本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程和納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及構(gòu)建的新型Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗(即Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab)靶向復(fù)合納米磁粒，在腫瘤熱療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,納米磁粒)誘導(dǎo)的腫瘤組織熱療是一種極具潛力的治療手段，已在多種體外實(shí)驗(yàn)的動物模型中被評估，取得可喜的結(jié)果，目前已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)。熱療是一個治療程序，其原理是促進(jìn)人體組織溫度升高，以改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，即溫度增加到41℃至42℃之間時，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞比周圍正常細(xì)胞對溫度突然升高的耐受性差。溫度的升高引起許多酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)作，進(jìn)而改變細(xì)胞的增殖和分化，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。一般認(rèn)為熱療觸發(fā)的細(xì)胞膜改變導(dǎo)致跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的減少并且破壞膜電位平衡。而且溫度升高可以影響核酸的合成并抑制修復(fù)酶，促進(jìn)DNA結(jié)構(gòu)變異。熱療所需的高溫可以通過不同的熱源獲得，如電磁輻射波(熱療用射頻或微波)、超聲波或電誘導(dǎo)熱療。這些技術(shù)顯示出了良好的效果，然而這些傳統(tǒng)方法的主要問題是如何達(dá)到熱療溫度均勻分布到腫瘤深部區(qū)域。從某種意義上說，治療失敗源于一些腫瘤區(qū)域溫度升高不足，使腫瘤復(fù)發(fā)。同時過熱也可導(dǎo)致癌旁組織損傷。目前磁流體熱療(magnetic fluid hyperthermia,MFH)技術(shù)已經(jīng)部分解決了這些問題。MFH的原理，是在腫瘤內(nèi)注射磁流體，隨后將腫瘤置于交變磁場(alternating magnetic field,AMF)下，促使腫瘤區(qū)域溫度升高。應(yīng)用磁性材料提高熱療療效開始于20世紀(jì)50年代中后期Gilchrist等的研究。隨后，許多研究評估了在不同腫瘤中的治療。然而，這些初步的研究結(jié)果直到20世紀(jì)90年代初才在學(xué)術(shù)界廣泛使用，而且目前這一領(lǐng)域也僅有少數(shù)臨床研究。因此，為更好地應(yīng)用于人體治療，有關(guān)物理?xiàng)l件、毒性程度和療效的更詳細(xì)研究是必要的。目前，MFH是一種非侵入性的極具前景的技術(shù)，能有效地對深部和難以觸及的組織進(jìn)行熱療。MFH可以特異性的靶向腫瘤組織，其溫度分布均勻且熱傳導(dǎo)率高，并減少健康組織的損害。

除納米磁粒外，納米金(nanogo1d)作為熱療用光敏感劑，也越來越受到學(xué)術(shù)界廣泛的關(guān)注。納米金即指金納米粒子，其直徑在1～100nm，具有高電子密度、介電特性、高吸收截面和高光熱轉(zhuǎn)化效率，經(jīng)過靜脈注射后，能夠富集在腫瘤部位，經(jīng)近紅外光(near-infrared,NIR)照射后，通過吸收近紅外激光能量，能迅速升溫“熱死”腫瘤細(xì)胞。此外，納米金還具有良好的生物相容性，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性。作為現(xiàn)代四大標(biāo)記技術(shù)之一的納米金標(biāo)記技術(shù)(nanogold labelling techique)，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到金納米粒子表面的包被過程。球形的金納米粒子對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，吸附機(jī)理可能是金納米粒子表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合，而且吸附后不會使生物分子變性，因此金納米粒子又是理想的藥物載體。

表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)介導(dǎo)的信號通路在腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，與腫瘤惡性程度及不良預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。尼妥珠單抗(Nimotuzumab)是在第一代人-鼠嵌合抗體西妥昔單抗基礎(chǔ)上開發(fā)的新一代IgGl型抗EGFR單克隆抗體，人源化程度達(dá)95％，免疫原性大大降低，安全性明顯提高，并且在人體內(nèi)的血清半衰期延長。臨床前研究、臨床研究表明，尼妥珠單抗在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、鼻咽癌和膠質(zhì)瘤等實(shí)體瘤均顯示出較高的抗腫瘤活性及腫瘤組織特異性，同時具有耐受性好、皮疹發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)。

EGFR單抗對腫瘤細(xì)胞的靶向性取決于其與受體的親和力常數(shù)(Kd)。尼妥珠單抗的Kd為4.5l×10-⁸mol/L，這種中度親和力既可有效靶向腫瘤細(xì)胞，阻斷配體與EGFR的結(jié)合，穩(wěn)定受體構(gòu)象不被二聚化，還可使皮膚等正常組織較低水平地攝取尼妥珠單抗。因此，尼妥珠單抗在發(fā)揮相似的最大抗腫瘤效應(yīng)的同時，還允許低劑量的正常EGFR保持活性，有助于降低不良反應(yīng)發(fā)生率。由此可見，尼妥珠單抗的靶向性是分子水平的，是靶向性很好的藥物，能夠賦予載體更好的靶向性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中的難題，既能賦予Fe₃O₄@Au更好的靶向性，使其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，而非正常細(xì)胞進(jìn)行熱療；又能利用Fe₃O₄的超順磁性在磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)下顯像示蹤、Fe₃O₄的磁感應(yīng)性進(jìn)行磁熱療，Au的光敏感性對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行近紅外熱療進(jìn)而將其同時作為腫瘤熱療的磁感應(yīng)劑、光敏感劑和陰性造影劑。本發(fā)明提供了一種具有雙加熱和顯像功能的靶向復(fù)合納米磁粒，技術(shù)方案如下：

