本發(fā)明屬于牙骨質(zhì)再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牙骨質(zhì)蛋白1/無(wú)定形磷酸鈣緩釋藥物及其制備方法、用途。

背景技術(shù)：

牙齒脫落通常由各種口腔疾病和生理起因引起，包括齲齒、牙周病、損傷、遺傳病和老齡化(Amar 2003，Philstrom2005，Kim 2006)。掉牙可導(dǎo)致身體和精神的痛苦，其可降低個(gè)體的自尊和生活品質(zhì)(Amar 2003，Philstrom 2005，Kim 2006)。許多形式的牙病和一些醫(yī)學(xué)病況如不受控的糖尿病提高掉牙的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于無(wú)牙癥的治療，目前的選擇局限于使用牙齒移植物和/或常規(guī)的固定或可移動(dòng)假體。

盡管牙齒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但是生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)的進(jìn)展已產(chǎn)生兩種目前采用的牙齒再生方法。第一種方法基于組織工程，目標(biāo)是通過在支架生物材料中接種干細(xì)胞使牙齒再生(Young 2002，Duailibi 2004，Honda 2005)。該技術(shù)已顯示牙周組織再生的有希望的結(jié)果(Nakahara2006)。第二種方法試圖復(fù)制或模仿胚胎牙齒形成的發(fā)育過程(Nakahara 2006)。該方法利用由小鼠胎兒采集的胚胎組織(牙齒上皮和牙齒間充質(zhì))并利用在胚胎中調(diào)節(jié)早期牙齒發(fā)育的原理(Ohazama2004，Hu 2006，Nakao 2007)。采用這些方法，在許多研究中，將生物工程化的牙胚移植到動(dòng)物宿主的身體中，所述動(dòng)物宿主通常為嚙齒動(dòng)物，其中存在足夠的血流來提供必要的營(yíng)養(yǎng)物和氧，以使組織形成最佳(Nakahara 2006)。

牙骨質(zhì)蛋白1(cementoblastoma-derived protein 1,CEMP1)是一種新近從成牙骨質(zhì)細(xì)胞瘤中克隆出的牙骨質(zhì)蛋白亞型。研究表明，CEMP1的表達(dá)僅限于成牙骨質(zhì)細(xì)胞群體中，且可能在牙周膜細(xì)胞分化中起著重要作用，因此它成為牙骨質(zhì)特有的生物標(biāo)記。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)CEMP1能促進(jìn)體外培養(yǎng)的細(xì)胞黏附、分化；在生物礦化過程中有促進(jìn)磷酸八鈣(OCP)晶體成核的作用；在非骨形成細(xì)胞中CEMP1的表達(dá)具有誘導(dǎo)礦化結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)形成、促進(jìn)鈣沉積的能力。這些結(jié)果提示CEMP1在牙骨質(zhì)形成中可能存在誘導(dǎo)作用，可為實(shí)現(xiàn)生理性種植牙提供幫助。

牙骨質(zhì)蛋白(cementum protein，CEMP)1是一種新近發(fā)現(xiàn)的在牙骨質(zhì)發(fā)生過程中特異表達(dá)的產(chǎn)物，其1 374bp大小的互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)序列包含的741bp大小的開放閱讀框可以編碼由247個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。其開放閱讀框開始于336位點(diǎn)的翻譯起始位點(diǎn)(ATG)，終止密碼子(TGA)位于1 077位點(diǎn)，前后分別是由335和295個(gè)核苷酸組成的非翻譯區(qū)。CEMP-1具有mgtsstdsqq aghrrcstsn tsaenltcls lpgspgktap lpgpaqagag qplpkgcaav kaevgipaph tsqevrihir rllswaapga cglrstpcal pqalpqarpc pgrwffpgcs lptggaqtil slwtwrhfln walqqreens grarrvppvp rtapvskgeg shppqnsnge kvktitpdvg lhqslt sdpt vavlrakrap eahpprscsg sltarvchmg vcqgqgdted grmtlmg的連續(xù)氨基酸序列。

從基因序列上推斷，CEMP1是一種堿性蛋白質(zhì)(等電點(diǎn)9.73)，其相對(duì)分子質(zhì)量約2.59×10⁴，不含信號(hào)肽。CEMP1含有大量的脯氨酸(11.3％)、甘氨酸(10.5％)、丙氨酸(10.1％)、絲氨酸(8.9％)、亮氨酸(8.1％)、蘇氨酸和精氨酸(各7.7％)，少量的色氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸(2.0％)、苯丙氨酸(1.6％)，不含酪氨酸。通過翻譯后修飾分析(ExPASy)，預(yù)測(cè)的CEMP1基因產(chǎn)物包含2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(20和25位點(diǎn))、1個(gè)環(huán)腺苷酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(14位點(diǎn))、3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(134、150和223位點(diǎn))、5個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(4、21、71、166和177位點(diǎn))，6個(gè)潛在的?；稽c(diǎn)(2、124、190、220、230和234位點(diǎn))，這些都可能與其蛋白質(zhì)的生物活性相關(guān)。

