本發(fā)明屬于藥物新用途技術(shù)領(lǐng)域，涉及LIM激酶抑制劑(LIMKi3)在鎮(zhèn)痛藥物領(lǐng)域的新用途。

背景技術(shù)：

疼痛(繼呼吸、脈搏、血壓、體溫之后可被列為人的第五大生命體征。它是指由實(shí)際損傷或具有潛在組織損傷風(fēng)險(xiǎn)的各種刺激所引起的一種不愉快的感覺和情緒體驗(yàn)。疼痛可以根據(jù)其特征被劃分為三個(gè)大類：傷害性疼痛、炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛。傷害性疼痛由傷害性刺激所引起，是人體的一種自我保護(hù)機(jī)制，機(jī)體感受到疼痛后逃避刺激，避免刺激對(duì)機(jī)體造成進(jìn)一步的傷害，從而保護(hù)身體的健康。炎癥性疼痛則涉及組織損傷和免疫細(xì)胞產(chǎn)物的滲透，炎癥因子將會(huì)誘發(fā)并維持傷害感受器的敏化，并導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)程的痛覺過敏直到組織修復(fù)和炎癥消失。神經(jīng)病理性疼痛則是由強(qiáng)烈的傷害性刺激或組織、神經(jīng)損傷引起，表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)間的痛覺過敏、痛覺異?；蜃园l(fā)性疼痛。

疼痛就病程而言，可分為急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛為新近產(chǎn)生并持續(xù)時(shí)間較短的疼痛，通常與損傷或疾病有關(guān)。疼痛則為持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的疼痛，可能是急性疼痛治療效果不好，或損傷愈合后仍然持續(xù)存在的疼痛，病人常伴有焦慮、抑郁等精神心理改變。無論是急性疼痛還是慢性疼痛，臨床上對(duì)疼痛控制的需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有得到滿足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的在于提供LIM激酶抑制劑LIMKi3在制備治療疼痛藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了式I所示LIM激酶抑制劑LIMKi3在制備治療疼痛藥物中的應(yīng)用

所述治療疼痛包括消除、減輕或者延緩疼痛等。

所述疼痛包括傷害性疼痛、炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛，但不限于上述疼痛。

作為優(yōu)選，所述藥物是以所述LIMKi3為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料所制成的制劑。

所述制劑選自但不限于注射液、皮下埋植劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、緩釋劑中的一種。

本發(fā)明所述LIMKi3在治療疼痛時(shí)，可以單獨(dú)使用，也可以與其他鎮(zhèn)痛藥物配合同時(shí)使用，或者與其他鎮(zhèn)痛藥物一起制成復(fù)方制劑使用，都可以達(dá)到治療疼痛的目的。

本發(fā)明在制備不同劑型時(shí)加入所需的各種常規(guī)輔料(即藥學(xué)上可接受的輔料)，例如稀釋劑、黏合劑、崩解劑、助流劑、潤(rùn)滑劑、矯味劑、包合材料、吸附材料等以常規(guī)的制劑方法制備成任何一種常用的制劑，例如可以是注射液、皮下埋植劑、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、緩釋劑等。

本發(fā)明中涉及的LIMKi3抑制底物L(fēng)IM激酶(LIMK)下游以多種蛋白作為作用底物，包括肌動(dòng)蛋白解聚因子/絲切蛋白cofilin，環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB等。LIM激酶通過磷酸化下游蛋白而廣泛參與到通道轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、形態(tài)發(fā)生等一些列過程中。在神經(jīng)系統(tǒng)中則表現(xiàn)為調(diào)節(jié)突觸形態(tài)和性能以及受體分布，從而達(dá)到影響信號(hào)傳遞的作用。因此在疼痛信號(hào)傳導(dǎo)過程中，也起到及其重要的調(diào)節(jié)作用。

最后，本發(fā)明還提供了LIM激酶抑制劑LIMKi3抑制LIM激酶下游蛋白磷酸化水平的應(yīng)用，通過疼痛動(dòng)物模型試驗(yàn)證實(shí)，以LIMK下游蛋白中的絲切蛋白Cofilin以及環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB為例，所述LIMKi3能顯著抑制其活性。

技術(shù)效果：相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了LIM激酶抑制劑LIMKi3治療疼痛的新用途，所述LIMKi3能夠顯著影響疼痛的產(chǎn)生，減輕或者延緩疼痛表型，單獨(dú)使用或者配合其他鎮(zhèn)痛藥物使用，能有效治療疼痛。

