本發(fā)明屬于醫(yī)療健康領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種新型的納米顆粒的MR成像造影劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

磁共振檢查具有軟組織分辨率高、無(wú)電離輻射等特點(diǎn)，有望成為臨床最重要的檢查方法，并且增強(qiáng)掃描能增加組織對(duì)比度，極大的提高了病灶的檢出率和診斷正確率。目前，臨床應(yīng)用的磁共振造影劑是釓類造影劑，然而，造影劑游離出的釓離子可能導(dǎo)致的腎源性系統(tǒng)纖維化，因而釓類對(duì)比劑的安全性受到質(zhì)疑。因此，臨床應(yīng)用的釓造影劑，制備復(fù)雜、造價(jià)高，游離的釓離子毒性大。錳是一種過(guò)度金屬元素，其外層電子排布為3d⁵4s²，在第三軌道上有5個(gè)不成對(duì)的電子，故具有很強(qiáng)的順磁性和很好的弛豫效能，能縮短周?chē)鷼滟|(zhì)子的T1和T2，引起相應(yīng)MR信號(hào)改變。錳是人體內(nèi)的微量元素，可隨著代謝周期性排除體外，生物安全性較高，然而離子形式的錳具有神經(jīng)毒性，因此獲得非離子型穩(wěn)定的錳造影劑是錳類造影劑應(yīng)用臨床的關(guān)鍵。錳基造影劑發(fā)展迅速，主要分類有錳離子螯合物類和錳氧化物類。與錳氧化物類造影劑相比，離子螯合物整體弛豫效能高。錳離子螯合物又可以分為小分子螯合物、大分子螯合物、納米粒子材料。增加螯合物的尺寸，可以提高造影劑的穩(wěn)定性、弛豫率及生物相容性，將順磁性金屬與納米粒子材料結(jié)合起來(lái)不僅可以增加其生物兼容性，還可以提高其弛豫率，是一個(gè)很有前景的發(fā)展方向。

錳類造影劑毒性低，弛豫效能高，有望取代釓成為安全有效的造影劑。錳類造影劑，尤其是納米錳類造影劑，主要存在兩的問(wèn)題:一、錳離子螯合穩(wěn)定性。二、載體的生物穩(wěn)定性及生物相容性。很多錳造影劑在體內(nèi)理化因素下會(huì)發(fā)生化學(xué)改變，如：錳福地吡三鈉(MnDPDP)和錳氧化物納米粒子類，在酸性條件下會(huì)釋放Mn²⁺，釋放的錳離子會(huì)增加中毒可能性。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)安全性高、制備陳本低的造影劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的納米顆粒的MR成像造影劑及其制備方法。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種MR納米造影劑，所述MR納米造影劑由黑色素作為載體螯合錳離子制成。

進(jìn)一步地，所述黑色素為水溶性黑色素。

進(jìn)一步地，所述水溶性黑色素為PEG修飾的黑色素。

進(jìn)一步地，所述MR納米造影劑具有下式所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明的第二方面，提供了一種MR納米造影劑的制備方法，所述方法包括步驟：

(1)水溶性黑色素納米顆粒

取黑色素并制備水溶性黑色素納米顆粒；

(2)PEG修飾

使用PEG修飾步驟(1)中制備的水溶性黑色素納米顆粒；

(3)螯合錳離子

混合步驟(2)中制備的水溶性黑色素納米顆粒和含錳離子溶液，所述水溶性黑色素納米顆粒螯合錳離子，從而制得所述MR納米造影劑；

其中，步驟(2)中PEG和所述水溶性黑色素納米顆粒的質(zhì)量比為3-8：1，優(yōu)選地為5：1。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中，取黑色素(melanin)10-30mg，加入0.1mol/L NaOH 3-5ml超聲振蕩混勻溶解；緩慢加入0.1mol/L HCl 2-3ml，并超聲振蕩，調(diào)節(jié)PH值到7-8(優(yōu)選為7.5)，離心15min；用雙蒸水洗滌、離心3-10次；經(jīng)冷凍干燥制得所述水溶性黑色素納米顆粒。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，取步驟(1)制得的所述水溶性黑色素納米顆粒，加入約5-10ml超純水，超聲振蕩溶解，然后加入NaOH，調(diào)節(jié)PH值到9.5；

