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      一種獸用疫苗佐劑的制作方法

      文檔序號:12024373閱讀:485來源:國知局
      一種獸用疫苗佐劑的制作方法與工藝

      本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種獸用疫苗佐劑。



      背景技術(shù):

      封閉帶毒素(zonulaoccludenstoxin,zot)是霍亂弧菌編碼的第二個毒素,相對分子質(zhì)量約45kd,zot本身是一種黏膜免疫佐劑。將卵白蛋白與基因工程方法表達的重組zot同時鼻內(nèi)免疫小鼠,其引起的抗卵白蛋白免疫球蛋白的滴度是單獨用抗原免疫引起的抗體滴度的40倍。而且zot還使血清、陰道和腸道中抗卵白蛋白iga滴度升高。雖然zot比大腸桿菌熱不穩(wěn)定內(nèi)毒素lt的佐劑活性稍低,但二者誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗卵白蛋白特異性igg亞群是相同的。二者都刺激產(chǎn)生了igg1、igg2a和igg2b。這些實驗結(jié)果表明,zot可以作為一個新的微生物來源的粘膜免疫佐劑。deltag是zot蛋白c端序列,為zot蛋白的第265到399位氨基酸序列,分子大小為15kd。

      霍亂毒素(choleratoxin,ct)是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素,它由1個a亞基(cta)和5個b亞基(ctb)組成。cta由240個氨基酸組成,分子質(zhì)量約為27kd,ctb由103個氨基酸組成,分子質(zhì)量11.6kd。cta亞基是ct具有佐劑活性的主要活性中心,ctb與細胞結(jié)合并將cta轉(zhuǎn)移到受體細胞膜上或胞漿內(nèi)。由于ct全毒素具有毒性,而且需要cta和ctb亞基在細菌細胞周質(zhì)內(nèi)組裝成具有活性的六聚體,表達量低,成本高,限制了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。cta(即1個cta亞基)雖然被證明也具有單獨的黏膜佐劑活性,但是由于其缺少細胞受體,效率比較低。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的第一目的在于提供一種獸用疫苗佐劑,能夠顯著提高動物體內(nèi)的血清抗體和黏膜抗體水平,毒性低、結(jié)構(gòu)簡單、易于原核表達。

      本發(fā)明的第二目的是提供所述獸用疫苗佐劑的編碼基因、含有所述編碼基因的重組載體、重組細胞。

      本發(fā)明的第三目的是提供所述獸用疫苗佐劑的制備方法,該方法簡單、易于操作、成本低。

      本發(fā)明的第四目的在于提供所述獸用疫苗佐劑在制備豬偽狂犬疫苗方面的應(yīng)用,該佐劑能夠顯著提高動物體內(nèi)的血清抗體和黏膜抗體水平。

      本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn):

      一種獸用疫苗佐劑,是氨基酸序列如seqidno:1所示的多肽。

      本發(fā)明還提供所述獸用疫苗佐劑的編碼基因。

      優(yōu)選的技術(shù)方案中,所述編碼基因序列如seqidno:2所示。

      本發(fā)明還提供含有所述編碼基因的重組載體、重組菌。

      本發(fā)明還提供制備所述獸用疫苗佐劑的方法,通過誘導(dǎo)表達所述重組菌,純化,得到所述獸用疫苗佐劑。

      在本發(fā)明中,所述重組菌采用如下方法構(gòu)建:在所述編碼基因的一端加上標(biāo)簽蛋白序列,然后插入pet32a載體內(nèi),轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

      優(yōu)選的技術(shù)方案中,所述標(biāo)簽蛋白為his標(biāo)簽蛋白。

      本發(fā)明還提供所述獸用疫苗佐劑在制備豬偽狂犬疫苗方面的應(yīng)用、含有所述獸用疫苗佐劑的豬偽狂犬疫苗。

      在本發(fā)明中,所述疫苗還含有豬偽狂犬病毒抗原。

      本發(fā)明獸用疫苗佐劑,能夠顯著提高動物體內(nèi)的血清抗體和黏膜抗體水平,毒性低、結(jié)構(gòu)簡單、易于原核表達、成本低。采用本發(fā)明獸用疫苗佐劑與單獨采用重組蛋白cta亞基、重組蛋白deltg亞基作為佐劑相比,血清igg抗體水平和鼻腔灌洗液中iga抗體水平的提高(相對于抗原來說)大于后兩者對相應(yīng)抗體水平的提高之和,取得了協(xié)同增效作用。因此,本發(fā)明獸用疫苗佐劑是良好的豬偽狂犬疫苗佐劑。