本發(fā)明涉及一種具有雙加熱和顯像功能的靶向復(fù)合納米磁粒，其特征在于，由Fe₃O₄納米粒子和Au復(fù)合而成的、具有核殼結(jié)構(gòu)、并吸附單克隆抗體尼妥珠單抗，以形成Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒。

優(yōu)選的，所述的靶向復(fù)合納米磁粒，其特征在于，是以Fe₃O₄納米粒子作為核心，以Au作為納米磁粒殼層，具有核殼結(jié)構(gòu)、并在該納米磁粒的表面吸附單克隆抗體尼妥珠單抗，以形成Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗復(fù)合納米磁粒。

另一方面，本發(fā)明還涉及一種上述靶向復(fù)合納米磁粒的制備方法，其特征在于，

1)Fe₃O₄納米磁粒的制備：取0.01～0.1mol/L的FeCl₃、FeCl₂溶液，按摩爾比Fe³⁺:Fe²⁺＝5:3將二者混合，去離子水分別配制10ml 1mol/L的檸檬酸三鈉溶液和50ml 1mol/L的氫氧化銨溶液，取混合液0.01～0.1倍量的0.1～1mol/L檸檬酸三鈉以及0.01～0.5倍量的0.1～1mol/L氫氧化銨混合液快速加入氮?dú)獗Ｗo(hù)下的上述混合液中，溶液中迅速出現(xiàn)黑色沉淀物，繼續(xù)攪拌30～60min后停止。于60℃～80℃水浴恒溫30～60min進(jìn)行熟化，然后用磁鐵吸住燒瓶底部，傾去上層廢液，用去離子水反復(fù)沖洗生成物，至其溶液PH＝7，將生成物真空干燥，既得Fe₃O₄納米磁粒；

2)Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的制備：用去氧處理后的去離子水和上述Fe₃O₄納米磁粒配制為濃度0.01～0.1mol/l的混懸液，超聲處理5min以上，功率為600W，將上述混懸液與0.1～1mol/l的檸檬酸三鈉溶液，按照體積比1：1～1：2混合攪拌10～30min，然后，再按照體積比1：5～1：10向上述混合液中加入去離子水稀釋，將所得混合液與質(zhì)量體積濃度為0.1～1％金氯酸溶液按照體積比20：1～10：1混合后加熱，邊加熱邊攪拌，緩慢加入1～10:1倍量的0.1～2mol/l的鹽酸羥胺溶液，直至混合液顏色由淡黃變?yōu)榻鹉z體的特征紅色后，停止加熱；再利用磁鐵將磁性納米顆粒從上述液體中分離出，然后用HCl洗滌3次以上，并用去離子水清洗1～3次，真空干燥后，即得到Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒；

3)制備Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗復(fù)合納米磁粒：稱取少量上述Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒，用去離子水配置成0.1～1g/L Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒混懸液，取上述混懸液1～5ml,并用0.01～0.1mol/l的HCl溶液調(diào)節(jié)其pH至9.0～10.0，加入1～5mg/ml的尼妥珠單抗注射液4～20μl，置于空氣中震蕩，于37℃、200r/min的速度充分混合上述混懸液并反應(yīng)2～4h，再加入20～100μl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的牛血清蛋白(BSA)溶液，反應(yīng)30min～1h，然后用磁鐵分離20～60min，小心移去上清液，沉淀用1～5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的牛血清蛋白(BSA)溶液溶解搖勻后，于4℃下保存?zhèn)溆茫吹肍e3O4@Au-尼妥珠單抗復(fù)合納米磁粒。

此外，本發(fā)明還涉及上述靶向復(fù)合納米磁粒的用途：

一方面，本發(fā)明涉及一種上述的Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的用途，其特征在于，在制備靶向抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

一方面，本發(fā)明涉及一種上述的Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的用途，其特征在于，在制備顯像示蹤藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選的，所述的用途為用于制備腫瘤活體追蹤藥物。

一方面，本發(fā)明涉及一種上述的Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的用途，其特征在于，在制備輔助腫瘤熱療藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，所述的用途為用作腫瘤熱療的磁感應(yīng)劑、光敏感劑或陰性造影劑；

優(yōu)選的，所述的用途為在制備輔助腫瘤熱療的控溫及恒溫藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，所述的用途為在制備輔助腫瘤光熱轉(zhuǎn)換的近紅外光譜技術(shù)熱療藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，所述的用途為在制備輔助雙熱療藥物中的應(yīng)用；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的雙熱療技術(shù)為磁流體熱療聯(lián)合近紅外光譜技術(shù)熱療技術(shù)。

