技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明創(chuàng)造屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于Titin-Telethoninβ-折疊片結(jié)構(gòu)的多肽復(fù)合物作為多肽及蛋白質(zhì)藥物的載體，延長多肽或者蛋白質(zhì)類藥物半衰期的應(yīng)用及方法，同時(shí)經(jīng)過這種多肽復(fù)合物對(duì)多肽或者蛋白質(zhì)類藥物的設(shè)計(jì)和改造，獲得了具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物。

背景技術(shù)：

目前，絕大多數(shù)肽類和其類似物藥物為激素或具有激素作用的肽衍生物，具有生物活性和特異性較高，可溶性強(qiáng)，低毒性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。肽類或蛋白質(zhì)類藥物雖然具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，但在體內(nèi)發(fā)揮藥理學(xué)作用時(shí)，也具有以下限制因素：1)口服利用度低，給藥方式通常選用注射；2)親水性強(qiáng)，不易通過生理屏障；3)較高的構(gòu)象靈活性，有時(shí)與受體和靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)合時(shí)缺乏特異選擇性，易導(dǎo)致副作用。除以上的因素，還有一個(gè)最為主要的限制因素為其在體內(nèi)半衰期較短。一些肽或蛋白質(zhì)類藥物的體內(nèi)半衰期僅有幾分鐘，從而導(dǎo)致到達(dá)靶組織的藥物濃度過低，不能發(fā)揮足夠的藥效，嚴(yán)重限制了臨床應(yīng)用。

半衰期較短一般有兩方面原因造成，一是在血漿、肝臟和腎臟中存在著大量的肽酶(Peptidase)和蛋白酶(Protease)，肽或蛋白質(zhì)在酶的作用下迅速降解；二是在血漿中分子量較小的肽類或蛋白質(zhì)類藥物(低于50kDa)，由于腎臟的過濾作用而被快速排出。延長肽類或蛋白質(zhì)類藥物的半衰期，不但可以改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征，而且可以減少用藥量和用藥次數(shù)，而這也是現(xiàn)在肽類或蛋白質(zhì)類藥物臨床應(yīng)用上的難題。

目前，已經(jīng)開發(fā)出一系列的延長肽類或蛋白質(zhì)類藥物半衰期的方法，如提高肽類或蛋白質(zhì)類藥物對(duì)酶的穩(wěn)定性來減少酶的降解；或者通過增加肽類或蛋白質(zhì)類藥物的流體力學(xué)體積(Hydrodynamic Volume)和FcRn介導(dǎo)的再生作用來減少腎臟過濾排出。另外，將較小的多肽或者蛋白質(zhì)類藥物與大分子物質(zhì)通過基因融合或者化學(xué)偶聯(lián)的方式連接在一起，不僅可以增大其分子量，使其超過腎臟過濾的臨界值(40-50kDa)，減少腎臟的過濾排出；而且可以依靠大分子量物質(zhì)的空間位阻效應(yīng)，減少蛋白質(zhì)酶等對(duì)多肽或者蛋白質(zhì)藥物的降解，從而極大的延長多肽或者蛋白質(zhì)類藥物的半衰期，增加了臨床應(yīng)用的潛力。

目前，應(yīng)用的比較成熟的大分子量載體有PEG，Albumin和IgG-Fc等?，F(xiàn)在最普遍用的一種方法，就是通過化學(xué)交聯(lián)的方式將不同分子量的PEG與多肽或蛋白質(zhì)類藥物的特異位點(diǎn)相連，能顯著延長多肽或蛋白質(zhì)藥物的半衰期。PEG修飾增加蛋白質(zhì)和多肽藥物的可溶性，提高了穩(wěn)定性，降低免疫原性，減少蛋白酶的降解，延長在血液中的滯留時(shí)間，延長了藥物的作用時(shí)間。但是，PEG修飾也存在一些問題，如生產(chǎn)成本較高；有些PEG修飾的藥物其活性降低；近年來又發(fā)現(xiàn)PEG修飾的蛋白和其降解物容易在腎臟中累積，干擾了正常腎臟的過濾作用；人和動(dòng)物能夠?qū)EG產(chǎn)生一定的抗體，表明其具有一定的免疫原性。

因此，有必要開發(fā)一種免疫原性更低或無免疫原性，在體內(nèi)更穩(wěn)定的肽或者蛋白質(zhì)類藥物的載體，使多肽或者蛋白質(zhì)類藥物既能保持原來的活性，其半衰期又得到延長，從而更好的應(yīng)用在臨床上。

肌原纖維是由肌節(jié)(sarcomere)構(gòu)成的，Z-盤(Z-disk)是肌節(jié)的分界線。在Z-盤中錨定著許許多多的蛋白質(zhì)，構(gòu)成了細(xì)胞的骨架成分，起著維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和肌肉伸縮的重要作用。在Z-盤中，titin分子起著維持肌節(jié)完整性的重要作用。Titin分子是自然界中已知的最大的蛋白質(zhì)，其分子量約為4MDa，長度約為1μm，其N端錨定在Z-盤中，其C端則跨越了肌節(jié)一半的長度到達(dá)M線。電鏡圖像和基因序列分析表明，titin分子是由300多個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Immunoglobulin-like，簡寫為Ig)和纖維連接蛋白III(fibronectin-like，簡寫為FN-III)樣的結(jié)構(gòu)域，以及其他一些結(jié)構(gòu)域(如PEVK結(jié)構(gòu)域)等構(gòu)成。

在Z-盤中，titin的N端與許多蛋白質(zhì)分子能發(fā)生相互作用，這些相互作用能在結(jié)構(gòu)上支持肌原纖維的功能。在這些蛋白質(zhì)分子中有一種特殊的分子，Telethonin，其能將兩個(gè)titin分子的N端通過非共價(jià)鍵連接在一起。

晶體結(jié)構(gòu)分析表明，Telethonin N端(TeN)的偽對(duì)稱結(jié)構(gòu)(pseudosymmetric structure)通過氫鍵等非共價(jià)鍵將titin分子的N端的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(Z1Z2)以反向平行的方式連接起來，構(gòu)成了獨(dú)特的β-折疊片結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)類型在先前的研究中僅在蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中被發(fā)現(xiàn)(Zou PJ et al,Nature,12Jan.2006,439:229-233)。這種交聯(lián)代表著一種新型的配體和受體相互作用的方式。傳統(tǒng)的配體和受體的相互作用是配體分子插入到受體分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，而Telethonin與Z1Z2的相互作用是配體分子Telethonin的N端通過β-折疊片的交聯(lián)作用將兩個(gè)titin分子的N端(Z1Z2)結(jié)合在一起。這種相互作用對(duì)于穩(wěn)定titin的N端具有非常重要的作用。

研究中，常將包含這種titin-Telethoninβ-折疊片結(jié)構(gòu)的復(fù)合物稱為Z1Z2/Telethonin復(fù)合物。Steered molecular dynamics(SMD)模擬顯示，這種Z1Z2/Telethonin復(fù)合物所能承受的機(jī)械力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)的Z1Z2分子(Lee EH,et al,Structure,Mar.2006,14(3):497-509)。而單分子機(jī)械力實(shí)驗(yàn)表明，Z1Z2/Telethonin復(fù)合物能夠承受700pN的拉力(Bertz M,et al,Proc Natl Acad Sci USA,11Aug.2009,106(32):13307-133310)，超過目前已知的蛋白質(zhì)分子或者復(fù)合物所能承受的拉力，因此Z1Z2/Telethonin復(fù)合物是非常穩(wěn)定的一種結(jié)構(gòu)。