取所述水溶性黑色素納米顆粒的5倍質(zhì)量的PEG放于另一樣品瓶中，加8ml左右超純水，超聲振蕩溶解，然后先先用NaOH調(diào)節(jié)PH值到9.5；

向上述制得的所述水溶性黑色素納米顆粒溶液中通入氮?dú)?30-90s,優(yōu)選60s)同時(shí)倒入上述制得的PEG溶液，充分混勻后，攪拌20-30h；

4000-5000r/min離心15-20min，重復(fù)洗滌離心5次，調(diào)整PH值到7左右，從而完成PEG修飾步驟，獲得PEG-MNP水溶液。

進(jìn)一步地，所述步驟(3)中，將獲得的PEG-MNP水溶液移入樣品瓶中，調(diào)節(jié)溶液體積到2ml；加入配制好的10mg/ml的MnCl₂水溶液2.5ml，混勻后，40℃下磁力攪拌器攪拌1h，3500r/min洗滌離心30min，重復(fù)洗滌離心4-5次，獲得所述MR納米造影劑。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了黑色素錳分子結(jié)構(gòu)及合成示意圖。

圖2中，圖a為黑色素納米顆粒(MNP-PEG)，其粒徑大小約5nm；圖b為黑色素-錳顆粒(MNP-Mn),其粒徑約7nm。

圖3顯示了黑色素與黑色素-錳核磁T1對(duì)比，可見(jiàn)連接錳離子后，納米粒子T1信號(hào)強(qiáng)度明顯提高。

圖4顯示了黑色素-錳與Gd-DTPA在金屬離子相同摩爾濃度下，信號(hào)強(qiáng)度及弛豫率的對(duì)比，可見(jiàn)MNP-Mn信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于Gd-DTPA。

圖5顯示了黑色素-錳與Gd-DTPA溶液的弛豫率，以1/T1為縱坐標(biāo)，離子濃度為橫坐標(biāo)，直線的斜率即為弛豫率。(T1值由西門(mén)子核磁自帶測(cè)量軟件測(cè)出)

圖6顯示了黑色素-錳連接羅丹明b，標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞激光共聚焦圖像，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒狀小泡。

圖7顯示了黑色素-錳(MNP-Mn)可用于標(biāo)記干細(xì)胞，并示蹤干細(xì)胞。

圖8顯示了活體移植MNP-Mn標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核磁成像，可見(jiàn)肌肉內(nèi)標(biāo)記干細(xì)胞呈明顯高信號(hào)，在注射兩周后仍能明顯觀察到，于注射后第21天檢測(cè)時(shí)信號(hào)消失。

具體實(shí)施方式

在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@類方法和條件可以變動(dòng)。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書(shū)限制。

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。

黑色素是生物體內(nèi)常見(jiàn)的色素，來(lái)源廣泛，價(jià)廉易得。人體內(nèi)的黑色素主要存在于皮膚及頭發(fā)中，是酪氨酸的代謝終產(chǎn)物，不再參與其他化學(xué)過(guò)程，因而在生物體內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。天然的黑色素是一種聚合物，不溶于水，具有吸附多種金屬陽(yáng)離子的特性。本發(fā)明涉及的水溶性黑色素納米粒(PEG-MNP)的合成方法可以參考文獻(xiàn)(如，F(xiàn)an,Q.,等,Transferring biomarker into molecular probe:melanin nanoparticle as a naturally active platform for multimodality imaging.J Am Chem Soc,2014.136(43):p.15185-94)進(jìn)行，并且合成的水溶性黑色素納米粒與多種金屬離子能穩(wěn)定螯合，黑色素納米顆粒具有光聲特性，其表面富含可修飾基團(tuán)可以連接多種有效基團(tuán)，作為多模態(tài)成像及診療一體化的有效載體。

