本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及一種榿木皮與山青皮的活性藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
皮膚光老化是指皮膚長(zhǎng)期反復(fù)暴露于紫外線下而引起的皮膚結(jié)構(gòu)和功能的特征性改變。表現(xiàn)為皮膚表而粗糙、松弛、下垂，出現(xiàn)粗深皺紋和局部色斑，甚至發(fā)生良性或惡性腫瘤等。皮膚光老化的主要組織學(xué)特征是膠原纖維減少和彈性纖維變性。目前認(rèn)為紫外線照射皮膚后可以產(chǎn)生高度反應(yīng)的自由基，這些自由基通過(guò)氧化或交聯(lián)作用，破壞皮膚的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致皮膚內(nèi)各種細(xì)胞的損傷、突變和死亡。紫外線輻射可誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（ Matrix metalloproteinases， MMPs）高表達(dá)，這些MMPs通過(guò)長(zhǎng)期反復(fù)損傷和降解膠原從而導(dǎo)致真皮膠原缺乏。目前對(duì)皮膚光老化的研究是多方面的，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用多種不同中藥或其提取物對(duì)皮膚光老化的防治作用進(jìn)行了頗有成效的研究。
1、人參
程基焱等研究人參的主要成分人參皂苷Rbl與芳維甲酸乙醋對(duì)光老化成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響，通過(guò)體外對(duì)真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用人參皂苷Rbl與芳維甲酸乙酯對(duì)其進(jìn)行干擾，紫外線照射48h后用免疫組織化學(xué)測(cè)定其基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rbl與芳維甲酸乙酯對(duì)培養(yǎng)成纖維細(xì)胞胞質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)均有顯著抑制作用（P<0.05），而人參皂苷Rbl和芳維甲酸乙酯對(duì)其表達(dá)的抑制作用相互之間差異無(wú)顯著性（P>0.05）。研究表明人參皂苷Rbl對(duì)光老化成纖維細(xì)胞具有與芳維甲酸乙酯相似的防治作用，其機(jī)理與芳維甲酸乙酯的作用機(jī)理可能相同或者相似，即通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs活性防治皮膚光老化。
2、黃芪
王詩(shī)晗通過(guò)研究黃芪提取液對(duì)紫外線照射引起的無(wú)毛小鼠皮膚光老化模型皮膚組織中一些氧化代謝產(chǎn)物，包括羥脯氨酸（HYP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量，以及無(wú)毛小鼠真皮結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組無(wú)毛小鼠皮膚組織SOD活性明顯降低，HYP含量顯著減少，MDA含量明顯增加（P<0.05）；模型+黃茂高劑量組的皮膚中HYP及MDA含量與正常組差異無(wú)顯著性，但其對(duì)SOD活性有提高作用（P<0.05） ；模型+黃芪中劑量、模型+黃茂高劑量組HYP含量提高（P<0.05） ， MDA含量降低（P<0.01），并呈劑量依賴。皮膚組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示：模型組可見(jiàn)彈性纖維發(fā)生變性、破壞乃至消失，呈嗜堿性變、無(wú)定形、顆粒狀，出現(xiàn)斷裂、破碎，變粗、卷曲扭結(jié)、聚集成團(tuán)，甚至消失，呈現(xiàn)光老化狀態(tài)；模型+黃芪中、低劑量組小鼠真皮層可見(jiàn)波浪狀彈性纖維，纖維少見(jiàn)斷裂、破碎，卷曲扭結(jié)、聚集成團(tuán)，與模型組比較有所改善，中、低劑量組之間無(wú)顯著差別；模型+黃芪高劑量組的彈性纖維受損程度較各自的中、低劑量組輕。研究表明黃芪提取液對(duì)紫外線照射引起的無(wú)毛小鼠皮膚光老化具有保護(hù)作用，其機(jī)理可能是一方而黃茂木身具有清除自由基的作用，另一方而黃芪可以通過(guò)提高SOD活力來(lái)達(dá)到防光目的。
3、黃芩
閡瑋等研究黃芩對(duì)紫外線（UVA、UVB）損傷皮膚細(xì)胞（角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）的保護(hù)作用，分別采用30、60、90mj/cm2的UVB和4，8，12）j/cm2的UVA照射培養(yǎng)的健康青少年男子環(huán)切術(shù)切除的包皮的原代角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，加入黃芩進(jìn)行干預(yù)處理后，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)UVA、UVB照射可引起皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞損傷，而經(jīng)黃芩預(yù)處理后其細(xì)胞活性可恢復(fù)18%～38%，紫外線照射前黃芩預(yù)處理的細(xì)胞活性均高于無(wú)黃芩處理的細(xì)胞（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)表明黃芩具有光保護(hù)性能，可減輕UVA、UVB對(duì)皮膚細(xì)胞的損傷作用。
4、黃精
楊智榮等采用人工光源（高壓汞燈）長(zhǎng)期照射小鼠皮膚，通過(guò)局部外用黃精，測(cè)定照射部位皮膚羥脯氨酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光老化實(shí)驗(yàn)中藥物組、基質(zhì)組、對(duì)照組皮膚中的羥脯氨酸含量依次遞減。試驗(yàn)表明黃精外用有促進(jìn)膠原纖維合成，防治光老化的作用。
5、綠茶
茶色素是綠茶的主要活性成分，國(guó)內(nèi)外多篇研究表明左旋表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯是綠茶中最有效的化學(xué)光防護(hù)劑。
張素慧等研究茶色素對(duì)紫外線照射致小鼠皮膚光老化的防護(hù)作用，在光鏡下觀察茶色素對(duì)真皮彈性纖維的影響，然后通過(guò)NestedPCR檢測(cè)皮膚組織線粒體DNA（mtDNA）的缺失突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶色素（灌胃或外涂）能有效改善光老化模型小鼠真皮彈性纖維的病變，兩者均可不同程度地緩解小鼠皮膚組織mtDNA的缺失突變，從而延緩皮膚光老化。
Chiu等應(yīng)用綠茶提取物對(duì)光老化病人進(jìn)行隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)研究，綠茶口服組、綠茶霜外用組、對(duì)照組之間的臨床分級(jí)結(jié)果沒(méi)有顯著差異，不過(guò)通過(guò)皮膚活檢發(fā)現(xiàn)經(jīng)綠茶處理后的皮膚彈性組織有顯著改善（P<0.05），表明綠茶可以預(yù)防光老化從而保護(hù)人皮膚。
紫外線輻射人類皮膚能增加過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，減少谷胱甘肽氧化物酶（GSH- Px）活性和總谷胱甘肽水平，Kaityar等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGCG預(yù)處理后能恢復(fù)紫外線誘導(dǎo)的谷胱甘肽水平，并對(duì)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶提供保護(hù)作用。試驗(yàn)研究表明EGCG可以通過(guò)抗氧化來(lái)防治皮膚光老化。
6、芍藥
Lee等研究了芍藥苷對(duì)紫外線誘導(dǎo)引起的人類和無(wú)毛小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的DNA損傷的影響，并研究了含有芍藥苷的化妝品制劑對(duì)人體皮膚的防皺效果。通過(guò)Comet法測(cè)定培養(yǎng)的人和無(wú)毛小鼠皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷可以保護(hù)UVB照射引起的角質(zhì)形成細(xì)胞的DNA損傷，其中正常人類角質(zhì)形成細(xì)胞DNA損傷從19.4%卜降為0.001 %，無(wú)毛小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的DNA損傷從41%下降為0.01 %；用含有0.5%芍藥苷的化妝品制劑20名志愿人員進(jìn)行為8周的臨床試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)芍藥苷可以顯著減少而部皺紋（P<0.05）。試驗(yàn)表明芍藥貳可以保護(hù)皮膚成纖維細(xì)胞，并顯著減少而部皺紋，有良好的防光和抗皺作用。