有益效果

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.采用檸檬酸鹽-金氯酸還原法來制備顆粒的金殼層，簡化Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的構(gòu)建工藝。先用化學(xué)共沉淀法合成水相分散的Fe₃O₄納米磁粒，然后再以這些納米磁粒為晶種，在其表面用金氯酸的檸檬酸鹽還原法生成金殼層。早在1951年，Turkevitch就最先報道了以較小的金納米顆粒為種子，用氫氧化亞胺與金氯酸反應(yīng)來制備粒徑較大的金納米顆粒。最近的研究表明，通過改變晶種與金屬的比率，金納米顆粒的粒徑可控制在5～40納米范圍，尺寸分布相對誤差在10-15％。在避免二次成核方面，逐步的顆粒放大方法要比一次性晶種生長法更有效。只要反應(yīng)試劑和條件選擇恰當(dāng)，同質(zhì)生長金納米顆粒的晶種調(diào)制法對異質(zhì)生長Fe₃O₄@Au核殼結(jié)構(gòu)納米顆粒也同樣有效。我們采用檸檬酸鈉與金氯酸反應(yīng)的方法，在晶種Fe₃O₄納米磁粒表面異質(zhì)生長金殼層，將制備得到的納米磁粒分散在HAuCl₄溶液中，加熱煮沸，利用還原劑對Au³⁺進(jìn)行還原，還原的Au原子會以Fe₃O₄為種子，在其表面沉積并生長。由于非均勻成核所需動力要低于均勻成核的動力要低于均勻成核，因此，Au原子優(yōu)先在Fe₃O₄上成核。從單分散顆粒形成的機(jī)理可知:控制實(shí)驗(yàn)條件，可以使成核與長大分兩個階段進(jìn)行，經(jīng)典的Frens方法制備金溶膠是均勻成核的過程，金核的形成往往需要一定誘導(dǎo)期，當(dāng)溶液中金的濃度低于其成核濃度，但又高于飽和濃度的時候，不會形成新的金核，而是在己有種子的情況下以相同的速度慢慢長大，因此控制種子的量和HAuCl₄的量，能夠控制復(fù)合粒子的大小和表面包覆量。

本發(fā)明制備的Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒大小均勻、圓形、平均直徑分別為30nm、殼層平均厚度5nm，分散性好、具有較好的穩(wěn)定性,磁響應(yīng)性和光學(xué)性質(zhì)；并具有良好的生物相容性。

2.尼妥珠單抗在Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒上的吸附能力較好。為了最大程度保持尼妥珠單抗固定后的抗體活性，我們選擇采用吸附法將尼妥珠單抗固定在Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的Au殼層上。借鑒膠體金標(biāo)記蛋白技術(shù)，金納米粒子對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。這種結(jié)合目前認(rèn)為是金表面負(fù)電荷和抗體正電荷基團(tuán)因靜電作用而吸附,并形成Au-S等穩(wěn)定化學(xué)鍵而形成了牢固結(jié)合。該Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒，平均粒徑30nm，且表面帶有較強(qiáng)負(fù)電荷，可以有效地固定IgG單克隆抗體尼妥珠單抗。由于鹽類成分能影響金膠體對抗體的吸附，并可使溶膠聚沉，利用這一特性，我們選擇尼妥珠單抗的最佳吸附量，結(jié)果顯示40-100μg/mL的尼妥珠單抗能穩(wěn)定Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁?；鞈乙?，說明此范圍質(zhì)量濃度下尼妥珠單抗和Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒比例合適。我們利用常見的酶免疫吸附法,研究了Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒和尼妥珠單抗的吸附情況。

Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒不僅能與抗體結(jié)合，而且可通過磁性分離形成沉淀。因此，在Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒吸附尼妥珠單抗的溶液中加入酶標(biāo)羊抗人IgG的二抗，然后磁性分離，可將Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗復(fù)合納米磁粒-酶標(biāo)羊抗人IgG復(fù)合物從溶液中分離。清液中的物質(zhì)為未和尼妥珠單抗結(jié)合并保留下來的酶標(biāo)抗體，加入底物顯色液，就可正常顯色。如果同時以同濃度的尼妥珠單抗溶液和酶標(biāo)羊抗人IgG反應(yīng)，加入底物顯色液，顯色后測定其OD值，通過兩次OD值得對比，可得到Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒對尼妥珠單抗對抗體Fc端的吸附率。結(jié)果表明Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒對尼妥珠單抗Fc端的吸附效率在90％以上(如表1所示)，說明Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒對尼妥珠單抗的吸附效果比較優(yōu)良。該過程方法簡單,利用了磁性分離和酶標(biāo)抗體的顯色能力,通過免疫酶吸附技術(shù)進(jìn)行測定,獲得了較理想的結(jié)果。采用激光粒度分析、zeta電位測定、UV-Vis光譜和磁滯回線等對Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒進(jìn)行表征。激光粒度分析Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的平均直徑為50nm，單峰狀，粒徑分布窄，與Fe₃O₄@Au的平均直徑30nm相比略有增大，這可能是由于Fe₃O₄@Au表面吸附尼妥珠單抗，形成一層蛋白質(zhì)層，造成Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒在水相中粒徑增大。在pH 7.4中性環(huán)境中，F(xiàn)e₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的zeta電位值為正電荷，說明尼妥珠單抗牢固吸附在Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒表面，將粒子表面電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾?。UV-Vis光譜顯示可以看出Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的最大光吸收峰較Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的最大光吸收峰，出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象，這表明抗體很好的吸附在金表面。Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的磁滯回線接近為重合“S”型曲線，與Fe₃O@Au復(fù)合納米磁粒相似，其矯頑力及剩磁很低，具有良好的超順磁性。