      附圖說明

      圖1顯示了pet32a-cta-deltg的瓊脂糖凝膠電泳分析,其中1為重組pet32a-cta-deltg質(zhì)粒ndei和xhoi雙酶切產(chǎn)物;m為dl2000。

      圖2顯示了重組菌的誘導(dǎo)表達結(jié)果,其中1:對照菌誘導(dǎo)全菌;2:bl21-pet32a-cta-deltg誘導(dǎo)全菌;3:bl21-pet32a-cta-deltg誘導(dǎo)后裂解液上清;bl21-pet32a-cta-deltg誘導(dǎo)后裂解液沉淀;m:蛋白marker。

      圖3是ni-nta樹脂純化后的重組蛋白的sds-page電泳圖,其中m:蛋白marker;cta-deltg:純化后的重組蛋白cta-deltg。

      圖4顯示了純化后的重組蛋白的western-blot檢測結(jié)果,其中cta-deltg:純化后的重組蛋白cta-deltg;m:蛋白marker。

      圖5是ni-nta樹脂純化后的重組蛋白cta亞基和重組蛋白deltg亞基的sds-page電泳圖,其中左圖為純化后的重組蛋白cta亞基的sds-page電泳圖,右圖為純化后的重組蛋白deltg亞基的sds-page電泳圖。

      圖6顯示了elisa檢測抗體水平的結(jié)果,圖6b顯示了鼻腔灌洗液中iga抗體水平;其中*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示p<0.001。

      具體實施方式

      實施例1、cta-deltag基因片段的獲得及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

      為了獲得能夠同時產(chǎn)生較高血清抗體和黏膜抗體水平的的疫苗佐劑,對多個已經(jīng)公開的黏膜佐劑進行分析,設(shè)計了多個多肽,僅僅發(fā)現(xiàn)由霍亂毒素(choleratoxin,ct)的cta亞基與zot(封閉帶毒素)的deltag串聯(lián)而成的重組蛋白(記為重組蛋白cta-deltag),具有較好的免疫增強效果,可以作為獸用疫苗佐劑。重組蛋白cta-deltag的氨基酸序列如seqidno:1所示,對重組蛋白cta-deltag的編碼基因進行密碼子優(yōu)化,得到密碼子優(yōu)化后的cta-deltag編碼基因,序列如seqidno:2所示。

      為了方便純化重組蛋白cta-deltag,在重組蛋白cta-deltag編碼基因(seqidno:2)的3’端添加his標(biāo)簽蛋白(6個組氨酸)編碼序列,然后在5’端加上catatg,3’端加上ctcgag,交由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成,得到cta-deltag基因片段。

      用ndei和xhoi對cta-deltag基因片段和載體pet32a進行雙酶切并進行連接。

      雙酶切體系:

      10×hbuffer3μl,

      ndei1μl,

      xhoi1μl,

      cta-deltag基因片段或pet32a8μl,

      ddh2o補足體積至30μl。

      將雙酶切體系放置37℃反應(yīng)1h,然后用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。

      連接體系:

      10×t4ligasebuffer2μl,

      pet32a酶切片段3μl,

      cta-deltag基因片段的酶切片段5μl,

      t4ligase1μl,

      ddh2o補足體積至20μl。

      將連接體系在16℃條件下連接過夜,得到連接產(chǎn)物1。

      將連接產(chǎn)物1轉(zhuǎn)化e.colidh5a感受態(tài)細胞,涂布含氨芐青霉素的lb平板,37℃培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落,在含有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),提取質(zhì)粒,經(jīng)ndei和xhoi雙酶切鑒定,電泳后獲得圖1。從圖1可以看出,陽性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,獲得5366bp和1160bp的兩條目的條帶。陽性重組表達質(zhì)粒經(jīng)測序正確后,命名為pet32a-cta-deltg。