7、地榆
Tsukahara等每大在相同時(shí)間應(yīng)用UVB照射大鼠后立即在單側(cè)后肢外涂地榆提取物，6周后用Bissett計(jì)分和圖像分析大鼠后肢皮膚皺紋，用掃描電鏡（SElVn觀察皮膚彈性，用影像分析系統(tǒng)定量彈性纖維的線性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地榆提取物對(duì)大鼠后腿皮膚皺紋的形成有明顯抑制作用，對(duì)UVB引起皮膚彈性降低有明顯抑制作用并呈劑量依賴性，同時(shí)還能抑制彈性纖維卷曲。試驗(yàn)表明地榆提取物可預(yù)防UVB照射引起的慢性光老化。
8、莪術(shù)
王志成等研究了莪術(shù)油UVB所致豚鼠皮膚損傷的治療作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分組后，把每一只豚鼠右側(cè)背部暴露皮膚（5 cm ×5 cm）置于UVB光源卜，其中莪術(shù)油組每大照射后用莪術(shù)油涂抹皮膚暴露處，連續(xù)照射30d后，取各組豚鼠背部雙側(cè)皮膚，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及抗氧化指標(biāo)CAT、SOD、GSH-Px、總抗氧化能力（T- AOC）和MDA檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油治療組照射側(cè)和所有未照射側(cè)未見(jiàn)表皮增厚而UVB照射組照射側(cè)表皮可見(jiàn)增厚；與UVB照射組比較，莪術(shù)油治療組成纖維細(xì)胞顯著增加（P<0.01），同組兩側(cè)比較UVB照射組照射側(cè)成纖維細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.05），而莪術(shù)油治療組未見(jiàn)明顯改變；與UVB照射組比較，莪術(shù)油治療組CAT、 SOD和GSH-Px顯著升高（P<0.05， P<0.01） ，MDA含量顯著降低（P<0.01）。試驗(yàn)表明莪術(shù)油對(duì)于紫外線輻射損傷后的皮膚具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與提高抗氧化酶含量及清除體內(nèi)自由基有關(guān)。
9、雷公藤
程基焱等應(yīng)用健康新生兒包皮建立體外培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞光老化模型，分組后應(yīng)用中藥雷公藤的有效成分雷公藤甲素與芳維甲酸乙酯進(jìn)行干擾，然后用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察衰老皮膚真皮成纖維細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的變化，用光學(xué)顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素的3種濃度對(duì)體外培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)MMP-1、MMP-3的表達(dá)的抑制作用均與芳維甲酸乙酯的相似，提示3種濃度雷公藤甲素對(duì)皮膚光老化均具有與維甲酸相似的預(yù)防和治療作用，即通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性而防治皮膚的光老化。
10、巴豆
朱彥君等通過(guò)應(yīng)用巴豆油外涂對(duì)經(jīng)過(guò)UVA、UVB照射20周后的無(wú)毛小鼠光老化皮膚進(jìn)行治療，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后60d皮膚紋理變得細(xì)膩，皮溝、皮脊分布均勻，皮膚紋理在皮膚平均粗糙度、算術(shù)平均粗糙度和皮膚平滑深度三方而均有明顯差異，治療組表皮、真皮結(jié)構(gòu)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸恢復(fù)，治療30d時(shí)基本恢復(fù)正常。表明應(yīng)用巴豆油化學(xué)脫皮劑，對(duì)光老化的無(wú)毛小鼠進(jìn)行治療，通過(guò)皮膚紋理、皮膚的病理組織學(xué)檢測(cè)證明，巴豆油能逆轉(zhuǎn)光老化引起的無(wú)毛小鼠表皮、真皮組織改變，這為臨床應(yīng)用巴豆油治療皮膚光老化疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
11、絞股藍(lán)
王麗紅等研究?jī)?nèi)服絞股藍(lán)對(duì)紫外線照射引起的無(wú)毛小鼠皮膚光老化模型的影響，把無(wú)毛小鼠隨機(jī)分組，模擬紫外線長(zhǎng)期照射16周，造成皮膚光老化模型，給藥組照射同時(shí)灌胃絞股藍(lán)提取液，采用病理組織切片制片技術(shù)，HE染色以40倍光鏡觀察真皮結(jié)構(gòu)改變，并以生化分析方法測(cè)定SOD活性，HYP及MDA含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)低、中、高劑量組對(duì)SOD活性均有提高作用（P<0.05），中、高劑量組可提高HYP含量，降低MDA含量。實(shí)驗(yàn)表明絞股藍(lán)提取液具有拮抗紫外線照射引起的無(wú)毛小鼠皮膚光老化的作用。
12、杜仲
Ho等研究發(fā)現(xiàn)從杜仲中分離的桃葉珊瑚苷，能夠很顯著地減少紫外線引起的人成纖維細(xì)胞中MMP-1的生成，與對(duì)照組相比，能夠抑制MMP- 1的產(chǎn)生近57%，并抑制MMP- 1 mRNA的表達(dá)。這些結(jié)果表明桃葉珊瑚苷是一種可以用來(lái)防治紫外線的潛在物質(zhì)。
13、何首烏
Hwang等研究何首烏提取物對(duì)紫外線照射引起無(wú)毛小鼠皮膚損傷的影響，照射后局部應(yīng)用何首烏提取物14d后，用免疫組化法對(duì)皮膚可溶性超氧化物歧化酶（SOD）的活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與蒸餾水對(duì)照組相比，何首烏治療組的SOD1表達(dá)的蛋白質(zhì)及活性升高，并呈劑量依賴性。試驗(yàn)表明何首烏提取物可以抑制紫外線對(duì)SOD的破壞，說(shuō)明何首烏可能內(nèi)含抗皮膚光老化的物質(zhì)。
14、其他天然植物
Alcaraz等研究局部應(yīng)用一種蕨類植物（Poly-podium leucotomos， PL）的提取物對(duì)紫外線照射后無(wú)毛小鼠表皮變化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PL未處理的對(duì)照組小鼠相比，局部應(yīng)用PL的治療組小鼠皮褶厚度顯著降低，另外與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠相比，治療組小鼠光損害的組織學(xué)參數(shù)顯著降低，其中包括真皮彈力纖維變性，而且有趣的是8周后停止紫外線照射后，治療組患皮膚癌的小鼠數(shù)量也同樣減少。實(shí)驗(yàn)初步表明這種蕨類植物有助于改善和局部抑制皮膚光老化小鼠的組織學(xué)損害，并且可能有助于降低紫外線誘發(fā)的小鼠患皮膚腫瘤的數(shù)量Moon等研究表明，蒜頭素提取物和堇菜屬提取物可以顯著減少紫外線誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞中MMP- 1的表達(dá)并具有劑量依賴性。
隨著對(duì)皮膚光老化發(fā)生機(jī)制研究的深入，中藥對(duì)其防治作用的研究也取得了相應(yīng)進(jìn)展。眾多對(duì)大然植物防光研究的結(jié)果表明，中藥及其提取物在改善皮膚組織結(jié)構(gòu)、提高抗氧化酶活性、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)、增強(qiáng)皮膚免疫防御功能等多方而對(duì)皮膚光老化起著防治作用。中藥是拮抗皮膚光老化的一種有效手段，在改善和防治皮膚光老化方而具有巨大的潛力。
本發(fā)明藥物是經(jīng)發(fā)明人多年來(lái)精心研制，主要用于抗皮膚光老化。經(jīng)研究表明，本發(fā)明藥物對(duì)皮膚光老化具有較好的治療效果。
在本發(fā)明藥物中原料藥的基源如下：
山青皮為海桐花科海桐屬植物大葉海桐Pittosporum daphniphylloides Hu et Wang[P. Daphniphylloides sensu Rehd. et Wils.]的樹(shù)皮和果實(shí)。