雖然對(duì)Z1Z2/Telethonin復(fù)合物這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，但對(duì)于這種結(jié)構(gòu)在各方面的應(yīng)用卻尚未見報(bào)道，而擁有這種結(jié)構(gòu)的復(fù)合物在作為藥物載體方面的適用性的研究至今也更未涉及。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明創(chuàng)造提供一種基于Titin-Telethoninβ-折疊片結(jié)構(gòu)的多肽復(fù)合物作為多肽或蛋白質(zhì)藥物載體的應(yīng)用，所述多肽復(fù)合物含有：(i)多肽A：包含titin分子N端的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(Z1Z2)的多肽、其同源物、類似物或衍生物；(ii)多肽B：包含Telethonin分子N端的β-折疊片區(qū)域的多肽、其同源物、類似物或衍生物；所述多肽B將兩個(gè)所述多肽A結(jié)合在一起構(gòu)成β-折疊片結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為包含SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列的片段、其保守性變體、生物活性片段或衍生物，所述多肽B為包含SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列的片段、其保守性變體、生物活性片段或衍生物，且所述多肽B將兩個(gè)所述多肽A結(jié)合在一起構(gòu)成β-折疊片結(jié)構(gòu)。

在一些方案中，所述多肽復(fù)合物中所述多肽A為包含與SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列至少具有60％相同性的序列的多肽片段，優(yōu)選為至少具有70％相同性，還優(yōu)選為至少具有80％相同性，再優(yōu)選為至少具有90％相同性，更優(yōu)選為至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性；所述多肽B為包含與SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列至少具有60％相同性的序列的多肽片段，優(yōu)選為至少具有70％相同性，還優(yōu)選為至少具有80％相同性，再優(yōu)選為至少具有90％相同性，更優(yōu)選為至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性。

在一些方案中，所述多肽復(fù)合物中所述多肽A包含從SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列中連續(xù)或間斷地缺失、替換或插入0-36中任意數(shù)值個(gè)氨基酸殘基得到的多肽之一，優(yōu)選為0-20中任意數(shù)值個(gè)，更優(yōu)選為0-10中任意數(shù)值個(gè)，最優(yōu)選為0、1、2、3、4、5、6個(gè)；所述多肽B包含從SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列中連續(xù)或間斷地缺失、替換或插入0-36中任意數(shù)值個(gè)氨基酸殘基得到的多肽之一，優(yōu)選為0-20中任意數(shù)值個(gè)，更優(yōu)選為0-10中任意數(shù)值個(gè)，最優(yōu)選為0、1、2、3、4、5、6、7、8個(gè)。

進(jìn)一步，所述多肽A和/或多肽B還可以包含或連接蛋白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列，所述蛋白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列可選自HA、GST、His6、MBP、Flag、Halo、CBD、Srep中的一種或多種。

進(jìn)一步，所述多肽A和/或多肽B還可以包含或連接一段或多段蛋白質(zhì)間隔或連接序列(linker)，所述蛋白質(zhì)間隔或連接序列用于將外源的氨基酸序列插入多肽A和/或多肽B的氨基酸序列中，而不破壞所述多肽復(fù)合物的β-折疊片結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列，多肽B為具有SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列或?qū)⑵銫ys突變?yōu)镾er的變體序列(SEQ ID NO:4中30-116位所示的氨基酸序列)。

還優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SEQ ID NO:6中27-221位所示的氨基酸序列，多肽B為具有SEQ ID NO:2中27-116位所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4中27-116位所示的氨基酸序列。

更優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SEQ ID NO:6中25-221位所示的氨基酸序列，多肽B為具有SEQ ID NO:2中25-116位所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4中25-116位所示的氨基酸序列。

最優(yōu)選的，所述多肽復(fù)合物中，所述多肽A為具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，多肽B為具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

進(jìn)一步，所述多肽復(fù)合物包含編碼所述多肽A的核酸序列A及編碼所述多肽B的核酸序列B；所述核酸序列A選自下述的一種核酸序列或其變體：(a)編碼具有SEQ ID NO:6中31-221位氨基酸序列的多肽、其保守性變體、生物活性片段或衍生物的核酸序列；(b)與核酸序列(a)互補(bǔ)的核酸序列；(c)與核酸序列(a)或(b)具有至少70％相同性的核酸序列；所述核酸序列B選自下述的一種核酸序列或其變體：(d)編碼具有SEQ ID NO:2中30-116位或SEQ ID NO:4中30-116位氨基酸序列的多肽、其保守性變體、生物活性片段或衍生物的核酸序列；(e)與核酸序列(d)互補(bǔ)的核酸序列；(f)與核酸序列(d)或(e)具有至少70％相同性的核酸序列；且所述核酸序列B編碼的多肽B能夠?qū)⑺龊怂嵝蛄蠥編碼的兩個(gè)多肽A結(jié)合在一起構(gòu)成β-折疊片結(jié)構(gòu)。

編碼所述多肽A的核酸序列A及編碼所述多肽B的核酸序列B可以分別優(yōu)選為根據(jù)待構(gòu)建表達(dá)載體的生物體的密碼子偏愛性設(shè)計(jì)的核酸序列，例如根據(jù)原核生物大腸桿菌偏愛的密碼子設(shè)計(jì)的分別編碼所述多肽A及多肽B的核酸序列。

編碼所述多肽A的核酸序列A還可以優(yōu)選為具有SEQ ID NO:5中91-663位的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體，還優(yōu)選為具有SEQ ID NO:5中79-663位的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體，更優(yōu)選為具有SEQ ID NO:5中73-663位的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體，最優(yōu)選為具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體；編碼所述多肽B的核酸序列B還可以優(yōu)選為具有SEQ ID NO:1中88-348位或SEQ ID NO:3中88-348位的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體，還優(yōu)選為具有SEQ ID NO:1中79-348位或SEQ ID NO:3中79-348位的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體，更優(yōu)選為具有SEQ ID NO:1中73-348位或SEQ ID NO:3中73-348位的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體，最優(yōu)選為具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列、其保守性變體、互補(bǔ)序列或互補(bǔ)序列的保守性變體。

本說明書和權(quán)利要求書中使用的下列術(shù)語，除非另外說明具有下述一般含義，且下述含義被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)：

“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，可以為單鏈或雙鏈，可以為有義鏈或反義鏈。

“多肽”泛指具有氨基酸序列的肽鏈，包括寡肽、肽、狹義的多肽(20個(gè)氨基酸殘基以上的肽)或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分，可以使糖基化或非糖基化的，氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被修飾或未被修飾。當(dāng)其氨基酸序列涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時(shí)，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與該天然存在的蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的或完全一致的天然氨基酸或其序列。

“同源”包括完全同源和部分同源，在描述多肽、蛋白質(zhì)或氨基酸序列時(shí)，指具有相同或相似的結(jié)構(gòu)或功能，或具有相似的氨基酸序列；在描述核酸序列時(shí)，指具有相似性或互補(bǔ)的核酸序列；“同源”在本發(fā)明具有相對(duì)較為廣泛的含義，例如，包括具有一定百分比的相同性的序列(氨基酸序列或核酸序列)，或包括序列的變體。

“類似物”指基本上保持本發(fā)明titin分子N端的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(Z1Z2)的多肽A和Telethonin分子N端β-折疊片區(qū)域的多肽B的結(jié)構(gòu)或生物學(xué)功能或活性的多肽，只要能夠基本形成二者間β-折疊片結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的多肽“類似物”可以包括：(I)在序列中連續(xù)或間隔地插入、缺失、替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，且所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入、缺失、替換在同一序列中可同時(shí)或不同時(shí)存在；(II)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的基團(tuán)被其他基團(tuán)替換或缺失；(III)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被修飾。

