本發(fā)明涉及雌激素受體抑制劑在制備治療缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：缺血性疾病是由于血管損傷、血管堵塞等原因造成組織細胞供血量不足的外周血管疾病的一種。由于血液是為組織和細胞提供氧氣、營養(yǎng)等對生命至關(guān)重要的物質(zhì)的介質(zhì)，供血量不足使得組織和細胞缺氧、缺營養(yǎng)，導(dǎo)致組織和細胞的壞死。對于機體而言，組織和細胞的壞死帶來巨大的痛苦，壞死面積大的患者需要切除壞死部位，大大降低了患者的生活質(zhì)量；壞死嚴重甚至能導(dǎo)致機體的死亡。對于缺血性疾病，目前被認為有望起到良好效果的治療方法之一是通過促進血管新生，改善供血狀況，從而阻止細胞和組織繼續(xù)壞死并起到改善它們的功能的作用。以下肢缺血性疾病為例，作為下肢缺血性疾病的藥物，目前有第一代治療藥物和第二代治療藥物。其中，第一代治療藥物利用的是單個血管新生因子(血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)等)，但臨床試驗結(jié)果不理想，新生血管不成熟，出現(xiàn)漏的情況，缺乏功能性(參見非專利文獻1)。治療結(jié)果不理想的原因被認為是由于血管重構(gòu)是個多因子參與的復(fù)雜的過程。第二代治療藥物則利用了多種血管新生因子的組合(成纖維細胞生長因子2(Fibroblastgrowthfactor2，F(xiàn)GF2)和血小板衍生因子(Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)；VEGF和血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG1)，雖然有一定的效果，然而血管新生因子種類繁多，它們在血管重構(gòu)的不同的階段起到不同的作用。因此，存在著血管新生因子種類的選擇、組合時的比率、何時給藥等難題。另外，目前對下肢缺血性疾病的治療手段還面臨外來血管新生因子的局部化，因此不足以在廣泛的缺血區(qū)域內(nèi)誘導(dǎo)足夠的新生成熟血管的難題。血管新生能力的個體差異較大，但可以肯定的是對于較嚴重的缺血疾病患者，機體本身的修復(fù)能力是不足以補償血管的損傷。另外，組織細胞所處的環(huán)境對血管新生能力的影響也非常關(guān)鍵。比如，糖尿病患者的組織修復(fù)能力，包括血管新生能力差，更加無法有效誘導(dǎo)血管新生。高糖條件使得血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等嚴重受損；另外，由于高糖條件這個特殊環(huán)境，各種血管新生因子(VEGF等)以及它們的受體(VEGFR等)、血小板衍生因子-BB(Platelet-derivedgrowthfactor-BBPDGF-BB)等血管新生因子的表達異常降低，而這些因子在血管重構(gòu)中起到重要作用。更為重要的是，在高血糖這種獨特的病理環(huán)境條件下，很多正常生理狀態(tài)下能夠促進血管新生的方法，在高糖條件下失去效果。即，機體在高糖條件下的響應(yīng)水平下降。例如，糖尿病人的組織/細胞缺失了細胞對低氧環(huán)境的應(yīng)激能力。這些原因?qū)е卢F(xiàn)有的血管新生治療方法無法起到有效效果。促進血管重構(gòu)等血管新生治療被認為是有效的治療方法，但目前有效的促進血管新生，達到血流回復(fù)仍是個難題?，F(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻1：Therapeuticangiogenesisforcriticallimbischaemia.NatureReviewsCardiology201310(7):387-96非專利文獻2：DiabetesMellitusandIschemicDiseases:MolecularMechanismsofVascularRepairDysfunction.ArteriosclerosisThrombosisandVascularBiology201434(6):1126-1135.技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的問題現(xiàn)狀是，目前迫切需要一種能在廣泛的缺血區(qū)域內(nèi)起作用，并同時調(diào)控多種血管新生因子和參與成熟血管重構(gòu)的多種體內(nèi)通路的藥物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雌激素受體抑制劑在制備治療缺血性疾病方面展現(xiàn)了積極的效果，而且這種效果在高糖的生理條件下也有效。解決問題的手段本申請的發(fā)明人等關(guān)注骨骼肌細胞，因為骨骼肌是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官，可以分泌各種血管新生因子。經(jīng)過廣泛深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞內(nèi)的雌激素受體(以下有時將其簡稱為“ERα”)的抑制劑對于治療缺血性疾病有良好的效果。本發(fā)明涉及雌激素受體抑制劑在制備治療缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述治療缺血性疾病的藥物為促進血管新生的藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述促進血管新生藥物為促進骨骼肌細胞分泌血管新生因子的藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述促進血管新生藥物為促進骨骼肌細胞遷移的藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述促進血管新生藥物為促進骨骼肌細胞增殖的藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述促進血管新生藥物為促進血管組成細胞遷移的藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述血管組成細胞包括血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述治療缺血性疾病的藥物為在高糖條件下促進血管新生的藥物。