榿木皮為樺木科榿木屬榿木Alnus cremastogyne Burk.的樹(shù)皮。
上述藥材均購(gòu)于哈藥集團(tuán)人民同泰藥店。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種山青皮與榿木皮的藥物。
本發(fā)明的另一目的是提供該藥物的制備方法。
本發(fā)明還提供了該藥物的質(zhì)量檢測(cè)方法。
本發(fā)明還提供了該藥物的制藥用途。
本發(fā)明的目的是由以下方式實(shí)現(xiàn)的：
一種抗皮膚光老化的藥物，該藥物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，榿木皮1～2重量份。
該藥物是優(yōu)選由以下重量份的原料制成的：山青皮1重量份，榿木皮2重量份。
該藥物是優(yōu)選還可以由以下重量份的原料制成的：山青皮2重量份，榿木皮1重量份。
該藥物是優(yōu)選還可以由以下重量份的原料制成的：山青皮1重量份，榿木皮1重量份。
所述的藥物可以制備成片劑、丸劑、散劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、口服液。
所述的藥物采用如下方法制備：
（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入膠囊即得。
所述抗皮膚光老化的藥物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，榿木皮1～2重量份；該藥物采用如下方法制備：
（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入膠囊即得；
其質(zhì)量檢測(cè)方法為：采用高效液相色譜法進(jìn)行左旋表兒茶素的含量測(cè)定：
（1）色譜條件：采用HypersilDs色譜柱；流動(dòng)相：比例為80：20的乙腈-0.05%磷酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：268nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL；
（2）對(duì)照品溶液制備：精密稱取80℃干燥至恒重的左旋表兒茶素對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1mL含0.2mg的對(duì)照品溶液；
（3）供試品溶液的制備：精密稱取本發(fā)明藥物10g，加甲醇40mL，加熱回流4h，提取液回流溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得供試品溶液；
（4）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。
所述抗皮膚光老化的藥物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該藥物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，榿木皮1～2重量份；該藥物采用如下方法制備：
（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入膠囊即得。
其檢測(cè)方法為：采用氣相色譜法對(duì)百里香酚、牻牛兒醛進(jìn)行含量測(cè)定：
（1）色譜條件：色譜柱：DB-1701型毛細(xì)管柱；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；載氣：N2，流量：25mL·mL-1；氫氣流量：45mL·mL-1；空氣流量：450mL·min-1；分流比：7：2；進(jìn)樣口溫度：250℃，檢測(cè)器溫度300℃；程序升溫：初始80℃，每分鐘5℃升至130℃，每分鐘10℃升至200℃，保持3.5min；內(nèi)標(biāo)法；
（2）內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取環(huán)己酮適量，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋制成每1mL含12.5mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液；
（3）供試品溶液的制備：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻；
（4）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取百里香酚對(duì)照品、牻牛兒醛對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋制成含百里香酚0.301mg·mL-1及牻牛兒醛0.901mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用；
（5）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。
一種由山青皮、榿木皮制成的藥物在制備治療痤瘡藥物中的應(yīng)用，該藥物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，榿木皮1～2重量份。
一種由山青皮、榿木皮制成的藥物在制備治療黃褐斑藥物中的應(yīng)用，該藥物是由以下重量份的原料制成的：山青皮1～2重量份，榿木皮1～2重量份。
實(shí)驗(yàn)一：本發(fā)明藥物延緩皮膚光老化的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究
本研究采用紫外線模擬日光照射誘發(fā)小鼠皮膚光老化模型，觀察本發(fā)明藥物對(duì)其皮膚衰老有關(guān)指標(biāo)的影響，為本發(fā)明藥物在延緩皮膚光老化方而的應(yīng)用進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料
1. 1動(dòng)物
昆明種小鼠50只，體重20士2g，雌雄各半，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院實(shí)驗(yàn)物中心提供。
1. 2藥品和試劑
本發(fā)明藥物：處方：山青皮50g，榿木皮50g；
制備方法：（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。
對(duì)比藥物A：處方：山青皮100g；制備方法：取干燥的山青皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物A。
對(duì)比藥物B：處方：榿木皮100g；制備方法：取干燥的榿木皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物B。
對(duì)比藥物C：處方：山青皮50g，榿木皮50g；制備方法：取干燥的山青皮50g，榿木皮50g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物C。
對(duì)比藥物D：處方：山青皮50g，榿木皮50g；制備方法：取干燥的山青皮50g，榿木皮50g，加95％乙醇400mL，回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物D。
SOD測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒、羥脯氨酸測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.3主要儀器
紫外燈管（南京華強(qiáng)電子有限司，80W UVA燈和160W UVB燈）；紫外線強(qiáng)度測(cè)定儀（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，型號(hào)：ZQJ一254型）；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（蘇州江東精密儀器有限公司，型號(hào)：752N）；組織勻漿機(jī)（上海越磁電子科技有限公司，型號(hào)：T10型）。
2 方法
2. 1動(dòng)物分組與給藥
隨機(jī)分為7組：
空白對(duì)照組（即正常組）：不進(jìn)行紫外照射且不給藥；
蒸餾水ig組（模型組）：紫外照射并ig等量蒸餾水；
本發(fā)明藥物組（50mg/kg）：紫外照射并ig本發(fā)明藥物水溶液；
對(duì)比藥物A組（50 mg/kg）：紫外照射并ig對(duì)比藥物A水溶液；
對(duì)比藥物B組（50 mg/kg）：紫外照射并ig對(duì)比藥物B水溶液；
對(duì)比藥物C組（50 mg/kg）：紫外照射并ig對(duì)比藥物C水溶液；
對(duì)比藥物D組（50 mg/kg）：紫外照射并ig對(duì)比藥物D水溶液；
ig組小鼠在進(jìn)行紫外線照射前30min給藥。
2. 2造模
