本發(fā)明涉及一種從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮的方法，屬于天然產(chǎn)物提取與分離
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：銀杏被稱為“活化石”植物，是我國特有的珍貴樹種，隨著銀杏葉中有效成分的藥用、保健等綜合價(jià)值的挖掘和開發(fā)，對銀杏葉的系統(tǒng)研究在世界范圍內(nèi)掀起了高潮。銀杏葉中蛋白質(zhì)含量10.9％～15.5％，總糖含量7.3％～8.7％，還原糖含量4.0％～5.6％，黃酮含量0.4％～1.2％。已開發(fā)的銀杏葉提取物主要是銀杏葉總黃酮醇苷(含萜類內(nèi)酯)提取物(簡稱：銀杏葉黃酮)和銀杏葉多糖。銀杏葉黃酮和萜內(nèi)酯具有清除自由基和擴(kuò)張血管、拮抗血小板因子的作用；銀杏葉多糖具有降低血糖、延緩衰老、提高免疫力的作用；銀杏酸具有抗腫瘤、抗微生物的作用，但又有較強(qiáng)的胚胎毒性和細(xì)胞毒性。目前，已經(jīng)有很多含銀杏葉黃酮的保健食品和藥品上市。關(guān)于銀杏葉提取物方面的研究國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較多，提取技術(shù)、功能應(yīng)用、檢測方法等等，也有相關(guān)一次性提取銀杏葉多種提取物的專利報(bào)道。中國專利申請CN103130816A(申請?zhí)?01210406959.6)公開了一種從銀杏葉中制備多種活性物質(zhì)的方法，包括原料前處理步驟、提取步驟、多糖沉淀步驟、大孔樹脂分離步驟、硅膠干柱分離步驟、反相層析精制步驟和結(jié)晶步驟等，可同時得到銀杏多糖、銀杏提取物、銀杏總黃酮、銀杏總內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C單體等多種活性物質(zhì)。所用原料是銀杏葉干粉，加入纖維素酶及果膠酶破壁后，烘干，再采用乙醇溶液進(jìn)行提取，提取液濃縮與金銀花干粉混合絮凝得到多糖，絮凝后的上清液再經(jīng)過大孔樹脂分離、硅膠干柱、反相層析等步驟，得到銀杏黃酮提取物、銀杏內(nèi)酯提取物等。該專利申請中多糖絮凝步驟額外添加了金銀花干粉，銀杏多糖測定結(jié)果中會含有金銀花的相應(yīng)成分。中國專利CN102603482A(申請?zhí)?01210038103.8)公開了一種銀杏葉多組分的分離技術(shù)，以銀杏葉為原料，采用超聲提取和超臨界CO2萃取——精餾相結(jié)合的技術(shù)實(shí)現(xiàn)有效多組分的分離。首先用不同濃度乙醇兩次超聲提取銀杏葉，過濾得到的濾液和濾渣分別經(jīng)以下工藝進(jìn)行：1)將濾渣采用超臨界CO2萃取分離得聚戊烯醇類化合物；萃余物采用“水提醇沉”法分離得到銀杏多糖；2)將濾液超濾、濃縮后采用超臨界CO2萃取，在適當(dāng)?shù)臏囟群蛪毫ο孪确蛛x得銀杏酚酸類；改變萃取條件，啟用精餾柱，采用軸向變溫分四段加熱，繼續(xù)萃取分離出銀杏萜類內(nèi)酯和黃酮類化合物。該專利是以銀杏葉為原料，先采用乙醇溶液萃取，萃取液用于分離銀杏黃酮和萜類內(nèi)酯，萃取渣用于制備銀杏多糖。但超臨界CO2萃取產(chǎn)量低，產(chǎn)品純度不高，且能耗和投資相對比較大，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。中國專利申請CN105477026A(申請?zhí)?01610073800.5)公開了一種從銀杏外種皮中聯(lián)合提取銀杏酸、黃酮和萜內(nèi)酯以及多糖的工藝，干燥的銀杏外種皮經(jīng)多次萃取后得到銀杏酸粗提物和一次殘?jiān)?，銀杏酸粗提物進(jìn)一步提純后得到純度大于97wt％的銀杏酸；一次殘?jiān)?jīng)多次浸提后得到黃酮和萜內(nèi)酯粗提物和二次殘?jiān)?，黃酮和萜內(nèi)酯粗提物進(jìn)一步純化后得到黃酮≥24wt％、萜內(nèi)酯≥6wt％提取物；二次殘?jiān)?jīng)多次水提后得到多糖粗提物和無毒殘?jiān)嗵谴痔嵛镞M(jìn)一步純化后得到純度大于98wt％銀杏多糖。