“衍生物”在描述多肽、蛋白質(zhì)或氨基酸序列時(shí)，指由原多肽、蛋白質(zhì)或氨基酸序列衍生而來的關(guān)聯(lián)多肽、蛋白質(zhì)或氨基酸序列，本發(fā)明的多肽復(fù)合物在能夠基本形成β-折疊片結(jié)構(gòu)時(shí)包括這樣的衍生物，例如，本發(fā)明中多肽A或多肽B包括這樣的衍生物：(IV)成熟多肽與另一種化合物融合，或者(V)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列(linker、蛋白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列、酶切位點(diǎn)等)；在描述核酸序列時(shí)，指由原始序列衍生未來的關(guān)聯(lián)序列，可以包括：(VI)序列或基因中連續(xù)或間隔地插入、缺失、替換一個(gè)或多個(gè)堿基(優(yōu)選為等位基因的替換)，且所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入、缺失、替換在同一序列或基因中可同時(shí)或不同時(shí)存在；(VII)序列或基因中一個(gè)或多個(gè)堿基被修飾；(VIII)序列或基因中融合或插入編碼附加的氨基酸序列的基因。

“保守”指所涉及的氨基酸序列或核酸序列與原始序列具有較高的相似性或同一性，能夠維持其原始序列基本的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性或功能，一般可以通過相似的氨基酸殘基替換或等位基因(簡并密碼子)替換等獲得，例如，賴氨酸和精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸之間的替換等。

“變體”指具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或核酸序列，所述改變可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替換。變體可具有保守性改變，其中替換的氨基酸與原氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如亮氨酸和異亮氨酸之間的替換，也可具有非保守性改變。值得指出的是，本發(fā)明中非保守性改變的變體也能夠達(dá)到甚至超越天然氨基酸序列構(gòu)成的多肽復(fù)合物所具有的性質(zhì)及能夠達(dá)到的效果，例如，研究發(fā)現(xiàn)，將SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中半胱氨酸全部替換為絲氨酸，能夠去除多肽B鏈中β-折疊片區(qū)域多余的二硫鍵，使得本發(fā)明的多肽復(fù)合物的β-折疊片結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

“相似性”、“相似”、“相同性”或“同一性”在用于描述多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、氨基酸序列或核酸序列時(shí)，指其包含的序列之間排列對(duì)比時(shí)相應(yīng)位置氨基酸殘基或核苷酸相同的程度，可以用百分?jǐn)?shù)表示。

本發(fā)明還提供了上述多肽復(fù)合物作為藥物載體的應(yīng)用的方法，所述方法包括：將一個(gè)或多個(gè)多肽或蛋白質(zhì)類藥物的編碼序列插入或連接所述多肽A和/或多肽B的編碼序列的一個(gè)或多個(gè)合適位點(diǎn)，獲得融合基因，并使融合基因在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得含有該多肽或蛋白質(zhì)藥物的多肽A和/或多肽B的融合蛋白，然后使融合蛋白和其配合物接觸，構(gòu)成具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物。其中，所述配合物是指能夠與所述融合蛋白形成β-折疊片結(jié)構(gòu)的多肽A或多肽B或另一連接了多肽或蛋白質(zhì)藥物的多肽A或多肽B的融合蛋白。

其中，所述位點(diǎn)是多肽復(fù)合物中能夠與多肽或蛋白質(zhì)藥物結(jié)合的區(qū)域，本發(fā)明中優(yōu)選的位點(diǎn)包括下述16個(gè)(圖1)：多肽B的N端(NT)、C端(CT)和內(nèi)部的兩個(gè)loop區(qū)(LT1、LT2)，兩個(gè)多肽A的N端(NZA、NZB)、C端(CZA、CZB)和八個(gè)loop區(qū)(LZA1、LZA2、LZA3、LZA4、LZB1、LZB2、LZB3、LZB4)。

其中，多肽或蛋白質(zhì)藥物能夠在上述10個(gè)loop區(qū)中的任意位置與所述多肽復(fù)合物結(jié)合。

進(jìn)一步，具體至具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽A和多肽B的中，上述10個(gè)loop區(qū)的位置分別為：

多肽B內(nèi)部的兩個(gè)loop區(qū)：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位和第72-73位氨基酸序列；

多肽A內(nèi)部的四個(gè)loop區(qū)：SEQ ID NO:6中第57-62位、第111-113位、第142-147位、第170-175位氨基酸序列。其中，所述融合基因還包括蛋白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列、酶切位點(diǎn)、各種柔性或剛性linker的編碼序列、調(diào)控序列等。所述融合基因可以通過PCR、酶切、酶連、基因重組、全基因合成等方式獲得。所述表達(dá)系統(tǒng)可以采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(可選用pET系列質(zhì)粒做表達(dá)載體)、酵母表達(dá)系統(tǒng)(如畢赤酵母)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)(如家蠶型多角體病毒)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)或植物表達(dá)系統(tǒng)等，優(yōu)選為采用pET系列質(zhì)粒做表達(dá)載體的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。

進(jìn)一步，所述方法還包括融合基因獲得后的測序步驟以及融合蛋白的純化步驟。

本發(fā)明還提供了上述多肽復(fù)合物作為藥物載體的應(yīng)用的另一種方法，包括用一些偶聯(lián)試劑將多肽或者蛋白質(zhì)藥物與多肽復(fù)合物的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行連接。如使用碳化二亞胺、戊二醛和二異氰酸化合物等常用偶聯(lián)劑將多肽或蛋白質(zhì)類藥物與多肽A和/或多肽B的N端或C端進(jìn)行連接，然后使連接后的多肽與其配合物接觸，獲得具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物；或者通過基因突變的方式在多肽A和/或多肽B內(nèi)部引入-SH，然后利用馬來酰亞胺等偶聯(lián)劑與多肽或蛋白藥物相連，然后使連接后的多肽與其配合物接觸，獲得具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種延長藥物半衰期的方法，所述方法使用一種多肽復(fù)合物作為載體，所述多肽復(fù)合物含有：(i)多肽A：包含titin分子N端的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(Z1Z2)的多肽、其同源物、類似物或衍生物；(ii)多肽B：包含Telethonin分子N端的β-折疊片區(qū)域的多肽、其同源物、類似物或衍生物；所述多肽B將兩個(gè)所述多肽A結(jié)合在一起構(gòu)成β-折疊片結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步，所述方法包括：將一個(gè)或多個(gè)多肽或蛋白質(zhì)藥物的編碼序列插入或連接所述多肽A和/或多肽B的編碼序列的一個(gè)或多個(gè)合適位點(diǎn)，獲得融合基因，并使融合基因在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得含有該多肽或蛋白質(zhì)藥物的多肽A和/或多肽B的融合蛋白，然后使融合蛋白和其配合物接觸，構(gòu)成具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物。其中，所述配合物是指能夠與所述融合蛋白形成β-折疊片結(jié)構(gòu)的多肽A或多肽B或另一連接了多肽或蛋白質(zhì)藥物的多肽A或多肽B的融合蛋白。

其中，所述位點(diǎn)是所述多肽復(fù)合物中能夠與多肽或蛋白質(zhì)藥物結(jié)合的區(qū)域，本發(fā)明中優(yōu)選的位點(diǎn)包括下述16個(gè)(圖1)：多肽B的N端(NT)、C端(CT)和內(nèi)部的兩個(gè)loop區(qū)(LT1、LT2)，兩個(gè)多肽A的N端(NZA、NZB)、C端(CZA、CZB)和八個(gè)loop區(qū)(LZA1、LZA2、LZA3、LZA4、LZB1、LZB2、LZB3、LZB4)。