3.具有較強(qiáng)的腫瘤活體追蹤能力。該Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒，可以作為特異性的靶向腫瘤EGFR受體，同時其磁學(xué)性能表現(xiàn)為超順磁性，且具有良好的生物相容性。Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的超順磁性可使磁共振成像(即MRI)的靶區(qū)信號明顯降低而產(chǎn)生負(fù)性對比劑效應(yīng)，從而可以在MRI上對靶細(xì)胞進(jìn)行觀察、示蹤。利用自制備的Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒在MRI的成像特點(diǎn)我們評價了其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性靶向作用。結(jié)果顯示，F(xiàn)e₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育后在T₂WI和T₂^*WI上信號強(qiáng)度均明顯降低，F(xiàn)e₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒和尼妥珠單抗與U251細(xì)胞共孵育后在T₂WI和T₂^*WI上信號強(qiáng)度無明顯降低。表明Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒對U251細(xì)胞具有良好的靶向性，相對于Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒，其可以更多的進(jìn)入U251細(xì)胞，造成T₂WI和T₂^*WI信號明顯降低。

同時，我們建立了裸鼠膠質(zhì)瘤移植瘤模型，進(jìn)行在體MRI靶向性評價。在體MRI結(jié)果顯示，尾靜脈注射Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒后腫瘤組織不同時間點(diǎn)的T₂WI、T₂^*WI強(qiáng)度及信號變化率均有明顯下降，其中T₂^*WI最為明顯，具有統(tǒng)計學(xué)差異，這可能是由于T₂^*WI對磁化率的差異更敏感，鐵引起的磁敏感效應(yīng)更大。而Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒+尼妥珠單抗在注射后2h和8h兩個時間點(diǎn)的信號亦有輕度下降，但下降幅度較Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒小，且持續(xù)時間短，F(xiàn)e₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒注射后24h的信號強(qiáng)度即恢復(fù)至平掃水平，而Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒注射后24h的信號強(qiáng)度仍然維持在較低水平，表明通過尼妥珠單抗介導(dǎo)靶向性和胞吞作用，且效果較非復(fù)合納米磁粒具有顯著性差異，即取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒主要聚集在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞內(nèi)，沒有被單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬降解，這與體外U251細(xì)胞MRI結(jié)果相一致。

4.輔助腫瘤熱療的控溫及恒溫。Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒具有超順磁性，在一定磁場下能快速均勻吸收電磁能而升溫。體外升溫恒溫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在230kHZ的AMF作用下，在最初的30min內(nèi)升溫急劇，30min～45min升溫平緩，50min后溫度幾乎不再上升而恒定。這是因?yàn)樵隗w外升溫實(shí)驗(yàn)中Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒的濃度、AMF磁場的強(qiáng)度較低，并且存在著產(chǎn)熱和散熱的平衡，即以一定的濃度存在于某介質(zhì)當(dāng)中的Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒吸收電磁波所產(chǎn)生的熱量與散發(fā)到介質(zhì)及環(huán)境中的熱量存在著一個動態(tài)的平衡過程。為此，我們可以利用不同濃度的Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗磁流體在一定磁場強(qiáng)度下的升溫恒溫特性，實(shí)現(xiàn)腫瘤熱療的控溫(調(diào)節(jié)磁流體的濃度)及恒溫。

5.輔助腫瘤光熱轉(zhuǎn)換的近紅外光譜技術(shù)(即NIR)熱療。Fe₃O₄@Au-尼妥珠單抗靶向復(fù)合納米磁粒，其吸收光譜較Au納米粒子出現(xiàn)了明顯的紅移。利用其光學(xué)特性，我們采用功率為2.5W的808nm NIR分別對其進(jìn)行照射60min。在最初的15min內(nèi)升溫急劇，30min后溫度幾乎不再上升而恒定。這是因?yàn)樵隗w外升溫實(shí)驗(yàn)中Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的濃度較低，并且存在著產(chǎn)熱和散熱的平衡。同時我們認(rèn)為溫度快速升高是由于NIR照射區(qū)域較小，熱量還未傳遞到周圍的環(huán)境中去，引起的局域溫度升高過快造成的。而且不同濃度的混懸液照射后的溫度梯度也不同，濃度越大溫度升高越快。由于腫瘤細(xì)胞在42℃左右即可被殺死，制備的Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒可以在利用光熱轉(zhuǎn)換的NIR熱療中得到應(yīng)用。

