，其中云南、海南兩省較為嚴(yán)重，許多省受到輸入性惡性瘧的威脅，尤其是境外輸入性惡性瘧的威脅。隨著經(jīng)濟(jì)全球化和國際交往的增多，近年來勞務(wù)輸出人數(shù)逐年增加，輸入性瘧疾病例逐年增多，呈逐年上升趨勢。輸入性病例大多源于非洲、緬甸等惡性瘧高發(fā)區(qū)勞務(wù)輸出的歸國人員，2008年我國瘧疾死亡病例全部為境外勞務(wù)回國人員，2009年有21個(gè)省(市、區(qū))有輸入性惡性瘧病例報(bào)告，且瘧疾死亡也全部為輸入病例。因此,關(guān)注瘧疾疫情,特別是境外輸入性惡性瘧疫情十分重要。
[0004]2009年全國報(bào)告惡性瘧1027例，占瘧疾總報(bào)告病例數(shù)的7.4%。其中，當(dāng)?shù)馗腥镜膼盒辕?30例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的12.7%，輸入性惡性瘧病例897例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的87.3%。2010年全年報(bào)告惡性瘧1258例，占瘧疾總報(bào)告病例數(shù)的16.0%，其中報(bào)告當(dāng)?shù)馗腥镜膼盒辕?7例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的7.7%，報(bào)告輸入性惡性瘧1161例，占惡性瘧報(bào)告病例數(shù)的92.3%，較上年上升29.4%。輸入性惡性瘧最主要的感染地為東南亞地區(qū)和非洲。東南亞有緬甸、柬埔寨、巴基斯坦、印度、印度尼西亞、馬來西亞等國家。非洲地區(qū)有尼日利亞、安哥拉、馬里、加納、幾內(nèi)亞、赤道幾內(nèi)亞、剛果、利比里亞、利比亞、馬拉維、多哥、喀麥隆、莫桑比克、科特迪瓦、南非和肯尼亞等國家，其中東南亞的緬甸，非洲地區(qū)的尼日利亞、安哥拉、幾內(nèi)亞、赤道幾內(nèi)亞，是我國輸入性惡性瘧最多的國家。
[0005]惡性瘧來勢兇險(xiǎn)，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，熱型不規(guī)則，起病方式各異，有的表現(xiàn)為呼吸道感染，有的表現(xiàn)為消化道感染，有的表現(xiàn)為急腹癥。并且惡性瘧可隨時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如腦型瘧、急性血管內(nèi)溶血(亦稱黑尿熱)等，容易引起誤診，若不及時(shí)救治，可出現(xiàn)意識(shí)障礙、昏迷、偏癱、腎功能衰竭、呼吸衰竭而死亡，病死率可達(dá)22% -50%，甚至高達(dá)70%。因此，惡性瘧的早期診斷對于及早實(shí)施有效的治療方案，減少重癥病例及死亡病例、防范“二代”病例的發(fā)生十分重要。
[0006]發(fā)熱病人血檢是全世界公認(rèn)的和推行的發(fā)現(xiàn)傳染源唯一可靠可行的辦法，在瘧疾檢測中占有很重要的地位。鏡檢仍是診斷瘧疾的金標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，漏檢率高，還需要有相當(dāng)經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員才能做到正確診斷，尤其是在低原蟲血癥、混合感染，以及需要大樣本人群現(xiàn)場檢測時(shí)，臨床應(yīng)用受到許多限制。因此，迫切需要研制出新的敏感、特異、快速、方便的惡性瘧診斷技術(shù)。[0007]實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比具有特異性和敏感性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。
[0008]TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)合成了一條能夠與之特異性雜交的探針，探針結(jié)合位置位于上下游引物之間，當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5’ 一 3’外切酶活性，將探針5’端連接的熒光基團(tuán)從探針上解離下來，破壞了兩個(gè)熒光基團(tuán)之間的突光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonance energytransfer, FRET),而發(fā)出熒光，解離下來的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此根據(jù)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算初始模板的數(shù)量。
[0009]惡性瘧原蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，包括兩大步驟，首先是從標(biāo)本中將惡性瘧原蟲核酸提取出來，然后再用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對目的基因進(jìn)行檢測。瘧原蟲的裂殖子進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育增殖，被感染的紅細(xì)胞最終被脹破，裂殖子、瘧色素和其他代謝產(chǎn)物一起進(jìn)入血流，引起一次臨床發(fā)病。瘧原蟲檢測標(biāo)本,通常有兩種,全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本，后者由于便于現(xiàn)場采集、保存和運(yùn)輸，可以滿足現(xiàn)場人群大規(guī)模篩查瘧疾采樣、特殊情況下(如在口岸現(xiàn)場)采樣或在邊遠(yuǎn)地區(qū)采樣的需要，被廣泛采用。
[0010]傳統(tǒng)的瘧原蟲核酸分離方法，有水煮法、酚氯仿抽提法等。水煮法提取核酸有幾種方式，一種是先用生理鹽水或用雙蒸水洗滌，然后用雙蒸水煮沸裂解；一種是先用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后用雙蒸水煮沸裂解；一種是先用皂素溶液裂解，然后用TriS-HCl溶液高溫裂解。水煮法簡捷、經(jīng)濟(jì)，但是核酸得率低、純度低，不利于核酸的長期保存，并且核酸提取物中含有抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的血紅蛋白等物質(zhì)，影響瘧原蟲檢出率；商品化試劑盒提取核酸得率較高，在核酸擴(kuò)增時(shí)受到的影響因素較少，但是試劑盒價(jià)格昂貴，不適合現(xiàn)場大量使用和邊遠(yuǎn)窮困地區(qū)使用。
[0011]其它瘧原蟲核酸提取法有碘化鈉法、酚氯仿抽提法等，這些方法耗時(shí)長、使用有毒試劑，對人體有害，污染環(huán)境，不適用于常規(guī)檢測。