除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠以10% 溶液取背部正中皮膚脫毛，暴露2cm × 2cm大小皮膚。模擬UV照射。照射光源：UVA燈80W，UVB燈160 W。光源在距離小鼠約40cm處進(jìn)行照射。第1周每天照射1次，每次1h，第2周起每天照射2次，每次40min，持續(xù)照射至累計(jì)照射劑量達(dá)到UVA 304. SJ/，UVB 6.3J/。
2. 3取材
第60天末次照射2h后，脫須椎處死小鼠，取脫毛部位皮膚約1，擬作羥脯氨酸含量檢測(cè)；另取脫毛部位皮膚1，以20%福爾馬林溶液固定，擬作成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)；取余脫毛背部皮膚0. 1 g左右，擬作MDA和SOD檢測(cè)。
2. 4成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)
取福爾馬林溶液固定的皮膚組織切片，HE染色，顯微鏡下計(jì)成纖維細(xì)胞數(shù)（以每片計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞，確定其中成纖維細(xì)胞日）。
2. 5羥脯氨酸含量檢測(cè)
精確稱取0. 050g皮膚組織，加入90～100℃水解液中水解40min，離心l0min，取上清液。嚴(yán)格按羥脯氨酸測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)。
2.6MDA、 SOD含量檢測(cè)
以預(yù)冷生理鹽水漂洗所取0. 1g左右的皮膚組織，除去結(jié)締組織和皮下脂肪，濾紙拭干，稱重，將組織剪碎后倒入內(nèi)切式勻漿管中，量取9倍該皮膚組織重量的預(yù)冷生理鹽水，先取少量倒入裝有組織塊勻漿器中，冰水中勻漿15 min，然后倒入剩余生理鹽水，制成10%組織勻漿。將10%組織勻漿以3000r/min離心l0min取上清液備用。嚴(yán)格按MDA、SOD試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)。
2. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析及組間檢驗(yàn)。
3 結(jié)果
3. 1小鼠皮膚一般狀態(tài)
正常組小鼠皮膚表而光滑有彈性，紋理清楚，無(wú)皺紋；
模型組小鼠皮膚表而有明顯紅斑，失去彈性和光澤，表皮角化、粗糙伴脫屑，有深的褶皺；
本發(fā)明藥物量組小鼠皮膚皺紋已不明顯，無(wú)明顯紅斑，紋理清楚，無(wú)皺紋，無(wú)脫屑，已接近正常組小鼠皮膚；
對(duì)比藥物A組小鼠皮膚上述表現(xiàn)較模型組有良性逆轉(zhuǎn)，紅斑減少，局部皮膚凹凸不平，有脫屑，有皺紋；
對(duì)比藥物B組小鼠皮膚上述表現(xiàn)較模型組有良性逆轉(zhuǎn)，紅斑減少，局部皮膚凹凸不平，有脫屑，有皺紋。
對(duì)比藥物C組小鼠皮膚上述表現(xiàn)較模型組有良性逆轉(zhuǎn)，紅斑減少，局部皮膚凹凸不平，有脫屑，有皺紋；
對(duì)比藥物D組小鼠皮膚上述表現(xiàn)較模型組有良性逆轉(zhuǎn)，紅斑減少，局部皮膚凹凸不平，有脫屑，有皺紋。
3. 2本發(fā)明藥物對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)目的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-1。與正常組比較，模型組皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P<0. 01）。本發(fā)明藥物組與模型組相比，皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)明顯升高，有顯著性差異（P < 0. 05）；對(duì)比藥物A組和對(duì)比藥物B組，與模型組相比，皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)沒(méi)有升高；對(duì)比藥物C組和對(duì)比藥物D組，與模型組相比，皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)略有升高，但無(wú)顯著性差異。
3. 3本發(fā)明藥物對(duì)小鼠皮膚SOD、MDA的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-1。與正常組比較，模型組皮膚SOD活性顯著降低（P <0.01），MDA水平顯著升高（P<0.01）。本發(fā)明藥物組與模型組相比，皮膚SOD活性均明顯升高（分別P <0.01）、MDA含量顯著降低（P <0.01）；對(duì)比藥物A組和對(duì)比藥物B組，與模型組相比，皮膚SOD活性略幾乎沒(méi)有升高，MDA含量幾乎沒(méi)有降低；對(duì)比藥物C組和對(duì)比藥物D組，與模型組相比，皮膚SOD活性略有升高，但不明顯，MDA含量略有降低，但無(wú)顯著性差異。
3. 4本發(fā)明藥物對(duì)小鼠皮膚羥脯氨酸含量的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-1。與正常組比較，模型組皮膚羥脯氨酸含量顯著下降（P<0. 01）。本發(fā)明藥物組與模型組相比，皮膚羥脯氨酸含量明顯升高（P <0.05）；對(duì)比藥物A組和對(duì)比藥物B組，與模型組相比，皮膚羥脯氨酸含量幾乎沒(méi)有升高；對(duì)比藥物C組和對(duì)比藥物D組，與模型組相比，皮膚羥脯氨酸含量略有升高，但無(wú)顯著性差異。
表1-1 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞數(shù)目、SOD、MDA、羥脯氨酸含量影響（±s，n=10）
注:與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01
4討論與結(jié)論
在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)眾多衰老學(xué)說(shuō)中，衰老的自由基學(xué)說(shuō)已受到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)同。皮膚老化是機(jī)體衰老的一部分，大量的研究證明自由基的積累損傷是皮膚組織老化的重要原因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，本發(fā)明藥物可明顯增強(qiáng)光老化小鼠皮膚組織SOD活性，降低MDA含量，表明本發(fā)明藥物可增強(qiáng)皮膚組織的抗氧化能力，降低皮膚組織自由基含量，使自由基對(duì)成纖維細(xì)胞損害減輕，發(fā)揮延緩皮膚光老化的作用。
特別是，本發(fā)明藥物的作用效果明顯優(yōu)于對(duì)比藥物A、對(duì)比藥物B、對(duì)比藥物C、對(duì)比藥物D，說(shuō)明本發(fā)明藥物中兩種藥味之間的配伍精良，缺一不可，并且在特定的制備方法下，兩種藥味之間的組合產(chǎn)生了明顯的協(xié)同增效作用，產(chǎn)生了一加一大于二的技術(shù)效果。
實(shí)驗(yàn)二：高效液相色譜法測(cè)定本發(fā)明藥物中左旋表兒茶素的含量
1儀器與試藥
1.1儀器
高效液相色譜儀（Agilent110高效液相色譜儀及工作站，G1311Aquat泵，G1314紫外檢測(cè)器）。
1.2試藥
左旋表兒茶素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院）；本發(fā)明中藥組合物；中藥材（哈藥集團(tuán)人民同泰藥店提供）；甲醇（色譜醇，上海生化工助劑廠）；其他試劑為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1處方
山青皮500g，榿木皮500g。
2.2 制備方法：
（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。
2.3 左旋表兒茶素的含量測(cè)定
2.3.1 HPLC色譜條件
采用HypersilDs（4.0mm×125mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：比例為80：20的乙腈-0.05%磷酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：268nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL；在該色譜條件下，對(duì)照品及樣品色譜峰良好，無(wú)山青皮陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。
2.3.2對(duì)照品溶液的制備
精密稱取80℃干燥至恒重的左旋表兒茶素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液。
2.3.3供試品溶液與陰性對(duì)照液的制備
