本發(fā)明屬于納米材料加工應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種特異性靶向的磁共振-光學(xué)雙模成像探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

目前臨床上常用的診斷肝癌的影像手段主要有多層螺旋CT(MDCT)、磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像(PET-CT)成像和超聲(US)等，它們各有優(yōu)劣勢。PET-CT成本高、普及面窄；US成像深度不足；CT成像較為快捷、相對便宜和無深度限制，但它的軟組織分辨率不高且有電離輻射的風(fēng)險；MRI相對于CT的優(yōu)勢在于它良好的軟組織分辨率和無電離輻射，對于微小腫瘤的辨別能力電優(yōu)于CT。MRI是臨床上術(shù)前診斷肝癌的較為理想的影像手段，但是它無法術(shù)中實(shí)時導(dǎo)航手術(shù)。熒光成像是近年新興的成像手段，有可能給腫瘤外科帶來突破性進(jìn)展，它的優(yōu)點(diǎn)是成本低，方便快捷，敏感性高，能夠?qū)崟r導(dǎo)航外科手術(shù)，缺點(diǎn)是組織穿透深度不夠。事實(shí)上，不論是MRI和CT，還是熒光和PET成像，單一模態(tài)都各有優(yōu)劣，無法全面精準(zhǔn)獲取腫瘤診斷信息。為了能夠同時獲取診治腫瘤的整體與局部影像信息，實(shí)現(xiàn)術(shù)前與術(shù)中診療一體化，兩種或兩種以上成像模態(tài)結(jié)合即多模成像因其能整合各成像模態(tài)的優(yōu)勢正成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)，也是未來的發(fā)展方向。據(jù)文獻(xiàn)報道，近年來在探索惡性腫瘤精準(zhǔn)診療時發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵環(huán)節(jié)是成像靶點(diǎn)的選擇和高效特異性分子探針的合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種特異性靶向的磁共振-光學(xué)雙模成像探針及其制備方法，以期至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題之一。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種特異性靶向的磁共振-光學(xué)雙模成像納米探針，單位納米探針包括：

脂質(zhì)體包覆納米四氧化三鐵形成的第一結(jié)構(gòu)；

第一結(jié)構(gòu)負(fù)載ICG后形成的第二結(jié)構(gòu)；

第二結(jié)構(gòu)由聚乙二醇修飾后與RGD靶點(diǎn)鏈接形成的終態(tài)結(jié)構(gòu)。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種特異性靶向的磁共振-光學(xué)雙模成像納米探針的制備方法，包括：

步驟一：制備羧化的四氧化三鐵納米粒子；

步驟二：制備空白脂質(zhì)體；

步驟三：將羧化的四氧化三鐵納米粒子加熱至脂質(zhì)體的相變溫度，與空白脂質(zhì)體混合，得到磁性脂質(zhì)體溶液；

步驟四：利用聚乙二醇溶液修飾磁性脂質(zhì)體溶液，加入靶點(diǎn)RGD，形成混合溶液；

步驟五：在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液。

進(jìn)一步的，步驟一中，制備羧化的四氧化三鐵納米粒子包括：在N₂保護(hù)環(huán)境下，利用FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O為原料，采用氧化沉淀法在溶液中合成油酸化的四氧化三鐵，采用DMSA取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三鐵納米粒子。

進(jìn)一步的，所述FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O的摩爾比為1∶2，氧化沉淀法的溫度為120～150℃。

進(jìn)一步的，步驟二中，制備空白脂質(zhì)體包括：利用膽固醇和卵磷脂為原料，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法，得到布滿一容器底部的空白脂質(zhì)體。

進(jìn)一步的，所述真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的旋轉(zhuǎn)速度為40～60轉(zhuǎn)/分鐘、蒸發(fā)溫度40～60℃。

進(jìn)一步的，步驟三和步驟四之間還具有中間步驟：將磁性脂質(zhì)體溶液經(jīng)脂質(zhì)體擠壓器擠壓后，利用光譜分析法測量磁性脂質(zhì)體內(nèi)四氧化三鐵的濃度，離心濃縮后要求設(shè)定濃度以上。

進(jìn)一步的，步驟四具體包括：利用聚乙二醇DSPE-PEG-NH₂溶液修飾磁性脂質(zhì)體溶液中，加入靶點(diǎn)RGD，利用RGD與NH₂之間的共價耦合作用將其緊密連接。