[0012]本發(fā)明的納米磁分離瘧原蟲核酸提取法，可用于提取微量全血和濾紙干血片標(biāo)本，利用經(jīng)修飾的納米磁微?？梢愿咝Ц患怂崽匦?，可獲得高純度的核酸模板，具有操作方便、快捷、高效，尤其在低水平瘧原蟲標(biāo)本核酸提取時(shí)此納米磁微粒高效捕獲核酸特性，可以大大提聞痕原蟲的檢出率。
[0013]納米磁微粒(MNP)是一種優(yōu)良的磁性分離介質(zhì)，具有比表面積大，磁響應(yīng)性強(qiáng)，可應(yīng)用于生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)的快速分離提取，尤其是其表面進(jìn)行化學(xué)修飾或高分子化合物包裹后，分離提取效率可大為提高，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，成本也大為降低，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種快速高效、靈敏度高、特異性好、操作方便、價(jià)格低廉的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0015]本發(fā)明還提供一種與該特異性強(qiáng)、靈敏度高的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測相關(guān)的核苷酸序列。
[0016]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0017]一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括如下組分:納米磁微粒、標(biāo)本稀釋液、裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照、陰性對照；
[0018]所述的納米磁微粒為用無水乙醇配制的納米磁微粒溶液；
[0019]所述標(biāo)本稀釋液為磷酸鹽緩沖液PBS ； [0020]所述裂解液為5M異硫氰酸胍溶液；
[0021]所述結(jié)合液為無水乙醇；
[0022]所述洗液為70%乙醇；
[0023]所述洗脫液為ΤΕρΗ8.0 ；
[0024]所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針Pl，見序列3 ；
[0025]所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為含有惡性瘧原蟲基因片段⑶的質(zhì)粒；
[0026]所述的陽性對照為惡性瘧原蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；
[0027]所述的陰性對照為正常人全血核酸提取液。
[0028]而且，瘧疾疑似病例全血標(biāo)本通常有兩種形式，一種是抗凝全血標(biāo)本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指，抗凝劑采用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉，置于2-8°C或-20°C保存，供核酸提取用；一種是濾紙干血片標(biāo)本，取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙上，室溫晾干后放入塑料袋密封，置于常溫18-25°C或2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用。
[0029]而且，所述Fe3O4納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟分述如下:
[0030]所述納米磁微粒MNP分離提取全血標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為:
[0031]⑴在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性瘧疑似病人全血標(biāo)本50 μ L，標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ；
[0032](2)加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；
[0033]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0034]⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸
取上清液備用。
[0035]而且，所述納米磁微粒MNP分離提取全血濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為:
[0036]⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，約Icm2大小，血量約為15-30 μ L，剪成紙條，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；
[0037](2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200 μ L結(jié)合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；
[0038]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0039]⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0040]一組惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列I為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。
[0041]而且，所述上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為:上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。
[0042]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0043]1、本試劑盒將納米磁分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本核酸技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，在標(biāo)本核酸提取方面具有操作方便、快捷、價(jià)廉、高效的特點(diǎn)，尤其在提取微量瘧原蟲核酸方面具有很大優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了最大程度降低漏檢率的目標(biāo)，本試劑盒的檢測限可以達(dá)到25copies/ μ L。