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述雌激素受體抑制劑包括選自他莫昔芬(Tamoxifene)、氟維司瓊(Fulvestrant)、鹽酸雷洛昔芬(Raloxifenehydrochloride)、拉索昔芬(Lasofoxifene)、酒石酸拉索昔芬(Lasofoxifenetartrate)、阿非昔芬(Afimoxifene)、吲哚昔芬(Idoxifene)、米普昔芬(Miproxifene)、阿佐昔芬(Arzoxifene)、阿佐昔芬鹽酸鹽(Arzoxifenehydrochloride)、克羅米酚(Clomiphene)、AZD9496((E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸)、阿克比芬(Acolbifene)、巴多昔芬(Bazedoxifene)、萘福昔定(Nafoxidine)、萘福昔鹽酸定(Nafoxidinehydrochloride)、枸櫞酸硝滅芬(Nitromifenecytrate)、奧培米芬(Ospemifene)、帕諾米芬(Panomifene)、比本哚昔芬(Pipendoxifene)、希比芬(Sivifene)、替米麗芬(Tesmilifene)、托瑞米芬(Toremifene)、三對甲氧苯氯乙烯(Chlorotrianisene)及其衍生物中的一種或多種(以下有時將它們稱為“ERα小分子抑制劑”)、以及雌激素受體基因沉默劑(以下有時稱為“ERα基因沉默劑”)。以下有時將ERα小分子抑制劑和ERα基因沉默劑統(tǒng)稱為“ERα抑制劑”)。本發(fā)明還涉及一種治療缺血性疾病的組合物，其特征在于，含有雌激素受體抑制劑。本發(fā)明還涉及一種治療缺血性疾病的藥物，其特征在于，含有雌激素受體抑制劑。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，對于促進血管新生有良好的效果的效果，進一步地對于治療缺血性疾病有良好。根據(jù)本發(fā)明，能夠促進骨骼肌細胞表達血管新生因子、促進骨骼肌細胞遷移和增殖、能夠促進血管組成細胞(例如，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等)遷移。根據(jù)本發(fā)明，能夠促進如下肢、腦、心臟等的缺血組織的血流恢復(fù)。另外，本發(fā)明即使在高糖條件下同樣能夠取得上述優(yōu)異的效果。附圖說明圖1為表示葡萄糖濃度對ERα表達量的影響的圖。圖2為表示葡萄糖濃度對血管新生因子表達量的影響的圖。圖3為表示ERα基因沉默劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響的圖。圖4為表示氟維司瓊對骨骼肌細胞血管新生因子的影響的圖。圖5為表示他莫西芬對骨骼肌細胞血管新生因子的影響的圖。圖6為表示鹽酸雷洛西芬對骨骼肌細胞血管新生因子的影響的圖。圖7為表示酒石酸拉索昔芬對骨骼肌細胞血管新生因子的影響的圖。圖8為表示ERα抑制劑對骨骼肌細胞遷移的影響的圖。圖9為表示ERα抑制劑對骨骼肌細胞增殖的影響的圖。圖10為表示ERα抑制劑處理過的骨骼肌細胞條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細胞遷移的影響的圖。圖11為表示ERα抑制劑處理過的骨骼肌細胞條件培養(yǎng)基對血管平滑肌細胞遷移的影響的圖。圖12為表示ERα基因沉默劑對促進缺血部位血流恢復(fù)的作用的圖。該圖為動物模型圖，其中，圖12(A)為原始結(jié)果的灰度圖，圖12(B)為對灰度圖進行了圖像處理后的圖。圖13為表示ERα小分子抑制劑對促進缺血部位血流恢復(fù)的作用的圖。該圖為動物模型圖，其中，圖13(A)為原始結(jié)果的灰度圖，圖13(B)為對灰度圖進行了圖像處理后的圖。圖14為表示ERα小分子抑制劑對促進缺血部位血流恢復(fù)的作用的圖。該圖為動物模型圖，其中，圖14(A)為原始結(jié)果的灰度圖，圖14(B)為對灰度圖進行了圖像處理后的圖。圖15為表示ERα抑制劑對促進缺血部位血管新生的作用的圖。圖16為表示ERα抑制劑對促進缺血部位血管新生的作用的圖。具體實施方式本發(fā)明的缺血性疾病可以包括心肌缺血、腦缺血，另外，還包括下肢缺血性疾病，例如血栓閉塞性脈管炎、閉塞性動脈硬化癥、間歇性跛行(Intermittentclaudication)、糖尿病足(DiabeticFoot)等糖尿病相關(guān)血管病變以及惡性下肢缺血性疾病(CriticalLimbIschemia)。下文中雖以糖尿病足為例進行了實驗，但根據(jù)本發(fā)明的原理可知，本發(fā)明并不限于以糖尿病足為代表的下肢缺血性疾病，還可以包括各種人等哺乳動物的缺血性疾病。即，本發(fā)明可以用于制備治療缺血性疾病的藥物。本發(fā)明涉及一種雌激素受體抑制劑在制備治療缺血性疾病的藥物中的應(yīng)用。其機理還未明確，但根據(jù)發(fā)明者的新發(fā)現(xiàn)推測：在高糖條件下骨骼肌細胞ERα表達上升，血管新生能力下降，因此認為骨骼肌細胞ERα的過表達是導(dǎo)致糖尿病人血管修復(fù)能力差的原因。通過在骨骼肌細胞中抑制ERα的表達，能夠?qū)崿F(xiàn)：促進骨骼肌細胞分泌血管新生因子、促進骨骼肌細胞遷移、促進骨骼肌細胞增殖，進而促進血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞等血管組成細胞遷移，最終促進缺血下肢血管新生和血流恢復(fù)。需要說明的是，雖然上述推測針對高糖條件，但如上說明的，機體在高糖條件下的響應(yīng)水平下降，可知在非高糖條件下，本發(fā)明仍可取得上述優(yōu)異的效果。