進(jìn)一步，具體至具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽A和多肽B的中，上述10個(gè)loop區(qū)的位置分別為：

多肽B內(nèi)部的兩個(gè)loop區(qū)：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位和第72-73位氨基酸序列；

多肽A內(nèi)部的四個(gè)loop區(qū)：SEQ ID NO:6中第57-62位、第111-113位、第142-147位、第170-175位氨基酸序列。其中，所述融合基因還包括蛋白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列、酶切位點(diǎn)、各種柔性或剛性linker的編碼序列、調(diào)控序列等。所述融合基因可以通過PCR、酶切、酶連、基因重組、全基因合成等方式獲得。所述表達(dá)系統(tǒng)可以采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(可選用pET系列質(zhì)粒做表達(dá)載體)、酵母表達(dá)系統(tǒng)(如畢赤酵母)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)(如家蠶型多角體病毒)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)或植物表達(dá)系統(tǒng)等。

進(jìn)一步，所述方法還包括融合基因獲得后的測序步驟以及融合蛋白的純化步驟。

本發(fā)明還提供了一種具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物，所述融合蛋白復(fù)合物包含由多肽或蛋白質(zhì)藥物與多肽A和/或多肽B構(gòu)成的融合蛋白，且該融合蛋白與多肽A或多肽B或另外的所述融合蛋白形成β-折疊片結(jié)構(gòu)。

其中，所述多肽A為包含titin分子N端的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域(Z1Z2)的多肽、其同源物、類似物或衍生物；所述多肽B為包含Telethonin分子N端的β-折疊片區(qū)域的多肽、其同源物、類似物或衍生物。

進(jìn)一步，所述融合蛋白中，多肽或蛋白質(zhì)藥物位于多肽A和/或多肽B的一個(gè)或多個(gè)下述位點(diǎn)：多肽B的N端(NT)、C端(CT)和內(nèi)部的兩個(gè)loop區(qū)(LT1、LT2)，兩個(gè)多肽A的N端(NZA、NZB)、C端(CZA、CZB)和八個(gè)loop區(qū)(LZA1、LZA2、LZA3、LZA4、LZB1、LZB2、LZB3、LZB4)。

進(jìn)一步，具體至具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽A和多肽B的中，上述10個(gè)loop區(qū)的位置分別為：

多肽B內(nèi)部的兩個(gè)loop區(qū)：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位和第72-73位氨基酸序列；

多肽A內(nèi)部的四個(gè)loop區(qū)：SEQ ID NO:6中第57-62位、第111-113位、第142-147位、第170-175位氨基酸序列。進(jìn)一步，所述融合蛋白中，多肽或蛋白質(zhì)藥物可以有一種或多種。

進(jìn)一步，所述融合蛋白的編碼序列還可以包括蛋白質(zhì)純化標(biāo)識(shí)序列、酶切位點(diǎn)、各種柔性或剛性linker的編碼序列、調(diào)控序列等。

本發(fā)明的多肽復(fù)合物能夠承載的藥物，包括在多肽復(fù)合物作為藥物載體的應(yīng)用、方法、延長藥物半衰期的方法、以及具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物幾個(gè)主題中涉及到的多肽或蛋白質(zhì)藥物，可以是能夠與下述受體相互作用的多肽或蛋白質(zhì)藥物，包括這些受體的激活劑(agonist)或拮抗劑(antagonist)：(a)含離子通道的受體，如N膽堿受體、興奮性氨基酸受體等；(b)G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)；(c)酶活性的受體，如胰島素受體、表皮生長因子受體、生長激素受體、干擾素受體等；(d)細(xì)胞核激素受體，如腎上腺皮質(zhì)激素受體、甲狀腺素受體等。

其中，GPCR是人體內(nèi)最大的膜受體蛋白家族，現(xiàn)代藥物中約有50％的多肽或蛋白質(zhì)藥物以GPCR為作用靶點(diǎn)。這些多肽或者蛋白質(zhì)藥物尤其適合以本發(fā)明多肽復(fù)合物作為載體，非限定性的例子可以針對(duì)以下幾種GPCR的一種或幾種：一，腫瘤相關(guān)GPCR，如Samatostatin(SST)/Growth(GH)受體群，Gonadotropin releasing hormone(GnRH)/Luteinizing hormone(LH)/類固醇激素受體群，CXCR4等等；二，免疫系統(tǒng)GPCR，如CC chemokine受體或者CXC chemokine受體，F(xiàn)ormyl多肽受體等等；三，內(nèi)分泌系統(tǒng)GPCR的多肽或者蛋白質(zhì)藥物，如GLP-1受體，Glucagon受體，NPYY2受體，Canabinoid受體CB1和CB2，Ghrelin受體GHS-R，Melanocortin受體MC4以及一些孤兒受體如GPR35，GPR85，GPR101等等。

進(jìn)一步，所述多肽復(fù)合物能夠承載的藥物還包括經(jīng)改造后的多肽或蛋白質(zhì)藥物，例如在保持藥物活性的條件下對(duì)多肽或蛋白質(zhì)藥物的氨基酸序列或其核酸序列進(jìn)行連續(xù)或間隔地插入、缺失、替換、修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或堿基，且所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或堿基的插入、缺失、替換、修飾在同一序列或基因中可同時(shí)或不同時(shí)存在。所述改造可以在本發(fā)明的融合蛋白復(fù)合物制備過程的任一步驟進(jìn)行，例如，在制備多肽或蛋白質(zhì)藥物與多肽A和/或多肽B的融合蛋白之前先對(duì)多肽或蛋白質(zhì)藥物的編碼序列進(jìn)行突變，然后再進(jìn)行基因融合獲得編碼融合蛋白的融合基因；或者先獲得編碼多肽或蛋白質(zhì)藥物與多肽A和/或多肽B的融合蛋白的融合基因，再對(duì)融合基因中多肽或蛋白質(zhì)藥物的編碼序列部分進(jìn)行突變等。

本發(fā)明說明書和權(quán)利要求中，在涉及到除本發(fā)明多肽復(fù)合物作為藥物載體應(yīng)用外的其他主題時(shí)，諸如多肽復(fù)合物作為藥物載體的應(yīng)用的方法、一種延長藥物半衰期的方法、一種具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物等，所提及的多肽A和多肽B，均與本發(fā)明在多肽復(fù)合物作為藥物載體應(yīng)用的主題內(nèi)討論的多肽A和多肽B具有同等的含義和范圍，不再贅述。

本發(fā)明的多肽復(fù)合物可以抗蛋白酶水解，穩(wěn)定性較好，其分子量大小在50kDa左右或更高，腎臟不能將其快速濾除；其源自于人體的肌肉蛋白質(zhì)，由四個(gè)類免疫球蛋白的亞基所組成，免疫原性較低；且多肽復(fù)合物含有多個(gè)位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)接入或插入肽或小分子蛋白質(zhì)而不影響復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性；將本發(fā)明的多肽復(fù)合物作為多肽或蛋白質(zhì)藥物的載體的同時(shí)，能夠快速地對(duì)多肽或蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，構(gòu)建新型的具有藥用作用的融合蛋白復(fù)合物，在保持原有藥物活性的同時(shí)，有效延長多肽或者蛋白質(zhì)類藥物的半衰期，更好地在臨床上得到應(yīng)用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中多肽復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及藥物接入或插入位點(diǎn)示意圖。其中，Z1_A和Z2_A分別表示多肽復(fù)合物中一條多肽鏈上的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域，Z1_B和Z2_B分別表示多肽復(fù)合物中另一條多肽鏈上的兩個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域。