[0044]2、本發(fā)明首次采取了納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和全血濾紙干血片標(biāo)本瘧原蟲核酸的方法，可以最大程度地減少提取過程中瘧原蟲核酸的損失，快速高效地分離純化全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本中的惡性瘧原蟲DNA，再通過自主設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系對惡性瘧原蟲進(jìn)行檢測，通過構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對惡性瘧原蟲的定量檢測。
[0045]3、本發(fā)明選取惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物及熒光探針進(jìn)行靶序列擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為162bp。標(biāo)本模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，再利用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量推算標(biāo)本中的惡性瘧原蟲DNA水平。實(shí)例檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的方法可用于惡性瘧原蟲感染的診斷及其惡性瘧原蟲型別的鑒定。
[0046]4、本發(fā)明中瘧原蟲濾紙干血片標(biāo)本由于現(xiàn)場采集、保存和運(yùn)輸方便，可以滿足現(xiàn)場人群大規(guī)模篩查瘧疾采樣、或在邊遠(yuǎn)地區(qū)采樣的需要，被廣泛采用，但是，從濾紙干血片中提取瘧原蟲核酸的方法多采用傳統(tǒng)方法(水煮法、酚氯仿抽提法等)或者商品試劑盒法，前者核酸得率低、純度低，提取液中含有抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的抑制物，降低了瘧原蟲的檢出率，后者價(jià)格昂貴，不適合現(xiàn)場大量使用和邊遠(yuǎn)窮困地區(qū)使用。本發(fā)明提取瘧原蟲核酸，操作簡單、快捷，價(jià)廉，核酸純度高，經(jīng)表面修飾的納米磁微?？筛咝Р东@核酸，大大提高了瘧原蟲的檢出率。
[0047]5、本發(fā)明應(yīng)用納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本瘧原蟲核酸和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，解決了短時(shí)間內(nèi)快速高效提取瘧原蟲核酸并對其準(zhǔn)確定量檢測的方法學(xué)問題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)品靈敏度達(dá)到25c0pies/y I。惡性瘧原蟲完成一代紅內(nèi)期裂體增殖的時(shí)間不規(guī)則，一般為36-48小時(shí)。惡性瘧原蟲早期滋養(yǎng)體在血液中發(fā)育，逐漸隱匿在微血管等處，繼發(fā)成晚期滋養(yǎng)體和裂殖體，一般在外周血液中不易見到。惡性瘧原蟲在發(fā)作期易于檢測到陽性結(jié)果，在其它期陽性率較低。瘧疾初發(fā)時(shí)原蟲血癥較低，需在48-72小時(shí)內(nèi)反復(fù)涂血片鏡檢，必要時(shí)做骨髓涂片，以提高陽性率。由于瘧原蟲耐藥株的產(chǎn)生以及不規(guī)范治療等因素的影響，常會(huì)出現(xiàn)外周血瘧原蟲感染密度低或原蟲形態(tài)不典型的情況，一定程度上影響了血液鏡檢陽性率和蟲種的有效鑒定。2008年四川省瘧疾實(shí)驗(yàn)室診斷的占65.7%，其余為臨床診斷，而實(shí)驗(yàn)室診斷中有18.1%未進(jìn)行瘧原蟲分型。2009年全 國30個(gè)省(市、區(qū))共報(bào)告瘧疾病例數(shù)14140例，其中間日瘧占75.6%，惡性瘧占7.4 %，未分型瘧占17.0 %。2011年全國實(shí)驗(yàn)室未確診病例比例^ 18.3% (821/4479)，其中共7個(gè)省(市、區(qū))報(bào)告的實(shí)驗(yàn)室未確診病例的比例高于25%。本發(fā)明提供的試劑盒可以敏感地檢測出惡性瘧原蟲感染初期病例或外周血惡性瘧原蟲密度低的感染者，可以為低水平惡性瘧原蟲的感染提供快速確診。
[0048]6、本試劑盒在開發(fā)過程中參考GeneBank中惡性瘧原蟲基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)得到了熒光定量PCR引物與探針，并應(yīng)用于惡性瘧原蟲檢測和定量分析，減少和避免了檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高了檢測方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)該探針對惡性瘧原蟲種特異性非常好，如果確定陽性，可以確診是惡性瘧，使治療更有針對性，根治更加徹底，防止復(fù)發(fā)；使用本試劑盒在入境歸國人員中檢測到極低水平的惡性瘧原蟲感染者，檢測靈敏度非常高。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0049]圖1顯示的是標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)在2.5 X 10L2.5 X IO8Copies/μ L時(shí)，Ct值范圍是11.91-36.45，質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值與Ct值之間呈現(xiàn)良好的對數(shù)線性關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.43，截距為40.93，R2 = 0.999。 [0050]圖2顯示強(qiáng)、中、弱三個(gè)陽性標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線；三個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是20.60,29.62,35.84，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其惡性瘧原蟲水平分別為，8.46 X IO5Copies/μ L、2.00X 103copies/y L,30copies/y L ;反應(yīng)曲線為典型的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線，均能夠判定為陽性。