本發(fā)明的治療缺血性疾病的藥物包含雌激素受體抑制劑，其沒有特別限定，包括選自他莫昔芬、氟維司瓊、鹽酸雷洛昔芬、拉索昔芬、酒石酸拉索昔芬、阿非昔芬、吲哚昔芬、米普昔芬、阿佐昔芬、阿佐昔芬鹽酸鹽、克羅米酚、AZD9496即(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸、阿克比芬、巴多昔芬、萘福昔定、萘福昔鹽酸定、枸櫞酸硝滅芬、奧培米芬、帕諾米芬、比本哚昔芬、希比芬、替米麗芬、托瑞米芬、三對甲氧苯氯乙烯及其衍生物中的一種或多種的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selectiveestrogenreceptormodulators，SERMs)。上述物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下所示。表1-1表1-2表1-3表1-4表1-5表1-6所述雌激素受體抑制劑還包括靶向雌激素受體的基因沉默劑?；虺聊瑒┑姆N類沒有限定，可包括通過阻止轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制雌激素受體的表達的各種核酸、質(zhì)粒、蛋白質(zhì)等，例如引起RNA干擾(RNAinterference)的siRNA(smallinterferingRNA)和表達siRNA或短發(fā)夾型RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的質(zhì)粒、引起基因編輯的基因編輯器(如Crispr/Cas9、TALEN、ZFN等)、與信使RNA形成雙鏈從而阻礙翻譯的反義RNA(antisense)、可降解RNA的酶性核糖核酸(ribozyme)等。本發(fā)明中的糖尿病模型包括1型糖尿病模型、2型糖尿病模型以及糖尿病前期。1型糖尿病和2型糖尿病的空腹血糖≥7.4mmol/L，糖尿病前期(pre-diabetes)的空腹血糖大于6.1mmol/L而小于7.4mmol/L。本說明書中記載的“高糖”是指由糖尿病以及糖尿病相關(guān)病變引起的高糖。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可以理解，本發(fā)明實施例中的糖尿病足小鼠模型是采用完全切斷大腿大動脈構(gòu)建的，且所用的糖尿病小鼠模型的空腹血糖≥16.7mmol/L，遠遠高于糖尿病標(biāo)準的空腹血糖(即≥7.4mmol/L)，是嚴重的糖尿病小鼠。因此可知，本發(fā)明實施例中的糖尿病足小鼠患有嚴重的糖尿病足?；谔悄虿〉某潭?即血糖的高低)與組織修復(fù)、傷口愈合等能力成反比，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可以理解，后述的本發(fā)明的效果除了對嚴重糖尿病足具有良好的治療效果之外，對血管重構(gòu)和下肢功能恢復(fù)能力更強的非糖尿病患者的下肢缺血疾病，以及前期病變、輕度或中度的糖尿病足能起到更好的治療效果。并且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明對于腦缺血、心肌缺血也可以具有積極的治療作用。本發(fā)明中的治療缺血性疾病的藥物和/或促進血管新生的藥物也可以包含一種或多種輔料。輔料沒有限定，例如溶劑、等張劑、賦形劑、pH調(diào)整劑、抗氧化劑、崩解劑、調(diào)味劑、香料、保存劑等本領(lǐng)域常用的輔料。作為溶劑可以列舉：注射用蒸餾水、生理鹽水、植物油，丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘油之類的醇類等。作為等張劑可以列舉：山梨醇、氯化鈉、葡萄糖等本領(lǐng)域常用的等張劑。作為賦形劑可以列舉：乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纖維素、淀粉等。作為pH調(diào)整劑可以列舉：鹽酸、枸櫞酸、氫氧化鈉、強氧化鉀、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉等。作為抗氧化劑可以列舉：亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸等。作為崩解劑可以列舉：馬鈴薯淀粉。作為調(diào)味劑可以列舉：蔗糖、單糖漿等甜味劑，等。作為香料可以列舉：薄荷油，橙皮油等。作為保存劑可以列舉：尼泊金類、山梨酸及其鹽等本領(lǐng)域常用的保存劑。本發(fā)明中的雌激素受體抑制劑可以為任何一種劑型，例如口服液、貼劑、片劑、膠囊、注射劑等；注射劑可以為靜脈注射劑、肌肉注射劑等。本發(fā)明中的血管新生因子為對促進成熟血管的形成起到作用的因子，其中包括對管腔形成起作用的因子(VEGF、HGF等)、對細胞成熟起作用的因子(HGF、PDGF-BB、ANG1等)等。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可以理解，這些因子在小鼠和包括人類在內(nèi)的哺乳動物中的調(diào)控機制以及它們的作用效果是共通的，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可以理解，基于本說明書對雌激素受體抑制劑作用效果以及作用機制的描述，本發(fā)明的效果在包括人類在內(nèi)的哺乳動物體內(nèi)也能達到治療缺血性疾病、能夠促進骨骼肌細胞表達血管新生因子、促進骨骼肌細胞遷移和增殖、能夠促進血管組成細胞(例如，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞等)遷移等本說明書所描述的效果。實施例1.葡萄糖濃度對ERα表達量的影響實驗方法及試劑細胞培養(yǎng)首先將C2C12骨骼肌細胞種到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(30000個細胞/孔)，所用的培養(yǎng)基為杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′sModifiedEagleMedium，DMEM)+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin。24h后將培養(yǎng)基換成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+葡萄糖的培養(yǎng)基(葡萄糖最終濃度如圖1和圖2所示，DMEM本身已含有4.5mg/ml的葡萄糖)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。之后將培養(yǎng)基換成DMEM+Penicillin+Streptomycin+葡萄糖的培養(yǎng)基(葡萄糖最終濃度如圖1和圖2所示)的培養(yǎng)基并在低氧環(huán)境下培養(yǎng)，4h后取總RNA。低氧環(huán)境下的細胞培養(yǎng)：低氧處理是將細胞培養(yǎng)板和AnaeroPack.Anaero(MitshubishiGasChemical,Japan)放入專用密封容器(標(biāo)準四角形密封容器，MitsubishiGasChemical)內(nèi)，放入培養(yǎng)箱。所述密封容器內(nèi)的氧氣濃度低于0.1％。RNA提取根據(jù)Trizol的說明書提取RNA。RNA提取之后用Nanodrop-2000(GeneCompany,Ltd)檢測所提取的RNA的質(zhì)量和濃度后進行反轉(zhuǎn)錄。mRNA水平的測定：RT-PCRTAKARA-PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAERaser(CodeNo.RR047A)(1)去除基因組DNA反應(yīng)試劑使用量體系完成之后置于Bio-RadT100Thermalcycler機子上面，反應(yīng)條件如下：42℃2min4℃。(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑使用量PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1.0μLRTPrimeMix*41.0μL5*PrimeScriptBuffer24.0μLRNaseFreeDH2O4.0μL步驟1的反應(yīng)液10.0μLTotal20.0μL體系完成之后置于Bio-RadT100Thermalcycler機子上面，反應(yīng)條件如下：37℃15min85℃5sec4℃(3)得到cDNA后稀釋10倍。稀釋后的樣品用來做定量PCR實驗(定量PCR儀：CFX96OpticalReactionModule#1845097，Bio-Rad)，測定表2中記載的各血管新生因子的基因的表達水平，用β-Actin的表達量歸一化并將對照組(即糖濃度4.5mg/mL)的值為1，算出其它組的相對表達量(各實驗進行了三次并獲得了平均值)。反應(yīng)體系如下試劑用量SYBR5.0μLPCRForwardPrimer(10Mm)0.4μLPCRReversePrimer(10Mm)0.4μLRT反應(yīng)液2.5μLDH2O1.7μLTotal10μL定量PCR反應(yīng)程序1.50.0℃for2min2.95.0℃for10min3.95.0℃for15sec4.60.0℃for35sec5.GOTO3.40moretimes6.95.0℃for15sec7.60.0℃for1min8.MeltCurve65.0to95.0,increment0.5℃.定量PCR相關(guān)引物序列圖1為示出葡萄糖濃度對ERα表達量的影響的圖。從該圖可知，雌激素受體ERα的表達顯示出葡萄糖濃度依賴性，即隨著葡萄糖濃度的升高，雌激素受體ERα的表達量升高。圖中，NS為沒有顯著差異；*為p值(ttest)＜0.05，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。2.葡萄糖濃度對血管新生因子表達量的影響實驗方法及試劑實驗方法如1，所用引物：圖2為示出葡萄糖濃度對血管新生因子表達量的影響的圖。從該圖可知，血管新生因子的表達顯示出葡萄糖濃度依賴性，即隨著葡萄糖濃度的升高，血管新生因子的表達量降低。圖中，NS為沒有顯著差異；*為p值(ttest)＜0.05，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。3.ERα基因沉默劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響(1)實驗方法及試劑構(gòu)建2個以ERα為靶標(biāo)，表達能誘導(dǎo)RNA干擾的短發(fā)夾型RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表達質(zhì)粒，即shERα-1和shERα-2。質(zhì)粒的制作可參見下述文獻：YinYang1inducestranscriptionalactivityofp73throughcooperationwithE2F1,ShourongWuet.al.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications365(2008)75–81；以及SynergisticcooperationofMDM2andE2F1contributestoTAp73transcriptionalactivity,ViviKasimetal.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications449(2014)319–326)。接種小鼠骨骼肌細胞C2C12于6孔板中，每孔30萬細胞，24h后，按照Lipofectamine2000(Invitrogen)試劑的指導(dǎo)說明進行轉(zhuǎn)染。將2μg質(zhì)粒(shERα-1、shERα-2shRNA表達質(zhì)粒)或不表達任何shRNA的對照質(zhì)粒(shCon，可參考上述文獻)分別與200μL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻，另外取4μLLipofectamine2000與200μL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻。室溫靜置5min。將兩個混合體系混合在一起，靜置20min后加入六孔板中。