用PSORTⅡ分析氨基酸序列顯示，CEMP 1像核蛋白，但其沒有DNA結(jié)合基序。用NCBI BLAST軟件分析，沒有找到與其他蛋白質(zhì)有明顯意義的相似之處，但是其30～110氨基酸卻與α-Ⅰ型(48％)、Ⅺ(46％)、Ⅹ(40％)人膠原相似，然而CEMP 1沒有膠原蛋白典型的甘氨酸-X-Y重復(fù)，故其不是膠原蛋白。

目前尚未見適合臨床應(yīng)用的具有牙骨質(zhì)誘導(dǎo)作用的組織工程材料出現(xiàn)?？煽剌d藥技術(shù)可延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間，以使藥物釋放與組織生長(zhǎng)誘導(dǎo)需要相適應(yīng)。有機(jī)試劑的使用在載體合成應(yīng)用中較為成熟，然而，有機(jī)試劑往往會(huì)使藥物失去活性或者殘留時(shí)間長(zhǎng)而造成毒副作用?；谝陨系膯栴}，本發(fā)明因此而來。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種牙骨質(zhì)蛋白1/無(wú)定形磷酸鈣緩釋藥物，該藥物提供了一種藥物釋放與組織生長(zhǎng)誘導(dǎo)能相適應(yīng)的組織工程材料，解決了現(xiàn)有技術(shù)中牙齒骨質(zhì)修復(fù)再生等技術(shù)問題。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包括：

藥效學(xué)上有效量的牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1)；

無(wú)定形磷酸鈣；以及，

用于包封無(wú)定形磷酸鈣的藥學(xué)上可接受的其他藥物載體。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述藥物組合物以其組分的重量百分比含量計(jì)包括：

牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1) 0.1～30％；

無(wú)定形磷酸鈣和其他藥物載體共70～99.9％；

優(yōu)選的，所述藥物組合物以其組分的重量百分比含量計(jì)包括：

牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1) 0.1～25％；

無(wú)定形磷酸鈣和其他藥物載體共75～99.9％；

優(yōu)選的，所述藥物組合物以其組分的重量百分比含量計(jì)包括：

牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1) 0.1～20％；

無(wú)定形磷酸鈣和其他藥物載體共80～99.9％；

優(yōu)選的，所述藥物組合物以其組分的重量百分比含量計(jì)包括：

牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1) 0.1～15％；

無(wú)定形磷酸鈣和其他藥物載體共85～99.9％；

最優(yōu)選的，所述藥物組合物以其組分的重量百分比含量計(jì)包括：

牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1) 0.1～10％；

無(wú)定形磷酸鈣和其他藥物載體共90～99.9％。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述藥物組合物中牙骨質(zhì)蛋白1具有SEQ ID No：1的連續(xù)氨基酸序列。其中SEQ ID No：1為mgtsstdsqqaghrrcstsn tsaenltcls lpgspgktap lpgpaqagag qplpkgcaav kaevgipaph t sqevrihir rllswaapga cglrstpcal pqalpqarpc pgrwffpgcs lptggaqtil slwtwrhfln walqqreens grarrvppvp rtapvskgeg shppqnsnge kvktitpdvg lhqsltsdpt vavlrakrap eahpprscsg sltarvchmg vcqgqgdted grmtlmg。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述藥物組合物中其他藥物載體選自聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、殼聚糖、葡聚糖、磷脂酰甘油；優(yōu)選的，所述其他藥物載體選自聚乙二醇(PEG)。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述藥物組合物中其他藥物載體為聚乙二醇(PEG)，聚乙二醇的平均分子量為1000-40000；更優(yōu)選的，聚乙二醇的平均分子量為2000-20000；最優(yōu)選的，PEG的平均分子量為3000-12000。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述藥物組合物通過以下步驟進(jìn)行步驟：

(1)使其他藥物載體包封無(wú)定形磷酸鈣，形成包封無(wú)定形磷酸鈣的藥物載體；

(2)使包封無(wú)定形磷酸鈣的藥物載體負(fù)載藥學(xué)上有效量的牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1)。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述方法步驟(1)中無(wú)定形磷酸鈣是通過氯化鈣與磷酸鈉在存在溶液環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)獲得的。

所述藥物組合物中牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1)為藥物活性成分，無(wú)定形磷酸鈣作為藥物載藥體系。本發(fā)明的另一目的在于提供了一種濕化學(xué)沉淀法制備重組人牙骨質(zhì)蛋白1/無(wú)定形磷酸鈣緩釋納米載藥顆粒。本發(fā)明的又一目的在于提供一種適合誘導(dǎo)牙骨質(zhì)再生的臨床應(yīng)用型生物材料及其制備方法。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述其他藥物載體選自PLA、PLGA、涂有DPPC的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明膠、白蛋白、殼聚糖、葡聚糖、DL-PLG、SDLM、PEG、透明質(zhì)酸鈉、二酮哌嗪衍生物、寡糖衍生性DPPG。