進(jìn)一步的，步驟五中，所述聚乙二醇溶液的用量為每mg磁性脂質(zhì)體納米粒子加入1mL聚乙二醇溶液中。

進(jìn)一步的，，步驟五具體包括：在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液0.5-3mg/mL，被動吸附后，旋轉(zhuǎn)離心，除去游離的ICG分子。

通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明的成像探針及其制備方法至少具有下述有益效果之一：

1、本發(fā)明所涉及的制備方法簡便容易操作，納米粒子具有粒徑小，穩(wěn)定性好，生物相容性好，單分散性良好等優(yōu)點(diǎn)；

2、本發(fā)明所制備的雙模成像納米粒子具有穩(wěn)定的磁性和熒光特性、具有良好的主動靶向性；

3、本發(fā)明所用原材料ICG是經(jīng)美國FDA(食品藥品監(jiān)督管理局)官方認(rèn)證可直接適用于人體的近紅外染料。SPIO經(jīng)美國FDA官方認(rèn)證已作為T2(加權(quán)成像)造影劑應(yīng)用于臨床實(shí)踐。Liposome合成的原料主要為卵磷脂和膽固醇，生物相容性好。RGD是一種生物多肽，原料安全系數(shù)高；在探針合成過程中，無有毒、腐蝕性制劑的添加；綜上所述，新合成的特異性靶向的MRI-光學(xué)雙模探針SPIO@Liposome-ICG-RGD具有良好的生物相容性和廣闊的臨床轉(zhuǎn)化前景；

4.影像診斷是臨床上輔助腫瘤患者手術(shù)治療的最重要的手段，本發(fā)明特異性靶向的MRI-光學(xué)雙模成像探針具有雙重應(yīng)用功能。。

附圖說明

圖1為根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式的一種磁共振-光學(xué)雙模成像探針的制備方法流程圖；

圖2A-2C為實(shí)施例2靶向肝臟腫瘤的一種磁共振-光學(xué)雙模成像探針(SPIO@Liposome-ICG-RGD)在裸鼠體內(nèi)的熒光信號檢測圖的患有皮下肝癌裸鼠圖、雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的背景信號峰分離圖、以及以及探針注入后成像圖；

圖3A-3C分別為實(shí)施例2的無靶向功能的磁共振-光學(xué)雙模成像納米探針(SPIO@Liposome-ICG)制劑在裸鼠體內(nèi)的熒光信號檢測圖中的患有皮下肝癌裸鼠圖、雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的背景信號峰分離圖、以及探針注入后成像圖；

圖4A-4D分別為實(shí)施例3的靶向腫瘤的SPIO@Liposome-ICG-RGD納米探針結(jié)合1T的小動物核磁共振和近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航儀，術(shù)者在為皮下肝癌裸鼠完成熒光導(dǎo)航手術(shù)的探針注入前的MRI成像圖、探針注入后的MRI成像圖、探針熒光導(dǎo)航發(fā)現(xiàn)微小病灶殘留圖、和熒光導(dǎo)航下根治手術(shù)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例的一方面提供一種特異性靶向的磁共振-光學(xué)雙模成像納米探針，其中單位納米探針包括：

脂質(zhì)體包覆納米四氧化三鐵形成的第一結(jié)構(gòu)(參見圖1中A所示)；

第一結(jié)構(gòu)負(fù)載ICG(吲哚菁綠，Indocyanine Green)后形成的第二結(jié)構(gòu)。(參見圖1中B所示)；

第二結(jié)構(gòu)由聚乙二醇修飾后與RGD靶點(diǎn)鏈接形成的終態(tài)結(jié)構(gòu)(參見圖1中C所示)。

第一結(jié)構(gòu)中包含有脂質(zhì)體和納米四氧化三鐵，其中，超順磁性的納米氧化鐵(SPIO)因其高靈敏性核磁信號，無毒性及良好的生物相容性在MRI的T2成像中得到了良好的應(yīng)用。脂質(zhì)體Liposome合成的原料主要為卵磷脂和膽固醇，生物相容性好。

第一結(jié)構(gòu)負(fù)載ICG后形成的第二結(jié)構(gòu)。ICG是經(jīng)美國FDA認(rèn)證的可直接用于人體的近紅外熒光染料，激發(fā)波長805nm，發(fā)射835nm，能夠很好的排除自身熒光的干擾，常被用來熒光成像，且ICG與脂質(zhì)體(liposome)結(jié)合后熒光量子產(chǎn)率增加。