精密稱取本發(fā)明藥物10g，加甲醇40mL，加熱回流4h，提取液回流溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取濾液即得；另按處方比例制備不含榿木皮的陰性對(duì)照品，同法制成陰性對(duì)照液。
2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取80℃干燥至恒重的左旋表兒茶素對(duì)照品適量，用甲醇制成10.4，20.8，41.6，83.2，166.4μgmL-1系列濃度的溶液，分別精密量取上述5種濃度溶液各10μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。
以峰面積比值與濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A=21.2763C-0.1391，r=0.9999。表明左旋表兒茶素在10.4～166.4μgmL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取供試品溶液10μL，分別于0、1、2、4、8h進(jìn)樣，并計(jì)算左旋表兒茶素含量。結(jié)果8h內(nèi)RSD為0.45%（n=5）。表明樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.6重復(fù)性試驗(yàn)
按供試品溶液制備方法平行處理樣品5份，依法測(cè)定左旋表兒茶素含量并計(jì)算。結(jié)果測(cè)得左旋表兒茶素平均含量為0.12mg·g-1，RSD為1.3%。
2.3.7精密度實(shí)驗(yàn)
精密吸取左旋表兒茶素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，依法測(cè)定峰面積。結(jié)果RSD為0.23%（n=5）。表明精密度較好。
2.3.8回收率實(shí)驗(yàn)
精密稱取已知左旋表兒茶素含量的同一批號(hào)的樣品6份，按高、中、低濃度分別精密加入適量的左旋表兒茶素對(duì)照品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)下操作，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為100.3%，RSD為0.45%（n=5）。
2.3.9樣品含量測(cè)定
分別量取對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，用微孔濾膜濾過(guò)，各進(jìn)樣10μL，按上述色譜條件測(cè)定3批樣品，平行測(cè)定5次。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品溶液左旋表兒茶素的含量。本品含左旋表兒茶素應(yīng)為標(biāo)示含量的95%～105%，以每1g樣品含左旋表兒茶素計(jì)，不得少于0.12mg。3批樣品含量分別為100.8%（RSD=1.2%），101.7%（RSD=1.3%），99.2%（RSD=1.1%）。
實(shí)驗(yàn)三：不同藥物中左旋表兒茶素的含量測(cè)定
1 待測(cè)樣品
1.1 本發(fā)明藥物：處方：山青皮50g，榿木皮50g；
制備方法：（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。
1.2 對(duì)比藥物A：處方：山青皮100g；制備方法：取干燥的山青皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物A。
1.3 對(duì)比藥物B：處方：榿木皮100g；制備方法：取干燥的榿木皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物B。
1.4 對(duì)比藥物C：處方：山青皮50g，榿木皮50g；制備方法：取干燥的山青皮50g，榿木皮50g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物C。
1.5 對(duì)比藥物D：處方：山青皮50g，榿木皮50g；制備方法：取干燥的山青皮50g，榿木皮50g，加95％乙醇400mL，回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物D。
2 測(cè)定方法
采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)二提供的高效液相色譜法測(cè)定各個(gè)藥物中的左旋表兒茶素的含量。
3 測(cè)定結(jié)果
測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3-1
3-1 樣品含量測(cè)定結(jié)果
4 討論與結(jié)論
從表3-1中可以看出，本發(fā)明藥物中的左旋表兒茶素的含量明顯高于其他藥物，這可能也是本發(fā)明藥物在治療皮膚光老化方面的效果優(yōu)于其他藥物的原因。
實(shí)驗(yàn)四：氣相色譜法同步測(cè)定本發(fā)明藥物中百里香酚、牻牛兒醛的含量
1儀器與試藥
Agilent7890N氣相色譜儀：FID檢測(cè)器，A.01.12.1色譜工作站；SGH－300高純氫氣發(fā)生器（北京東方精華科技苑科技有限公司）；色譜柱彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；梅特勒－托利多十萬(wàn)分之一電子分析天平；百里香酚對(duì)照品（含量99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；牻牛兒醛對(duì)照品（含量99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；本發(fā)明藥物（參照本發(fā)明說(shuō)明書(shū)具體實(shí)施方式中的實(shí)施例1制備），試劑：環(huán)己酮，無(wú)水乙醇均為色譜純。
2色譜條件
色譜柱：DB-1701型毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.32μm）；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），載氣：N2，流量：25mL·mL-1；氫氣流量：45mL·mL-1；空氣流量：450mL·min-1；分流比：7：2；進(jìn)樣口溫度：250℃，檢測(cè)器溫度300℃；程序升溫：初始80℃，每分鐘5℃升至130℃，每分鐘10℃升至200℃，保持3.5min；內(nèi)標(biāo)法。
3試驗(yàn)方法與結(jié)果
3.1內(nèi)標(biāo)溶液的制備
取環(huán)己酮適量，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋制成每1g含12.5mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。
3.2供試品溶液的制備
精密量取本品1.0g，置10mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。
3.3對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備
精密稱取百里香酚對(duì)照品、牻牛兒醛對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋制成含百里香酚0.301mg·mL-1及牻牛兒醛0.901mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用；
3.4陰性對(duì)照溶液的制備
取按處方中未加百里香酚與牻牛兒醛的空白溶液，按“3.2”項(xiàng)下制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。
3.5線性關(guān)系的考察
分別精密移取0.2、0.5、1.0、1.5、3.5mL對(duì)照品儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，分別取1μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以百里香酚、牻牛兒醛與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（C）為橫坐標(biāo)（X），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為：Y（百里香酚）=1.1148X－0.0016，R2=0.9999，百里香酚濃度在0.144～2.552mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；Y（牻牛兒醛）=1.1347X+0.0035，R2=0.9999，牻牛兒醛濃度在0.195～3.466mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。
3.6精密度試驗(yàn)