本發(fā)明的另一目的在于提供了一種所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

(1)使其他藥物載體包封無(wú)定形磷酸鈣，形成包封無(wú)定形磷酸鈣的藥物載體；

(2)使包封無(wú)定形磷酸鈣的藥物載體負(fù)載藥學(xué)上有效量的牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1)。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，

本發(fā)明的另一目的在于提供了一種藥物顆粒，其特征在于所述藥物顆粒是采用所述的藥物組合物得到的。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種所述的藥物組合物在制備產(chǎn)生牙骨質(zhì)誘導(dǎo)再生作用的藥物方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的在于提供一種牙齒支架，所述支架包含所述的藥物組合物。

在硬組織誘導(dǎo)中使用磷酸鈣體系載入藥物可以達(dá)到同時(shí)滿足硬組織修復(fù)與藥物緩釋兩大目標(biāo)的效果。磷酸鈣的化學(xué)成份與骨組織的無(wú)機(jī)成份相似，相關(guān)的磷酸鈣包括：無(wú)定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)可以分子式Ca₃(PO₄)₂·3H₂O近似表示；磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)[Ca₃(PO₄)₂]；羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)[Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂](PDF#26-1056)。HA具有良好的生物活性和骨傳導(dǎo)性，但是它在體內(nèi)極難溶解不能被吸收。盡管TCP可以被生物降解，但是當(dāng)它和聚酯類聚合物混合時(shí)，并不能完全中和聚酯物水解所產(chǎn)的酸。在礦化組織中，ACP是許多生物礦物前體。ACP具有不規(guī)則結(jié)構(gòu)，與體液反應(yīng)活性高，極易溶解并發(fā)現(xiàn)快速磷灰石再沉淀。因此，ACP體內(nèi)骨傳導(dǎo)性優(yōu)于HA，比磷酸三鈣生物可降解性更佳。

本發(fā)明用于包封無(wú)定形磷酸鈣的其他藥物載體，優(yōu)選選自平均分子量為2000-30000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或平均分子量為3000-40000的聚乙二醇(PEG)。PEG具有1000-40，000、更優(yōu)選2000-20，000、最優(yōu)選3，000-12，000的平均分子量。

優(yōu)選地，本發(fā)明的PEG具有至少一個(gè)羥基，更優(yōu)選其為末端羥基。該羥基優(yōu)選被活化。反應(yīng)基團(tuán)的類型和量可以變化，本發(fā)明的PEG與牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1)形成共價(jià)鍵合的PEG/牙骨質(zhì)蛋白1(CEMP-1)。

水溶性聚氧乙基化多元醇也可以用于本發(fā)明。其包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)等?？梢詢?yōu)選POG。由于聚氧乙基化甘油的甘油骨架與例如在動(dòng)物和人中的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，在體內(nèi)將不必被視為外源試劑。POG具有與PEG相同范圍的優(yōu)選分子量。

雖然通過酵母真核體系可以表達(dá)CEMP1，但本發(fā)明通過原核系統(tǒng)獲得的CEMP1是本發(fā)明藥物活性物質(zhì)的優(yōu)選。不同的表達(dá)載體對(duì)重組蛋白的折疊，可能導(dǎo)致CEMP1的空間構(gòu)象產(chǎn)生差異。構(gòu)象的差異，可能導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變引起的蛋白活性的差異。

本發(fā)明藥物負(fù)載不是通過在基質(zhì)中致孔或者在基質(zhì)中心形成空心中運(yùn)送，而是利用ACP制備的初態(tài)易于與鈣化相關(guān)蛋白rhCEMP1整合組裝而發(fā)揮運(yùn)載功能。本發(fā)明通過負(fù)載載體如PEG與rhCEMP1通過非簡(jiǎn)單吸附的方式結(jié)合，將rhCEMP1通過共價(jià)結(jié)合的方式吸附到無(wú)定形磷酸鈣上。制備方法中需要先將PEG等藥物載體與無(wú)定形磷酸鈣預(yù)先包埋形成核殼結(jié)構(gòu)，然后在一定的pH值條件下連接上rhCEMP1，避免堿性環(huán)境對(duì)rhCEMP1細(xì)胞因子活性的危害。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方式中采用洗滌去除濕化學(xué)反應(yīng)中的堿性環(huán)境。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

本發(fā)明的制備方法既經(jīng)濟(jì)便捷，又能讓ACP與rhCEMP1能通過非簡(jiǎn)單吸附的方式結(jié)合，有效避免簡(jiǎn)單吸附造成的藥物爆釋。本發(fā)明技術(shù)方案與一般的骨組織工程材料相比，具有特異性牙骨質(zhì)誘導(dǎo)作用。本發(fā)明采用特殊的載藥體系，與其它磷酸鈣載藥體系相比，無(wú)定形磷酸鈣更適合骨組織修復(fù)與改建。本發(fā)明得到的藥物組合物具有高達(dá)97.8％的包封率，超過28天的緩釋效果。