第二結(jié)構(gòu)由聚乙二醇修飾后與RGD靶點(diǎn)鏈接形成的終態(tài)結(jié)構(gòu)。由于整合素αvβ3受體在正常肝細(xì)胞中陰性表達(dá)，在Hep-G2肝癌細(xì)胞中是高表達(dá)。環(huán)狀RGD多肽是一種含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列的小肽，可以特異性識別整合素αvβ3受體。

所以，該實(shí)施例提供的特異性靶向的磁共振-光學(xué)雙模探針SPIO@Liposome-ICG-RGD具有良好的生物相容性和顯影性。

本發(fā)明實(shí)施例的另一方面還提供一種特異性靶向的磁共振-光學(xué)雙模成像納米探針的制備方法，包括：

步驟一：制備羧化的四氧化三鐵納米粒子；

步驟二：制備空白脂質(zhì)體；

步驟三：將羧化的四氧化三鐵納米粒子加熱至脂質(zhì)體的相變溫度，與空白脂質(zhì)體混合，得到磁性脂質(zhì)體溶液；

步驟四：利用聚乙二醇溶液修飾磁性脂質(zhì)體溶液，加入靶點(diǎn)RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽，Arg-Gly-Asp(RGD)sequence)，形成混合溶液；

步驟五：最后在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液，。

優(yōu)選的，制備羧化的四氧化三鐵納米粒子包括：在N₂保護(hù)環(huán)境下，利用FeSO4·7H₂O和FeCL3·6H₂O為原料，采用氧化沉淀法在溶液中合成油酸化的四氧化三鐵，采用DMSA(二巰丁二酸，dimercaptosuccinic acid)取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三鐵納米粒子。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述FeSO₄·7H₂O和FeCL₃·6H₂O的摩爾比為1∶2，氧化沉淀法的溫度為120～150℃。

優(yōu)選的，步驟二中，制備空白脂質(zhì)體包括：利用膽固醇和卵磷脂為原料，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法，得到布滿一容器底部的空白脂質(zhì)體。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的旋轉(zhuǎn)速度為40-60轉(zhuǎn)/分鐘、蒸發(fā)溫度40-60℃。

優(yōu)選的，步驟三和步驟四之間還具有中間步驟：

將磁性脂質(zhì)體溶液經(jīng)脂質(zhì)體擠壓器擠壓后，利用光譜分析法測量磁性脂質(zhì)體內(nèi)四氧化三鐵的濃度，離心濃縮后要求設(shè)定濃度(例如1mg/mL)以上。

優(yōu)選的，步驟四具體包括：利用聚乙二醇DSPE-PEG-NH₂(WM3500)溶液修飾磁性脂質(zhì)體溶液中，加入靶點(diǎn)RGD，利用RGD與NH₂之間的共價耦合作用將其緊密連接。

優(yōu)選的，步驟五中，所述聚乙二醇溶液的用量為每mg磁性脂質(zhì)體納米粒子加入1mL聚乙二醇溶液中。

優(yōu)選的，在步驟四的混合溶液中加入ICG溶液0.5-3mg/mL，被動吸附后，旋轉(zhuǎn)離心，除去游離的ICG分子。

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

請參考圖1，為本發(fā)明靶向腫瘤的一種特異性靶向的MRI-光學(xué)雙模成像探針的制備方法流程圖，具體地，其步驟如下：

步驟1：在N₂保護(hù)環(huán)境下，利用FeSO₄·7H₂O和FeCL₃為原料，采用氧化沉淀法在135℃溶液中合成油酸化的四氧化三鐵，采用DMSA取代油酸合成水溶性的羧化四氧化三鐵納米粒子；配制濃度為2mg/mL，備用；

步驟2：利用膽固醇和卵磷脂為原料，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法(轉(zhuǎn)速：40轉(zhuǎn)/分鐘、溫度：40℃)，得到布滿圓底燒瓶底部的空白脂質(zhì)體；

步驟3：將羧化的四氧化三鐵納米粒子加熱至脂質(zhì)體的相變溫度(約60℃)，加入空白脂質(zhì)體的圓底燒瓶內(nèi)，水化脂質(zhì)體，得到磁性脂質(zhì)體溶液；

步驟4：將磁性脂質(zhì)體溶液經(jīng)1ml容量的脂質(zhì)體擠壓器擠壓后，利用光譜分析法測量磁性脂質(zhì)體內(nèi)四氧化三鐵的濃度，離心濃縮后要求達(dá)到1mg/mL；