研究表明水溶性黑色素(PEG-MNP)與金屬離子結(jié)合緊密，在人體理化環(huán)境下離子沒(méi)有發(fā)生明顯的游離，黑色素是生物體的代謝終產(chǎn)物，不會(huì)在人體內(nèi)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。另一個(gè)重要的方面是載體的生物穩(wěn)定性及生物相容性。納米材料在體內(nèi)的代謝途徑以及納米材料本身的毒性，是納米造影劑生物應(yīng)用重要的參照因素。理想的錳類載體，在生物體內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，不被降解，以免錳離子游離出來(lái)造成毒性，同時(shí)，又能在體內(nèi)循環(huán)適當(dāng)時(shí)間后排出體外，不在生物體內(nèi)蓄積。本發(fā)明中合成的水溶性黑色素粒徑小，約5nm，生物相容性好，具有較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，并且可以通過(guò)腎臟基底膜經(jīng)尿液排泄。因此，MNP-Mn很好的解決了錳類造影劑的主要問(wèn)題。

本發(fā)明提供的磁共振造影劑應(yīng)帶具有以下特點(diǎn)：1.良好的穩(wěn)定性和生物相容性。2.弛豫效能較高。3.水溶性好。4.在體內(nèi)有適當(dāng)?shù)难h(huán)時(shí)間又易排除體外。5.有一定靶向性。MNP-Mn其組成部分均是人體含有的物質(zhì)，其毒性極低，水溶液弛豫效能高，信號(hào)強(qiáng)度及弛豫率均優(yōu)于Gd-DTPA。另外，其能成功長(zhǎng)時(shí)間標(biāo)記示蹤骨髓間充干細(xì)胞，說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，并且信號(hào)強(qiáng)度高。納米材料可以利用腫瘤組織的滲透與滯留增強(qiáng)效應(yīng)(EPR)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向作用，黑色素表面含有豐富的可修飾基團(tuán)，可以連接功能性基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向作用。因此，黑色素-錳納米粒(MNP-Mn²⁺)擁有臨床應(yīng)用磁共振造影劑的所有特點(diǎn)。

本發(fā)明提供了一種新型的活體內(nèi)磁共振示蹤干細(xì)胞的納米造影劑,本發(fā)明利用水溶性小粒徑的黑色素納米粒作為載體，螯合錳離子作為磁共振納米造影劑，其合成方法簡(jiǎn)單，其生物相容性好，毒性小，弛豫率高，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)釓類造影劑的缺點(diǎn)，標(biāo)記干細(xì)胞后可在TIWI引起高信號(hào)且在活體內(nèi)可被磁共振示蹤到，顯像時(shí)間長(zhǎng)，因此黑色素-錳有望轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的納米造影劑，用于干細(xì)胞的磁共振TIWI活體示蹤。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲得。

實(shí)施例1

取黑色素melanin(購(gòu)自Sigma-aldrich公司)20mg。

加入0.1mol/L NaOH 4ml超聲振蕩水浴混勻溶解。

再緩慢加入0.1mol/L HCl 2.5ml，并超聲振蕩棒振蕩，調(diào)節(jié)PH值到7-8，以略偏堿性為主。

放入超濾離心管內(nèi)離心15min轉(zhuǎn)速4500r/min。

用雙蒸水洗滌離心5-6次，直至過(guò)濾后的水泛清。

然后用移液槍移出至10ml的離心管中(量約1ml左右)。

后置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)。

24小時(shí)后獲得量約14mg的水溶性黑色素納米顆粒。

放于樣品玻璃小瓶中，加入約8ml超純水，超聲水浴振蕩溶解，然后先加200μl 0.1mol/L NaOH超聲水浴振蕩溶解，調(diào)節(jié)PH值到9.5。