附圖說明

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

圖1為不同顆粒的TEM透射電鏡圖；其中a為未加PEG時(shí)合成的ACP，呈約60nm的短棒狀；b為加PEG時(shí)合成的ACP，可見PEG將ACP包裹成約15nm的同心圓納米球粒；c為制備ACP/PEG洗滌后加入rhCEMP1混合；

圖2為ACPs紅外光譜；

圖3為負(fù)載、包封與釋放情況；其中a圖顯示了ACP/PEG在rhCEMP1負(fù)載率分別為1％，2％，5％，8％時(shí)，包封率分別為97.8％，96.4％，81.3％，79.6％，在rhCEMP1加入量較少時(shí)，大部分蛋白可以有效結(jié)合在ACP/PEG納米球體表面。而rhCEMP1加入量較多時(shí)，多余蛋白可以混合吸附于材料中間。b圖顯示ACP/PEG在rhCEMP1負(fù)載率分別為1％，2％，5％，8％時(shí)，在取樣點(diǎn)所表現(xiàn)出來的釋放方式。

圖4為掃描電鏡與能譜分析結(jié)果；

圖5為細(xì)胞粘附與增殖。其中a為牙周膜細(xì)胞PDLC與支架ACP/PCL/COL共同培養(yǎng)5天后，細(xì)胞在支架表面生長(zhǎng)良好，c.高倍鏡下可以觀察到細(xì)胞在支架表面鋪展，b為甚至可以遷入支架中。d為顯示支架與PDLC共同培養(yǎng)1，3，7天時(shí)MTT測(cè)定細(xì)胞增殖率的表現(xiàn)。可以與對(duì)照組control相比，ACP/PCL/COL對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，而且rhCEMP1/ACP/PCL/COL則對(duì)細(xì)胞增殖在相對(duì)抑制的作用，這可能是因?yàn)閞hCEMP1在定向促進(jìn)細(xì)胞分化而抑制了細(xì)胞的增殖。

圖6為Q-PCR支架與PDLC共培養(yǎng)7天后，提取細(xì)胞RNA測(cè)定相關(guān)成骨，成牙骨質(zhì)基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比，ACP/PCL/COL對(duì)成骨相關(guān)基因OCN，OPN有明顯的促進(jìn)作用，而rhCEMP1/ACP/PCL/COL明顯抑制了成骨相關(guān)基因OCN，OPN表達(dá)，而促進(jìn)成牙骨質(zhì)相關(guān)基因CEMP1和CAP的表達(dá)。證明rhCEMP1可有效促進(jìn)牙骨質(zhì)形成，防止組織在愈合的過程中形成骨硬化，骨粘連。

圖7為將支架植入大鼠頂骨缺損處，分別于術(shù)后第4，8，12周行microCT觀察硬組織的形成情況。對(duì)缺損處的組織進(jìn)行骨密度計(jì)量。

圖8為對(duì)空白對(duì)照組，ACP/PCL/COL和rhCEMP1/ACP/PCL/COL支架植入組4周，8周組織切片進(jìn)行HE染色。對(duì)照組4周時(shí)只有薄層結(jié)締組織形成。ACP/PCL/COL支架組早期即可誘導(dǎo)骨組織形成，在高倍鏡下可見血管化生。rhCEMP1/ACP/PCL/COL支架中只有少量骨組織再生，表現(xiàn)為抑制骨組織形成，但是在支架周圍一圈可見藍(lán)紫色的類牙骨質(zhì)細(xì)胞排列。證實(shí)其具有牙骨質(zhì)誘導(dǎo)再生作用。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用屬于“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、部件或者模塊、組件和/或它們的組合。

需要說明的是，本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書及上述附圖中的術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”等是用于區(qū)別類似的對(duì)象，而不必用于描述特定的順序或先后次序。應(yīng)該理解這樣使用的數(shù)據(jù)在適當(dāng)情況下可以互換，以便這里描述的本申請(qǐng)的實(shí)施方式例如能夠以除了在這里圖示或描述的那些以外的順序?qū)嵤?。此外，術(shù)語(yǔ)“包括”和“具有”以及他們的任何變形，意圖在于覆蓋不排他的包含，例如，包含了一系列步驟或單元的過程、方法、系統(tǒng)、產(chǎn)品或設(shè)備不必限于清楚地列出的那些步驟或單元，而是可包括沒有清楚地列出的或?qū)τ谶@些過程、方法、產(chǎn)品或設(shè)備固有的其它步驟或單元。