[0051]圖3顯示方法特異性曲線，從熒光擴(kuò)增曲線上可以看到，惡性瘧原蟲出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)增曲線，Ct值為25.30，而間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲以及陰性對照的擴(kuò)增曲線均沒有上升。
[0052]圖4顯示13份從非洲高疫區(qū)回國的入境人員標(biāo)本檢測曲線，其中1份標(biāo)本Ct值為37.02，判斷為惡性瘧原蟲可疑陽性，經(jīng)復(fù)測最終判斷為惡性瘧原蟲陽性。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0054]本實(shí)施例使用的所有溶劑及試劑均為市售成品，引物及探針為委托基因公司合成，納米磁微粒由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局、國家納米科學(xué)中心聯(lián)合研制。
[0055]本發(fā)明除了采用納米磁微粒分離瘧原蟲DNA以外，還可以采用常規(guī)技術(shù)分離瘧原蟲DNA，然后根據(jù)本發(fā)明提供的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和熒光探針(Pl)來檢測惡性瘧原蟲，具體方法為本領(lǐng)域常規(guī)分離瘧原蟲DNA的方法，不再贅述。但是，在惡性瘧原蟲密度較低時(shí)，使用常規(guī)技術(shù)分離惡性瘧原蟲，漏檢率會(huì)增高。
[0056]本發(fā)明關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測臨床樣品中惡性瘧原蟲的試劑盒，該試劑盒組成包括:(I)分別裝納米磁分離核酸體系、水(超純水)、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系、陰性對照、陽性對照和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或離心管；(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或離心管的包裝盒。
[0057]本發(fā)明中涉及的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的核苷酸序列，包括實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和熒光探針(P1)，以及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列(S)，其具體序列如下:
[0058]Fl:5’ -TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTA-3’
[0059]Rl:5’ -GAACTCAATCATGACTACCCGTCTGT-3’
[0060]Pl:5’ -TCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGT-3’，
[0061]其中探針的5’端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA，或其他配對的熒光標(biāo)記均可。
[0062]質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品序列⑶如下:
[0063]TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTAATAAATTATGTTTTTATCAGATATGACAGAATCTTTTTTAAAATCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGTGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTC。
[0064]本發(fā)明提供的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，組成如下:
[0065]所述納米磁微粒(簡稱MNP)為表面修飾的納米磁性粒子，其制備過程為:首先利用熱分解法分解乙酰丙酮鐵(Ferric acetylacetonate),合成Fe3O4納米粒子,在堿性條件下水解四乙氧基硅烷(Tetraethylorthosilicate,TEOS),包裹Fe3O4納米粒子,形成表面為硅羥基的納米磁性微粒。
[0066]納米磁微粒具 體制備方法為:在三口燒瓶中將0.500g乙酰丙酮鐵溶解于20mL苯甲醇，室溫抽真空，再在氬氣保護(hù)下以平均6.50C /min升溫速率升至190°C，并在此溫度下反應(yīng)2h，得到黑色的膠體溶液。使用磁鐵收集產(chǎn)物，用正己烷和乙醇分別洗滌數(shù)次，在真空干燥箱內(nèi)抽真空，70°C干燥24h，即可制成四氧化三鐵納米磁微粒；將IOOmg四氧化三鐵納米磁微粒溶解在IOOmL乙醇水的混合溶液中，乙醇與水的體積比為4:1，再加入0.4mLTE0S、4mL氨水(濃度為25% )，TEOS經(jīng)水解、聚合，最后經(jīng)無水乙醇洗滌、抽濾、干燥即可制成表面為硅羥基修飾的納米磁微粒。納米磁微粒保存在無水乙醇中或者DEPC處理的水中，室溫保存或者2-8 °C冷藏保存均可。
[0067]所述裂解液為:5M異硫氰酸胍、50mMTris-HCl、20mMEDTA、l% TritonX-100，調(diào)節(jié)pH值至6.0。
[0068]所述標(biāo)本稀釋液為磷酸鹽緩沖液；
[0069]所述結(jié)合液為無水乙醇；
[0070]所述洗液為70%乙醇；
[0071 ] 所述洗脫液為TE (ρΗ8.0)；
[0072]所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液為PremixExTaq酶、上游引物(Fl)和下游引物(Rl)、熒光探針(Pl)、標(biāo)本DNA |吳板和水；
[0073]質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為含有惡性痕原蟲基因片段⑶的質(zhì)粒，濃度為I X IO7Copies/μ L ;
[0074]所述的陽性對照為質(zhì)粒濃度為I X IO3Copies/ μ L的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；
[0075]所述的陰性對照為正常人全血標(biāo)本核酸提取液。
[0076]具體操作方法如下:
[0077]1、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建步驟如下:
[0078]分離提取惡性瘧原蟲DNA，普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因片段⑶；
[0079]對擴(kuò)增片段進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆、測序，確認(rèn)插入目的序列片段的準(zhǔn)確性；[0080]純化質(zhì)粒,測定并計(jì)算質(zhì)粒濃度；此次制備質(zhì)粒濃度為2.5 X IO8Copies/ μ L ；
[0081]對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，質(zhì)粒濃度為2.5X108、2.5X107、2.5X IO6,2.5Χ105、2.5Χ104、2.5Χ103、2.5Χ102 和 2.5X IO1Copies/μ L，Ct 值依次為 11.91,15.88、18.96,22.72,25.90,28.96,32.45,36.45，檢測靈敏度為 25copies/μ L。選定合適的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍(2.5 X IO1Copies/ μ L~2.5 X IO8Copies/ μ L)，以實(shí)時(shí)熒光PCR的Ct值為縱坐標(biāo)(y)，以惡性瘧原蟲核酸拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0082]上述的普通PCR反應(yīng)液為:10 X PCRbuffer (含Mg2+)、上游引物(Fl)、下游引物(Rl)、Taq酶、dNTPs、模板(惡性瘧原蟲DNA)和水。
[0083]普通PCR反應(yīng)步驟:在0.2mL離心管中，依次加入2.5 μ LlO X PCRbuffer (含Mg2+)，
0.5 μ LdNTPs (IOmM)，上游引物(FLlOyM)和下游引物(RLlOyM)各 I μ L，0.2 μ LTaq 酶(5~4 1^)、2 4 1^惡性瘧原蟲0嫩提取液，補(bǔ)水至25“1^反應(yīng)條件為:95°C lmin ；95°C 30s,55°C 30s, 72°C 40s，35 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0084]2、納米磁微粒(MNP)分離提取全血標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA步驟如下:
[0085]⑴在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L,加入惡性瘧疑似病人全血標(biāo)本50 μ L,標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ；
[0086](2)加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；
[0087]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0088]⑷加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸
取上清液備用。
[0089]3、納米磁微粒(MNP)分離提取全血濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA步驟如下:
[0090]⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，剪成紙條(剪刀在剪切前后均在酒精燈上燒一下)，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；
[0091](2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200 μ L結(jié)合液,加入20 μ LMNP(25 μ g/μ L),渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；
[0092]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0093]⑷加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0094]4、實(shí)時(shí)熒光PCR:
[0095]在0.2mL 離心管中，依次加入 12.5 μ L2 X PremixExTaq, 0.5 μ L 上游引物(Fl，10μΜ)、0.5yL下游引物(R1，10 μ M)，0.3 μ L熒光探針(Ρ1，10 μ Μ)、2 μ L上述惡性瘧原蟲DNA提取液，補(bǔ)水至25 μ L0如采用ΑΒΙ7900實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，則使用實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集模式，數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)為SDS2.3。
[0096]循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s,40 個(gè)循環(huán)。
[0097]5、反應(yīng)系統(tǒng)的質(zhì)量控制:
[0098]根據(jù)使用不同的實(shí)時(shí)突光PCR儀設(shè)定好基線(baseline),設(shè)定的一般原則以閾值線剛好超過正常陰性對照反應(yīng)曲線的最高點(diǎn)，也可根據(jù)儀器噪音情況調(diào)整。反應(yīng)結(jié)果應(yīng)同時(shí)符合以下2個(gè)條件:即陰性對照無擴(kuò)增曲線而陽性對照Ct〈35并有明顯擴(kuò)增曲線。否則，試驗(yàn)結(jié)果無效。
[0099]陰性結(jié)果:樣品無Ct值或Ct > 40，且無明顯擴(kuò)增曲線，報(bào)告為惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為陰性。
[0100]陽性結(jié)果:樣品Ct值≤35，并有明顯擴(kuò)增曲線，報(bào)告為惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為陽性。
[0101]可疑結(jié)果:樣品Ct值在35-40之間的標(biāo)本必須重做，若重做結(jié)果仍然有明顯擴(kuò)增曲線，則該標(biāo)本判斷為惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。