6.磁流體熱療(MFH)聯(lián)合近紅外光譜技術(shù)(NIR)熱療。通過分別進(jìn)行Fe₃O₄@Au靶向復(fù)合納米磁粒在AMF和NIR作用下進(jìn)行升溫恒溫試驗(yàn)，利用Fe₃O₄@Au靶向復(fù)合納米磁粒在AMF作用下升溫速度慢、達(dá)到熱平衡時間長、但恒定溫度高的特點(diǎn)；而其在NIR作用下升溫速度快、達(dá)到熱平衡時間短、但恒定溫度低的特點(diǎn)。因此我們將二者聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行升溫恒溫試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)AMF強(qiáng)度一定并且NIR激光照射功率一定時，在二者同時作用下，開始15分鐘內(nèi)溫度可以迅速上升，20min后溫度幾乎不再上升而保持穩(wěn)定。這可能是由于Fe₃O₄4@Au復(fù)合納米磁粒在AMF和NIR照射開始階段，其Au層對吸收NIR，可以快速的將光能轉(zhuǎn)化為熱能，使周圍環(huán)境溫度迅速升高；而其核心Fe₃O₄可以持續(xù)吸收AMF的電磁波，將電磁能量轉(zhuǎn)化為熱能，使周圍環(huán)境溫度繼續(xù)升高，且在較高溫度達(dá)到熱平衡。Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的這種升溫恒溫特點(diǎn)，具有很好的臨床應(yīng)用前景，可以縮短單純MFH的治療時間，并且可以獲得更好的治療效果。

附圖說明

圖1為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab復(fù)合納米磁粒透射電鏡圖(100000)

圖2為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒平均粒徑分布圖

圖3為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒zeta電位圖

圖4曲線d為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒吸收光譜

圖5為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒的磁滯回線

圖6為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育后在MRI T₂WI上圖像

圖7為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育T₂WI弛豫時間

圖8為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T₂*WI圖像

圖9為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T₂*WI弛豫時間

圖10為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒在交變磁場作用下體外熱動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

圖11為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒在近紅外光作用下體外熱動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

圖12為Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒在交變磁場和近紅外光聯(lián)合作用下體外熱動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步具體說明。

1.主要試劑

1)三氯化鐵(FeCl₃.6H₂O，A.R)：中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站

2)氯化亞鐵(FeCl₂.4H₂O，A.R)：中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站

3)氨水(NH₃.H₂O,A.R):上?；瘜W(xué)試劑有限公司

4)鹽酸(HCL A.R)：南京化學(xué)試劑一廠

5)氫氧化鉀(KOH,A.R)：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司

6)氫氧化鈉(NaOH A.R)：上海化學(xué)試劑有限公司

7)無水乙醇：分析純，南京化學(xué)試劑一廠

8)異丙醇：分析純，南京化學(xué)試劑一廠

9)氯仿：分析純，中國寶應(yīng)化學(xué)試劑廠

10)無水乙醚：分析純，南京化學(xué)試劑一廠

11)鹽酸羥胺：分析純，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站

12)氯金酸(AuCl₃.HCL.4H₂O，A.R)：中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站

13)檸檬酸三鈉(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，A.R):中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站

14)HEPES：AMRESCO，美國

15)胎牛血清(BSA)：杭州四季青生物工程公司，56℃水浴30分鐘滅活

16)PBS：準(zhǔn)確稱取Na2HPO478.248g和NaH2PO430.592g置于大燒杯中，加雙蒸水350ml，攪拌均勻，定容至400ml，即得20×PBS儲存液，用時稀釋成1×PBS

17)DMEM培養(yǎng)基：GIBCO BD公司，美國

18)0.25％胰蛋白酶：AMRESCO，稱取胰蛋白酶0.25g,先用D-Hanks液調(diào)成糊狀，然后再用其定容至100ml，磁力攪拌30分鐘，使其完全溶解，用5.6％NaHCO3調(diào)pH值為7.2-7.6，過濾除菌，分裝后-20℃儲存?zhèn)溆?/p>

19)碳酸氫鈉(NaHCO3A.R)：用雙蒸水配成5.6％溶液，微孔濾膜過濾除菌

20)25％戊二醛：生化試劑，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。用0.2M pH7.2的PBS配成4％戊二醛溶液，4℃保存

21)尼妥珠單抗注射液(每瓶含50mg尼妥珠單抗、4.5mg磷酸二氫鈉、18.0mg磷酸氫二鈉、86.0mg氯化鈉、2.0mg聚山梨醇酯80,50mg/瓶(10mL))，百泰生物藥業(yè)有限公司

2.主要儀器

1)SB3200型超聲波儀：BRANSON，上海

2)SL1001型電子天平：上海民橋電子儀器廠

3)JA1003型電子天平：上海天平儀器廠

4)SHZ-22水浴恒溫震蕩器：江蘇太倉醫(yī)療器械廠

5)微量加樣器：Eppendorf，美國

6)ZFQ-B型全自動蒸汽發(fā)生器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司

7)高速冷凍離心機(jī)：TA—2R(上海離心機(jī)械研究所)

