本公開總體上涉及基于雷公藤甲素(雷公藤內(nèi)酯，triptolide)、棉酚(gossypol)及其可接受的鹽的組合物或試劑盒。當(dāng)前的組合物或試劑盒可用于限制或抑制出生率，包括誘導(dǎo)不育(infertility)——通過組合抑制線粒體乳酸脫氫酶(ldh)-c4和核因子κb(nf-κb)活性。

背景技術(shù)：

1、對動物的群體控制是世界范圍內(nèi)的重要問題，而生育力調(diào)節(jié)對于保護生命支持資源和動物福利是必要的。

2、家畜絕育已經(jīng)應(yīng)用了幾個世紀，為的是控制動物的數(shù)量、遺傳選擇、攻擊性動物的安寧，并確保生產(chǎn)滿足人類需求的高質(zhì)量肉類。主要的閹割方法有手術(shù)閹割、激素抑制和化學(xué)閹割。

3、理想的閹割應(yīng)該是這樣的：它將提供永久或連續(xù)的低成本治療，阻止精子發(fā)生和產(chǎn)雄(androgenetic)，并且不影響動物福利水平[hassan,a.,fromsa,a.(2017).review?onchemical?sterilization?of?male?dogs.international?journal?of?advancedresearch,5(11),758-770]。

4、性腺切除手術(shù)避孕——手術(shù)去除雄性的睪丸或雌性的卵巢，導(dǎo)致性腺喪失產(chǎn)生性類固醇——常在動物中實施并產(chǎn)生永久和不可逆的效果。該程序存在數(shù)個可能的副作用，如生殖器官發(fā)育不全、肌肉骨骼系統(tǒng)紊亂、激素功能障礙、尿失禁、腫瘤風(fēng)險、肥胖、換毛(coat?changes)等。[root?kustritz?m.v.,2012.effects?of?surgical?sterilizationon?canine?and?feline?health?and?on?society.reprod.domest.anim.47,214–222]。然而，開放手術(shù)閹割需要術(shù)后護理才能使出血和感染風(fēng)險最低。此外，這種方法也有一些缺點：成本不低且耗時長，同時有嚴重術(shù)后并發(fā)癥風(fēng)險。與其它方法相比，非手術(shù)化學(xué)絕育存在更好的優(yōu)勢，其中包括減少疼痛和壓力，消除出血、疝、感染、蠅蛆病和其它手術(shù)后遺癥。

5、與手術(shù)方法相比，不同的生殖生物學(xué)家接受了開發(fā)化學(xué)絕育方法的挑戰(zhàn)，這種方法可能是手術(shù)閹割更好的替代方法，以及適于雄性家畜大規(guī)模絕育而無術(shù)后危險。使用無機化學(xué)品、免疫避孕藥和包括雄激素、孕激素、雄激素加孕激素以及促性腺激素釋放激素(gnrh)激動劑在內(nèi)的激素，嘗試了不同的化學(xué)劑來實現(xiàn)閹割。不同研究人員評估了在多個種屬的雄性動物中注射各種激素的非手術(shù)絕育，但這些治療未能誘導(dǎo)永久不孕(sterility)。免疫技術(shù)也被用于誘導(dǎo)抗促性腺激素和gnrh的抗體，并且表明了這種免疫技術(shù)在無精子癥的有效性和持續(xù)時間方面各不相同。疫苗接種不良反應(yīng)也被認為是另一個缺點。化學(xué)絕育已應(yīng)用于一些雄性動物種屬，如猴、山羊、公牛、倉鼠、兔和狗。

6、因此，研究人員在過去幾年中也嘗試了各種化學(xué)劑，如達那唑(danazol)、甘油、乳酸、氯化鐵和硫酸亞鐵、氯化鈣(cacl2)、卡介苗(bcg)、葡萄糖酸鋅(neutersol)和20％高滲鹽溶液，用于誘導(dǎo)化學(xué)絕育。然而，所有這些化學(xué)劑經(jīng)睪丸內(nèi)注射后都表現(xiàn)出疼痛、發(fā)熱，甚至嚴重的睪丸炎癥(睪丸炎)。一些劑如氯化鎘、甘油、乳酸引起了睪丸組織的選擇性破壞，并伴有可逆的睪丸組織損傷。雖然所使用的化學(xué)品對睪丸組織的破壞有影響，但它還有并發(fā)癥和一些缺點。例如，在某些情況下，生精小管的間質(zhì)部分在睪丸萎縮的初期后再生，而這導(dǎo)致了繼發(fā)的雄性行為，引起動物的管理問題。由于使用上述化學(xué)品所引起的這類并發(fā)癥，有效的化學(xué)絕育劑尚未確立。

