本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)納米熒光技術(shù)和功能化材料領(lǐng)域，具體涉及一種攜帶有機(jī)熒光標(biāo)記的磁性納米載體及其制備的方法。

背景技術(shù)：

在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，常常需要用到病毒和非病毒等，作為運(yùn)輸DNA、RNA、蛋白、脂類等生物大分子的載體。但是病毒載體存在著潛在的致病可能，存在生物安全隱患，而非病毒載體雖然安全性高于病毒載體，但是存在缺乏靶向性、轉(zhuǎn)運(yùn)效率不高等缺點(diǎn)。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，對于納米級非病毒載體的探索方興未艾。對于Fe3O4納米顆粒而言，由于粒徑達(dá)到納米級別還具備了超順磁性，即在外加磁場中有較強(qiáng)磁性，磁場撤除時(shí)磁性又很快消失，故可在外加磁場的引導(dǎo)下，實(shí)現(xiàn)在局部濃聚富集，可作為各種大分子物質(zhì)的載體，起到靶向運(yùn)輸?shù)淖饔?。但是單純Fe3O4納米顆粒的水溶性、分散度等物理特性并不理想；缺少共價(jià)鍵等大分子結(jié)合位點(diǎn)，加載大分子物質(zhì)的量受到限制；且容易被生物體內(nèi)免疫細(xì)胞吞噬；因此需要對其進(jìn)行改性，在其外包裹大分子物質(zhì)，增加其親水性、降低清除率，從而延長其在血液系統(tǒng)中的循環(huán)時(shí)間，并將大分子物質(zhì)遞送到目標(biāo)部位。

有機(jī)熒光標(biāo)記技術(shù)作為一種實(shí)時(shí)、非同位素可視標(biāo)記法，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)醫(yī)學(xué)等研究中。將目的物標(biāo)記后，通過光學(xué)檢測設(shè)備，可動態(tài)、實(shí)時(shí)、精確地對目的物進(jìn)行示蹤。但傳統(tǒng)的熒光試劑存在著一些缺陷：如多數(shù)熒光試劑存在光漂白致使熒光信號不穩(wěn)定、發(fā)出的熒光光子平均數(shù)量少，熒光試劑及其光解產(chǎn)物對活體細(xì)胞有一定毒副作用等。此外，既往的熒光標(biāo)記方法連接的有機(jī)熒光分子數(shù)量較少，可視化效果不夠理想；且熒光基團(tuán)對目標(biāo)物進(jìn)行標(biāo)記的方法較復(fù)雜，所需成本較高；連接熒光基團(tuán)所使用的修飾材料容易對熒光的觀察產(chǎn)生干擾，無法滿足研究和應(yīng)用的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種制備方法簡便，熒光穩(wěn)定性高，具備順磁性，易于用光學(xué)方法或磁共振方法觀察、便于用外加磁場控制的熒光-磁性雙模態(tài)納米載體及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

這種熒光-磁性雙模態(tài)納米載體，其特征在于，包括有機(jī)熒光劑和磁性納米顆粒，其中有機(jī)熒光劑通過修飾物葡聚糖包裹在磁性納米顆粒表面，形成熒光-磁性雙模態(tài)納米載體；所述有機(jī)熒光劑為異硫氰酸熒光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、菁類染料、藻紅蛋白或氨甲基香豆素醋酸酯；所述磁性納米顆粒為Fe₃O₄磁性納米顆粒，粒徑為10nm～50nm。

作為優(yōu)選：所述葡聚糖的分子量為6kD～40kD。

熒光-磁性雙模態(tài)納米載體的制備方法，包括如下步驟：

1)將檸檬酸鹽溶于去離子水，制成濃度為0.05～0.1mol/L的檸檬酸鹽溶液；

2)將Fe₃O₄磁性納米顆粒加入檸檬酸鹽溶液中，超聲乳化后，加入含葡聚糖的檸檬酸鹽溶液，繼續(xù)超聲乳化；葡聚糖、Fe₃O₄磁性納米顆粒和檸檬酸鹽的摩爾比為1:1:50～1:1.5:200；