24h后換成含有最終濃度為2.5mg/mL的嘌呤霉素的培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+2.5mg/ml的嘌呤霉素)培養(yǎng)篩選未被導(dǎo)入shRNA質(zhì)粒的細胞。36h后更換培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖)，4h后更換為DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖并在低氧環(huán)境下培養(yǎng)12h，之后收集樣品進行總RNA提取和定量PCR。構(gòu)建shERα質(zhì)粒使用的核酸序列如下所示：圖3為示出ERα基因沉默劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響的圖。從該圖可知，ERα基因沉默劑促進血管新生因子表達。圖中，*為p值(ttest)＜0.05，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。4.ERα小分子抑制劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響實驗方法及試劑首先將C2C12骨骼肌細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(80000個細胞/孔)進行培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基為DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin。24h后將培養(yǎng)基換成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖+ERα小分子抑制劑的培養(yǎng)基(各個ERα小分子抑制劑的最終濃度如下所示)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。之后將培養(yǎng)基換成DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖+ERα小分子抑制劑的培養(yǎng)基(各個ERα小分子抑制劑的最終濃度如下所示)并在低氧環(huán)境下培養(yǎng)，4h后取總RNA進行定量PCR(具體操作如上所述)。另外將不添加ERα小分子抑制劑而是添加了等量的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline，PBS)的樣品作為對照組。ERα小分子抑制劑最終濃度氟維司瓊(FL)0.4nM他莫昔芬(TA)12nM鹽酸雷洛昔芬(RA)5.7nM酒石酸拉索昔芬(LA)1nM從圖4～7可知，高糖條件下，ERα的表達量升高，同時骨骼肌細胞血管新生因子的表達量降低。具體如下所述。圖4為示出氟維司瓊對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響的圖。從該圖4可知，氟維司瓊促進血管新生因子表達。圖5為示出他莫昔芬對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響的圖。從該圖5可知，他莫昔芬促進血管新生因子表達。圖6為示出鹽酸雷洛昔芬對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響的圖。從該圖6可知，鹽酸雷洛昔芬促進血管新生因子表達。圖7為示出酒石酸拉索昔芬對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響的圖。從該圖7可知，酒石酸拉索昔芬促進血管新生因子表達。圖中，*為p值(ttest)＜0.05，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。5.ERα抑制劑對骨骼肌細胞遷移的影響實驗方法(transwell小室實驗)及試劑ERα基因沉默劑實驗按照上述項目“3.ERα基因沉默劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響”(進行至嘌呤霉素篩選36h的步驟)準備對照細胞(導(dǎo)入不表達短發(fā)夾型RNA的shCon對照質(zhì)粒的細胞)和導(dǎo)入shERα-1以及shERα-2或shCon質(zhì)粒的細胞，嘌呤霉素篩選后將培養(yǎng)基換成DMEM+penicillin+streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。將細胞接種在transwell小室的上室(upperchamber)內(nèi)(每個小室內(nèi)接種7000細胞，培養(yǎng)基為DMEM+penicillin+streptomycin)，將DMEM+penicillin+streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培養(yǎng)基加入下室(lowerchamber)，置于低氧條件下培養(yǎng)。4h后取出transwell小室，去除transwell小室內(nèi)部未遷移的細胞后，用結(jié)晶紫(碧云天)染色透過濾膜而到達小室另一側(cè)的細胞并在熒光顯微鏡下拍照(每組6張以上)，并通過數(shù)出6張照片中的細胞數(shù)(即遷移的細胞)得出每張照片中細胞數(shù)的平均。ERα小分子抑制劑實驗首先將C2C12骨骼肌細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(80000個細胞/孔)進行培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基為DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin。24h后將培養(yǎng)基換成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖+ERα小分子抑制劑的培養(yǎng)基(各個ERα抑制劑的最終濃度如下所示)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，準備各種ERα小分子抑制劑處理后的細胞。