該專利中原料是銀杏的外種皮，提取工藝是先分離得到銀杏酸，再制備銀杏黃酮，最后分離銀杏多糖。另外，銀杏葉的貯存，目前一般是采購新鮮銀杏葉(水分70％(w/w)以上)，用大型烘干機(jī)烘干至水分含量10％以內(nèi)，儲存?zhèn)溆?。這一生產(chǎn)環(huán)節(jié)需要消耗大量的能源，導(dǎo)致生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)成本也偏高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮的方法。本發(fā)明的方法，通過對新鮮的銀杏葉進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵保藏，替代現(xiàn)有的烘干機(jī)烘干工藝，利于活性成分的浸出，節(jié)約能源，降低生產(chǎn)成本。保藏后的銀杏葉，直接加水浸提，過濾，濾液濃縮，用于銀杏多糖的生產(chǎn)，濾渣再用乙醇提取精制生產(chǎn)銀杏葉黃酮提取物。原料先提取多糖再用于生產(chǎn)黃酮，可同時得到銀杏葉多糖和黃酮兩種產(chǎn)品，與現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的工藝相比，銀杏葉提取物的收率和提取率都得到了明顯提高，且提高了后期精制純化的效率，得到的產(chǎn)品純度也明顯提高。本發(fā)明的方法，比現(xiàn)有工藝更加節(jié)能，提取率更高，更利于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮的方法，包括以下步驟：(1)發(fā)酵：將乳酸菌(市場購買的乳酸菌是固體粉狀的，使用前先常溫水活化，此為常規(guī)手段)與新鮮銀杏葉按質(zhì)量比1:1000～10000的比例混勻，密封條件(比如裝在密封袋中)、缺氧條件、自然環(huán)境溫度下發(fā)酵20天以上；在進(jìn)行提取前3～5天，加入銀杏葉質(zhì)量的2％～6％的活性干酵母，繼續(xù)密封發(fā)酵；(2)水提：取出發(fā)酵后的銀杏葉，按物料比1:5～12(重量比)的比例加入水，70～95℃提取0.5～3h，過濾，得提取液和銀杏葉渣，提取液用于銀杏葉多糖的提取，銀杏葉渣用于銀杏葉黃酮的提??；(3)上述提取液，用乙醇溶液提取1～3次，每次提取時間6～24h，提取后離心分離，得上清液和沉淀，沉淀即為銀杏葉多糖；優(yōu)選的，先將提取液濃縮至原體積的1/12～1/5，再加入1～5倍體積的95％(體積百分?jǐn)?shù))乙醇溶液，室溫下提取6～24h；(4)調(diào)整上述上清液的乙醇濃度至50％～70％(體積百分?jǐn)?shù))，與銀杏葉渣按重量比5～12:1的比例混合，60～85℃回流提取2～6h，過濾，濾液為銀杏葉黃酮粗提取物；(5)銀杏葉黃酮粗提取物回收乙醇后，陶瓷膜過濾(以除去部分色素、大分子物質(zhì))，透過液采用0.5～2BV/h流速通過大孔吸附樹脂lx-5，用55％～75％(體積百分?jǐn)?shù))乙醇溶液洗脫，洗脫液以0.2～0.6BV/h流速直接通過大孔樹脂lxd-200或D301，收集流出液，濃縮，回收乙醇，噴霧干燥，得銀杏葉黃酮(符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)的銀杏葉提取物，含總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯)。所述乳酸菌、活性干酵母，為市售的含植物乳桿菌的乳酸菌保存劑和釀酒活性干酵母。本發(fā)明所采用的乳酸菌、活性干酵母，分別購自亞芯生物科技有限公司、安琪酵母。本發(fā)明的從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明采用乳酸菌保存鮮銀杏葉，利于多糖和黃酮成分的浸出；替代現(xiàn)有的烘干機(jī)烘干銀杏葉保存工藝，節(jié)約大量電能的消耗，降低企業(yè)生產(chǎn)成本。