步驟5：利用聚乙二醇DSPE-PEG5000-NH₂溶液修飾磁性脂質(zhì)體溶液中，加入靶點(diǎn)RGD，利用RGD與NH2之間的共價耦合作用將其緊密連接；

步驟6：最后在步驟5的混合溶液中加入ICG溶液，被動吸附后，旋轉(zhuǎn)離心(轉(zhuǎn)速)，除去游離的ICG分子。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1制備得到的特異性靶向的MRI-光學(xué)雙模成像納米探針，用10Kd的超濾管將上述溶液進(jìn)行超濾，然后用超純水洗滌3次，然后用PBS液稀釋得到濃度為1mg/mL近紅外主動靶向探針制劑。此納米制劑中的納米顆粒的平均粒徑為150納米。

將濃度為1mg/mL的上述近紅外雙模成像探針熒光納米探針制劑注射入患有皮下肝癌裸鼠體內(nèi)(參見圖2A所示)進(jìn)行核磁和熒光檢測，檢測結(jié)果如圖2B和圖2C所示。從圖2B中可以看出，該雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的背景信號峰分離的很好，腫瘤區(qū)域和腫瘤周圍正常組織的對比度達(dá)到近3倍，這樣背景干擾就小，可以給術(shù)者提供清晰的腫瘤位置和精確的腫瘤邊界，調(diào)腫瘤的檢測率、切除率。從右圖中可以看出，該探針注入后，腫瘤區(qū)域明顯變暗，說明核磁T2相成像效果好，有助于術(shù)前診斷

將濃度為1mg/mL的上述不帶靶點(diǎn)的近紅外雙模成像探針熒光納米探針制劑注射入患有皮下肝癌裸鼠體(參見圖3A所示)內(nèi)進(jìn)行核磁和熒光檢測，檢測結(jié)果如圖3所示。從圖3B中可以看出，該雙模成像納米探針的近紅外熒光信號峰與裸鼠本身的的背景信號峰依舊有區(qū)別，但不及帶靶點(diǎn)RGD的探針組，腫瘤區(qū)域和腫瘤周圍正常組織的對比度達(dá)到才1倍，這樣背景干擾大，導(dǎo)航手術(shù)效果差。從圖3C中可以看出，該探針注入后，腫瘤區(qū)域明顯變暗不明顯。

實(shí)施例3

將上述實(shí)施例2中得到的濃度為1mg/mL的雙模成像納米探針制劑注射入患有原位肝癌裸鼠體內(nèi)進(jìn)行診療一體化研究，并在MRI和近紅外熒光手術(shù)導(dǎo)航儀輔助下，術(shù)者完成實(shí)時術(shù)前診斷和術(shù)中熒光導(dǎo)航手術(shù)切除腫瘤，在術(shù)前診斷評估，通過術(shù)前MRI掃描獲取腫瘤的宏觀信息，主要包括腫瘤的部位、大小、數(shù)目，腫瘤與肝臟內(nèi)血管、膽管的關(guān)系，明確腫瘤的分期，制定適合該患者的個體化治療方案；在術(shù)中實(shí)時導(dǎo)航，通過術(shù)中熒光成像，能夠探查出肉眼不能確定和不能識別的微小殘余病灶，血管浸潤病灶，增加手術(shù)的徹底性，減少復(fù)發(fā)概率，改善患者的預(yù)后。該探針的研發(fā)有望整合術(shù)前成像和術(shù)中導(dǎo)航，實(shí)現(xiàn)肝癌患者的診療一體化。手術(shù)實(shí)施過程如圖4A-4D所示(其中，圖4A為MRI成像前，圖4B為MRI成像后，圖4C為探針熒光導(dǎo)航發(fā)現(xiàn)微小病灶殘留；圖4D為熒光導(dǎo)航下根治手術(shù))，在主動靶向雙模成像探針、MRI和熒光手術(shù)導(dǎo)航儀的輔助下，術(shù)者術(shù)前可以精準(zhǔn)明確腫瘤的大小和位置，術(shù)中熒光可以輔助精確的定位腫瘤邊界，并參考客觀的熒光腫瘤邊界進(jìn)行腫瘤的完全切除，即使是對于亞毫米的殘余病灶，術(shù)者依靠近紅外熒光信號，同樣的能夠進(jìn)行精準(zhǔn)的手術(shù)切除，減少手術(shù)殘癌率和手術(shù)切緣陽性率，整體上實(shí)現(xiàn)了診療一體化的效果。

以上所述的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。