附圖說明

圖1為局部鞘內(nèi)給藥模式下，保留性神經(jīng)損傷模型中LIMKi3顯著抑制LIM激酶下游蛋白磷酸化水平示意圖；

圖2為局部鞘內(nèi)給藥模式下，LIMKi3對(duì)炎癥性疼痛表型影響示意圖；

圖3為不同時(shí)間點(diǎn)局部鞘內(nèi)給藥模式下，LIMKi3對(duì)保留性神經(jīng)損傷疼痛表型影響的示意圖；

圖4為造模后局部鞘內(nèi)給藥模式下，LIMKi3對(duì)手術(shù)后疼痛表型影響的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)解決方案。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中所述試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑盒材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

所使用的動(dòng)物模型，皆為成熟的疼痛動(dòng)物學(xué)模型，相關(guān)實(shí)驗(yàn)在具備實(shí)驗(yàn)操作技能的人員操作下可以進(jìn)行重復(fù)。

實(shí)施例1、鞘內(nèi)給予LIMKi3可以顯著抑制LIM激酶下游蛋白磷酸化水平

a)試驗(yàn)動(dòng)物：健康成年C57bl/6小鼠，清潔級(jí)，體重為20-25g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于12h-12h晝夜交替的獨(dú)立環(huán)境中，室溫維持在24±2℃，自由飲水和攝食，在適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)動(dòng)物的所有處理均遵循國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)倫理委員會(huì)的要求。

b)試驗(yàn)藥品：藥物L(fēng)IMKi3，純度＞98％，市售(購(gòu)自Calbiochem公司)。二甲基亞砜(DMSO)，市售。Tris、TEMED、Bovine Serum Albumin、β-Mercaptoethanol、甘氨酸、甘油、吐溫-20、溴酚藍(lán)、SDS、Triton 100、Marker購(gòu)于Sunshine；30％Acrylamide/Bis、Ammonium Persulfate購(gòu)于Bio-Rad；甲醇、氯化鈉、丙三醇、蔗糖購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司；Paraformaldehyde購(gòu)于Solarbio；Anti-p-Pofilin抗體購(gòu)于Santa cruz；Anti-Cofilin抗體購(gòu)于CST；Anti-CREB抗體購(gòu)于CST；Anti-p-CREB抗體購(gòu)于Santa cruz；Anti-Tubulin抗體購(gòu)于Bio-World；anti-rabbit購(gòu)于R&D。

c)試驗(yàn)方法：

保留性神經(jīng)損傷模型：小鼠麻醉后，切開皮膚、鈍性分離肌肉就可以看見坐骨神經(jīng)主干及其三個(gè)分支，脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)。用6-0縫合線結(jié)扎并切斷脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)，確保腓腸神經(jīng)完好無損，待小鼠恢復(fù)后1天進(jìn)行脊髓取樣。

小鼠鞘內(nèi)注射：按壓小鼠腰骶部?jī)蓚?cè)固定，自L5–L6棘突間進(jìn)針，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)向運(yùn)動(dòng)為注射成功標(biāo)志。用25μl微量進(jìn)樣器，注射容積為5μl，注射時(shí)間10s，留針20s。

LIMKi3給藥劑量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理鹽水稀釋，劑量為5μg/5μl溶媒，給藥方式均為鞘內(nèi)注射。本實(shí)施例中，為取樣前2小時(shí)注射1劑。

組織蛋白免疫印跡：取相關(guān)L4-L6脊髓節(jié)段稱重后，按照1:20(質(zhì)量:體積)比例加入裂解液，冰上超聲處理10s后，沸水浴中5min變性，15,000轉(zhuǎn)離心15min，吸取上清，20μl/管分裝，-70℃保存。取10μl樣品/泳道上樣于10％SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，4℃110V電轉(zhuǎn)90min。5％BSA-TBS封閉1小時(shí)后，加入p-Cofilin抗體(p-Ser3)(1:1,000，Santa Cruz)、Cofilin抗體(1:2000，CST)、Tubulin抗體(1：8000，Bio-World)4℃過夜。TBST漂洗10min×3次后，加入HRP標(biāo)記二抗羊抗兔-HRP二抗(1:1000，R&D)室溫孵育3小時(shí)后加入ECL(Pierce)發(fā)光底物顯色。用分子顯影儀成像分析數(shù)據(jù)。用目的蛋白灰度值與胞漿蛋白內(nèi)參Tubulin灰度值之比進(jìn)行半定量分析。

d)試驗(yàn)結(jié)果描述：

本實(shí)施例中主要選取多種LIMK下游蛋白中的絲切蛋白Cofilin以及環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB的活性作為抑制指標(biāo)。如圖1AB所示，鞘內(nèi)注射5ug LIMKi3可以顯著降低Cofilin的磷酸化水平，抑制保留性神經(jīng)損傷導(dǎo)致的Cofilin活化。如圖1CD所示，鞘內(nèi)注射5ug LIMKi3同樣可以顯著降低CREB的磷酸化水平，抑制保留性神經(jīng)損傷導(dǎo)致的CREB活化。