為了便于描述，在這里可以使用空間相對(duì)術(shù)語(yǔ)，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用來描述如在圖中所示的一個(gè)部件或者模塊或特征與其他部件或者模塊或特征的空間位置關(guān)系。應(yīng)當(dāng)理解的是，空間相對(duì)術(shù)語(yǔ)旨在包含除了部件或者模塊在圖中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附圖中的部件或者模塊被倒置，則描述為“在其他部件或者模塊或構(gòu)造上方”或“在其他部件或者模塊或構(gòu)造之上”的部件或者模塊之后將被定位為“在其他部件或者模塊或構(gòu)造下方”或“在其他部件或者模塊或構(gòu)造之下”。因而，示例性術(shù)語(yǔ)“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”兩種方位。該部件或者模塊也可以其他不同方式定位(旋轉(zhuǎn)90度或處于其他方位)，并且對(duì)這里所使用的空間相對(duì)描述作出相應(yīng)解釋。

藥學(xué)上有效量通常為治療劑產(chǎn)生預(yù)期的效果而無(wú)過度毒性的足夠的濃度。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明藥物組合物包含約1mg/g-100mg/g藥物組合物的CEMP1；在更具體的實(shí)施方案中，CEMP1以約1mg/g-80mg/g藥物組合物在藥物組合物中。在更具體的實(shí)施方案中，CEMP1以約10mg/g-80mg/g藥物組合物在藥物組合物中。CEMP1在藥物組合物中的含量通常可以理解為載藥量。其計(jì)算公式為：載藥量＝(藥物組合物中所含藥物質(zhì)量/藥物組合物的總質(zhì)量)×100％。無(wú)定形磷酸鈣優(yōu)選預(yù)置為納米顆粒，用來負(fù)載藥物活性成分，其尺寸在0.1-500μm范圍內(nèi)。

包封媒介物包括但不限于微粒、脂質(zhì)體、微球體等，或任何上述的組合，以提供不同比例的期望的釋放分布。試劑的受控-釋放遞送的其它方法為專業(yè)技術(shù)人員已知。此外，可將這些和其它系統(tǒng)組合和/或修改，以使試劑在基質(zhì)內(nèi)的整合/釋放最佳。聚合微球體可使用天然存在或合成的聚合物生產(chǎn)，并且為尺寸在0.1-500μm范圍內(nèi)的顆粒系統(tǒng)。聚合膠束和聚合物泡囊(polymeromes)為具有與微球體類似特性的聚合遞送媒介物，并且也能促進(jìn)無(wú)定形磷酸鈣的包封和/或基質(zhì)整合。

通過聚合物的類型、聚合物分子量、共聚物組成、加入到微球體制劑的賦形劑和微球體尺寸，可調(diào)節(jié)微球體的釋放速率?？捎糜谛纬晌⑶蝮w的聚合物材料包括PLA、PLGA、涂有DPPC的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明膠、白蛋白、殼聚糖、葡聚糖、DL-PLG、SDLM、PEG(例如，ProMaxx)、透明質(zhì)酸鈉、二酮哌嗪衍生物(例如，Technosphere)、磷酸鈣-PEG顆粒和/或寡糖衍生性DPPG(例如，Solidose)?？衫缡褂盟?油單乳液方法、水-油-水雙乳液方法或凍干實(shí)現(xiàn)包封?？衫脦追N工業(yè)包封技術(shù)(例如，Alkerme)。

然而，本發(fā)明用于包封的聚合物還需要具有一種性質(zhì)，需要與CEMP-1進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，用于攜帶藥物活動(dòng)成分CEMP-1。本發(fā)明中，優(yōu)選采用PEG末端的羥基活化，來連接CEMP-1。優(yōu)選的，PEG的平均分子量在3000-10000，具有高度親水性，該P(yáng)EG可以隱藏藥物運(yùn)輸，而有效的防止體內(nèi)防御系統(tǒng)對(duì)藥物活性成分進(jìn)行干預(yù)。這些藥物活性成分可以是脂質(zhì)體、納米粒子、聚合物納米載體、蛋白質(zhì)、其它藥物載體以及藥物本身。

本發(fā)明還提供一種牙齒支架，這些實(shí)施方案的支架可使用專業(yè)技術(shù)人員公認(rèn)有用的任何材料來制造。合適的基質(zhì)材料例如在以下討論：Ma和Elisseeff編輯(2005)Scaffolding in Tissue Engineering(在組織工程中支架化)，CRC，ISBN 1574445219；Saltzman(2004)Tissue Engineering：EngineeringPrinciples for the Design of Replacement Organs and Tissues(組織工程：代替器官和組織的設(shè)計(jì)的工程原理)，Oxford ISBN 019514130X。用于全部或部分支架的可能有用的材料的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇、聚丙交酯、聚羥基乙酸、丙交酯-乙交酯共聚物、聚(己內(nèi)酯)、聚酸酐、polyglactin、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酸酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚乙縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚磷腈、可降解的聚氨酯、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物和其它?；〈睦w維素乙酸鹽和它們的衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烴、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯醇、特氟尼龍、瓊脂糖、藻酸鹽(例如，藻酸鈣凝膠)、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維連接蛋白、膠原蛋白(例如，膠原蛋白凝膠)、明膠、透明質(zhì)酸、幾丁質(zhì)和其它合適的聚合物和生物聚合物，或以上的類似物、混合物、組合和衍生物。包封率可以用來表征無(wú)定形磷酸鈣-PEG的藥物包封程度。

