本發(fā)明涉及一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑。
背景技術(shù):
:副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的,是近年來嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的新發(fā)細(xì)菌性傳染病,主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜腦炎等,發(fā)病率一般為10-15%,死亡率可達(dá)50%以上,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,引起了人們的日益重視。目前控制該病的有效方式是疫苗接種。文獻(xiàn)報(bào)道商業(yè)疫苗或自家苗的使用可以控制副豬嗜血桿菌的感染。但是也有使用疫苗預(yù)防失敗的實(shí)例,疫苗的免疫效果對于有效預(yù)防該病尤為重要。高免疫效力的疫苗除了需要好的疫苗毒株,高濃度的抗原,佐劑對于提高疫苗的免疫效果也相當(dāng)重要,好的免疫佐劑具有減少疫苗抗原劑量,降低疫苗成本等優(yōu)勢。本發(fā)明旨在研制一種能夠提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果的免疫增強(qiáng)劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于提供一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑,其特征在于,該免疫增強(qiáng)劑由10~50份6-pgd,0.5~5份il-8,0.3~5份il-6,1~6份葡萄糖,2~8份明膠組成,所述份數(shù)均為質(zhì)量份數(shù)。進(jìn)一步的,上述免疫增強(qiáng)劑由20~30份6-pgd,2~4份il-8,1~3份il-6,2~4份葡萄糖,4~6份明膠組成,所述份數(shù)均為質(zhì)量份數(shù)。一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑,該免疫增強(qiáng)劑含有10~50mg/ml6-pgd,0.5~5mg/mlil-8,0.3~5mg/mlil-6,1~6mg/ml葡萄糖,2~8mg/ml明膠,余量為無菌生理鹽水。進(jìn)一步的,上述免疫增強(qiáng)劑含有20~30mg/ml6-pgd,2~4mg/mlil-8,1~3mg/mlil-6,2~4mg/ml葡萄糖,4~6mg/ml明膠,余量為無菌生理鹽水。一種副豬嗜血桿菌疫苗混合物,該疫苗混合物中含有上述任一項(xiàng)所述的免疫增強(qiáng)劑。進(jìn)一步的,上述免疫增強(qiáng)劑的體積為副豬嗜血桿菌疫苗的1~15%。6-pgd、il-8和il-6同時(shí)作為副豬嗜血桿菌疫苗免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用。進(jìn)一步的,6-pgd、il-8和il-6的質(zhì)量比例為(10~50):(0.5~5):(0.3~5)。6-pgd、il-8、il-6、葡萄糖和明膠同時(shí)作為副豬嗜血桿菌疫苗免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用。進(jìn)一步的,6-pgd、il-8、il-6、葡萄糖和明膠的質(zhì)量比例為(10~50):(0.5~5):(0.3~5):(1~6):(2~8)。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明發(fā)現(xiàn)6-pgd、il-8和il-6的同時(shí)使用能夠顯著提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)6-pgd、il-6、il-8同時(shí)使用時(shí)對副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果產(chǎn)生了協(xié)同作用,其所發(fā)揮的促免疫效果高于6-pgd、il-6、il-8分開使用產(chǎn)生的促進(jìn)效果的和。本發(fā)明研究的含有10~50mg/ml6-pgd,0.5~5mg/mlil-8,0.3~5mg/mlil-6,1~6mg/ml葡萄糖,2~8mg/ml明膠的免疫增強(qiáng)劑對副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果具有更佳的促進(jìn)效果。本發(fā)明的免疫增強(qiáng)劑有利于促進(jìn)副豬嗜血桿菌疫苗的廣泛有效地應(yīng)用,具有很好的應(yīng)前景。附圖說明圖1為各組免疫仔豬血清中副豬嗜血桿菌igg抗體水平,縱坐標(biāo)為od450nm值;圖2為各組副豬嗜血桿菌igg抗體水平,縱坐標(biāo)為od450nm值。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑本實(shí)施例免疫增強(qiáng)劑由20份6-pgd蛋白(6-phosphogluconatedehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶),2份il-8蛋白,3份il-6蛋白,3份葡萄糖,5份明膠組成,所述份數(shù)均為質(zhì)量份數(shù)。免疫增強(qiáng)劑的制備方法:蛋白質(zhì)6-pgd、il-8、il-6、葡萄糖、明膠按上述配比配制、混勻,分裝至青霉素瓶中,凍干保存?zhèn)溆?,即可。免疫增?qiáng)劑的使用:(1)使用時(shí)往免疫增強(qiáng)劑中加入相應(yīng)量的無菌生理鹽水,使各成分濃度分別為20mg/ml6-pgd,2mg/mlil-8,3mg/mlil-6,3mg/ml葡萄糖,5mg/ml明膠,得用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑。(2)將副豬嗜血桿菌疫苗中加入體積為疫苗體積6%的用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑,即可。實(shí)施例2一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑本實(shí)施例免疫增強(qiáng)劑中含有10~50mg/ml6-pgd蛋白(6-phosphogluconatedehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶),0.5~5mg/mlil-8蛋白,0.3~5mg/mlil-6蛋白,1~6mg/ml葡萄糖,2~8mg/ml明膠,余量為無菌生理鹽水。免疫增強(qiáng)劑的制備方法:蛋白質(zhì)6-pgd、il-8、il-6、葡萄糖、明膠按上述配比配制好后,分裝至青霉素瓶中,凍干保存?zhèn)溆?,使用時(shí)每瓶加入相應(yīng)量的無菌生理鹽水。免疫增強(qiáng)劑的使用:將副豬嗜血桿菌疫苗中加入疫苗體積1~15%的用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑。實(shí)施例3副豬嗜血桿菌疫苗的制備按現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)制備副豬嗜血桿菌疫苗,具體操作方法如下:1)一級種子液制備:取保存的副豬嗜血桿菌接種于tsa固體平板,在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)18h;然后挑取單菌落于tsb培養(yǎng)基中,在溫度為37℃的條件下,以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)18h,進(jìn)行純粹檢驗(yàn)合格后,作為一級種子液,置2~8℃保存?zhèn)溆?,保存時(shí)間均不超過3天;2)二級種子液制備:取步驟1)得到的一級種子液,按種子液與培養(yǎng)基的體積比1:20接種于tsb培養(yǎng)基中,在溫度為37℃的條件下,以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)16h,進(jìn)行純粹檢驗(yàn)合格后,作為二級種子液,置2~8℃保存?zhèn)溆?,保存時(shí)間均不超過3天;3)原菌液制備:取步驟2)得到的二級種子培養(yǎng)液,按種子液與培養(yǎng)基的體積比1:100接種于tsb培養(yǎng)基中,在溫度為37℃的條件下,以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)24h后,得到原菌液;4)活菌計(jì)數(shù):將步驟3)中獲得的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),步驟如下:將副豬嗜血桿菌接種于tsa固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)12h左右,用ph7.4pbs洗下菌苔后反復(fù)吹打混合均勻,再進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù):每個(gè)樣品取1ml,用ph7.4pbs做10倍系列稀釋,每個(gè)稀釋度換1支吸管。具體方法是:準(zhǔn)確吸取菌液100μl,放入盛有稀釋液900μl的第一支1.5ml離心管中(不接觸液面),另取1支1ml槍頭將第一管液體混合均勻后,吸取100μl放入盛有稀釋液900μl的第2支1.5ml離心管中,依次稀釋至最后1管。根據(jù)對樣品含菌數(shù)的估計(jì),選擇適宜稀釋度,吸取最終稀釋度的菌液接種適宜的培養(yǎng)基平板3個(gè),每個(gè)滴100μl,使菌液散開,置37℃涼干后,翻轉(zhuǎn)平板,培養(yǎng)48~72h,按照下列方法數(shù)出每個(gè)平皿中的菌落個(gè)數(shù),計(jì)算每ml菌液中的活菌數(shù)(cfu/ml)。5)滅活:在上述菌液中加入終濃度為0.2~0.4%的甲醛溶液,37℃振蕩滅活24h。6)乳化:在步驟5)得到的滅活菌液中取樣,按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn);將原菌液在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心10min取沉淀的菌體,用無菌生理鹽水重懸菌體后洗滌,經(jīng)洗滌的菌體用生理鹽水稀釋成濃度為3×109cfu/ml的制苗菌液,將制苗菌液與鋁膠佐劑以體積比4:1~9:1混合,轉(zhuǎn)速8000rpm的條件下乳化20min,得到副豬嗜血桿菌疫苗,2~8℃保存?zhèn)溆?。?shí)施例4不同免疫佐劑的免疫增強(qiáng)效果比較研究在本發(fā)明研究過程中,研究了大量的細(xì)胞因子作為免疫佐劑對副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果的影響,下面列舉部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。取30頭10日齡仔豬,隨機(jī)分成5組,每組5頭,在上述實(shí)施例3制備的疫苗中分別加入下列a~e組免疫佐劑,f組為對照組(見表1),將a~e組免疫佐劑直接免疫上述副豬嗜血桿菌疫苗,每頭仔豬免疫2ml,15天后二免2ml/頭,二免20天后進(jìn)行攻毒,同時(shí)采血測定副豬嗜血桿菌抗體效價(jià)。表1試驗(yàn)分組情況注:表中的濃度均為細(xì)胞因子在疫苗中的終濃度。