實(shí)施例2、鞘內(nèi)給予LIMKi3可以顯著抑制炎癥性疼痛表型

a)試驗(yàn)動(dòng)物：

健康C57bl/6小鼠，清潔級(jí)，體重為20-25g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于12h-12h晝夜交替的獨(dú)立環(huán)境中，室溫維持在24±2℃，自由飲水和攝食，在適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)動(dòng)物的所有處理均遵循國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)倫理委員會(huì)的要求。

b)試驗(yàn)藥品及試劑：

藥物L(fēng)IMKi3，純度＞98％，市售(購(gòu)自Calbiochem公司)。二甲基亞砜(DMSO)，市售。

c)試驗(yàn)方法：

炎癥性疼痛模型：小鼠保固后，使用30號(hào)針頭注射器，在小鼠足底注射完全弗氏佐劑和生理鹽水1：1的混合物20微升。注射后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定小鼠機(jī)械閾值。

小鼠鞘內(nèi)注射：按壓小鼠腰骶部?jī)蓚?cè)固定，自L5–L6棘突間進(jìn)針，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)向運(yùn)動(dòng)為注射成功標(biāo)志。用25μl微量進(jìn)樣器，注射容積為5μl，注射時(shí)間10s，留針20s。

LIMKi3給藥劑量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理鹽水稀釋，劑量為5μg/5μl溶媒，給藥方式均為鞘內(nèi)注射。本實(shí)施例中，注射2劑，間隔12小時(shí)。

機(jī)械觸絲反射閾值測(cè)定：在安靜環(huán)境中，維持環(huán)境溫度20～25℃，將小鼠放入底部為絲網(wǎng)的玻璃箱內(nèi)，全身可以自由活動(dòng)。待小鼠靜置60min后，用機(jī)械觸絲刺激小鼠足掌，測(cè)定小鼠的抬腳閾值，并以此作為機(jī)械刺激縮足反射閾值。

圖2中小鼠隨機(jī)分為兩組：溶媒組與LIMKi3組，在造模前15分鐘注射，造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行疼痛的行為學(xué)測(cè)定。記錄給藥后炎癥痛模型小鼠的縮足閾值(圖2)。

d)試驗(yàn)結(jié)果描述

如圖2所示：在造模前鞘內(nèi)注射LIMKi3，對(duì)小鼠炎癥性機(jī)械刺激疼痛具有緩解作用。以上結(jié)果表明：LIMKi能夠顯著抑制炎癥導(dǎo)致的疼痛表型。

實(shí)施例3、鞘內(nèi)給予LIMKi3對(duì)于保留性神經(jīng)損傷疼痛表型的影響

a)試驗(yàn)動(dòng)物：

健康C57bl/6小鼠，清潔級(jí)，體重為20-25g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于12h-12h晝夜交替的獨(dú)立環(huán)境中，室溫維持在24±2℃，自由飲水和攝食，在適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)動(dòng)物的所有處理均遵循國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)倫理委員會(huì)的要求。

b)試驗(yàn)藥品及試劑：

藥物L(fēng)IMKi3，純度＞98％，市售(購(gòu)自Calbiochem公司)。二甲基亞砜(DMSO)，市售。

c)試驗(yàn)方法：

保留性神經(jīng)損傷模型：小鼠麻醉后，切開皮膚、鈍性分離肌肉就可以看見坐骨神經(jīng)主干及其三個(gè)分支，脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)。用6-0縫合線結(jié)扎并切斷脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)，確保腓腸神經(jīng)完好無損，待小鼠恢復(fù)后進(jìn)行痛覺測(cè)試。

小鼠鞘內(nèi)注射：按壓小鼠腰骶部?jī)蓚?cè)固定，自L5–L6棘突間進(jìn)針，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)向運(yùn)動(dòng)為注射成功標(biāo)志。用25μl微量進(jìn)樣器，注射容積為5μl，注射時(shí)間10s，留針20s。