8)免疫酶聯(lián)檢測儀：Multiskan MK3-353,美國

9)668型真空干燥箱：江蘇東臺縣電器廠

10)振動磁強(qiáng)計:PPMS-9,Quantum Design,美國

11)數(shù)字溫度計：TM902C，深圳市經(jīng)騰威實(shí)業(yè)有限公司

12)SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備：頻率：230kHZ，輸出交變加熱電流：5A～30A,深圳雙平高頻加熱器廠

13)752棱光紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司

14)808nm近紅外半導(dǎo)體激光器：MDL-III-808,中國科學(xué)院長春光機(jī)所

15)7.0Tesla Mcrio-MR成像儀：PharmaScan，德國Bruker公司

3.細(xì)胞和動物

1)U251細(xì)胞株(人膠質(zhì)瘤細(xì)胞)：購自中科院上海細(xì)胞研究所

2)Babl/c nu/nu裸小鼠：5～7周齡，雌雄各半，SPF級，購自中科院上海萊克斯實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(滬)2002-0010

實(shí)施例一、Fe₃O₄納米磁粒和Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的制備

1.Fe₃O₄納米磁粒的制備

采用改良的化學(xué)共沉淀方法，用分析純FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O分別用去氧處理后的去離子水配制成0.1mol/L的FeCl₃溶液和FeCl₂溶液，按摩爾比Fe³⁺:Fe²⁺＝5:3將100ml0.1mol/L的FeCl₃溶液和60ml 0.1mol/L的FeCl₂溶液混合于燒瓶中，再用去氧處理后的去離子水分別配制10ml 1mol/L的檸檬酸三鈉溶液和50ml 1mol/L的氫氧化銨溶液，將檸檬酸三鈉和氫氧化銨混合液快速加入氮?dú)獗Ｗo(hù)下正劇烈磁力攪拌著的FeCl₃和FeCl₂混合液，溶液中迅速出現(xiàn)黑色沉淀物，繼續(xù)攪拌30min后停止。于80℃水浴恒溫30min進(jìn)行熟化，然后用強(qiáng)磁鐵吸住燒瓶底部，傾去上層廢液，用去離子水反復(fù)沖洗生成物，至其溶液PH＝7，將生成物真空干燥備用。

2.Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒的制備

用去氧處理后的去離子水溶解Fe₃O₄納米磁粒至0.01mol/L，超聲處理5分鐘，取20ml與20ml的0.1mol/L檸檬酸三鈉溶液混合攪拌10分鐘。再用去離子水稀釋混合液至200ml，加入濃度為0.1％金氯酸溶液10ml，開始加熱該溶液(配回流冷凝管)至沸后，逐次加入1mol/L鹽酸羥胺1ml，繼續(xù)加熱并攪拌，溶液顏色隨即由淡黃變?yōu)樽厣?，最后變?yōu)榻鹉z體的特征紅色，停止加熱。利用永久磁鐵將磁性納米顆粒從溶液中分離出，用lmol/1鹽酸反復(fù)洗滌，以除去未包裹或包裹不完全的多余的Fe₃O₄納米磁粒，并用去離子水清洗3次，即得到Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒，真空干燥備用。

實(shí)施例二、Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒的制備和表征

1.Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒對Nimotuzumab的吸附

取1g/L Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒混懸液5mL,用0.1mol/L的HCL溶液調(diào)節(jié)pH＝9.0,加入5mg/mL的Nimotuzumab 20μL,置于空氣震蕩，于37℃、200轉(zhuǎn)/分左右的速度充分反應(yīng)混合2h。再加入100μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％的BSA溶液反應(yīng)30min,磁性分離20min。小心移取上清液,沉淀用1mL 1％的BSA溶液溶解,搖勻后4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.吸附免疫反應(yīng)和吸附效果的測定

取100μL的Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab混懸液,加入1mL酶標(biāo)羊抗人Fc段二抗溶液(分別為500、1 000、2000、4000、8000、16000倍的酶標(biāo)抗體稀溶液,pH＝7.4),37℃水浴反應(yīng)60min。4℃左右磁性分離60min,取上清液100μL加入100μL鄰苯二胺(OPD)底物溶液避光反應(yīng)10min,加入50μL 2mol/L的硫酸溶液中止反應(yīng),在酶標(biāo)儀中492nm波長下測定OD值。對照實(shí)驗(yàn)中,將Fe₃O₄@Au表面的活性位點(diǎn)以BSA溶液完全封閉,然后加入Nimotuzumab溶液,從而獲得Fe₃O₄@Au-BSA,Nimotuzumab混合溶液。同樣取100uL該混合溶液,加入1mL酶標(biāo)羊抗人Fc段二抗(分別為500、1 000、2000、4000、8000、16000倍的酶標(biāo)抗體稀溶液,pH＝7.4),步驟同上。

表1Fe₃O₄@Au對Nimotuzumab單抗Fc的吸附率

3.電鏡形態(tài)學(xué)檢測

取少量自制備的Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab混懸液，滴有膜銅網(wǎng)，制得電鏡樣品，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)下觀察。它們近似圓形，電子密度高，大小均一,呈散在分布。(圖1)

4.粒徑及zeta電位分析

應(yīng)用ZETA SIZER3000激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑、Zeta電位測定，應(yīng)用動態(tài)光散射軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，記錄平均粒徑及表面電位。Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒的平均直徑為51.4nm，單峰狀，粒徑分布窄(圖2)。在pH 7.4中性環(huán)境中，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒的zeta電位值為38.6±6.1mV(圖3)。