7、已經(jīng)報道了幾種推定的雷公藤甲素靶蛋白，包括多囊蛋白-2、adam10、dctpp1、tab1和xpb。xpb(ercc3)及其伴侶蛋白gtf2h4存在多重雷公藤甲素耐藥突變。然而，在多囊蛋白-2、adam10、dctpp1和tab1中沒有發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素耐藥突變。xpb的cys342被鑒定為通過雷公藤甲素的12,13-環(huán)氧基團進行共價修飾的殘基，并且xpb-c342t突變體使得t7115細胞系幾乎完全對雷公藤甲素耐藥。c342t突變賦予的耐藥水平是先前鑒定的大多數(shù)雷公藤甲素耐藥突變體的約100倍之高?？傊@些結(jié)果證實了xpb是負責(zé)雷公藤甲素抗增殖活性的靶點。

8、明尼甲素(minnelide)是雷公藤甲素的一種水溶性更高的合成類似物，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為雷公藤甲素。在胰腺癌的臨床前小鼠模型中，它“甚至比吉西他濱更有效”。

9、糖化雷公藤甲素(glutriptolide)是雷公藤甲素的葡萄糖綴合物，具有更好的溶解性和更低的毒性，在體外不抑制xpb活性，但在體內(nèi)表現(xiàn)出腫瘤控制，這可能是由于活性雷公藤甲素在癌細胞內(nèi)持續(xù)逐步釋放。

10、來自雷公藤(tripterygium?wilfordii)的二萜雷公藤甲素在體外抑制一系列細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生和基因表達，包括il-1β、il-6、tnf-α和ifn-γ，同時它還通過抑制cox-2基因減少pge2產(chǎn)生。雷公藤甲素的其它機制效應(yīng)包括通過抑制iκbα磷酸化來抑制nf-κb信號傳導(dǎo)，并且它可調(diào)節(jié)t細胞反應(yīng)，因為它也可抑制體外il產(chǎn)生。此外，雷公藤甲素還抑制il-1α誘導(dǎo)的人滑膜成纖維細胞前基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)-1和-3的產(chǎn)生以及mrna水平，以及軟骨細胞和滑膜成纖維細胞中細胞因子誘導(dǎo)的mmp-3、mmp-13和可聚蛋白聚糖-1基因表達。

11、人乳酸脫氫酶(ldh)有五種同工酶。在厭氧葡萄糖條件下，丙酮酸在nadh的存在下被ldh還原成乳酸。大量報道表明，棉酚的抗生育特性具體與(-)-異構(gòu)體相關(guān)。(-)-棉酚是nadh與ldh結(jié)合的非選擇競爭性抑制劑。據(jù)認為，其抗生育作用是由于對線粒體ldh-c4(ldh-x)的抑制，而ldh-c4只存在于睪丸和精子中，并且是產(chǎn)生能量所必需的。然而，其作用方式復(fù)雜并且涉及許多必需酶系統(tǒng)的抑制，包括核糖核苷酸還原酶、蘋果酸脫氫酶(mdh)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ga3pdh)和細胞質(zhì)磷脂酶a2(cpla2)。后一種酶在精子成熟過程中的頂體反應(yīng)中起重要作用。在嚙齒類動物和細胞培養(yǎng)模型中對cpla2α表達的遺傳操縱致使對該酶如何影響細胞穩(wěn)態(tài)和疾病有了更好的理解。cpla2α在胚胎著床和生育中起到重要作用。cpla2α還與過敏性炎癥、哮喘、肺癌轉(zhuǎn)移、脊髓損傷、阿爾茨海默病和c型尼曼匹克膽固醇貯積障礙(niemann?pick?type?c?cholesterol?storage?disorder)的病理生理學(xué)有關(guān)。對最近發(fā)現(xiàn)的c1p轉(zhuǎn)運蛋白的抑制，導(dǎo)致cpla2α活性和類花生酸產(chǎn)量增加。因此，c1p水平與cpla2α活性之間的相關(guān)性提供c1p/類花生酸軸導(dǎo)致上述疾病的證據(jù)。cpla2δ與銀屑病有關(guān)，但其它cpla2同種型在疾病中的作用將需要更多的研究努力。