圖2是實(shí)施例一中Z1Z2/GLTe(A)和Z1Z2/TeN(B)純化后SDS和Native-PAGE。

圖3是實(shí)施例一中不同濃度GLP-1和Z1Z2/GLTe刺激RINm5F細(xì)胞產(chǎn)生Camp。

圖4是實(shí)施例一活性檢測結(jié)果圖。其中，(A)，一次腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe，Z1Z2/TeN和GLP-1對(duì)血糖的控制作用；(B)表示A實(shí)驗(yàn)的曲線下面積(AUC)；(C)表示一次腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe和GLP-1后，大鼠血漿中胰島素含量變化；(D)表示一次腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe 24h后，進(jìn)行OGTT；(E)表示D實(shí)驗(yàn)的AUC；(F)表示不同濃度Z1Z2/GLTe對(duì)血糖的控制作用；(G)表示E實(shí)驗(yàn)的AUC。(不同處理組與PBS組進(jìn)行比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。)

圖5是實(shí)施例一Z1Z2/GLTe和GLP-1在大鼠血清中的穩(wěn)定性測試圖。(**表示p<0.01，***表示p<0.001。)

圖6是實(shí)施例一Z1Z2/GLTe和GLP-1通過腹腔注射(A)和靜脈注射(B)大鼠后，活性GLP-1在大鼠血漿中的含量隨時(shí)間變化曲線。

圖7是實(shí)施例一每天注射一次Z1Z2/GLTe對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖長期控制的影響曲線。

圖8是實(shí)施例一腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe和等體內(nèi)PBS后，24h內(nèi)對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠(A)和正常小鼠(B)飲食量的影響對(duì)比圖。(**表示p<0.01，***表示p<0.001。)

圖9是實(shí)施例二活性檢測結(jié)果圖。其中，(A)表示不同濃度(1，5，25nmol/kg)Z1Z2/GLTe-G進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；(B)表示不同濃度(1，5，25nmol/kg)Z1Z2/GLTe-G刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。(**表示p<0.01，***表示p<0.001。)

圖10是實(shí)施例二中體內(nèi)穩(wěn)定性檢測實(shí)驗(yàn)中Z1Z2/GLTe-G經(jīng)靜脈注射入大鼠后，血漿中GLP-1的含量變化曲線圖。

圖11是實(shí)施例三中Z1Z2/SSTe純化后SDS和Native-PAGE。

圖12是實(shí)施例三中活性檢測實(shí)驗(yàn)中大鼠體內(nèi)生長激素含量變化曲線圖。

圖13是實(shí)施例三中半衰期檢測實(shí)驗(yàn)中Z1Z2/SSTe經(jīng)靜脈注射入大鼠后，血漿中SST的含量變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造進(jìn)行進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或本領(lǐng)域技術(shù)人員在知識(shí)范圍內(nèi)能夠推知的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施例中涉及的試劑和儀器用具，通常為商用可市購產(chǎn)品，或能夠通過其他公開途徑獲得的產(chǎn)品。

實(shí)施例一多肽復(fù)合物作為GLP-1的載體

GLP-1(Glucagon-like peptide 1)是一種葡萄糖依賴的促胰島素分泌肽，其具有兩種活性形式，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。GLP-1在體內(nèi)能與屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的GLP-1受體結(jié)合，能促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，抑制胰高血糖素的分泌，控制血糖，是有效治療2型糖尿病的多肽激素，但其在體內(nèi)受到二肽基肽酶IV(Dipeptidyl Peptidase IV，DPP-IV)的降解，其半衰期僅2min左右，臨床應(yīng)用時(shí)需要高劑量頻繁注射，嚴(yán)重限制了其作為藥物在臨床上的應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)部分：

1.基因融合

將具有編碼Z1Z2的基因序列(如SEQ ID NO:5中73-663位，以下簡稱Z序列)和具有編碼Telethonin N端(TeN)的基因序列(如SEQ ID NO:1中73-348位，以下簡稱T序列)通過NcoI/KpnI酶切位點(diǎn)克隆到一個(gè)經(jīng)過改造的pET24d的載體上(在pET24d上引入以6xHis標(biāo)簽和一個(gè)TEV蛋白酶酶切位點(diǎn))，并且將T序列中的Cys突變?yōu)镾er(Zou PJ et al,J Biol Chem.24Jan 2003,278(4):2636-2644)，得到pET-Z1Z2(原pET24d載體之外的序列部分如SEQ ID NO:5所示)和pET-TeN(原pET24d載體之外的序列部分如SEQ ID NO:3所示)質(zhì)粒。

通過PCR的方法將GLP-1(7-37)連接到T序列的N端，中間通過linker(GGGGSGGGGSGGGGS)連接。用引物TeN-F、TeN-R將pET-TeN質(zhì)粒全長進(jìn)行擴(kuò)增，

TeN-F:(SEQ ID NO:13)

GGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCCATGGCTACCTCAGAGCTGAG(下劃線部分為linker密碼子)

TeN-R:(SEQ ID NO:14)

CTGAAAATAAAGATTCTCAGTAGTGGGGAT

GLP-1全長基因采用重疊延伸法擴(kuò)增，引物分別為GLP-1-F、GLP-1-R，

GLP-1-F:(SEQ ID NO:15)

P’CATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGC

GLP-1-R:(SEQ ID NO:16)

P’GCCACGGCCTTTCACCAGCCACGCAATAAACTCTTTCGCCGCCTGGCCTTCCAGAT

P’表示5’端磷酸化。

先用TeN-F和TeN-R擴(kuò)增全長且?guī)в?GGGGS)₃的pET-TeN，然后用T4DNA ligase將pET-TeN和帶有5’磷酸的GLP-1基因進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，挑選單克隆提取質(zhì)粒后測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pET-24d-GLTe，原pET24d載體之外的序列部分如下(SEQ ID NO:7)：

其中，箭頭所指為TEV酶酶切位點(diǎn)，雙下劃線為6xHis標(biāo)簽，單下劃線為GLP-1氨基酸序列，曲線部分為linker。

2.表達(dá)

將pET-Z1Z2、pET-TeN和pET-24d-GLTe分別轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落于含60μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接下一級(jí)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600約為0.4-0.6時(shí)加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，并于30℃誘導(dǎo)表達(dá)12h。待表達(dá)時(shí)間結(jié)束后在4℃，5000g條件下離心10min，收集菌體。

收集菌體后，用平衡緩沖液(25mM Tris/HCl,300mM NaCl,10mM咪唑，pH 8.0)進(jìn)行重懸，然后，用細(xì)胞高壓破碎儀(廣州聚能生物科技有限公司)對(duì)菌體進(jìn)行破碎，破碎結(jié)束后，14000rpm離心30min。

對(duì)于Z1Z2，吸取上清到Ni²⁺-NTA柱子(預(yù)先用平衡緩沖液進(jìn)行平衡)中；利用AKTA purifier 10蛋白純化儀對(duì)蛋白分別用漂洗緩沖液(25mM Tris/HCl,300mM NaCl,30mM咪唑，pH 8.0)進(jìn)行漂洗，然后用洗脫緩沖液(25mM Tris/HCl,300mM NaCl,400mM咪唑，pH 8.0)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。

對(duì)于TeN和GLTe則將上清棄掉，用含有8M尿素的平衡緩沖液進(jìn)行重懸，14000rpm離心30min后，吸取上清加入到用含有8M尿素的平衡緩沖液平衡好Ni2+-NTA柱中；利用AKTA purifier 10蛋白純化儀對(duì)蛋白分別用漂洗緩沖液(8M尿素，25mM Tris/HCl,300mM NaCl,30mM咪唑，pH 8.0)進(jìn)行漂洗，然后用洗脫緩沖液(8M尿素，25mM Tris/HCl,300mM NaCl,400mM咪唑，pH 8.0)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。