5.光學(xué)性能檢測

應(yīng)用752棱光紫外可見分光光度計測定紫外-可見光(UV-vis)吸收光譜。Fe₃O₄@Au溶液在612nm處有最大的光吸收峰,而Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab溶液的最大光吸收峰在630nm,相同的稀釋倍數(shù)下,不僅Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab的吸收峰值有所降低,而且出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象。這表明Nimotuzumab很好的吸附在納米金表面。(圖4)

6.磁學(xué)性能檢測

振動樣品磁強(qiáng)計(vibration sample magnetometer，VSM)進(jìn)行體外磁響應(yīng)性測定。磁滯回線表明，在300K溫度，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒磁化強(qiáng)度均隨外加磁場強(qiáng)度的增大而增大，但最終都趨于飽和；當(dāng)外加磁場強(qiáng)度逐漸降低至0時，其磁化強(qiáng)度也同樣趨近于0；反方向施加磁場，則反向趨于飽和。其磁滯回線接近為重合“S”型曲線，其矯頑力及剩磁很低，具有良好的超順磁性。(圖5)

7.穩(wěn)定性檢測

Fe₃O₄納米磁粒和Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒分別用生理鹽水制備為磁流體后觀察其外觀形態(tài)、懸浮穩(wěn)定性，然后4℃避光放置，然后每日觀察，持續(xù)2個月，進(jìn)行觀察比較。制備的Fe₃O₄納米磁粒配制為磁流體后4℃、24h后均出現(xiàn)輕度沉降分層，上層為無色清亮液體，下層為黑色液體，境界清楚。予振蕩或超聲懸浮1min后，立即重懸為均勻黑色液體，呈膠體狀。而Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒配制為磁流體后4℃、1w后才出現(xiàn)輕度沉降分層，說明本實(shí)驗(yàn)制備的Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁流體具有較好的懸浮穩(wěn)定性。

實(shí)施例三、Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒體外靶向性評價

1.Fe₃O₄@Au、Nimotuzumab以及Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab標(biāo)記U251細(xì)胞的體外觀察

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251接種于含10％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，飽和濕度5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，使細(xì)胞處于貼壁狀態(tài)。倒置顯微鏡下觀察U251細(xì)胞均質(zhì)而透明，成扁平不規(guī)則的多邊形，單層密集排列，細(xì)胞大小、形態(tài)表現(xiàn)出多樣性，以梭形細(xì)胞及有相對較大的細(xì)胞核的多角形細(xì)胞較為多見，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核異型性明顯，核大小不一，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例較大，核染色質(zhì)增加，核仁增大。分別以0.05mg/mL的Fe₃O₄@Au、Nimotuzumab和Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒體標(biāo)記U251細(xì)胞。對比實(shí)驗(yàn)顯示，U251細(xì)胞內(nèi)吞對Nimotuzumab無內(nèi)吞作用；對Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab顯著強(qiáng)于Fe₃O₄@Au，其中復(fù)合納米磁粒較多，背景干凈，細(xì)胞外無顆粒聚集。這個實(shí)驗(yàn)充分說明了，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab的抗腫瘤效果顯著強(qiáng)于Fe₃O₄@Au，并且是由于形成了靶向復(fù)合納米磁粒而導(dǎo)致的、預(yù)料不到的技術(shù)效果。

2.標(biāo)記U251細(xì)胞的的體外MRI

取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約含細(xì)胞1×10⁶，24h細(xì)胞貼壁后，分為A，B和C三組，分別將濃度為0.05mg/mL的Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒(A組)、Fe₃O₄@Au(B組)和Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒+Nimotuzumab(0.05mg/mL)(C組)與U251細(xì)胞共孵育24h后，用0.25％胰蛋白酶消化后收集、離心，重懸于0.5ml，1％瓊脂糖的Eppendof管中，另取1個Eppendof管內(nèi)為瓊脂糖作為對照。MRI采用7.0Tesla Micro-MR儀(Bruker，PharmaScan 7.0)，內(nèi)徑3.0cm的體線圈，T₂加權(quán)自旋回波成像序列，具體參數(shù)如下：視野(FOV)5cm×5cm；層厚1mm；矩陣256×256；TR2000ms，TE 36ms。測量信號強(qiáng)度及信號范圍，給出時間-信號衰減圖形。體外MRI顯示，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育后(A組)在T₂WI上信號強(qiáng)度與對照組相比明顯降低；Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育后(B組)在T₂WI上信號強(qiáng)度無明顯降低；Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒+Nimotuzumab與U251細(xì)胞共孵育后(C組)在T₂WI上信號強(qiáng)亦無明顯降低。其中，圖6表示：Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育后在MRI T₂WI上圖像(A)，F(xiàn)e₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育后在MRI T₂WI上圖像(B)，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒和Nimotuzumab與U251細(xì)胞共孵育后在MRI T₂WI上圖像(C)，瓊脂糖為對照；圖7表示：Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育T₂WI弛豫時間(A)，F(xiàn)e₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒與U251細(xì)胞共孵育T₂WI弛豫時間(B)，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒和Nimotuzumab與U251細(xì)胞共孵育(C)(^*與對照組相比，P＜0.05))