2、本發(fā)明的工藝，在提取前3～5天，加入活性干酵母，可以降低提取液中單糖的含量，提高銀杏葉多糖產(chǎn)品純度，與其他工藝相比，銀杏葉多糖達(dá)到相同的質(zhì)量，可以減少一次醇沉的次數(shù)，或者相同醇沉次數(shù)時，多糖的含量要提高5.2％～8.9％，如表1所示。3、銀杏葉多糖醇沉后的上清液與銀杏葉渣混合，用于提取銀杏葉黃酮，可回收第一步水提工藝中損失的少許黃酮成分，同時減少新鮮乙醇的消耗量，節(jié)約生產(chǎn)成本。4、本發(fā)明先用水提取制備銀杏葉多糖，再用乙醇溶液提取銀杏葉黃酮，與現(xiàn)在普遍采用的先提取銀杏葉黃酮，剩余的渣再用于提取銀杏葉多糖的技術(shù)相比，得到的銀杏葉黃酮產(chǎn)品純度要提高3.8％～6.4％，如表2所示，提高了企業(yè)生產(chǎn)效率，降低企業(yè)生產(chǎn)成本，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等。實(shí)施例1從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮步驟如下：乳酸菌與鮮銀杏葉(1kg，水分含量72.4％)按質(zhì)量比1:1000混勻，裝在密封袋中，自然環(huán)境溫度發(fā)酵保藏90天；解開密封袋，加入銀杏葉質(zhì)量的4％的活性干酵母，封口3天取出；按物料比1:8加入無離子水，70℃提取3h，過濾；提取液濃縮8倍，用4倍體積的95％的乙醇室溫下提取20h，離心分離，醇沉2次，沉淀烘干，得銀杏葉多糖20.42g，，經(jīng)檢測，含量為48.4％(即銀杏葉多糖純度為48.4％)，提取率為7.4％。上清液調(diào)整至乙醇濃度65％，與銀杏葉渣按10:1混合，75℃回流提取2.5h，過濾，得到銀杏葉黃酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜過濾，透過液采用2BV/h流速通過大孔吸附樹脂lx-5，用60％乙醇洗脫，洗脫液以0.3BV/h流速直接通過大孔吸附樹脂lxd-200，收集流出液，濃縮，回收乙醇，噴霧干燥，得銀杏葉提取物(含總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯)6.02g，經(jīng)檢測，總黃酮醇苷含量為31.3％，萜類內(nèi)酯含量為7.1％；銀杏葉黃酮提取率為87.5％(相對于銀杏葉中黃酮含量計(jì)算)。實(shí)施例2從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮步驟如下：乳酸菌與鮮銀杏葉(10kg，水分含量72.4％)按質(zhì)量比1:5000混勻，裝在密封袋中，自然環(huán)境溫度發(fā)酵保藏40天；解開密封袋，加入銀杏葉質(zhì)量的2.5％的活性干酵母，封口5天取出；按物料比的1:5加入無離子水，80℃提取2h，過濾；提取液濃縮5倍，用2倍體積的95％的乙醇室溫下提取24h，離心分離，醇沉3次，沉淀烘干得到銀杏葉多糖198g，含量52.8％，提取率為7.2％。上清液調(diào)整至乙醇濃度55％，與銀杏葉渣按5:1混合，80℃回流提取4h，過濾，得到銀杏葉黃酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜過濾，透過液采用0.5BV/h流速通過大孔吸附樹脂lx-5，用70％乙醇洗脫，洗脫液以0.6BV/h流速直接通過大孔吸附樹脂lxd-200，收集流出液，濃縮，回收乙醇，噴霧干燥，得銀杏葉提取物(總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯)，得到銀杏葉提取物55.7g，產(chǎn)品中總黃酮醇苷含量為30.6％，萜類內(nèi)酯含量為6.4％；銀杏葉黃酮提取率85.7％(相對于銀杏葉中黃酮含量計(jì)算)。實(shí)施例3從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮步驟如下：乳酸菌與鮮銀杏葉(10kg，水分含量72.4％)按質(zhì)量比1:10000混勻，裝在密封袋中，自然環(huán)境溫度發(fā)酵保藏21天；解開密封袋，加入銀杏葉質(zhì)量的5.4％的活性干酵母，封口3天取出；按物料比的1:12加入無離子水，90℃提取1.5h，過濾；提取液濃縮10倍，用5倍體積的95％的乙醇室溫下提取10h，離心分離，醇沉3次，沉淀烘干得到銀杏葉多糖215.3g，含量50.3％，提取率為7.8％。