取百里香酚濃度為0.230mg·mL-1和牻牛兒醛濃度為0.290mg·mL-1的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算2種成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（A/A內(nèi)標(biāo)），百里香酚、牻牛兒醛的RSD分別為0.22%和1.3%（n=6）。
3.7重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批樣品，按樣品測(cè)定項(xiàng)下的方法重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果百里香酚、牻牛兒醛的RSD分別為0.33%、1.6%（n=6）。
3.8穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一批樣品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12h后測(cè)定，結(jié)果按百里香酚、牻牛兒醛的RSD分別為0.38%、0.35%，說(shuō)明樣品溶液在12h內(nèi)測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定。
3.9加樣回收率試驗(yàn)
取已知含量的樣品溶液9份，并加入適當(dāng)?shù)牡?、中、高?duì)照品溶液，按樣品測(cè)定法測(cè)定百里香酚、牻牛兒醛含量，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4-1。
表4-1 回收率測(cè)定結(jié)果（n=9，%）
結(jié)果表明，本方法的回收率較好，百里香酚的回收率分別在99.4%～100.2%，牻牛兒醛的回收率在98.1%～100.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.28%與0.86%，本測(cè)定方法能滿足本發(fā)明藥物中百里香酚與牻牛兒醛的含量測(cè)定。
3.10定量限與檢測(cè)限
采用“信噪比法”來(lái)確定本研究的定量限和檢測(cè)限，取線性標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，采用加無(wú)水乙醇逐步稀釋法進(jìn)行稀釋，當(dāng)進(jìn)樣濃度為6.27、9.90μg·mL-1時(shí)，取1μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣3次，得到百里香酚、內(nèi)標(biāo)、牻牛兒醛信噪比平均值分別接近10.0，可以以此濃度為定量限；繼續(xù)稀釋進(jìn)樣，當(dāng)進(jìn)樣濃度為1.044、1.65μg·mL-1，連續(xù)進(jìn)樣3次，得到百里香酚、內(nèi)標(biāo)、牻牛兒醛信噪比平均值接近3.0，可以以此濃度為檢測(cè)限。
3.11耐用性試驗(yàn)
經(jīng)不同色譜柱考察和溶液穩(wěn)定性考察，以及柱溫，進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度考察，表明本方法耐用性良好，適用于本發(fā)明藥物中兩組分的含量測(cè)定。
3.11.1色譜柱的影響
選用3根不同商品規(guī)格的色譜柱，測(cè)定同一批樣品的含量，計(jì)算含量值的RSD%分別為1.3、1.7、1.6。結(jié)果表明，樣品用不同的PEG色譜柱測(cè)定含量，百里香酚、牻牛兒醛與內(nèi)標(biāo)均可有效分離，說(shuō)明方法耐用性良好。
3.11.2柱溫的影響
柱溫對(duì)分離的影響主要為影響主峰的出峰時(shí)間，溫度越高，主峰出峰時(shí)間越短，在第一階段為80℃時(shí)，百里香酚主峰百里香酚與雜質(zhì)峰能保證基線分離，第二階段130℃時(shí)牻牛兒醛主峰與雜質(zhì)峰能保證基線分離，且各溫度下含量的RSD小于2.0%。
3.11.3進(jìn)樣口溫度的影響
進(jìn)樣口溫度高于柱溫時(shí)，百里香酚與雜質(zhì)峰能夠保證基線分離，牻牛兒醛與雜質(zhì)分離良好，且各溫度下含量的RSD小于2.0%。
3.11.4檢測(cè)器溫度的影響
檢測(cè)器溫度高于進(jìn)樣口溫度時(shí)，百里香酚與雜質(zhì)峰能夠保證基線分離，牻牛兒醛與雜質(zhì)分離良好，且各溫度下含量的RSD小于2.0%。
3.12樣品含量測(cè)定結(jié)果
經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，本含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，能更有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。因此應(yīng)用該方法對(duì)10批樣品，按照前述方法采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4-2。
表4-2 樣品含量測(cè)定結(jié)果
4討論
4.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)
在本試驗(yàn)氣相色譜系統(tǒng)下，分別吸取樣品測(cè)定用混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液各1μL，記錄色譜圖。2種組分與內(nèi)標(biāo)物均能夠較好地分離，陰性無(wú)干擾。該系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果見(jiàn)表4-3。
表4-3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)
4.2內(nèi)標(biāo)物的選擇
曾試用過(guò)環(huán)己酮、萘、聯(lián)苯、水楊酸甲酯等，因樣品揮發(fā)性成分多，結(jié)果以環(huán)己酮的保留時(shí)間及分離效果最合適。
4.3柱溫的選擇
百里香酚、環(huán)己酮和牻牛兒醛的沸點(diǎn)相差比較大，柱溫低時(shí)，牻牛兒醛的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，柱溫高時(shí)，百里香酚與雜質(zhì)不能有效分離，經(jīng)采用兩段程序升溫方式能滿足兩種成分的同時(shí)分析。
4.4本品的含量限度
由10批次產(chǎn)品測(cè)定結(jié)果，暫定本品的含量限度為：本品每1g含百里香酚不得少于0.200mg，含牻牛兒醛不得少于0.200mg。
本方法對(duì)2種成分同時(shí)進(jìn)行分離與檢測(cè)，方法快速、靈敏，分離度好、專屬性好，能有效地控制藥品質(zhì)量。
實(shí)驗(yàn)五：不同藥物中百里香酚、牻牛兒醛的含量測(cè)定
1 待測(cè)樣品
1.1 本發(fā)明藥物：處方：山青皮50g，榿木皮50g；
制備方法：（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。
1.2 對(duì)比藥物A：處方：山青皮100g；制備方法：取干燥的山青皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物A。
1.3 對(duì)比藥物B：處方：榿木皮100g；制備方法：取干燥的榿木皮100g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物B。
1.4 對(duì)比藥物C：處方：山青皮50g，榿木皮50g；制備方法：取干燥的山青皮50g，榿木皮50g，加水500mL，煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物C。
1.5 對(duì)比藥物D：處方：山青皮50g，榿木皮50g；制備方法：取干燥的山青皮50g，榿木皮50g，加95％乙醇400mL，回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液，干燥，得對(duì)比藥物D。
2 測(cè)定方法
采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)四提供的氣相色譜法同步測(cè)定百里香酚、牻牛兒醛的含量的方法，進(jìn)行測(cè)定。
3 測(cè)定結(jié)果
測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5-1
5-1 樣品含量測(cè)定結(jié)果
4 討論與結(jié)論
從表5-1中可以看出，本發(fā)明藥物中的百里香酚、牻牛兒醛的含量明顯高于其他藥物，這可能也是本發(fā)明藥物在治療皮膚光老化方面的效果優(yōu)于其他藥物的原因。
實(shí)驗(yàn)六：本發(fā)明藥物治療皮膚光老化療效觀察