3.純化

分別將等體積TeN和GLTe逐滴加入到Z1Z2中，邊加邊搖動(dòng)，使最終尿素的濃度達(dá)4M；然后將混合溶液在透析液I(25mM Tris/HCl，300mM，pH 8.0)中透析4h，然后換到透析液II(25mM Tris/HCl，pH 8.0)中透析過夜。最終分別形成Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/GLTe復(fù)合物。

在Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/GLTe復(fù)合物中按1/50的體積比加入TEV蛋白酶，以及TEV蛋白酶酶緩沖液(50mM Tris/HCl pH 8.0，0.5mM EDTA，1mM DTT)，在室溫反應(yīng)2h。

將用TEV蛋白酶酶切后的Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/GLTe復(fù)合物過Ni²⁺-NTA柱，沒有被切完全的或者一些雜蛋白與Ni²⁺重新結(jié)合。流穿為沒有His-tag的Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/GLTe復(fù)合物。

用HiTrapTM Q離子交換柱對(duì)Z1Z2/TeN和Z1Z2/GLTe進(jìn)行進(jìn)一步的純化。分別將Z1Z2/TeN和Z1Z2/GLTe與Q離子交換柱進(jìn)行結(jié)合，然后用AKTA Purifier10蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行線性洗脫，分別得到純度較高的Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/GLTe復(fù)合物。

4.除內(nèi)毒素

用大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)中含有大量的內(nèi)毒素，而內(nèi)毒素會(huì)對(duì)后期的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此必須去除。用Q離子交換柱純化后的Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/GLTe復(fù)合物加入到內(nèi)毒素去除柱子中(ToxinEraserTM Endotoxin Removal kit，Genscript，Nanjing，China)以除去內(nèi)毒素，并用內(nèi)毒素檢測試劑盒(ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit，Genscript)進(jìn)行內(nèi)毒素含量檢測，最終Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/GLTe復(fù)合物中內(nèi)毒素的含量小于2EU/ml。

5.GLP-1受體(GLP-1 receptor，GLP-1R)激活實(shí)驗(yàn)

大鼠胰島素瘤細(xì)胞RINm5F在含有10％FBS(Life Technology)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technology)，并放于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5000個(gè)RINm5F細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)；用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基清洗兩遍后，將不同濃度的Z1Z2/GLTe復(fù)合物和GLP-1(用不含血清的培養(yǎng)基稀釋，并加100μM的IBMX)分別與RINm5F細(xì)胞在37℃下孵育20min；然后，裂解細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量按照cAMP-GloTM Assay試劑盒(Promega)說明書進(jìn)行檢測。

6.活性檢測

為了確定Z1Z2/GLTe對(duì)葡萄糖的控制作用，我們進(jìn)行了口服葡萄糖耐受性實(shí)驗(yàn)(Oral glucose tolerance test，OGTT)。將250g左右大鼠隨機(jī)分為4組(n＝5)，分別為Z1Z2/TeN組，Z1Z2/GLTe組，GLP-1組和PBS組；前3組分別按體重給腹腔注射25nmol/kg，PBS組給予相同體積的PBS，并用血糖儀測血糖濃度。30min后，通過灌胃的方式給予每kg體重2g葡萄糖，此時(shí)計(jì)為0min，此后分別在10，30，60，90，120min時(shí)測血糖。曲線下面積(Area of under curve，AUC)用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行計(jì)算。在這個(gè)過程中，分別在0，10，30min時(shí)通過尾靜脈取血，加入到含有EDTA-Na₂的離心管中，4000rpm離心10min，取上清，用Rat/Mouse Insulin Elisa kit(Millipore)測定其胰島素含量。

為了進(jìn)一步確定Z1Z2/GLTe的濃度與血糖控制的關(guān)系，我們進(jìn)行了不同濃度Z1Z2/GLTe的OGTT實(shí)驗(yàn)；將250g左右SD大鼠隨機(jī)分為4組(n＝5)，為別為1nmol/kg組，5nmol/kg組，25nmol/kg組和PBS組；通過腹腔注射分別將上述濃度劑量的Z1Z2/GLTe和PBS注射入大鼠體內(nèi)，30min后通過灌胃的方式給予每kg體重2g的葡萄糖，此時(shí)計(jì)為0min，此后分別在10，30，60，90，120min時(shí)用血糖儀測血糖，并分別計(jì)算AUC。

為確定Z1Z2/GLTe可以在多長時(shí)間內(nèi)發(fā)揮控制血糖的作用，我們進(jìn)行了腹腔注射藥物24h后對(duì)SD大鼠進(jìn)行OGTT。正常進(jìn)食的大鼠隨機(jī)分為兩組(n＝5)，分別是PBS組和Z1Z2/GLTe組。Z1Z2/GLTe組，將25nmol/kg的Z1Z2/GLTe通過腹腔注射入大鼠體內(nèi)，另一組注射等體積的PBS。讓其自由進(jìn)食12h，然后禁食12h，禁食后進(jìn)行OGTT。

7.體外穩(wěn)定性檢測

將Z1Z2/GLTe復(fù)合物和GLP-1分別加入新鮮采集的大鼠血清中，使其終濃度為1nM，然后分別在0，0.25，0.5，1，2，4，6，10h進(jìn)行取樣，取樣后馬上加入DPP-4抑制劑(Millipore)使抑制劑的終濃度為50μM。樣品中活性GLP-1的濃度用Active GLP-1Elisa kit(Millipore)進(jìn)行檢測。

8.體內(nèi)穩(wěn)定性檢測

將Z1Z2/GLTe和GLP-1分別通過腹腔(4nmol)和靜脈(1nmol)注射入SD大鼠體內(nèi)，分別在0，0.5，1，1.5，2，4，6，10h從尾部取血，滴入預(yù)先用EDTA-Na₂處理過的Ep管中，取血后立即(30s以內(nèi))加入DPP-4抑制劑。樣品中活性GLP-1的濃度用Active GLP-1Elisa kit(Millipore)進(jìn)行檢測。

9.對(duì)糖尿病小鼠血糖及飲食控制

將鏈脲佐菌素(STZ)按45mg/kg體重腹腔注射入KM小鼠中，連續(xù)注射5d，然后正常飼喂10d。然后，過夜禁食(12-16h)后測血糖，空腹血糖值>11.1mM的可判斷為糖尿病模型。實(shí)驗(yàn)分為三組，正常組(即非糖尿病模型組)；糖尿病小鼠對(duì)照組(注射PBS)和糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)組(注射Z1Z2/GLTe)，每組6只，分3籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組每天上午9點(diǎn)按體重給予腹腔注射25nmol/kg Z1Z2/GLTe，對(duì)照組和正常組分別給予腹腔注射PBS。每4d過夜禁食(12-16h)一次，第4d測空腹血糖值。

為了研究Z1Z2/GLTe對(duì)正常小鼠和糖尿病小鼠飲食的影響。我們將正常KM小鼠(非糖尿病模型)12只，分2組，對(duì)照組(PBS)和Z1Z2/GLTe組；糖尿病模型小鼠12只，分2組，對(duì)照組(PBS)和Z1Z2/GLTe組。過夜禁食(12-16h)后，正常小鼠和糖尿病小鼠分別稱重，然后Z1Z2/GLTe組分別按重量腹腔注射25nmol/kg Z1Z2/GLTe，PBS組分別腹腔注射同體積的PBS；給予預(yù)先稱重的鼠糧，然后分別在2h，4h，8h和24h時(shí)稱鼠糧的重量，以鼠糧的減少量除以每籠小鼠的體重為指標(biāo)測定小鼠的進(jìn)食量。