上清液調(diào)整至乙醇濃度70％，與銀杏葉渣按12:1混合，60℃回流提取2h，過濾，得到銀杏葉黃酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜過濾，透過液采用1BV/h流速通過大孔吸附樹脂lx-5，用75％乙醇洗脫，洗脫液以0.2BV/h流速直接通過大孔吸附樹脂D301，收集流出液，濃縮，回收乙醇，噴霧干燥，得銀杏葉提取物(總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯)，得到銀杏葉提取物60.8g，產(chǎn)品中總黃酮醇苷含量為28.2％，萜類內(nèi)酯含量為7.0％；銀杏葉黃酮提取率85.4％(相對于銀杏葉中黃酮含量計(jì)算)。實(shí)施例4從銀杏葉中同時提取銀杏葉多糖和銀杏葉黃酮步驟如下：乳酸菌與鮮銀杏葉(20kg，水分72.4％)按質(zhì)量比1:6000混勻，裝在密封袋中，自然環(huán)境溫度發(fā)酵保藏52天；解開密封袋，加入銀杏葉質(zhì)量的2％的活性干酵母，封口4天取出；按物料比的1:10加入無離子水，70℃提取3h，過濾；提取液濃縮9倍，用3倍體積的95％的乙醇室溫下提取6h，離心分離，醇沉3次，沉淀烘干得到銀杏葉多糖430.1g，含量47.1％，提取率為7.8％。上清液調(diào)整至乙醇濃度50％，與銀杏葉渣按8:1混合，70℃回流提取3h，過濾，得到銀杏葉黃酮粗提取物；回收乙醇，陶瓷膜過濾，透過液采用1.2BV/h流速通過大孔吸附樹脂lx-5，用68％乙醇洗脫，洗脫液以0.6BV/h流速直接通過大孔吸附樹脂D301，收集流出液，濃縮，回收乙醇，噴霧干燥，得銀杏葉提取物(總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯)，得到銀杏葉提取物127.7g，產(chǎn)品中總黃酮醇苷含量為27.8％，萜類內(nèi)酯含量為6.7％；銀杏葉黃酮提取率86.9％(相對于銀杏葉中黃酮含量計(jì)算)。實(shí)驗(yàn)本發(fā)明方法與常規(guī)方法的比較(1)采用本發(fā)明的方法(具體方法步驟如實(shí)施例1、2、3、4所示，醇沉1次、2次、3次時均進(jìn)行檢測)提取銀杏葉多糖，檢測醇沉次數(shù)分別為1次、2次、3次時的多糖含量，如表1所示。同時，與常規(guī)方法(常規(guī)方法為未經(jīng)發(fā)酵的傳統(tǒng)水提醇沉工藝，表1中，常規(guī)方法與其相對應(yīng)的實(shí)施例的方法的不同之處在于：不加入乳酸菌和酵母菌，直接向銀杏葉中加入無離子水)進(jìn)行對比。結(jié)果如表1所示。由表1可見，本發(fā)明的方法，可以提高銀杏葉多糖產(chǎn)品純度，與常規(guī)方法相比，相同醇沉次數(shù)時，多糖的含量要提高5.2％～8.9％。表1(2)采用本發(fā)明的方法(具體方法步驟如實(shí)施例1、2、3、4所示)提取銀杏葉黃酮，檢測總黃酮醇苷含量，如表2所示。同時，與常規(guī)方法(常規(guī)方法為未經(jīng)發(fā)酵的傳統(tǒng)提取黃酮工藝，表2中，常規(guī)方法與其相對應(yīng)的實(shí)施例的方法的不同之處在于：不加入乳酸菌和酵母菌，直接向銀杏葉中加入無離子水)進(jìn)行對比。結(jié)果如表2所示。由表2可見，本發(fā)明的方法，與常規(guī)方法相比，得到的銀杏葉黃酮產(chǎn)品純度要提高3.8％～6.4％。表2銀杏葉原料中黃酮含量％(絕干)本發(fā)明方法黃酮純度未經(jīng)發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝黃酮含量0.78％31.3％(實(shí)施例1)24.9％0.72％28.2％(實(shí)施例3)24.7％0.72％27.8％(實(shí)施例4)24.0％0.74％30.6％(實(shí)施例2)24.5％上述雖然結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3