      酶切和連接體系中的試劑均購自大連寶生物工程有限公司。

      實施例2、重組菌的構(gòu)建、重組蛋白的制備及鑒定

      將實施例1獲得的重組表達質(zhì)粒pet32a-cta-deltg轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),得到重組表達菌株bl21-pet32a-cta-deltg。將空質(zhì)粒pet32a按照相同方法轉(zhuǎn)化bl21(de3),得到對照菌株。

      分別挑取重組表達菌株bl21-pet32a-cta-deltg和對照菌株的單菌落,接種于含有50μg/ml氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)好的菌液10μl接種于4ml含有50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中,在37℃、200rpm條件下振搖培養(yǎng)約3h,使0d600達到0.6?0.8。向上述菌液中分別加入終濃度為0.1mm的iptg進行誘導(dǎo)表達,誘導(dǎo)溫度為16℃,誘導(dǎo)時間為24h。將誘導(dǎo)表達后的發(fā)酵液在4℃、6000g條件下離心5min,收集菌體;將菌體用pbs緩沖液(ph7.2)洗滌2次后進行重懸。將菌體懸浮液置于冰浴中,用超聲波裂解菌體(功率為200w,超聲裂解5s,停頓5s),直至菌液澄清,獲得菌體裂解液。將菌體裂解液在4℃、12000g條件下離心l0min,分別收集裂解液上清和裂解液沉淀。將裂解液沉淀用與上清等體積的pbs緩沖液(ph7.2)重懸后進行sds-page分析。從圖2可以看出,與誘導(dǎo)表達后的對照菌相比,誘導(dǎo)表達后的bl21-pet32a-cta-deltg裂解液上清在約43kda處有一條明顯的條帶,用ni-nta樹脂從誘導(dǎo)表達后bl21-pet32a-cta-deltg裂解液上清中純化重組蛋白cta-deltg,將純化蛋白進行常規(guī)的sds-page電泳獲得圖3,從圖3可以看出,純化后的重組蛋白大小約為43kda,純度達到95%以上。將純化后的重組蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,以抗霍亂毒素抗體(購自sigma公司)為一抗,用western-blot方法檢測獲得圖4。從圖4可以看出,純化后的重組蛋白為霍亂毒素的cta亞基與封閉帶毒素的deltag亞基的融合蛋白。

      實施例3:cta亞基及zot-deltg蛋白的重組表達及純化

      根據(jù)霍亂毒素a亞基(即cta亞基,氨基酸序列為seqidno:中第1--240位氨基酸)和zot(封閉帶毒素)的deltag亞基(氨基酸序列為seqidno:1中第241-375位氨基酸)的氨基酸序列,分別按照大腸桿菌密碼子進行優(yōu)化后,優(yōu)化后的cta亞基編碼基因為seqidno:2中第1-第723位核苷酸,優(yōu)化后的deltg亞基編碼基因為seqidno:2中第724-第1128位核苷酸。

      為了方便純化重組蛋白,在優(yōu)化后的cta亞基編碼基因的3’端添加his標(biāo)簽蛋白(6個組氨酸)編碼序列,然后在5’端加上catatg,3’端加上ctcgag,交由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。在優(yōu)化后的deltg亞基編碼基因的3’端添加his標(biāo)簽蛋白(6個組氨酸)編碼序列,然后在5’端加上catatg,3’端加上ctcgag,交由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。將兩條合成基因片段,分別插入pet32a表達載體,轉(zhuǎn)化e.colidh5a感受態(tài)細胞,獲得重組表達菌株。采用實施例2中相同方法對重組菌株進行誘導(dǎo),表達重組蛋白cta亞基和deltg亞基。經(jīng)sds-page電泳發(fā)現(xiàn),cta亞基和deltg亞基均實現(xiàn)了可溶性表達。將兩株重組菌分別裂解后,提取裂解液上清,采用ni-nta樹脂進行純化。將純化后的重組蛋白cta亞基和deltg亞基分別進行sds-page電泳,從圖5可以看出重組蛋白cta亞基的分子量約為27kda,與理論值相符;重組deltg亞基的分子量約為15kda,與理論值相符。兩種純化蛋白均獲得了高度的純化,純化達到95%以上。