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。

實(shí)施例1ACP載藥顆粒

1、ACP材料的制備

原料為分析純的無(wú)水CaCl₂、Na₃PO₄·12H₂O和進(jìn)口分裝的PEG分子量為10000。

將質(zhì)量比(w.t.)為1：1的PEG和CaCl₂溶于200ml的去離子水中，使Ca²⁺的濃度為0.1M(即加入PEG和CaCl₂各2.22g)，冰水浴條件下攪拌溶解得到溶液B0。

把Na₃PO₄·12H₂O溶于100ml的去離子水中，冰水浴攪拌溶解得到溶液B1。將B0、B1兩溶液快速混合，使得Ca/P為1.5。在冰水浴條件中，并且磁力攪拌下反應(yīng)30min。離心(3000rpm)10min，取上層清液作定性分析。

所得沉淀使用去離子水洗滌，去除多余離子，過濾獲取沉淀物；濾液直至用硝酸銀滴定；如此循環(huán)，直至得到的濾液無(wú)沉淀為止。最后得到的沉淀物即為A1樣品(ACP/PEG)。

在得到的A1樣品使用去離子水洗滌后樣品加入適量rhCEMP1凍干品，使其占溶質(zhì)質(zhì)量百分比分別是1％，2％，5％，8％，攪拌反應(yīng)5min。即得到A2樣品(ACP/PEG/CEMP1)。

純ACP樣品制備同A1樣品，但是不加入PEG，標(biāo)記為A0樣品(ACP)。即將CaCl₂溶于200ml的去離子水中，使Ca²⁺的濃度為0.1M(即加入CaCl₂2.22g)，冰水浴條件下攪拌溶解得到溶液B2。將B0、B2兩溶液快速混合，使得Ca/P為1.5。在冰水浴條件中，并且磁力攪拌下反應(yīng)30min。離心(3000rpm)10min，取上層清液作定性分析。所得沉淀使用去離子水洗滌，去除多余離子，過濾獲取沉淀物；濾液直至用硝酸銀滴定；如此循環(huán)，直至得到的濾液無(wú)沉淀為止。得到的樣品即為A0樣品(ACP)

所得樣品冷凍干燥48h，取出放入干燥器備用。

2.上層清液的定性分析方法

取A0，A1，A2制備中上層清液兩份，分別加入數(shù)滴CaCl₂或Na₃PO₄·12H₂O溶液，觀察產(chǎn)生沉淀情況。如果體系中產(chǎn)生沉淀說明含有PO₄^3-或Ca²⁺離子剩余，否則發(fā)生了完全反應(yīng)。結(jié)果表明在各組中Ca²⁺反應(yīng)完全，而PO₄^3-則過量。

3.ACP載藥顆粒的表征

掃描電子顯微鏡(SEM)觀察用傅立葉紅外光譜儀(FT-IR，Nicolet-Avatar 360型)測(cè)定樣品中各官能基團(tuán)，采用KBr壓片法。用粉末X射線衍射(XRD，Rigaku D/max-RA CuKα掃描速度5°/min)測(cè)定樣品的結(jié)晶狀況。

如圖1為TEM透射電鏡圖。其中a為未加PEG時(shí)合成的ACP，呈約60nm的短棒狀。b為加PEG時(shí)合成的ACP，可見PEG將ACP包裹成約15nm的同心圓納米球粒，從而限制ACP原子的遷移運(yùn)動(dòng)，防止晶體生長(zhǎng)，保持穩(wěn)定。c為制備ACP/PEG洗滌后加入rhCEMP1混合得到的ACP載藥顆粒(ACP/PEG/CEMP 1)。

其中各種參數(shù)的測(cè)定或計(jì)算方法如下：

載藥量及包封率測(cè)定方法如下：10mg A2溶解于10ml PBS溶液中，50rpm 37℃振蕩5min。離心2000rpm 5min，取上清液200μl，測(cè)量上清液中蛋白濃度。

載藥顆粒載藥量＝(ACP載藥顆粒中所含藥物質(zhì)量/ACP載藥顆粒質(zhì)量)×100％。載藥顆粒包裹率＝ACP載藥顆粒液中藥物濃度×ACP載藥顆粒液容積×100％。

體外CEMP 1釋放檢測(cè)方法如下：準(zhǔn)確稱取凍干保存的A2 10mg裝入EP管，加入的PBS(pH＝7.4)10mL后，37℃條件下以50r/min速率恒溫恒速振蕩。共5組，編號(hào)為①，②，③，④，⑤。分別以1，3，5，7，14，21，28為取樣及檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，在各取樣時(shí)間點(diǎn)，將50mL釋放介質(zhì)(含0.5％SDS的PBS)全部取出，補(bǔ)加全新50mL釋放介質(zhì)。在取出的50mL釋放介質(zhì)中取上清液100μL用檢測(cè)CEMP1/GDF5的ELISA檢測(cè)試劑盒