結(jié)果與分析部分：

1.Z1Z2/GLTe表達(dá)純化

從圖2可以看出，經(jīng)過一系列的純化后，Z1Z2/GLTe在SDS-PAGE圖上表現(xiàn)為兩條非常純的條帶，分別為Z1Z2(上)和GLTe(下)；而在Native-PAGE圖上則表現(xiàn)為一條非常純的條帶，為Z1Z2/GLTe復(fù)合物。這表明，我們獲得了純度較高的用于后續(xù)試驗(yàn)的Z1Z2/GLTe復(fù)合物。

Z1Z2/GLTe復(fù)合物經(jīng)內(nèi)毒素去除預(yù)裝柱處理后，其內(nèi)毒素含量控制在2EU/ml的范圍內(nèi)，可以進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2.激活GLP-1R實(shí)驗(yàn)

GLP-1R是一個(gè)細(xì)胞表面表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)受體，GLP-1能夠與細(xì)胞表面表達(dá)的GLP-1R結(jié)合，從而激活下游的信號(hào)通路，產(chǎn)生cAMP。通過產(chǎn)生的cAMP的量可以反映與受體的結(jié)合情況。結(jié)果表明，Z1Z2/GLTe和GLP-1均能與GLP-1R結(jié)合，且能以濃度依賴的方式刺激cAMP的產(chǎn)生。Z1Z2/GLTe和GLP-1的EC50值分別為0.35±0.05nM和0.24±0.03nM(圖3)。這表明Z1Z2/GLTe能夠與GLP-1R結(jié)合且能強(qiáng)有力的激活GLP-1R，是GLP-1R的一種激動(dòng)劑。

3.活性檢測

GLP-1在體內(nèi)能促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，抑制胰高血糖素的分泌，控制血糖。結(jié)果表明Z1Z2/GLTe能夠非常顯著地降低大鼠血糖。當(dāng)口服葡萄糖后，血糖含量急劇升高，GLP-1和Z1Z2/GLTe能顯著降低血糖，但是GLP-1只能在30min內(nèi)發(fā)揮作用，而Z1Z2/GLTe卻能在整個(gè)120min內(nèi)有效控制血糖(圖4A，B)。從胰島素的產(chǎn)生來看，Z1Z2/GLTe和GLP-1都能顯著地增加血液中胰島素的含量，因此能夠有效的發(fā)揮降血糖的作用(圖4C)。

Z1Z2/GLTe控制血糖的能力具有濃度依賴性，隨著濃度的升高而增加，當(dāng)Z1Z2/GLTe的注射量為1nmol/kg時(shí)，即能顯著降低血糖；當(dāng)注射量為25nmol/kg時(shí)，其抑制血糖升高的能力最強(qiáng)(圖4F，G)。

通過腹腔注射Z1Z2/GLTe 24h后，進(jìn)行OGTT，發(fā)現(xiàn)Z1Z2/GLTe仍然能在60min內(nèi)控制血糖，表明其在24h后血液中仍然存在Z1Z2/GLTe，且其濃度仍然能夠發(fā)揮作用(圖4D，E)。

4.體外穩(wěn)定性檢測

檢測結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)表明，在大鼠血清中，GLP-1具有較短的半衰期，大約為0.5h，這是由于血清中含有DPP-IV，DPP-IV會(huì)將GLP-1N端的兩個(gè)氨基酸His和Ala切下，形成沒有活性的多肽；而Z1Z2/GLTe可能由于空間位阻的原因減少了DPP-IV對(duì)其的酶切作用，明顯延長了GLP-1的半衰期，其半衰期大約為4h。

5.體內(nèi)穩(wěn)定性檢測

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Z1Z2/GLTe不論通過腹腔注射(圖6A)或靜脈注射(圖6B)都能顯著延長GLP-1半衰期。Z1Z2/GLTe腹腔注射后2h時(shí)，血漿中濃度達(dá)到最大，而GLP-1則是0.5h時(shí)達(dá)到最大；然后，GLP-1迅速下降，1h時(shí)達(dá)到檢測下限，而腹腔注射Z1Z2/GLTe 24h后仍然能檢測到200pM以上的濃度。這表明，Z1Z2/GLTe顯著增加了GLP-1的穩(wěn)定性，延長了其半衰期，也就增加了其發(fā)揮作用的時(shí)間。靜脈注射后，Z1Z2/GLTe濃度緩慢下降，而GLP-1迅速下降，0.5h時(shí)達(dá)到檢測下限。GLP-1經(jīng)靜脈注射半衰期為1-2min(Kim BJ et al,J Pharmacol Exp Ther,2012,334(3):682-692)，而本實(shí)驗(yàn)中Z1Z2/GLTe為67±3.3min，顯著延長了GLP-1的半衰期。

6.Z1Z2/GLTe對(duì)糖尿病小鼠血糖的長期控制

Z1Z2/GLTe較原始GLP-1具有更長的半衰期，但是其活性并沒有減弱，因此比GLP-1具有更長時(shí)間的控制血糖的能力。通過對(duì)糖尿病小鼠血糖控制實(shí)驗(yàn)可以看出(圖7)，每天腹腔注射25nmol/kg的Z1Z2/GLTe，能有效降低糖尿病小鼠空腹血糖水平。每天一次注射，能有效地長時(shí)間控制空腹血糖水平在一個(gè)較低的范圍內(nèi)。當(dāng)停止注射(28d)后，其Z1Z2/GLTe組血糖值又開始升高。

7.對(duì)進(jìn)食量的影響

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明Z1Z2/GLTe能夠顯著減少糖尿病小鼠(圖8A)和正常小鼠(圖8B)的進(jìn)食量，這應(yīng)該是由于Z1Z2/GLTe中的GLP-1能夠增加飽腹感，減少胃排空的原因。減少了進(jìn)食量也就減少了血糖的進(jìn)一步升高，對(duì)血糖的控制具有積極的作用。

實(shí)施例二多肽復(fù)合物作為GLP-1(8G)的載體

GLP-1(7-37)由于其氨基酸序列的前兩個(gè)氨基酸為HA，所以在血液中易受到DPP-4的切割作用而失去活性，所以將GLP-1(7-37)氨基酸序列中第8位氨基酸突變?yōu)镚ly，可以有效的抑制DPP-4對(duì)其的酶切，從而更長時(shí)間延長半衰期。

實(shí)驗(yàn)部分：

1.載體構(gòu)建

采用下列引物對(duì)實(shí)施例一中的載體pET-24d-GLTe進(jìn)行定點(diǎn)突變，將GLP-1(7-37)氨基酸序列中第8位氨基酸Ala突變?yōu)镚ly。

8A-G-F:(SEQ ID NO:17)

AATCTTTATTTTCAGCATGGCGAAGGCACCTTTACC(下劃線部分為突變位點(diǎn))

8A-G-R:(SEQ ID NO:18)

GCCATGCTGAAAATAAAGATTCTCAGTAGTGGGGATGTC

測序成功后，命名為pET-24d-GLTe-G，原pET24d載體之外的序列部分如下(SEQ ID NO:9)：

其中，箭頭所指為TEV酶酶切位點(diǎn)，雙下劃線為6xHis標(biāo)簽，單下劃線為GLP-1氨基酸序列，曲線部分為linker，黑斜體部分為突變的氨基酸。