      實施例4重組蛋白cta-deltg的免疫佐劑活性實驗

      1-7日齡偽狂犬病毒陰性仔豬,隨機分成四組,7只/組。第一組仔豬采用弱毒疫苗偽狂靜(福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司)滴鼻免疫,免疫劑量為1ml/頭/次;第二組仔豬采用偽狂靜和重組蛋白cta亞基(實施例3制備)共同滴鼻免疫,偽狂靜免疫劑量為1ml/頭/次,重組蛋白cta亞基免疫劑量為100μg/頭/次;第三組仔豬采用偽狂靜和重組蛋白cta-deltg(實施例2制備)共同滴鼻免疫,弱毒疫苗免疫劑量為1ml/頭/次,重組蛋白cta-deltg免疫劑量為100μg/頭/次;第四組仔豬采用偽狂靜和重組蛋白deltg亞基(實施例3制備)共同滴鼻免疫,偽狂靜免疫劑量為1ml/頭/次,重組蛋白deltg亞基免疫劑量為100μg/頭/次。各組免疫次數(shù)均為兩次,二免在首免后14天進行。二免后14天采集血液和鼻腔灌洗液。采用豬偽狂犬病(prv)gb抗體elisa檢測試劑盒(biocheck),按照文獻1(linghua,z.,xingshan,t.,fengzhen,z.,2008.invivooraladministrationeffectsofvariousoligodeoxynucleotidescontainingsyntheticimmunostimulatorymotifsintheimmuneresponsetopseudorabiesattenuatedvirusvaccineinnewbornpiglets.vaccine26,224-233.)中方法檢測各個血清樣品的igg抗體水平和鼻腔灌洗液樣品的iga抗體水平,具體結(jié)果見圖6。從圖6可以看出,與單用prv弱毒疫苗(偽狂靜)相比,重組蛋白cta-deltg與prv弱毒疫苗共同免疫可顯著提高動物體內(nèi)血清igg和黏膜iga水平。血清中igg抗體檢測結(jié)果顯示:prv弱毒疫苗單獨免疫后血清中igg抗體平均滴度為1250,重組蛋白cta-deltg與prv弱毒疫苗共同免疫后血清中igg抗體平均滴度為2285,重組蛋白cta亞基與prv弱毒疫苗共同免疫后血清中igg抗體平均滴度為1753,重組蛋白deltg亞基與prv弱毒疫苗共同免疫后血清中igg抗體平均滴度為1442。結(jié)果說明重組蛋白deltg亞基與單獨免疫疫苗組相比,血清中抗體水平?jīng)]有差異(p>0.05),并且重組蛋白cta-deltg與prv弱毒疫苗共同免疫后血清中igg抗體水平顯著大于重組蛋白cta亞基、deltg亞基分別作為佐劑免疫后抗體水平。鼻腔黏膜中iga抗體檢測結(jié)果顯示:prv弱毒疫苗單獨免疫后鼻腔中iga抗體平均滴度為29,重組蛋白cta-deltg與prv弱毒疫苗共同免疫后鼻腔中iga抗體平均滴度為55,重組蛋白cta亞基與prv弱毒疫苗共同免疫后鼻腔中iga抗體平均滴度為43,重組蛋白deltg亞基與prv弱毒疫苗共同免疫后鼻腔中iga抗體平均滴度為36,因此可以看到重組蛋白cta-deltg與prv弱毒疫苗共同免疫后iga水平顯著大于重組蛋白cta亞基、deltg亞基分別作為佐劑免疫后抗體水平。上述結(jié)果說明,cta-deltg重組蛋白作為佐劑獲得的igg和iga抗體水平顯著優(yōu)于重組蛋白cta亞基和deltg亞基作為佐劑時的抗體水平,cta-deltg重組蛋白是一種良好的免疫佐劑。

      sequencelisting

      <110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

      <120>一種獸用疫苗佐劑

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