LIMKi3給藥劑量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理鹽水稀釋，劑量為5μg/5μl溶媒，給藥方式均為鞘內(nèi)注射。本實(shí)施例中，注射6劑，初次注射后每間隔12小時(shí)注射。

機(jī)械觸絲反射閾值測(cè)定：在安靜環(huán)境中，維持環(huán)境溫度20～25℃，將小鼠放入底部為絲網(wǎng)的玻璃箱內(nèi)，全身可以自由活動(dòng)。待小鼠靜置60min后，用機(jī)械觸絲刺激小鼠足掌，測(cè)定小鼠的抬腳閾值，并以此作為機(jī)械刺激縮足反射閾值。

冷覺閾值測(cè)定：使用注射器向小鼠足底施加一滴丙酮溶液，然后觀察小鼠在一分鐘內(nèi)的舔足甩足等疼痛表型的時(shí)間，重復(fù)四次后取平均值作為最終冷覺閾值。

圖3中小鼠隨機(jī)分為多組：溶媒組與造模前后不同時(shí)間給LIMKi3組(造模前15分鐘，造模后6h)，然后在造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行疼痛的行為學(xué)測(cè)定。記錄給藥后小鼠的縮足閾值(圖3A)與冷覺反應(yīng)閾值(圖3B)。

d)試驗(yàn)結(jié)果描述

如圖3所示：在造模前鞘內(nèi)注射LIMKi3，對(duì)小鼠機(jī)械刺激和冷覺疼痛都具有緩解作用。在造模后給藥組中，可以達(dá)到造模前給藥類似的效果。以上結(jié)果表明：LIMKi3能夠顯著抑制保留性神經(jīng)損傷導(dǎo)致的疼痛表型。

實(shí)施例4、鞘內(nèi)給予LIMKi3對(duì)于術(shù)后疼痛表型的影響

a)試驗(yàn)動(dòng)物：

健康C57bl/6小鼠，清潔級(jí)，體重為20-25g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于12h-12h晝夜交替的獨(dú)立環(huán)境中，室溫維持在24±2℃，自由飲水和攝食，在適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)動(dòng)物的所有處理均遵循國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)倫理委員會(huì)的要求。

b)試驗(yàn)藥品及試劑：

藥物L(fēng)IMKi3，純度＞98％，市售(購(gòu)自Calbiochem公司)。二甲基亞砜(DMSO)，市售。

c)試驗(yàn)方法：

術(shù)后痛模型：小鼠麻醉后，切開小鼠一側(cè)足底皮膚，鈍性分離足底肌腱，使用鑷子牽拉保持2分鐘，然后使用6-0縫合線進(jìn)行足底縫合，待小鼠恢復(fù)后進(jìn)行痛覺測(cè)試。

小鼠鞘內(nèi)注射：按壓小鼠腰骶部?jī)蓚?cè)固定，自L5–L6棘突間進(jìn)針，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)向運(yùn)動(dòng)為注射成功標(biāo)志。用25μl微量進(jìn)樣器，注射容積為5μl，注射時(shí)間10s，留針20s。

LIMKi3給藥劑量和方法：LIMKi3用DMSO溶解后以生理鹽水稀釋，劑量為5μg/5μl溶媒，給藥方式均為鞘內(nèi)注射。本實(shí)施例中，注射1劑。

機(jī)械觸絲反射閾值測(cè)定：在安靜環(huán)境中，維持環(huán)境溫度20～25℃，將小鼠放入底部為絲網(wǎng)的玻璃箱內(nèi)，全身可以自由活動(dòng)。待小鼠靜置60min后，用機(jī)械觸絲刺激小鼠足掌，測(cè)定小鼠的抬腳閾值，并以此作為機(jī)械刺激縮足反射閾值。

圖4中小鼠隨機(jī)分為兩組：溶媒組與LIMKi3組，在造模前15分鐘注射，造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行疼痛的行為學(xué)測(cè)定。記錄給藥后小鼠的縮足閾值(圖4)。

d)試驗(yàn)結(jié)果描述

如圖4所示：在造模前鞘內(nèi)注射LIMKi3可以減輕手術(shù)后疼痛的形成，阻止機(jī)械疼痛閾值的降低，但是對(duì)未手術(shù)處理側(cè)腳掌的疼痛閾值沒有明顯影響。

以上結(jié)果表明：LIMKi3能夠顯著抑制手術(shù)操作導(dǎo)致的異常疼痛表型，對(duì)于手術(shù)后疼痛的發(fā)生有明顯的緩解作用。