檢測(cè)，計(jì)算均值，根據(jù)ELISA的結(jié)果，繪制A2樣品的累計(jì)釋放曲線，如圖2所示。

圖3顯示了藥物負(fù)載、包封與釋放的過程。其中a圖顯示了ACP/PEG在rhCEMP1負(fù)載率分別為1％，2％，5％，8％時(shí)，包封率分別為97.8％，96.4％，81.3％，79.6％，在rhCEMP1加入量較少時(shí)，大部分蛋白可以有效結(jié)合在ACP/PEG納米球體表面。而rhCEMP1加入量較多時(shí)，多余蛋白可以混合吸附于材料中間。b圖顯示ACP/PEG在rhCEMP1負(fù)載率分別為1％，2％，5％，8％時(shí)，在取樣點(diǎn)所表現(xiàn)出來的釋放方式。

實(shí)施例2rhCEMP1/ACP緩釋納米載藥顆粒(ACP/PEG/CEMP1)的生物相容性與誘導(dǎo)作用

采用I型膠原蛋白(type I collagen，COL)和聚已內(nèi)酯(poly(ε-caprolactone)，PCL)作為支架材料的主體成份。在靜電紡絲制備過程中，在COL/PCL材料中分別加入rhCEMP1納米鈣磷基質(zhì)生物礦化復(fù)合材料(ACP/PEG/CEMP1)，進(jìn)行混合溶液的靜電紡絲，形成負(fù)載rhCEMP1的三維多孔膜支架材料(rhCEMP1/ACP/COL/PCL)。

1.復(fù)合膜材料的表征：

(1)掃描電子顯微鏡(SEM)觀察

濕態(tài)下將CEMP1/HA/COL共混膜切成小片并冷凍干燥，經(jīng)過干燥的膜在液氮中脆斷并用導(dǎo)電膠將其固定在電鏡臺(tái)土。樣品經(jīng)噴金后(10mA，1205)在真空掃描電鏡(Tesean5136MM microseope，20kV)上分別進(jìn)行膜表面和斷面的形態(tài)觀察。樣品經(jīng)過噴金后，在掃描電子顯微鏡下觀察其表面形貌，并采用圖像分析軟件測(cè)量30根纖維的直徑并計(jì)算出纖維的平均直徑(×1000，×30000)。

(2)能譜分析(EDX)：確定無(wú)定形磷酸鈣微粒在復(fù)合物中的存在，測(cè)定Ca、P元素分布及比例。

圖4為掃描電鏡與能譜分析。其中a，c，e為三種支架的掃描電鏡，b,d,f為能譜分析。a:PCL支架，支架由直徑約為130±54nm的纖維組成，形成了孔徑較大的多孔互通結(jié)構(gòu)，纖維表面較為光滑；c為ACP/PCL/COL支架，為加入ACP混紡后纖維將其包裹，形成較為粗糙的表面，纖維直徑約為214±63nm；e為rhCEMP/ACP/PCL/COL支架，表面粗糙，纖維交通成多孔結(jié)構(gòu)，纖維直徑約為204±59nm，b.PCL支架，未見Ca、P元素，其中Al為電紡時(shí)用的襯底鋁箔；d為ACP/PCL/COL支架，能譜分析證實(shí)Ca、P原素的存在，即含有ACP，Ca/P＝1.24(原子比)；f為rhCEMP/ACP/PCL/COL支架，能譜分析證實(shí)Ca、P原素的存在，即含有rhCEMP/ACP，Ca/P＝1.54(原子比)。

2.PDLC在支架材料上的粘附

以分別負(fù)載rhCEMP1三維支架作為實(shí)驗(yàn)組，以不加功能蛋白的空白支架作為對(duì)照。支架材料Co60消毒，在細(xì)胞培養(yǎng)液中浸泡1h進(jìn)行預(yù)濕處理。后將細(xì)胞(1.0×10⁵細(xì)胞/支架)接種于支架上。細(xì)胞/支架置于含5％CO₂的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q液一次，在特定時(shí)間用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗兩次，4％戊二醛固定半小時(shí)后，乙醇逐級(jí)脫水，空氣干燥，SEM觀察。

3.PDLC在支架材料上的增殖

支架材料置于96孔板中，每孔接種1×10³個(gè)細(xì)胞，分別于培養(yǎng)后第1、3、5、7天各取3個(gè)復(fù)孔，棄去原培養(yǎng)液，PBS漂洗。每孔加入含5mg/ml MTT的DMEM培養(yǎng)4h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光值，各組所測(cè)結(jié)果平均值分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組OD值(設(shè)空白對(duì)照組，各組光密度值均減去空白對(duì)照組OD值，空白對(duì)照組為DMSO，減少干擾)。