3)步驟2中，超聲乳化工作頻率為30kHZ～50kHZ，乳化時(shí)間為20～40min；

4)將含有Fe₃O₄磁性納米顆粒和葡聚糖的檸檬酸鹽溶液置于水浴中反應(yīng)，得到葡聚糖包裹的Fe₃O₄磁性納米顆粒；

5)步驟4中，水浴溫度為80～85℃，反應(yīng)時(shí)間為2～4h；

6)加入有機(jī)熒光劑，均勻震蕩攪拌，得到的反應(yīng)產(chǎn)物需用去離子水洗滌6～8次，得到熒光-磁性雙模態(tài)納米載體；

7)步驟6中，葡聚糖和有機(jī)熒光劑的摩爾比為1:10～1:20，反應(yīng)需在4℃避光條件下進(jìn)行，時(shí)間為6～8h。

本發(fā)明所公開的一種熒光-磁性雙模態(tài)納米載體及制備方法，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：1)載體具有良好、穩(wěn)定的光學(xué)顯像能力，易于對載體進(jìn)行實(shí)時(shí)、動態(tài)觀察；2)所用載體粒徑和有機(jī)熒光材料可根據(jù)不同需要或者應(yīng)用場景進(jìn)行選擇，適用性強(qiáng)；3)載體具有良好的磁響應(yīng)和磁成像能力，可在磁場引導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)的靶向運(yùn)輸，亦能在磁共振下觀察載體在活體內(nèi)的位置和運(yùn)動路徑；4)載體制備方法簡單，具有良好的生物安全性，不會對生理活動造成影響；5)所用修飾物葡聚糖在載體表面形成正電荷界面，使其易被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞攝取，提高了載體的轉(zhuǎn)運(yùn)效率；6)葡聚糖側(cè)枝基團(tuán)大大增加有機(jī)熒光材料和生物大分子的結(jié)合位點(diǎn)，且其在可見光到近紅外光范圍內(nèi)又是透明的，能避免對熒光信號形成干擾。

附圖說明

圖1制備完成后，在透射電鏡下所見熒光-磁性雙模態(tài)納米載體；

圖2制備完成后，紫外光下攜帶熒光標(biāo)記的熒光-磁性雙模態(tài)納米載體；

圖3制備完成后，自然光下攜帶熒光標(biāo)記的熒光-磁性雙模態(tài)納米載體；

圖4無外加磁場下，攜帶熒光標(biāo)記的熒光-磁性雙模態(tài)納米載體在細(xì)胞內(nèi)的分布情況(黑箭頭所指為進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的納米載體)；

圖5給予外加磁場后，攜帶熒光標(biāo)記的熒光-磁性雙模態(tài)納米載體在細(xì)胞內(nèi)的分布情況(黑箭頭所指為進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的納米載體)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。下述實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

這種熒光-磁性雙模態(tài)納米載體及制備方法，它包括有機(jī)熒光劑和磁性納米顆粒，其中有機(jī)熒光劑通過連接物葡聚糖包裹在磁性納米顆粒表面，形成熒光-磁性雙模態(tài)納米載體。其具體制備步驟如下：將葡聚糖和Fe3O4磁性納米顆粒分別溶于檸檬酸鹽溶液中，將含有Fe3O4磁性納米顆粒的檸檬酸鹽溶液超聲乳化后，加入含有葡聚糖的檸檬酸鹽溶液繼續(xù)超聲乳化，然后將溶液轉(zhuǎn)移到水浴中，用攪拌器攪拌反應(yīng)，并加入用DMSO溶解的有機(jī)熒光劑，得到熒光-磁性雙模態(tài)納米載體。

所用葡聚糖分子量為6kD～40kD，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒粒徑為10nm～50nm，有機(jī)熒光劑為異硫氰酸熒光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、菁類染料、藻紅蛋白或者氨甲基香豆素醋酸酯。