[0102]值得特別 說明的是，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的惡性瘧原蟲定量檢測，參考GeneBank中惡性瘧原蟲基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，利用DNAMAN6.0進(jìn)行序列比對，通過軟件PrimerExpress3.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)突光PCR引物與探針。構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的上、下游引物為實(shí)時(shí)熒光PCR上、下游引物，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品基因片段為162bp。借助這些質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制作外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以實(shí)現(xiàn)惡性瘧原蟲的定量檢測。
[0103]具體檢測實(shí)例
[0104]實(shí)施例1:惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒及其使用
[0105]⑴制備包括下列組成成分的試劑盒:
[0106]納米磁微粒、標(biāo)本稀釋液、裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、超純水、陰性對照、陽性對照、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0107]⑵標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存:
[0108]全血標(biāo)本:無菌操作采集疑似惡性瘧病人的全血標(biāo)本；全血標(biāo)本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指；抗凝劑可選用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉；一周內(nèi)進(jìn)行瘧原蟲檢測的可存放于2-8°C，長時(shí)間保存應(yīng)置于_20°C或_70°C以下；標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)符合生物安全要求，在冷藏(2-8°C )或冷凍(_20°C )的條件下運(yùn)送。
[0109]濾紙干血片標(biāo)本:取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙片上，室溫自然晾干后放入塑料袋密封，置于常溫(18-25°C )或冷藏或冷凍保存；標(biāo)本可在常溫、冷藏或者冷凍的條件下運(yùn)送。
[0110]⑶檢測步驟和結(jié)果分析:
[0111]全血標(biāo)本中的惡性瘧原蟲核酸分離提取:在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性痕疑似病人全血標(biāo)本50 μ L,標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附MNP，棄上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0112]陰性對照全血與病人全血標(biāo)本提取核酸步驟相同。
[0113]濾紙干血片標(biāo)本中的惡性瘧原蟲核酸分離提取:
[0114]將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，剪成紙條(剪刀在剪切前后均在酒精燈上燒一下)，放入1.5mL 離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；在上清液中加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附MNP，棄上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；加入洗脫液50 μ LjfMNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0115]實(shí)時(shí)熒光PCR:分別取2 μ L上述惡性瘧原蟲DNA提取液、或2 μ L陽性對照或陰性對照或系列梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，加入實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管中，反應(yīng)總體積為25 μ L，其中上游引物(Fl)200nM，下游引物(Rl) 200nM，熒光探針(Pl) 120nM。采用ABI7900實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，使用實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集模式，數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)為SDS2.3。
[0116]循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為95°C 30s ；95°C 5s,60°C 30s,40 個(gè)循環(huán)。
[0117]反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件，并對數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析。
[0118]由圖2可見強(qiáng)、中和弱三個(gè)陽性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，三個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是20.60,29.62,35.84，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算其惡性瘧原蟲水平分別為8.46X IO5Copies/μ L、2.0OX IO3Copies/ μ L,30copies/ μ L ;反應(yīng)曲線為典型的實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線，均能夠判定為陽性。
[0119]圖3顯示該檢測方法的特異性曲線。惡性瘧原蟲標(biāo)本檢測Ct值為25.30，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出標(biāo)本中惡性瘧原蟲含量，為3.60 X IO4Copies/μ L ;而間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲以及陰性對照的擴(kuò)增曲線均沒有上升。