作為對照，將C2C12骨骼肌細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(80000個細胞/孔)用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin培養(yǎng)基進行培養(yǎng)24h后，更換培養(yǎng)基(“正常”對照換成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin，“高糖”對照換成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖)繼續(xù)培養(yǎng)24h。之后與上述ERα基因沉默劑實驗的方法一樣地進行transwell小室實驗。ERα小分子抑制劑最終濃度氟維司瓊(FL)0.4nM他莫昔芬(TA)12nM鹽酸雷洛昔芬(RA)5.7nM酒石酸拉索昔芬(LA)1nM圖8為示出ERα抑制劑對骨骼肌細胞遷移的影響的圖。該圖中，相對遷移細胞數(shù)以高糖對照組或shCon組為1。通過比較正常和高糖對照可知，高糖導(dǎo)致骨骼肌細胞遷移能力下降，但抑制ERα能使這個功能恢復(fù)。即，ERα抑制劑能夠促進骨骼肌細胞遷移。圖中，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。FL為氟維司瓊、TA為他莫昔芬、RA為鹽酸雷洛昔芬、LA為酒石酸拉索昔芬。6.ERα抑制劑對骨骼肌細胞增殖的影響ERα小分子抑制劑實驗如上述項目“4.ERα小分子抑制劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響”中所記載地準備各種ERα小分子抑制劑處理后的細胞細胞；另外準備正常對照(即不經(jīng)過ERα小分子抑制劑處理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin培養(yǎng)的細胞)和高糖對照(即不經(jīng)過ERα小分子抑制劑處理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培養(yǎng)的細胞)。之后在低氧培養(yǎng)12h(培養(yǎng)基：DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培養(yǎng)的細胞)后將細胞用4％多聚甲醛固定并用TritonX-100處理，之后用1％牛血清白蛋白封閉并用抗Ki67抗體(Abcam，Ab15580)在室溫孵育90分鐘，然后用PBS清洗三次，每次5min。再用針對抗Ki67抗體的二抗(驢抗兔抗體，DonkeyAnti-rabbitAlexa488conjugate,InvitrogenA21206)在室溫孵育70分鐘，用PBS清洗3次后加入DAPI(碧云天)，在室溫孵育15分鐘后清洗，用丙三醇封片后，利用熒光顯微鏡(LeicaMicrosystems，DMI6000B)進行檢測。ERα基因沉默劑實驗按照上述項目“3.ERα基因沉默劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響”(進行至嘌呤霉素篩選36h的步驟)準備對照細胞(導(dǎo)入不表達短發(fā)夾型RNA的shCon對照質(zhì)粒的細胞)和導(dǎo)入shERα-1以及shERα-2或shCon質(zhì)粒的細胞，嘌呤霉素篩選后將培養(yǎng)基換成DMEM+penicillin+streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。之后在低氧培養(yǎng)(培養(yǎng)基：DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培養(yǎng)的細胞)12h后將細胞用4％多聚甲醛固定并用TritonX-100處理，之后用1％牛血清白蛋白封閉并用抗Ki67抗體(Abcam，Ab15580)在室溫孵育90分鐘，然后用PBS清洗三次，每次5min。再用針對抗Ki67抗體的二抗(驢抗兔抗體，DonkeyAnti-rabbitAlexa488conjugate,InvitrogenA21206)在室溫孵育70分鐘，用PBS清洗3次后加入DAPI(碧云天)，在室溫孵育15分鐘后清洗，用丙三醇封片后，利用熒光顯微鏡(LeicaMicrosystems，DMI6000B)進行檢測。圖9為示出ERα抑制劑對骨骼肌細胞增殖的影響的圖。該圖中，相對遷移細胞數(shù)以高糖對照組或shCon組為1。通過比較正常和高糖對照可知，高糖導(dǎo)致肌細胞增殖能力下降，但通過抑制ERα能使骨骼肌細胞增殖恢復(fù)。圖中，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。FL為氟維司瓊、TA為他莫昔芬、RA為鹽酸雷洛昔芬、LA為酒石酸拉索昔芬。7.ERα抑制劑處理過的肌細胞條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細胞遷移的影響實驗方法(transwell小室實驗)及試劑條件培養(yǎng)基的制備骨骼肌細胞能分泌各種血管新生因子從而影響組成血管的各種細胞，且上述實驗結(jié)果已證明，抑制ERα能促進骨骼肌細胞表達血管新生因子。為了進一步驗證抑制ERα是否促進骨骼肌細胞分泌血管新生因子而影響血管組成細胞，發(fā)明人制備了富含骨骼肌細胞各種分泌因子的條件培養(yǎng)基，并考察了它們對血管組成細胞的影響。如上述項目“3.ERα基因沉默劑對骨骼肌細胞血管新生因子表達量的影響”和上述項目“4.ERα小分子抑制劑對骨骼肌細胞血管新生因子的影響”中所記載地準備細胞，在低氧條件下培養(yǎng)12h(培養(yǎng)基：DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培養(yǎng)的細胞)后收集培養(yǎng)基，3000rpm/min離心5min，收集上清液，用0.22μm膜濾器進行過濾。由此，得到各種條件培養(yǎng)基。