所用檸檬酸鹽溶液為檸檬酸鹽溶于去離子水而成，其濃度為0.05～0.1mol/L。

葡聚糖、Fe₃O₄磁性納米顆粒和有機(jī)熒光劑的摩爾比為1:1:10～1:1.5:20，葡聚糖與檸檬酸鹽的摩爾比為1:50～1:200。

超聲乳化工作頻率為30kHZ～50kHZ，乳化時(shí)間為20～40min。

含有Fe₃O₄磁性納米顆粒和葡聚糖的檸檬酸鹽溶液需要在80～85℃水浴中反應(yīng)2～4h。

有機(jī)熒光劑溶于DMSO溶液，加入后需在4℃避光條件下均勻震蕩攪拌，反應(yīng)6～8h。

得到的反應(yīng)產(chǎn)物需用去離子水洗滌6～8次，去除未參與反應(yīng)的單體，從而得到熒光-磁性雙模態(tài)納米載體溶液。

實(shí)施例1

1)將0.05mol檸檬酸鈉溶于1L去離子水中，得到0.05mol/L的溶液。

2)將粒徑為20nm的Fe₃O₄磁性納米顆粒加入檸檬酸鈉溶液中，工作頻率為30kHZ的超聲乳化20min后，加入含葡聚糖(分子量為20kD)的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)超聲乳化20min，其中葡聚糖、Fe₃O₄磁性納米顆粒和檸檬酸鈉的摩爾比為1:1:50。

3)將步驟(2)中所得混合液置于溫度為80℃的水浴中，反應(yīng)4h。

4)將步驟(2)中所得混合液降溫至4℃，避光條件下加入溶于DMSO的異硫氰酸熒光素，均勻震蕩攪拌6h。

5)將步驟(4)中所得混合液用去離子水洗滌6～8次，得到熒光-磁性雙模態(tài)納米載體。

實(shí)施例2

1)將0.075mol檸檬酸鈉溶于1L去離子水中，得到0.075mol/L的溶液。

2)將粒徑為30nm的Fe₃O₄磁性納米顆粒加入檸檬酸鈉溶液中，以工作頻率為40kHZ的超聲乳化30min后，加入含葡聚糖(分子量為10kD)的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)超聲乳化30min，其中葡聚糖、Fe₃O₄磁性納米顆粒和檸檬酸鈉的摩爾比為1:1:100。

3)將步驟(2)中所得混合液置于溫度為85℃的水浴中，反應(yīng)2h。

4)將步驟(2)中所得混合液降溫至4℃，避光條件下加入溶于DMSO的四甲基異硫氰酸羅丹明，均勻震蕩攪拌7h。

5)將步驟(4)中所得混合液用去離子水洗滌6～8次，得到熒光-磁性雙模態(tài)納米載體。

實(shí)施例3

1)將0.1mol檸檬酸鈉溶于1L去離子水中，得到0.1mol/L的溶液。

2)將粒徑為50nm的Fe₃O₄磁性納米顆粒加入檸檬酸鈉溶液中，以工作頻率為50kHZ的超聲乳化40min后，加入含葡聚糖(分子量為6kD)的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)超聲乳化40min，其中葡聚糖、Fe₃O₄磁性納米顆粒和檸檬酸鈉的摩爾比為1:1:200。

3)將步驟(2)中所得混合液置于溫度為85℃的水浴中，反應(yīng)4h。

4)將步驟(2)中所得混合液降溫至4℃，避光條件下加入溶于DMSO的四甲基異硫氰酸羅丹明，均勻震蕩攪拌8h。

5)將步驟(4)中所得混合液用去離子水洗滌6～8次，得到熒光-磁性雙模態(tài)納米載體。

熒光-磁性雙模態(tài)納米載體的性能檢測

熒光-磁性雙模態(tài)納米載體的電鏡觀測：將納米復(fù)合物溶液滴于銅網(wǎng)上,干燥后置于透射電子顯微鏡下觀測，其顆粒尺寸小于20納米(如圖1)。

熒光-磁性雙模態(tài)納米載體的磁響應(yīng)及熒光特性：將雙模態(tài)納米載體及單純磁性納米載體水溶液分別置于石英比色器中，一側(cè)置永久磁鐵，可見順磁性載體聚集于靠近磁鐵的器壁；在紫外燈照射下溶雙模態(tài)納米載體呈現(xiàn)熒光，而單純磁性納米載體不發(fā)光(如圖2和圖3)。

熒光-磁性雙模態(tài)納米載體在磁場引導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞的能力以及實(shí)時(shí)觀察：取2個(gè)含有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)皿(皿中含4毫升培養(yǎng)液)，分別加入雙模態(tài)納米載體溶液15微升，一個(gè)皿不給予磁場，另一個(gè)皿底給予200mT的磁場，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，置于紫外熒光顯微鏡下數(shù)碼成像(如圖4和圖5)。