圖5為細(xì)胞粘附與增殖的結(jié)果。其中a.牙周膜細(xì)胞PDLC與支架ACP/PCL/COL共同培養(yǎng)5天后，細(xì)胞在支架表面生長(zhǎng)良好，c.高倍鏡下可以觀察到細(xì)胞在支架表面鋪展，b.甚至可以遷入支架中。d.顯示支架與PDLC共同培養(yǎng)1，3，7天時(shí)MTT測(cè)定細(xì)胞增殖率的表現(xiàn)?？梢耘c對(duì)照組(control)相比，ACP/PCL/COL對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，而且rhCEMP1/ACP/PCL/COL則對(duì)細(xì)胞增殖在相對(duì)抑制的作用，這可能是因?yàn)閞hCEMP1在定向促進(jìn)細(xì)胞分化而抑制了細(xì)胞的增殖。

4.細(xì)胞分化相關(guān)因子的基因表達(dá)mRNA水平的變化

同時(shí)將支架材料置于6孔板中，以1×10⁴個(gè)/孔接種PDLC，共培養(yǎng)4周后，提取各組細(xì)胞總RNA，以等量RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)成牙骨質(zhì)相關(guān)基因(CAP、CEMP1)，成骨相關(guān)基因(OPN，OCN)的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參照。利用StepOneTM Software v2.1軟件采用2－ΔΔCT法(Analysis of relative，geneexpression data using real time quantitative PCR and the 2-Ct method.)計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組RNA表達(dá)的差別。以確定支架材料對(duì)牙周膜干細(xì)胞分化的影響。

圖6為Q-PCR支架與PDLC共培養(yǎng)7天后，提取細(xì)胞RNA測(cè)定相關(guān)成骨，成牙骨質(zhì)基因的表達(dá)。與對(duì)照組，ACP/PCL/COL對(duì)成骨相關(guān)基因OCN、OPN有明顯的促進(jìn)作用，而rhCEMP1/ACP/PCL/COL明顯抑制了成骨相關(guān)基因OCN、OPN表達(dá)，而促進(jìn)成牙骨質(zhì)相關(guān)基因CEMP1和CAP的表達(dá)。證明rhCEMP1可有效促進(jìn)牙骨質(zhì)形成，防止組織在愈合的過程中形成骨硬化、骨粘連。

實(shí)施例3動(dòng)物試驗(yàn)：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(原位成骨)：

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar(或SD)大鼠，雄性，7～8周齡，重約250～300g。可實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境。

取12只大鼠，隨機(jī)分為3組，每組4只。在大鼠左右兩側(cè)頂骨區(qū)制備直徑5mm缺損。具體分組為空白對(duì)照組(control，不加入材料)，ACP/PCL/COL()，及rhCEP1/ACP/PCL/COL支架組。

(2)Micro CT

分別于術(shù)后當(dāng)天，第4周和第8周對(duì)手術(shù)動(dòng)物進(jìn)行Micro-CT掃描觀察。小動(dòng)物麻醉機(jī)3％異氟烷誘導(dǎo)麻醉大鼠后，將大鼠俯臥固定于掃描臺(tái)上，用1.5％異氟烷維持麻醉，采用瑞士Scanco viva40Micro-CT進(jìn)行掃描。選取顱骨全層進(jìn)行重建，閾值采用220.(pixel matrix，1024*1024；voxel size，36mm；slice thickness，36mm)

圖7為將支架植入大鼠頂骨缺損處，分別于術(shù)后第4，8，12周行microCT觀察硬組織的形成情況。對(duì)缺損處的組織進(jìn)行骨密度計(jì)量。

(3)組織學(xué)觀察:

術(shù)后4周、8周分別處死6只大鼠，取5mm骨缺損處及邊緣3～5mm顱骨(包含支架)，于10％福爾馬林(甲醛)PBS緩沖液中固定過夜。樣本用10％EDTA，pH 7.4，0.5％福爾馬林固定5周。

然后使用乙醇梯度脫水，再使用蠟塊包埋，切成5um厚切片。HE，染色觀察成骨情況。

圖8為比照空白對(duì)照組、ACP/PCL/COL支架植入組和rhCEMP1/ACP/PCL/COL支架植入組植入4周，8周時(shí)組織切片后進(jìn)行HE染色的結(jié)果。從圖中可以看出，空白對(duì)照組(a、d、g、j圖)4周時(shí)只有薄層結(jié)締組織(b位置)形成。ACP/PCL/COL支架植入組(b、e、h、k圖)早期即可誘導(dǎo)骨組織(s位置)形成，在高倍鏡(400×)下可見血管化生(v位置)。rhCEMP1/ACP/PCL/COL支架植入組(c、f、i、l圖)中只有少量骨組織(s位置)再生，表現(xiàn)為抑制骨組織形成，但是在支架周圍一圈可見藍(lán)紫色的類牙骨質(zhì)細(xì)胞(c位置)排列。證實(shí)其具有牙骨質(zhì)誘導(dǎo)再生作用。

上述實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。