Transwell小室實驗除在上室接種7000個血管內(nèi)皮細胞HUVECs、并把下室(lowerchamber)的培養(yǎng)基改成各種條件培養(yǎng)基外，與上述項目“5.ERα抑制劑對骨骼肌細胞遷移的影響”同樣地進行實驗。圖10為示出ERα抑制劑處理過的肌細胞條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細胞遷移的影響的圖。從該圖可知，ERα抑制劑處理過的肌細胞條件培養(yǎng)基促進血管內(nèi)皮細胞的遷移。圖中，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異?！罢！睘閺牟唤?jīng)過ERα小分子抑制劑處理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin培養(yǎng)的C2C12細胞獲得的條件培養(yǎng)基，“高糖”為從不經(jīng)過小分子抑制劑處理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培養(yǎng)的C2C12細胞獲得的條件培養(yǎng)基，“FL”為從經(jīng)過氟維司瓊處理過的C2C12細胞獲得的條件培養(yǎng)基、“TA”為從經(jīng)過他莫昔芬處理過的C2C12細胞獲得的條件培養(yǎng)基、“RA”為從經(jīng)過鹽酸雷洛昔芬處理過的C2C12細胞獲得的條件培養(yǎng)基、“LA”為從經(jīng)過酒石酸拉索昔芬處理過的C2C12細胞的C2C12細胞獲得的條件培養(yǎng)基。8.ERα抑制劑處理過的肌細胞條件培養(yǎng)基對血管平滑肌細胞遷移的影響如上述項目7“ERα抑制劑處理過的肌細胞條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細胞遷移的影響”中所記載地準備條件培養(yǎng)基。Transwell小室實驗除在上室種上7000個血管平滑肌細胞MOVAS細胞、并把下室(lowerchamber)的培養(yǎng)基改成各種條件培養(yǎng)基外，與上述項目“5.ERα抑制劑對骨骼肌細胞遷移的影響”同樣地進行實驗。圖11為示出ERα抑制劑處理過的肌細胞條件培養(yǎng)基對血管平滑肌細胞遷移的影響的圖。從該圖可知，ERα抑制劑處理過的肌細胞條件培養(yǎng)基促進血管平滑肌細胞的遷移。圖中，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。9.ERα抑制劑對促進缺血部位血流恢復(fù)的作用(1)I型糖尿病小鼠模型的建立C57BL/6J小鼠(8周，雄性)購買(購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué))回來一周后測量小鼠血糖，用下述高脂飼料喂養(yǎng)4周后測量血糖，出現(xiàn)糖尿病前期(pre-diabetes)的情況后，將鏈脲佐菌素通過肌肉連續(xù)注射五天，射量為50mg/kg，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)一周后測量小鼠血糖，血糖高于16.7mmol/L的被選用做下一步實驗。在此，需要說明的是，一般血糖為7.4mmol/L以上已被認為患有糖尿病，但本發(fā)明的模型選定血糖為16.7mmol/L以上的小鼠。另外，至實驗結(jié)束(3周)，小鼠的血糖沒有降低的現(xiàn)象，因此本實施例的血流恢復(fù)的作用不是因為血糖下降導(dǎo)致的血管修復(fù)能力上升，而是因為ERα的抑制導(dǎo)致骨骼肌細胞遷移和表達血管新生因子的功能上升。高脂飼料的配方：15％豬油10％蛋黃10％白糖65％普通飼料其中，普通飼料、蛋黃、豬油、白糖由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院提供，并由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院生產(chǎn)高脂飼料。(2)II型糖尿病小鼠利用db/db二型糖尿病小鼠模型(常州卡文斯實驗動物中心)。(3)ERα抑制劑對促進缺血部位血流恢復(fù)的治療效果使用上述糖尿病小鼠模型，在麻醉條件下對左側(cè)大腿大動脈進行切除手術(shù)，并利用LaserDopplerPerfusionImagingSystem檢測血流的情況。需要說明的是，關(guān)于本申請說明書中“左側(cè)”、“右側(cè)”的表述，進行了手術(shù)的是左側(cè)大腿，此時小鼠處于俯臥狀態(tài)，后述的血流圖的照片中小鼠處于仰臥狀態(tài)，所以該血流圖照片中手術(shù)的大腿在圖中右側(cè))(參照文獻ShourongWuetal.Prolylhydroxylasedomain-2silencinginducedbyhydrodynamiclimbveininjectionenhancesvascularregenerationincriticallimbischemiamicethroughactivationofmultiplegenes(2015)CurrGeneTher.15(3):313-325中的方法)。ERα抑制劑的注射ERα基因沉默劑：將shERα-1質(zhì)粒(1μg/μl，用PBS溶解)用0.22μm膜過濾后保存。在小鼠術(shù)后的第二天，將質(zhì)粒溶液(1mg/kgbodyweight)肌肉注射到小鼠缺血下肢(即進行手術(shù)的下肢)腓腸肌內(nèi)。之后一周一次按以上方法注射質(zhì)粒溶液。對照組則使用對照質(zhì)粒shCon作為對照，同樣地過濾、保存和注射。ERα小分子抑制劑：將氟維司瓊用PBS溶解(最終濃度10nM)，用0.22μm膜過濾后保存。在小鼠術(shù)后的第二天，將氟維司瓊(最終濃度1.2mg/kgbodyweight)肌肉注射到小鼠缺血下肢(即進行手術(shù)的下肢)腓腸肌內(nèi)。之后兩天一次按以上方法注射質(zhì)粒溶液。關(guān)于對照組，使用PBS作為對照，同樣地過濾、保存和注射。