取大約制作的黑色素的5倍量的PEG約70mg放于玻璃小瓶中，加8ml左右超純水，超聲振蕩溶解，然后先加200μl 0.1mol/L NAOH超聲水浴振蕩溶解，調(diào)節(jié)PH值到9.5。

通入氮?dú)饧s1min(中間倒入PEG)，充分混勻后，測(cè)試PH值9.5，磁力攪拌器上常溫下攪拌24h。

移入超濾離心管，加入超純水，離心15-20min轉(zhuǎn)速4000-5000r/min，重復(fù)5次，測(cè)PH值，調(diào)整PH值到7左右。

將獲得的PEG-MNP水溶液移入樣品瓶中，調(diào)節(jié)溶液體積到2ml。

加入配制好的10mg/ml的MnCl₂水溶液2.5ml，混勻后，40℃下磁力攪拌器攪拌1h，3500r/min洗滌離心30min，重復(fù)4-5次。

本發(fā)明合成的水溶性黑色素步驟簡(jiǎn)便，電鏡觀測(cè)其粒徑僅5nm，粒徑均勻，水溶液?jiǎn)畏稚⑿院茫瑘F(tuán)聚不明顯。圖2顯示了本發(fā)明制備的納米顆粒，其中，圖a為黑色素納米顆粒(MNP-PEG)，其粒徑大小約5nm；圖b為黑色素-錳顆粒(MNP-Mn),其粒徑約7nm。錳離子負(fù)載穩(wěn)定，模擬生物體內(nèi)不同PH環(huán)境下，錳離子游離的量非常少。作為造影劑MNP-Mn弛豫率高，可以減少造影劑劑量，從而進(jìn)一步減小毒性。

使用本發(fā)明制備的納米顆粒進(jìn)行造影實(shí)驗(yàn)，將黑色素、黑色素-錳、Gd-DTPA配成如圖標(biāo)注的濃度，利用磁共振成像設(shè)備掃描并測(cè)量數(shù)值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖3顯示了黑色素與黑色素-錳核磁T1對(duì)比，可見(jiàn)連接錳離子后，納米粒子T1信號(hào)強(qiáng)度明顯提高。

圖4和圖5分別顯示了黑色素-錳與Gd-DTPA在金屬離子相同摩爾濃度下，信號(hào)強(qiáng)度及弛豫率的對(duì)比，可見(jiàn)MNP-Mn弛豫率及信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于Gd-DTPA。

將本發(fā)明制備的黑色素-錳連接羅丹明b，標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行觀察，將黑色素-錳與羅丹明b混合攪拌1h，用超濾離心管除去游離的羅丹明b，并將黑色素-錳-羅丹明b加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中孵育4h。

結(jié)果如圖6所示，激光共聚焦圖像顯示細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒狀小泡。

使用本發(fā)明制備的黑色素-錳(MNP-Mn)標(biāo)記干細(xì)胞，將黑色素-錳(MNP-Mn)加入到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中孵育24h，并將離心濃縮得到的干細(xì)胞進(jìn)行核磁掃描。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，圖7顯示了黑色素-錳(MNP-Mn)可用于標(biāo)記干細(xì)胞，并示蹤干細(xì)胞。

活體移植MNP-Mn標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將MNP-Mn標(biāo)記的干細(xì)胞團(tuán)注到大鼠肌肉內(nèi)，并進(jìn)行核磁掃描。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，圖8顯示了活體移植MNP-Mn標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞核磁成像，可見(jiàn)肌肉內(nèi)標(biāo)記干細(xì)胞呈明顯高信號(hào)，在注射兩周后仍能明顯觀察到，于注射后第21天檢測(cè)時(shí)信號(hào)消失。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。