目前激光和強(qiáng)脈光治療新進(jìn)展、療效方面的文獻(xiàn)較多，而療效維持的時(shí)效、延緩反彈方面的報(bào)道卻較很少。通過(guò)臨床觀察，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對(duì)于皮膚光老化經(jīng)過(guò)激光和強(qiáng)脈光治療治療后，面臨反彈的問(wèn)題，主要表現(xiàn)為色素沉著。2014年6月～2014年12月，發(fā)明人采用口服本發(fā)明藥物治療光老化患者，取得了較好效果。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
共16例光老化患者，其中女15例，男1例，年齡35～45歲。臨床表現(xiàn)有面部皮膚粗糙、彈性差、色素沉著、黃褐斑、老年斑等。
入選患者均符合以下條件：①無(wú)光敏性皮炎病史；②近1個(gè)月未服用光敏性藥物；③治療前無(wú)陽(yáng)光暴曬史；④近1個(gè)月未使用祛斑產(chǎn)品；⑤無(wú)免疫缺陷及凝血障礙方面的疾??；⑥均同意治療期、觀察期注意防曬；⑦簽署知情同意書(shū)。
1.2 方法
將患者隨機(jī)分為2組：
Ⅰ組（口服本發(fā)明藥物）：8例，本發(fā)明藥物，參照說(shuō)明書(shū)實(shí)施例2制備，2片/次，2次/天，30天為一個(gè)療程，連續(xù)4個(gè)療程；
Ⅱ組（強(qiáng)脈沖光系統(tǒng)或調(diào)Q、像素激光）：8例，根據(jù)個(gè)體面部皮膚光老化的情況選擇強(qiáng)脈沖光590nm或者1064nm、532nm調(diào)Q雙波長(zhǎng)激光、2940nm像素激光并選擇相應(yīng)的能量進(jìn)行治療，2次治療間隔22～25天，5次為一個(gè)療程。
1.3療效評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)
描述性評(píng)分方法參考Glogau（Glogau RG. Physiologic and structural changes associated with aging shin [J].DermatolClin,1997,15：555-559.），圖像分析法是在Chung（Chung JH,Lee SH,Youn CS,et al.Cutaneous photodamage in Koreans：influence of sex,sun-exposure,smoking and skin color[J].Arch Dermatol,2001,137：1043-1051）、Larnier（Larnier C, Ortonne JP,Venot A, etal. Evaluation of cutaneous photodamage using a photographic scale[J].Br J Dermatol,1994,130：167-173.）、Lever（Lever L, Kumar P, Marks R.Topical retinoic acid fortreatment of solar damage[J].Br J Dermatol,1990,122：91-98）、Watson（Watson RE,Griffiths CE.Pathogenic aspects of cutaneous photoaging
[J].J Cosmet Dermatol,2005,4：230-236.）等的評(píng)價(jià)方法基礎(chǔ)上略加改進(jìn)。
1.3.1 療效標(biāo)準(zhǔn)
顯效：治療前后面部皮膚光老化評(píng)分減輕2個(gè)等級(jí)或者減輕跨2個(gè)分值（如從5分→3分或以下）；
有效：治療前后面部皮膚光老化評(píng)分減輕1個(gè)等級(jí)或者減輕跨1個(gè)分值（如從3分→2分）；
無(wú)效：治療前后面部皮膚光老化評(píng)價(jià)減輕低于1個(gè)等級(jí)或者幾乎沒(méi)變化。
1.3.2 每位觀察者治療前拍面部正位、側(cè)位片，用描述性評(píng)價(jià)法結(jié)合評(píng)價(jià)圖像分析評(píng)分法進(jìn)行面部皮膚光老化評(píng)價(jià)；Ⅰ組每月評(píng)價(jià)一次，Ⅱ組每次激光治療前評(píng)價(jià)一次；治療結(jié)束后，均在第6、12、18個(gè)月隨訪一次，拍照并進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2 結(jié)果
共有16例患者，治療4個(gè)月后療效統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表6-1，各組反彈情況見(jiàn)表6-2。
表6-1 治療4個(gè)月后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組療效統(tǒng)計(jì)（例，%）
經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示，Ⅰ組療效優(yōu)于Ⅱ組，P＜0.005；
表6-2 各組6、12、18個(gè)月反彈情況（例）
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示，第6個(gè)月的反彈例數(shù)，2組之間無(wú)差異，P＞0.05；在第12個(gè)月、第18個(gè)月時(shí)，Ⅰ組與Ⅱ組（P＜0.05），反彈例數(shù)有差異，Ⅰ組反彈例數(shù)低于Ⅱ組（P＜0.05）。
3結(jié)論
口服本發(fā)明藥物治療皮膚光老化，效果好、安全可靠。效果優(yōu)于激光、強(qiáng)脈沖光治療，特別是在降低反彈率和推遲反彈時(shí)間上有明顯優(yōu)勢(shì)。
實(shí)驗(yàn)七：本發(fā)明藥物治療痤瘡的實(shí)驗(yàn)研究
本發(fā)明藥物對(duì)皮膚光老化有非常好的治療效果，研究人員預(yù)測(cè)，本發(fā)明藥物對(duì)痤瘡也應(yīng)該具有一定的治療效果，于是便開(kāi)展了嘗試性實(shí)驗(yàn)研究，觀察本發(fā)明藥物對(duì)痤瘡的治療效果。
1實(shí)驗(yàn)材料
1.1動(dòng)物
雄性金黃地鼠，重（100±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，微生物控制為清潔級(jí)。
1.2藥物
本發(fā)明藥物：本發(fā)明藥物：處方：山青皮50g，榿木皮50g；
制備方法：（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。制成0.200g/mL濃度的本發(fā)明藥物溶液備用。
對(duì)照組：清熱暗瘡片（廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z44020578），主要成分：穿心蓮浸膏、人工牛黃、金銀花、蒲公英浸膏、大黃浸膏、山蘭根浸膏、桅子浸膏、珍珠層粉、甘草。制成0.200g/mL濃度的清熱暗瘡片溶液備用。
模型組：生理鹽水。
1.3主要儀器及試劑
LD4-2型高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、GC-1200C放射免疫計(jì)數(shù)器（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司中佳光電儀器分公司）、脫水機(jī)、生物組織自動(dòng)包埋機(jī)、攤片機(jī)、切片機(jī)。睪酮（T）、雌二醇（E2）試劑盒均由中美合資天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司提供。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1動(dòng)物分組
雄性金黃地鼠飼養(yǎng)3天，無(wú)不良反應(yīng)，飲食、飲水、活動(dòng)正常者納入實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成3組：模型組、清熱暗瘡片組、本發(fā)明藥物組，每組各10只。
2.2動(dòng)物給藥
飼養(yǎng)3天后開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)灌胃30天，各組金黃地鼠分別按以下方案給藥：模型組：以生理鹽水灌胃，2mL/天；清熱暗瘡片組：以0.200g/mL濃度的清熱暗瘡片溶液灌胃，2mL/天；本發(fā)明藥物組以0.800g/mL濃度的本發(fā)明藥物溶液灌胃，2mL/天。
2.3模型
以金黃地鼠側(cè)腹部皮脂腺斑作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>
2.4標(biāo)本采集
于實(shí)驗(yàn)第34天取材，取材前禁食，自由飲水，24h后，用摘除眼球法采血3~5mL滴入試管，分離血清送檢。采血后脫頸椎處死動(dòng)物，在強(qiáng)光照射下，用游標(biāo)卡尺測(cè)量右側(cè)斑塊的最大橫徑和最大縱徑。立即取下金黃地鼠側(cè)腹部皮脂腺斑組織，切取約1cm×1cm組織塊以10%甲醛固定液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，于光鏡下觀察皮脂腺斑的組織學(xué)改變。
