本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體涉及一種具有抗腫瘤活性和核酸遞送功能的陽離子化香菇多糖制備方法及其作為基因載體的同時發(fā)揮免疫學活性的應用。
背景技術：
腫瘤是威脅人類健康和生命的常見疾病之一，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，國際癌癥研究中心預測未來20年全球新增腫瘤病例會上升到每年2200萬，腫瘤患者死亡病例將上升到每年1300萬(IARC Science Public Lyon, 2014, 1: 1365)。腫瘤已成為全世界關注的極其重要的公共衛(wèi)生疾病。目前，臨床用于腫瘤治療的大部分化療藥物，主要通過抑制細胞增殖和腫瘤生長發(fā)揮其作用，在殺傷腫瘤細胞的同時也殺傷正常細胞，其昂貴的醫(yī)療費用和較大的毒副作用嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為患者及學者所面臨的共同難題，因而人們一直尋找最優(yōu)化的腫瘤治療方法。
中藥在腫瘤治療方面日益顯現(xiàn)出很大的優(yōu)勢，已成為我國腫瘤治療領域的一大特色。多糖是中藥研究最深入、最廣泛的抗腫瘤活性成分之一，更是中藥抗腫瘤生理作用的主要物質(zhì)之一，被稱為“生物反應調(diào)節(jié)劑”。與直接殺傷腫瘤細胞的化療藥物不同，中藥多糖除了具有直接抑制腫瘤細胞作用之外，更重要是通過其免疫調(diào)節(jié)作用刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活多種免疫細胞，提高宿主對腫瘤細胞的特異性抗原免疫反應能力，這也是防治腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移的重要條件。趙國華等(藥學學報, 2003, 38: 37)報道，山藥多糖對Lewis 肺癌和B16黑色素瘤有最佳的抑制作用。李小定等(華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2002, 21: 261)實驗證明，灰樹花多糖既可直接殺傷癌細胞又可提高機體的免疫力。謝遵江等(解剖學報, 2002, 33: 538)發(fā)現(xiàn)人參多糖本身或誘導產(chǎn)生的細胞因子能增強IL-2對NK 細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的刺激作用，對腫瘤有極強的殺傷和抑制作用。中藥抗腫瘤機制的研究為治療腫瘤提供了理論基礎，同時也開辟了新途徑。
香菇多糖(Lentinan，LNT)是從傳統(tǒng)藥食同源的香菇中分離、提取得到的藥用活性成分。1969年Chihara 等率先從香菇中提取出抗腫瘤活性的多糖，活性成分是它分支結構中的β-(1→3)-D-葡聚糖，它主鏈的葡萄糖基通過β-(1→3)糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈的葡萄糖基由分布的β-(1→6)糖苷鍵連接形成，分子結構中含有大量活性基團-OH。臨床上，將香菇多糖與化療藥物聯(lián)用可用于不能手術切除或轉(zhuǎn)移復發(fā)性腫瘤的輔助治療(Carbohydrate Polymers, 2012, 88: 966-972)。例如，其與紫杉醇聯(lián)用可激活NLRP3炎性體和ASK1/p38MAPK信號通路誘導A549細胞凋亡(Critical Reviews In Food Science and nutrition, 2015, 10: 132)。香菇多糖/S-1聯(lián)合治療胃癌患者，結果原發(fā)灶明顯縮小，且腹部CT未檢測到淋巴結轉(zhuǎn)移(Carbohydrate Polymers, 2016, 137: 52)。研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖本身對腫瘤細胞沒有直接抑制作用，而是激活T細胞，促進淋巴細胞活化因子的產(chǎn)生，釋放各種輔助性T細胞因子，增強宿主腹腔巨噬細胞吞噬率，最終達到殺傷腫瘤細胞的。
腫瘤的發(fā)生與發(fā)展都與基因直接或間接相關，從基因水平治療腫瘤能夠直接糾正和修復與腫瘤發(fā)病有關的基因，有效達到治療腫瘤的目的。而基因治療腫瘤的成功與否在很大程度上取決于安全、高效的基因傳遞載體。以多糖為骨架，經(jīng)聚乙烯亞胺等改性得到的納米載體不僅具有生物相容性好的優(yōu)點，同時也能高效壓縮核酸并轉(zhuǎn)染至細胞(Advanced Drug Delivery Reviews, 2013, 65: 1123-1147)。因此，多糖類納米載體已成為目前基因傳遞載體的研究熱點之一(鄭州大學學報, 2014, 4: 457-460)。香菇多糖分子結構中含有大量活性基團，通過對其進行陽離子化修飾可實現(xiàn)基因遞送的功能，并且保留了香菇多糖的生物活性，但是至今未見到有關陽離子化香菇多糖作為基因傳遞載體的同時又發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的公開報道。
技術實現(xiàn)要素：
針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種陽離子化香菇多糖的制備方法，可作為基因載體遞送系統(tǒng)并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，有效解決腫瘤治療中的應用問題。