利用LaserDopplerPerfusionImagingSystem(MOORINSTRUMENTSLtd，MOORLDLS2-IR)檢測手術(shù)前、剛手術(shù)后、術(shù)后第7、14、21天的血流情況(II型糖尿病小鼠觀察到第14天)。參見圖12～14可知，I型和II型糖尿病小鼠模型中，術(shù)前對照組小鼠和給藥組小鼠具有同等的血流狀況。在I型糖尿病小鼠模型的情況下，在術(shù)后第21天時，與shCon對照組或PBS對照組相比，分別注射了shERα-1質(zhì)粒和氟維司瓊的小鼠的下肢血流顯著恢復(fù)。在II型糖尿病小鼠模型的情況下，在術(shù)后第14天時，與PBS對照組相比，注射了氟維司瓊的小鼠的下肢血流顯著恢復(fù)。具體地，圖12～14中，灰色部分反應(yīng)血流狀況。術(shù)前，對照組小鼠和給藥組小鼠具有同等的血流狀況(需要說明的是，LaserDopplerPerfusionImagingSystem原初成像為彩圖，轉(zhuǎn)化為灰度圖片后，與原初所成的像看起來有些許差異。在原彩圖中，紅色表示血流豐富，藍色或綠色表示沒有血流。在灰度圖像下無法較清晰地區(qū)分血流恢復(fù)的地方(即原彩圖中紅色部位)和沒有血流(即原彩圖中藍色或綠色部位)的地方)。針對該問題，本申請發(fā)明人依據(jù)彩圖結(jié)果對灰度圖進行了圖像處理，從而得到了圖12(B)、圖13(B)和圖14(B)。在處理后的圖像中，網(wǎng)點狀表示血流恢復(fù)的地方，即原彩圖中的紅色部分。剛手術(shù)后，對照組小鼠和給藥組小鼠左側(cè)下肢均顯示出沒有血流的狀態(tài)(在原彩圖中均為藍色或綠色的部分，在處理后的圖中顯為黑色，沒有網(wǎng)點狀圖案)，可知手術(shù)成功地制造出缺血小鼠模型。在I型糖尿病小鼠模型的情況下，在術(shù)后第21天時，相對于對照組，給藥組觀察到明顯的血流恢復(fù)(即原彩圖中的紅色部分、處理后的圖中的網(wǎng)點部分)。在II型糖尿病小鼠模型的情況下，在術(shù)后第14天時，相對于對照組，給藥組觀察到明顯的血流恢復(fù)(即原彩圖中的紅色部分、處理后的圖中的網(wǎng)點部分)。10.ERα抑制劑對促進缺血部位血管新生的作用實驗方法及試劑采用冰凍切片進行，術(shù)后21天(II型糖尿病小鼠術(shù)后14天)，取得小鼠的左側(cè)腓腸肌組織后保存在-80℃。待組織冷凍后進行切片。切片流程如下，包埋劑包埋組織后在切片機(Leica生產(chǎn))上進行切片，切片厚度是10μm。切片結(jié)束后將切片置于37℃烘箱中烘干30min，2.5％牛血清白蛋白(BSA)中封閉30～60min。將組織周圍的BSA除去后，用抗PECAM-1(別名：CD31)抗體室溫孵育1h(PECAM-1：PurifiedRatAnti-MouseCD31(CloneMEC13.3,BDPharmingenTMCat550274)，抗體稀釋比例1:50)，然后用含有0.1％吐溫的PBS(PBS-T)清洗三次，每次5min。進一步將該切片用帶有熒光標(biāo)記的抗α-SmoothMuscleActin(α-SMA)的抗體Mousemonoclonal(Clone1A4,Sigma-AldrichCatC6198)(即α-SmoothMuscle-Cy3，抗體稀釋比例1:100)、和熒光標(biāo)記的針對抗PECAM-1抗體的二抗(Goatanti-RatIgG(H+L)SecondaryAntibody,Alexa488conjugate(ThermoScientificCatA11006)(抗體稀釋比例1:100)的混合液室溫孵育30min。然后PBS-T清洗三次，每次5min。免疫熒光染色結(jié)束并用丙三醇封片后，在熒光顯微鏡(LeicaMicrosystems，DMI6000B)上面檢測。對注射了ERα抑制劑、對照質(zhì)粒shCon和PBS的小鼠確認血管生成及血管成熟情況。結(jié)果如圖15左側(cè)所示。另外，對所獲得的圖片利用LeicaApplicationSuiteVersion4.6軟件進行定量，得出PECAM-1陽性和α-SMA陽性的面積。結(jié)果如圖15右側(cè)所示。圖15-16為示出ERα抑制劑對促進缺血部位血管新生的作用的圖。從這些圖可知，ERα抑制劑實現(xiàn)了促進缺血部位血管新生的作用。圖中，**為p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被認為有顯著性差異。FL為氟維司瓊。結(jié)果可以確認，注射ERα抑制劑的小鼠的組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮細胞(即PECAM-1陽性)和血管平滑肌細胞(即α-SMA陽性)的細胞增多。通過重疊圖片(Mergeimage)發(fā)現(xiàn)PECAM-1和α-SMA雙陽性的結(jié)構(gòu)增多，并形成由血管平滑肌細胞包圍血管內(nèi)皮細胞的管腔結(jié)構(gòu)，意味著形成了豐富的成熟血管，而注射PBS的小鼠僅有微弱的噪音信號。另外，定量結(jié)果也顯示了抑制ERα能在缺血缺氧條件下顯著地誘導(dǎo)更多的血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞。該結(jié)果表明，抑制ERα能夠治療小鼠惡性下肢缺血、即促進缺血下肢血流的恢復(fù)，其原因很可能是由于抑制ERα促進了小鼠的血管新生和成熟血管的形成。需要說明的是，雖然動物實驗所用的ERα抑制劑為ERα基因沉默劑以及氟維司瓊，但基于上述實驗，他莫昔芬、鹽酸雷洛昔芬、酒石酸拉索昔芬也均有促進骨骼肌細胞遷移和表達血管新生因子的作用，且經(jīng)過上述ERα抑制劑處理過的骨骼肌細胞的條件培養(yǎng)基也能促進血管組成細胞的遷移，而這些細胞功能與血管新生和成熟血管的形成密切相關(guān)。換句話說，由于他莫昔芬、鹽酸雷洛昔芬、酒石酸拉索昔芬對骨骼肌細胞和血管組成細胞的影響與ERα基因沉默劑以及氟維司瓊非常相似，可以推斷上述ERα小分子抑制劑乃至其它ERα抑制劑也能促進缺血部位的血管新生和成熟血管的形成，從而導(dǎo)致缺血部位的血流恢復(fù)，能有效地治療缺血性疾病。產(chǎn)業(yè)實用性雌激素受體抑制劑在制備治療缺血性疾病的藥物中有良好的效果。當(dāng)前第1頁1 2 3