各組免疫仔豬被攻毒后的發(fā)病情況如表2所示,從中可以看出,a、b組的中il-2、il-4、ifn-α、ifn-β作為副豬嗜血桿菌疫苗的免疫佐劑時(shí),并沒有對疫苗起到增強(qiáng)的作用,甚至不利于副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果的產(chǎn)生,加重了仔豬的發(fā)病情況。從表2中可以看出,c~e組沒有發(fā)現(xiàn)仔豬發(fā)病,說明免疫佐劑有利于提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果。表2各組免疫仔豬被攻毒后的發(fā)病情況進(jìn)一步檢測各組免疫仔豬血清中副豬嗜血桿菌igg抗體水平發(fā)現(xiàn),如圖1和表3所示,a(0.91)、b(0.95)組igg抗體水平與疫苗對照組f組(0.91)相當(dāng),沒有明顯區(qū)別;c(1.18)、e(1.29)組的igg抗體水平高于f(0.91)組,但不具有顯著差異,d組的免疫效果顯著高于f組,抗體水平達(dá)1.69,且高于c、e組2組促進(jìn)效果的和,說明6-pgd、il-6、il-8同時(shí)使用時(shí),產(chǎn)生了協(xié)同促進(jìn)的效果,顯著提高了副豬嗜血桿菌疫苗免疫效果。表3為各組免疫仔豬血清中副豬嗜血桿菌igg抗體水平組別igg抗體水平(od450nm值)a0.91b0.95c1.18d1.69e1.29f0.91實(shí)施例5本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑的免疫效果檢測在上述制備的副豬嗜血桿菌疫苗中按疫苗體積1~15%的比例添加本發(fā)明實(shí)施例1中用生理鹽水溶解的免疫增強(qiáng)劑,充分振蕩混勻后即可使用。取10日齡仔豬25頭,隨機(jī)分成5組,a~e組,每組5頭,分別按表4所述的體積添加量(0%、1%、5%、10%、15%)將免疫增強(qiáng)劑添加到副豬嗜血桿菌疫苗中,然后對仔豬進(jìn)行免疫,2ml/頭,15天后進(jìn)行二免,2ml/頭,二免后20天進(jìn)行攻毒或取血液測定抗體水平,比較免疫效果。表4各組免疫仔豬被攻毒后的發(fā)病情況表5各組副豬嗜血桿菌igg抗體水平組別igg抗體水平(od450nm值)a0.91b1.12c1.56d1.69e1.59從表4、5和圖2的檢測結(jié)果中可以看出,按疫苗體積1~15%添加本發(fā)明免疫增強(qiáng)劑,可有效提高副豬嗜血桿菌疫苗的免疫效果,其中當(dāng)添加量為10%時(shí)效果最佳。實(shí)施例6一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑本實(shí)施例免疫增強(qiáng)劑由10份6-pgd蛋白,0.6份il-8蛋白,5份il-6蛋白,6份葡萄糖,2份明膠組成,所述份數(shù)均為質(zhì)量份數(shù)。免疫增強(qiáng)劑的制備方法:蛋白質(zhì)6-pgd、il-8、il-6、葡萄糖、明膠按上述配比配制、混勻,分裝至青霉素瓶中,凍干保存?zhèn)溆?,即可。免疫增?qiáng)劑的使用:(1)使用時(shí)往免疫增強(qiáng)劑中加入相應(yīng)量的無菌生理鹽水,使各成分濃度分別為10mg/ml6-pgd,0.6mg/mlil-8,5mg/mlil-6,6mg/ml葡萄糖,2mg/ml明膠,得用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑。(2)將副豬嗜血桿菌疫苗中加入體積為疫苗體積15%的用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑,即可。實(shí)施例7一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑本實(shí)施例免疫增強(qiáng)劑由50份6-pgd蛋白(6-phosphogluconatedehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶),5份il-8蛋白,0.3份il-6蛋白,1份葡萄糖,8份明膠組成,所述份數(shù)均為質(zhì)量份數(shù)。免疫增強(qiáng)劑的制備方法:蛋白質(zhì)6-pgd、il-8、il-6、葡萄糖、明膠按上述配比配制、混勻,分裝至青霉素瓶中,凍干保存?zhèn)溆茫纯?。免疫增?qiáng)劑的使用:(1)使用時(shí)往免疫增強(qiáng)劑中加入相應(yīng)量的無菌生理鹽水,使各成分濃度分別為50mg/ml6-pgd,5mg/mlil-8,0.3mg/mlil-6,1mg/ml葡萄糖,8mg/ml明膠,得用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑。(2)將副豬嗜血桿菌疫苗中加入體積為疫苗體積1%的用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑,即可。實(shí)施例8一種提高副豬嗜血桿菌疫苗免疫效力的免疫增強(qiáng)劑本實(shí)施例免疫增強(qiáng)劑中含有30mg/ml6-pgd蛋白(6-phosphogluconatedehydrogenase,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶),4mg/mlil-8蛋白,1mg/mlil-6蛋白,2mg/ml葡萄糖,4mg/ml明膠,余量為無菌生理鹽水。免疫增強(qiáng)劑的制備方法:蛋白質(zhì)6-pgd、il-8、il-6、葡萄糖、明膠按上述配比配制好后,分裝至青霉素瓶中,凍干保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)每瓶加入相應(yīng)量的無菌生理鹽水。免疫增強(qiáng)劑的使用:將副豬嗜血桿菌疫苗中加入疫苗體積8%的用生理鹽水溶解后的免疫增強(qiáng)劑。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12