本發(fā)明解決的技術方案是，通過pH敏感型化學鍵將香菇多糖與低分子量的聚乙烯亞胺連接，香菇多糖分子量為20-800kD，聚乙烯亞胺分子量為600-1200D，聚乙烯亞胺與香菇多糖的摩爾比為1:3-10。具體制備方法是：
1）將50-150mg香菇多糖溶解于8-10ml去離子水或二甲基亞砜中，在23-27℃，氮氣保護下與100-450mg活化試劑A避光反應4-48h，將反應液透析2-3d，或者在50℃與100-450mg活化試劑B反應4-24h，得活化的香菇多糖；所述的活化試劑A為高碘酸鉀、乙二胺、含有3-5%乙二胺的磷酸鹽緩沖液、羰基二咪唑、三乙胺的一種或兩種以上，活化試劑B為馬來酸酐、琥珀酸酐、4-二甲胺基吡啶、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、 N-羥基琥珀酰亞胺的一種或兩種以上；
2）將100-300mg聚乙烯亞胺溶于2-6ml體積濃度為3.7% 的鹽酸或二甲基亞砜中，然后在氮氣保護下接枝到活化的香菇多糖上，或者直接將100-300mg聚乙烯亞胺接枝到活化的香菇多糖上，在23-27℃，氮氣保護下，避光反應24-72h，于超純水中透析2-3d，冷凍干燥，得聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。
本發(fā)明的制備工藝簡便，原料來源較為廣泛，成本低廉，極具開發(fā)和應用前景，制備得到的陽離子化香菇多糖形態(tài)均一，粒徑在200 nm左右，分布均勻，結構穩(wěn)定，生物相容性良好，能夠高效負載核酸并遞送至腫瘤細胞，實現(xiàn)基因治療與免疫治療聯(lián)合的抗腫瘤作用。
具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學公司購買。
實施例1
本發(fā)明在具體實施中，該陽離子化香菇多糖可以是，1）將100 mg香菇多糖溶于10 mL去離子水中，邊攪拌邊加入150mg高碘酸鉀，在25℃，氮氣保護下避光反應48h，再滴入含有200μL乙二胺的5mL磷酸鹽緩沖液，于1h內(nèi)滴加完畢，氮氣保護下避光攪拌36 h，將反應液于超純水中透析3d，得活化的香菇多糖反應液；
2）再向活化的香菇多糖反應液中逐滴加入含有250mg聚乙烯亞胺的2mL體積濃度為3.7%的鹽酸，在25℃，氮氣保護下，避光攪拌72 h，于超純水中透析2d，冷凍干燥，得聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。
實施例2
本發(fā)明在具體實施中，該陽離子香菇多糖還可以是，1）將100mg香菇多糖溶于8mL二甲基亞砜中，然后加入30mg羰基二咪唑和100μL三乙胺，在26℃，氮氣保護下避光攪拌4h，得活化的香菇多糖反應液；
2）再向活化的香菇多糖反應液中逐滴加入含有100mg聚乙烯亞胺的6mL二甲基亞砜（DMSO）溶液，在23℃，氮氣保護下，避光攪拌24h，于超純水中透析2d，冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。
實施例3
本發(fā)明在具體實施中，該陽離子香菇多糖還可以是，1）將100 mg香菇多糖溶于10 mL二甲基亞砜中，依次加入10mg 4-二甲胺基吡啶和400mg馬來酸酐，50℃下攪拌24h，再依次加入10mg 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和5mg N-羥基琥珀酰亞胺攪拌反應4h，得活化的香菇多糖反應液；
2）再向活化的香菇多糖反應液中加入300mg聚乙烯亞胺，氮氣保護下，避光攪拌48h，于超純水中透析2d，冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。
實施例4
本發(fā)明在具體實施中，該陽離子化香菇多糖還可以是，1）將100 mg香菇多糖溶于10mL二甲亞砜中，依次加入10mg 4-二甲胺基吡啶和400mg琥珀酸酐，50℃下攪拌24h，再依次加入10mg l-乙基(3一二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和50mgN-羥基琥珀酸亞胺攪拌反應4h，得活化的香菇多糖反應液；
2）再向活化的香菇多糖反應液中加入300mg聚乙烯亞胺，氮氣保護下，避光攪拌48h，將反應液于超純水中透析3d，冷凍干燥，得到聚乙烯亞胺修飾的香菇多糖，即陽離子化香菇多糖。
本發(fā)明制備的陽離子化香菇多糖經(jīng)多次反復實驗，均能取得較好的結果，達到滿意的技術效果，有關試驗資料如下：
實驗一：將不同質(zhì)量的陽離子化香菇多糖溶于20μL去離子水中，加入2μg質(zhì)粒eGFP，室溫孵育30 min，進行0.7 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測。實驗結果顯示，當加入陽離子化香菇多糖與質(zhì)粒eGFP質(zhì)量比為16:1時，質(zhì)粒eGFP條帶完全滯留在孔道中，這說明當陽離子香菇多糖可以完全負載核酸。將不同質(zhì)量比的陽離子化香菇多糖與質(zhì)粒eGFP復合物進行粒徑和電位的檢測，隨著香菇多糖比例增加，復合粒徑會逐漸變小，說明質(zhì)粒eGFP已完全被多糖結合并形成致密的復合物。當質(zhì)量比增加電位則繼續(xù)增大，到一定值時電位在0左右，說明當陽離子香菇多糖通過正負電荷相互作用完全負載核酸，這與瓊脂糖凝膠電泳結果相符。