2.表達(dá)、純化、除內(nèi)毒素

采用同實(shí)施例1的方法步驟進(jìn)行，分別獲得純度較高且內(nèi)毒素的含量小于2EU/ml的Z1Z2/GLTe-G復(fù)合物，其他復(fù)合物如Z1Z2/TeN復(fù)合物可直接由實(shí)施例1中的載體或其表達(dá)產(chǎn)物或除內(nèi)毒素后的產(chǎn)物獲得。

3.活性檢測

為了確定Z1Z2/GLTe-G能否有效控制血糖，以及不同濃度與血糖控制的關(guān)系，我們進(jìn)行了不同濃度Z1Z2/GLTe-G的OGTT實(shí)驗(yàn)；將250g左右SD大鼠隨機(jī)分為4組(n＝5)，為別為1nmol/kg組，5nmol/kg組，25nmol/kg組和PBS組；通過腹腔注射分別將上述濃度劑量的Z1Z2/GLTe-G和PBS注射入大鼠體內(nèi)，30min后通過灌胃的方式給予每kg體重2g的葡萄糖，此時(shí)計(jì)為0min，此后分別在10，30，60，90，120min時(shí)用血糖儀測血糖。

在每組進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)中，10-30min分別從大鼠尾靜脈取血，滴入含有EDTA-Na₂的Ep管中，取血漿，用Insulin Elisa kit(Millipore)進(jìn)行胰島素含量測定。。

4.體內(nèi)穩(wěn)定性檢測

將1nmol Z1Z2/GLTe-G通過大鼠尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)，此時(shí)計(jì)為0h，然后分別在1，2，4，8，24h取血，滴入預(yù)先用EDTA-Na₂處理過的Ep管中。樣品中活性GLP-1的濃度用GLP-1(Total)Elisa kit(Millipore)進(jìn)行檢測。

結(jié)果與分析部分：

1.活性檢測

對(duì)不同濃度Z1Z2/GLTe-G復(fù)合物進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其能劑量依賴性的降低血糖(圖9A)。即使在1nmol/kg時(shí)仍然能夠發(fā)揮降血糖作用，而25nmol/kg時(shí)，其降血糖作用最為顯著。這充分表明了，對(duì)GLP-1序列中的第8位氨基酸A突變?yōu)镚時(shí)，其活性不受影響，依然能夠發(fā)揮降血糖作用。

而胰島素分泌試驗(yàn)也表明，隨著濃度的增加，其胰島素分泌量也增加(圖9B)。表明，Z1Z2/GLTe-G復(fù)合物能有效刺激胰島細(xì)胞分泌胰島素，從而發(fā)揮降血糖作用。

2.體內(nèi)穩(wěn)定性檢測

將Z1Z2/GLTe-G復(fù)合物經(jīng)靜脈注射入SD大鼠體內(nèi)后，每隔一定時(shí)間尾部取血，用GLP-1(Total)Elisa Kit(Millipore)對(duì)血漿中Z1Z2/GLTe-G進(jìn)行檢測(圖10)。發(fā)現(xiàn)其下降速度較慢，經(jīng)計(jì)算其半衰期約為4h，是突變前(67min)的4倍，而是原GLP-1(1-2min)的約200倍，極大的延長了其半衰期，為更好的應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。

實(shí)施例三多肽復(fù)合物作為SST的載體

生長抑素(Somatostatin，SST)是一種環(huán)狀多肽，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道中，能顯著抑制生長激素的分泌和釋放，也能抑制胰腺激素、胃泌素分泌等。SST能調(diào)控胰島素和胰高血糖素的分泌。SST有兩種活性形式，SST14和SST28。SST與屬于GPCRs的SST受體結(jié)合，從而激活下游通路。主要用于治療肢端肥大癥，肝硬化門脈高壓導(dǎo)致的食管靜脈出血，急性胰腺炎及其并發(fā)癥和胰膽腸瘺等。但是由于其在體內(nèi)的半衰期只有2-3min(Afargan M et al,Endocrinology,2001,142(1):477-486)，嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)部分：

1.基因融合

采用全基因合成的方式分別獲得實(shí)施例1中pET-Z1Z2和pET-TeN載體(也可以直接使用實(shí)施例1中的這兩個(gè)載體或其表達(dá)產(chǎn)物)，以及具有將SST基因插入到TeN突變體Loop(LT1)中的基因序列的載體pET-24d-SSTe(原pET24d載體之外的序列部分如下SEQ ID NO:11)。

其中，箭頭所指為TEV酶酶切位點(diǎn)，雙下劃線為6xHis標(biāo)簽，單下劃線為SST氨基酸序列，曲線部分為linker。

2.表達(dá)、純化、除內(nèi)毒素

采用同實(shí)施例1的方法步驟進(jìn)行，分別獲得純度較高且內(nèi)毒素的含量小于2EU/ml的Z1Z2/TeN復(fù)合物和Z1Z2/SSTe復(fù)合物。

3.活性檢測

將250g左右的SD大鼠禁食12-16h后，隨機(jī)分為2組，一組為實(shí)驗(yàn)組，按體重腹腔注射200nmol/kg的Z1Z2/SSTe復(fù)合物；另一組注射等體積的PBS。在0，30，60，120min時(shí)分別從尾部取血，加入到含有EDTA-Na₂的離心管中，4000rpm離心10min，取上清。上清中生長激素的濃度用Growth hormone ELISA kit(Millipore)試劑盒檢測。

4.半衰期檢測

將Z1Z2/SSTe 0.28mg通過尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)，分別在0，0.5，1，2，4，8，24h，從尾靜脈取血，加入到含有EDTA-Na₂的離心管中，4000rpm離心10min，取上清。上清中Z1Z2/SSTe中的SST用Somatostatin(SST)EIA kit(Phoenix pharmaceuticals)進(jìn)行檢測。

結(jié)果與分析部分：

1.Z1Z2/SSTe表達(dá)純化

從圖11可以看出，經(jīng)過一系列的純化后，Z1Z2/SSTe在SDS-PAGE圖上表現(xiàn)為兩條非常純的條帶；而在Native-PAGE圖上則表現(xiàn)為一條非常純的條帶，為Z1Z2/SSTe復(fù)合物。這表明，我們獲得了純度較高的用于后續(xù)試驗(yàn)的Z1Z2/SSTe復(fù)合物。

Z1Z2/SSTe復(fù)合物的內(nèi)毒素經(jīng)內(nèi)毒素去除樹脂處理后含量控制在2EU/ml的范圍內(nèi)，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.活性檢測

SST在體內(nèi)能抑制生長激素的分泌，因此可以通過測定大鼠體內(nèi)生長激素的含量來驗(yàn)證Z1Z2/SSTe復(fù)合物的活性。Z1Z2/SSTe復(fù)合物注射入大鼠體內(nèi)后，顯著抑制了大鼠生長激素的水平。SST及Z1Z2/SSTe注射入大鼠體內(nèi)后，初期均能明顯抑制體內(nèi)生長激素的分泌，但是SST的半衰期(2-3min)較短，隨著SST的降解，其抑制作用逐漸減弱，最后在2h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照水平；而Z1Z2/SSTe能在120min內(nèi)明顯抑制生長激素的水平，說明其具有更長的半衰期(圖12)。表明其具有與原SST類似的生物學(xué)活性，且能更長時(shí)間地發(fā)揮對(duì)生長激素的抑制作用。

3.半衰期檢測

Z1Z2/SSTe復(fù)合物經(jīng)靜脈注射后，血漿中SST的含量如圖13所示，其計(jì)算的半衰期為6.62±0.43h，比原SST(2-3min)延長了大約200倍。這表明Z1Z2/SSTe復(fù)合物在不影響SST與其受體結(jié)合的情況下，極大延長了其半衰期，使其能更長時(shí)間發(fā)揮藥效。