[0120]圖4顯示采用本試劑盒，對非洲流行區(qū)回國的入境人員的惡性瘧原蟲感染狀況進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測出I例低水平惡性瘧原蟲感染者，Ct值為37.02，判斷為惡性瘧原蟲可疑陽性，經(jīng)復(fù)測驗(yàn)證最終判斷為惡性瘧原蟲陽性，惡性瘧原蟲水平為Hcopies/μ L。對此例感染者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)其4天前在非洲疫區(qū)醫(yī)院因瘧疾治愈而出院；此次入境時(shí)檢出其體內(nèi)存在低水平的惡性瘧原蟲，說明該患者還沒有完全治愈，還有惡性瘧復(fù)燃的危險(xiǎn)，建議其及早行瘧疾根治治療；病人隨后及時(shí)到?？漆t(yī)院就醫(yī)，經(jīng)抗惡性瘧治療康復(fù)。
【權(quán)利要求】
1.一種惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括如下組分:納米磁微粒、標(biāo)本稀釋液、裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、陽性對照、陰性對照； 所述的納米磁微粒為用無水乙醇配制的納米磁微粒溶液； 所述標(biāo)本稀釋液為磷酸鹽緩沖液PBS ； 所述裂解液為5M異硫氰酸胍溶液； 所述結(jié)合液為無水乙醇； 所述洗液為70%乙醇； 所述洗脫液為TEpH8.0 ； 所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針Pl，見序列3 ； 所述的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為含有惡性瘧原蟲基因片段(S)的質(zhì)粒； 所述的陽性對照為惡性瘧原蟲質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品； 所述的陰性對照為正 常人全血核酸提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:瘧疾疑似病例全血標(biāo)本通常有兩種形式，一種是抗凝全血標(biāo)本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指，抗凝劑采用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉，置于2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用；一種是濾紙干血片標(biāo)本，取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙上，室溫晾干后放入塑料袋密封，置于常溫18-25°C或2-8°C或-20C保存，供核酸提取用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述Fe3O4納米磁微粒分離提取全血標(biāo)本和濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟分述如下: 所述納米磁微粒MNP分離提取全血標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為: (1)在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性瘧疑似病人全血標(biāo)本50 μ L，標(biāo)本量不足50 μ L時(shí),用標(biāo)本稀釋液補(bǔ)足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ； ⑵加入200 μ L結(jié)合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP，棄上清； ⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液； ⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述納米磁微粒MNP分離提取全血濾紙干血片標(biāo)本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為: ⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標(biāo)本，約Icm2大小，血量約為15-30 μ L，剪成紙條，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標(biāo)本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻,56。。IOmin ;8000rpm離心Imin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中； (2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200μ L結(jié)合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；⑶ 加入300 μ L洗液清洗MNP，用磁鐵吸附MNP，棄上清；重復(fù)清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液； ⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
5.一組惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其特征在于:其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列I為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一組惡性瘧原蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其特征在于:所述上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為:上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103937907SQ201410201466
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】劉翌, 王飛, 田茵, 孫寧, 楊靜, 孫福軍, 劉艷華, 薛強(qiáng), 高璟瑜, 張紹福, 鄒明強(qiáng), 鄧叢良, 葛廣路 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗(yàn)檢疫局