2.5指標(biāo)觀測(cè)及方法
2.5.1一般情況
每日觀察記錄金黃地鼠的飲食、飲水、大小便、精神狀況及活動(dòng)度。
2.5.2測(cè)量皮脂腺斑的大小
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)先用電動(dòng)剃須刀剃盡金黃地鼠背部毛，將地鼠用乙醚麻醉后，在強(qiáng)光照射下，用游標(biāo)卡尺測(cè)量右側(cè)斑塊的最大橫徑和最大縱徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)再次將鼠毛剃盡，用同樣的方法、在同樣的部位測(cè)量右側(cè)斑塊的最大橫徑和最大縱徑。
2.5.3血清睪酮（T）的測(cè)定
將所取鼠血4℃、3000r/min離心10min，分離血清送檢，采用雙抗體放射免疫法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院同位素室協(xié)助完成。
2.5.4血清雌二醇（E2）的測(cè)定
將所取鼠血4℃、3000r/min離心10min，分離血清送檢，采用液相平衡競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院同位素室協(xié)助完成。
2.5.5觀察皮脂腺斑顯微結(jié)構(gòu)的變化
將10%甲醛固定液中的皮脂腺斑組織固定脫水后，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色后，光鏡下觀察皮脂腺班的顯微結(jié)構(gòu)。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科協(xié)助完成。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1對(duì)金黃地鼠皮脂腺斑大小的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用藥前，各組動(dòng)物皮脂腺斑大小經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各組之間具有可比性；用藥后，本發(fā)明藥物組與模型組之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。見(jiàn)表7-1。
表7-1 對(duì)金黃地鼠皮脂腺斑大小的影響（mm2，±s）
注：與模型組比較，*P<0.05。
3.2對(duì)金黃地鼠血清睪酮水平的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：用藥后睪酮水平比較，本發(fā)明藥物組與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。見(jiàn)表7-2。
表7-2治療后各組金黃地鼠血清睪酮（T）水平的比較（±s）
注：與模型組比較，*P<0.05。
3.3本發(fā)明藥物對(duì)金黃地鼠血清雌二醇水平的影響
用藥后，雌二醇水平比較，本發(fā)明藥物組與模型組之間沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。見(jiàn)表7-3。
表7-3治療后各組金黃地鼠血清雌二醇（E2）水平的比較（±s）
注：與模型組比較，*P<0.05。
4 結(jié)論
以金黃地鼠側(cè)腹部皮脂腺斑作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察本發(fā)明藥物對(duì)皮脂腺斑、血清激素的影響，結(jié)果表明，本發(fā)明藥物不能縮小皮脂腺斑、不能使皮脂腺變薄，不能降低血清睪酮、也不能提高血清雌二醇水平。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)初步了解本發(fā)明藥物不能治療痤瘡，對(duì)治療痤瘡無(wú)效。
具體實(shí)施方式：
實(shí)施例1：本發(fā)明藥物
處方：山青皮50g，榿木皮50g
制備方法：
（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，即得。
實(shí)施例2：本發(fā)明藥物硬膠囊劑
藥物處方：山青皮500g，榿木皮500g
制備方法：
（1）取山青皮、榿木皮，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油提取物Ⅰ，備用；
（2）將山青皮、榿木皮水蒸氣蒸餾提取后的水溶液過(guò)濾，得蒸餾后的水溶液，加熱濃縮，得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ，備用；保留水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，備用；
（3）取步驟（2）所得水蒸氣蒸餾提取后的藥渣Ⅲ，向其中加4倍量的95％乙醇回流提取3次，每次回流提取2小時(shí)，合并乙醇提取液，濾過(guò)，得乙醇提取液，回收乙醇并濃縮，得乙醇提取濃縮液Ⅳ，備用；保留乙醇提取后的藥渣Ⅴ，備用；
（4）將步驟（3）所得乙醇提取后的藥渣Ⅴ加5倍量水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并水提取液，濾過(guò)，得水提取液，加熱濃縮，得水提取濃縮液Ⅵ；
（5）將步驟（3）所得混合乙醇提取濃縮液Ⅳ、步驟（4）所得水提取濃縮液Ⅵ、步驟（2）所得蒸餾后的水濃縮液Ⅱ合并，混勻，干燥，粉碎，再加入步驟（1）所得揮發(fā)油提取物Ⅰ，混勻，裝入硬膠囊，制成1000粒。
采用高效液相色譜法對(duì)左旋表兒茶素進(jìn)行含量測(cè)定：
（1）色譜條件：采用HypersilDs色譜柱；流動(dòng)相：比例為80：20的乙腈-0.05%磷酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：268nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL；
（2）對(duì)照品溶液制備：精密稱取80℃干燥至恒重的左旋表兒茶素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液；
（3）供試品溶液的制備：精密稱取本發(fā)明藥物10g，加甲醇40mL，加熱回流4h，提取液回流溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次15mL，正丁醇提取液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得供試品溶液；
（4）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為左旋表兒茶素的含量為0.1823mg/g。
采用氣相色譜法對(duì)百里香酚、牻牛兒醛進(jìn)行含量測(cè)定：
（1）色譜條件：色譜柱：DB-1701型毛細(xì)管柱；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；載氣：N2，流量，1.0mL·mL-1；氫氣流量：45mL·mL-1；空氣流量：450mL·min-1；分流比：7：2；進(jìn)樣口溫度：250℃，檢測(cè)器溫度300℃；程序升溫：初始80℃，每分鐘5℃升至130℃，每分鐘10℃升至200℃，保持3.5min；內(nèi)標(biāo)法；
（2）內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取環(huán)己酮適量，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋制成每1mL含12.5mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液；
（3）供試品溶液的制備：精密量取本品1.0mL，置10mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，再精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0mL，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻；
（4）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取百里香酚對(duì)照品、牻牛兒醛對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋制成含百里香酚0.301mg·mL-1及牻牛兒醛0.901mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用；
（5）測(cè)定：分別精密量取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。
（6）測(cè)定結(jié)果：本品每1g含百里香酚為0.225mg，含牻牛兒醛為0.231mg。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。