實(shí)施例四、Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒體內(nèi)靶向性評價

1.裸鼠膠質(zhì)瘤移植瘤模型制作

取對數(shù)生長期的人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，用0.25％胰酶消化離心后，以生理鹽水調(diào)整好濃度以2×10⁶細(xì)胞數(shù)量注入裸鼠右下肢皮下。每個部位0.15mL，注射點(diǎn)距進(jìn)針點(diǎn)1cm，均形成皮丘，經(jīng)2-3周于接種部位腫瘤開始生長，經(jīng)4周腫瘤直徑達(dá)0.5cm左右始用于試驗(yàn)。

2.Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab復(fù)合納米磁粒靶向膠質(zhì)瘤的MRI

按分組要求，將12只裸鼠隨機(jī)分成A和B三組，每組6只，A組經(jīng)尾靜脈注射Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab復(fù)合納米磁粒，B組經(jīng)尾靜脈注射Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒，納米磁粒濃度為0.05mg/mL，注射劑量均為10mg/kg。在注射前及注射后2h、8h、24h分別進(jìn)行7.0Tesla超高場強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動物MR系統(tǒng)成像，觀察不同時間點(diǎn)腫瘤的信號變化，成像序列包括SE-T₁WI、SE-T₂WI、GRE-T₂^*WI。量化分析腫瘤組織信號改變的程度、范圍、隨時間的改變。在體MRI結(jié)果顯示，A組注射Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒后腫瘤組織不同時間點(diǎn)的T₂WI、T₂^*WI強(qiáng)度及信號變化率均有明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異。而B組Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒在注射后2h和8h兩個時間點(diǎn)的信號亦有輕度下降，但下降幅度較A組小，且持續(xù)時間短。B組在注射后24h的信號強(qiáng)度即恢復(fù)至平掃水平，而A組注射后24h的信號強(qiáng)度仍然維持在較低水平。圖8表示：Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T2*WI圖像(A)，F(xiàn)e₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒注射后裸鼠移植瘤MRI T2*WI圖像(B)(白色箭頭指向移植瘤)；圖9表示：Fe3O4@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒注射后不同時間點(diǎn)裸鼠移植瘤MRI T2*WI弛豫時間(A)，F(xiàn)e3O4@Au復(fù)合納米磁粒注射后不同時間點(diǎn)裸鼠移植瘤MRI T2*WI弛豫時間(B)(*與0時間點(diǎn)相比，P＜0.05)。

實(shí)施例五、Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒熱動力學(xué)試驗(yàn)

(1)將Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒用0.9％NaCl溶液配制成濃度分別為1.0g/L的納米磁流體，取5ml入25mm平底試管中，置于頻率230KHz，輸出電流30A的SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備平板線圈上加熱1h，起始室溫25℃，試管底距高頻磁感應(yīng)加熱線圈中心0.5cm，每隔5min用TM902C數(shù)字測溫儀測溫1次，以時間為橫坐標(biāo),溫度為縱坐標(biāo)繪制Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒升溫曲線。當(dāng)磁場強(qiáng)度一定時，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒在磁場作用下，溫度可以上升至42.5℃，在作用前30min內(nèi)升溫迅速、30～45min升溫平緩、50min后溫度幾乎不再上升而恒定。(圖10)

(2)將Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒用0.9％NaCl溶液配制成濃度分別為1.0g/L的納米磁流體,取5ml入25mm平底試管中，應(yīng)用輸出功率為2.5W的808nm近紅外半導(dǎo)體激光器照射1小時，起始室溫25℃，每隔5分鐘用TM902C數(shù)字測溫儀測溫1次，以時間為橫坐標(biāo),溫度為縱坐標(biāo)繪制Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒升溫曲線。當(dāng)近紅外(NIR)的激光照射功率一定時，F(xiàn)e₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒在激光照射下，溫度可以上升達(dá)41.3℃，在作用前15min內(nèi)升溫迅速、30min后溫度幾乎不再上升而恒定。(圖11)

(3)將Fe₃O₄@Au-Nimotuzumab靶向復(fù)合納米磁粒用0.9％NaCl溶液配制成濃度分別為1.0g/L的納米磁流體,取5ml入25mm平底試管中，置于頻率230KHz，輸出電流30A的高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備平板線圈上加熱，同時應(yīng)用輸出功率為2.5W的808nm近紅外半導(dǎo)體激光器照射，起始室溫25℃，時間1小時，每隔5min用TM902C數(shù)字測溫儀測溫1次，以時間為橫坐標(biāo)，溫度為縱坐標(biāo)繪制Fe₃O₄@Au復(fù)合納米磁粒升溫曲線。當(dāng)磁場強(qiáng)度一定并且近紅外激光照射功率一定時，在AMF和NIR同時作用下，開始15分鐘內(nèi)溫度可以迅速上升至45.5℃，20min后溫度幾乎不再上升而保持穩(wěn)定。(圖12)。