實驗二：肝癌細胞HepG2在含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基和37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。按照1.5×105個/孔接種于6孔板培養(yǎng)16 h，將FAM標記的小干擾RNA(siPD-L1)加入培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染4 h后，流式細胞儀測定攝取量，實驗結果顯示陽離子香菇多糖負載siPD-L1的攝取量為96.2%，實驗結果表明陽離子香菇多糖能夠?qū)⒑怂徇f送至細胞內(nèi)。
實驗三：乳腺癌細胞MCF-7在含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基和37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，按照5×103個/孔接種于96孔板中培養(yǎng)16 h，將不同質(zhì)量的陽離子香菇多糖加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后用四甲基偶氮哩鹽比色法測定細胞增殖。實驗結果顯示，在0-640 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著陽離子香菇多糖含量的增加，細胞存活率略有增加，試驗結果表明陽離子香菇多糖具有良好的生物相容性。
實驗四：取雌性的昆明小鼠15只，每組5只隨機分三組：空白對照組(NC)、香菇多糖組(LNT)、陽離子化香菇多糖組(LNT-PEI)，分別通過尾靜脈注射生理鹽水、香菇多糖溶液（給藥量為12 mg/kg）、陽離子化香菇多糖溶液（給藥量為12 mg/kg）。每2 d給藥一次，共給藥7次。實驗過程中觀察小鼠生活狀態(tài)，檢測小鼠體重變化。最后一次給藥結束后的第二天處死小鼠，取各組小鼠臟器，以及腹腔巨噬細胞和脾細胞進行體外抗腫瘤活性考察。結果顯示，與NC組相比，LNT組和LNT-PEI組小鼠的體重變化和臟器指數(shù)均沒有明顯差異。體外抗腫瘤活性考察結果顯示，LNT組和LNT-PEI組脾細胞抑制率分別為20.74%、25.57%，巨噬細胞細胞抑制率分別為10.17%、18.12%。RT-PCR結果顯示，與NC組相比LNT組和LNT-PEI組的脾臟、胸腺的IL-2、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達量均有所增加。說明陽離子化香菇多糖保持了香菇多糖自身的免疫學活性，在體內(nèi)仍可以發(fā)揮生物調(diào)節(jié)作用。
在上述實驗中，所用到的細胞株，質(zhì)粒，小干擾RNA為：
1、細胞株：肝癌細胞HepG2，乳腺癌細胞MCF-7，均購自中國科學院細胞庫。
2、質(zhì)粒：增強型綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒eGFP(GenBank登陸號X83959)，購自BD Biosciences Clontech公司。
3、小干擾RNA（siPD-L1）：
正義鏈，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
反義鏈，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
本發(fā)明陽離子化香菇多糖作為基因傳遞載體在腫瘤預防與治療中的應用，還包括將陽離子化香菇多糖與抗腫瘤基因治療藥物混合后進行體外、體內(nèi)抗腫瘤的生物學評價。
所述抗腫瘤基因治療藥物有：裝載有治療基因的質(zhì)粒DNA、裝載有治療基因的病毒載體DNA、反義寡核苷酸、小干擾RNA中的一種或幾種。
所述的腫瘤細胞為鼠源或人源的各種實體瘤細胞，包括乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、鼻咽癌細胞、舌癌細胞、食管癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、前列腺癌細胞、腎癌細胞、陰莖癌細胞、翠丸癌細胞、皮膚癌細胞、白血病細胞、惡性黑色素瘤細胞中的一種。
所述的腫瘤為人器官表面或內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、舌癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、陰莖癌、翠丸癌、皮膚癌、白血病、惡性黑色素瘤中的一種。
由上述表明，本發(fā)明的陽離子化香菇多糖制備方法經(jīng)反復多次試驗均取得較為滿意的技術效果。本發(fā)明通過將聚乙烯亞胺接枝到香菇多糖，作為核酸傳遞載體的同時保持了香菇多糖免疫活性，本發(fā)明中的陽離子香菇多糖合成原料來源廣泛，制備條件容易滿足，制備成本低，兼?zhèn)漭^好的水溶性，穩(wěn)定的物理以及化學性質(zhì)，較強的核酸負載能力，陽離子化香菇多糖作為一種良好的基因傳遞載體的同時保持香菇多糖自身的免疫學活性，開辟了基因治療與免疫治療聯(lián)合抗腫瘤新途徑、新方法，具有巨大的醫(yī)用價值和社會效益。