12、在cns中，spla2?mrna響應(yīng)于促炎細胞因子tnf-α、il-1β和ifn-γ表達。在損傷部位，pla2產(chǎn)物(即花生四烯酸)被代謝成促炎代謝物如前列腺素e2(pge2)，它不僅促進巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞募集，而且增加局部血流并增強血管通透性和促炎細胞因子表達。

13、雷公藤甲素具有復(fù)雜的作用機制，涉及抑制轉(zhuǎn)錄因子核因子κb(nf-κb)活化、抑制前列腺素e2的產(chǎn)生和降低細胞因子水平。先前報道雷公藤甲素抑制轉(zhuǎn)錄因子nf-κb。然而，尚不清楚抑制nf-κb活化是否與雷公藤甲素抑制stat?3活化有關(guān)。nf-κb和stat?3被不同的細胞因子活化；例如，腫瘤壞死因子是nf-κb的主要活化因子，而il-6活化stat?3。然而，值得注意的是，據(jù)報道ja?k活化同時調(diào)節(jié)stat?3和nf-κb活化(53)。因此，雷公藤甲素是一種靶向ja?k調(diào)節(jié)的強力化療劑，ja?k調(diào)節(jié)nf-κb和stat?3活化。值得注意的是，雷公藤甲素抑制骨髓增殖性障礙細胞中的詹納斯激酶(ja?k)2途徑，該疾病與mm類似(22)。

14、jak/stat蛋白的成員tyk?2、stat?1和stat?4存在于人類精子中且具有活性。stat1和stat?4蛋白在精子頭部頂端區(qū)域的定位以及它們被ifn-a、ifn-g或il-12活化，表明精子stat蛋白在受精中的作用。我們假設(shè)精子來源的磷酸化stat?1和stat?4可能有助于精子-卵母細胞融合過程中轉(zhuǎn)錄因子的匯集(pool)，以及向卵母細胞核傳遞信號。因此，精子tyk?2和stat?1或stat?4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑的缺陷可能與雄性因素不育有關(guān)。

15、棉酚是一種來自棉花植物(棉屬)的天然酚。棉酚是一種滲透細胞并作為幾種脫氫酶抑制劑的酚醛。它是一種黃色顏料。該結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出軸向手性，兩種對映體具有不同的生物化學(xué)性質(zhì)。在其它應(yīng)用中，它已經(jīng)在中國作為雄性口服避孕藥進行了測試。除了其推定的避孕性質(zhì)外，棉酚還一直已知具有抗瘧疾性質(zhì)。

16、在體外研究了醋酸棉酚——一種強力的雄性不育劑——對山羊肝臟ldh(ldh-a4)、心臟ldh(ldh-b4)和睪丸ldh(ldh-c4)的影響。當(dāng)反應(yīng)在丙酮酸-乳酸(正向)或乳酸-丙酮酸(反向)方向進行時，所有l(wèi)dh制劑均被棉酚抑制。在25℃和ph?7.4下，在0.27mm丙酮酸和0.15mm?nadh的存在下，棉酚通過ldh同工酶氧化丙酮酸的ic50在16與42之間變化，而對于乳酸氧化，在25℃和ph?9.0下，在含有3.3mm乳酸和1.8mm?nad的系統(tǒng)中，ic50為125μm。lineweaver-burk的倒數(shù)圖顯示，這些同工酶關(guān)于丙酮酸和乳酸以非競爭性方式受到抑制，而當(dāng)nad和nadh作為底物變化時，以競爭性方式受到抑制。在棉酚存在下，ldh-a4、-b4和-c4同工酶對丙酮酸的ki值分別為20、34和29μm；對nadh的ki值分別為33、43和45μm；對乳酸的ki值分別為85、85和125，以及對nad的ki值分別為94、108和83μm。

17、然而，傳統(tǒng)的化學(xué)絕育需要捕獲動物并由獸醫(yī)或?qū)I(yè)人員提供治療，然后釋放動物。此外，在某些情況下，需要不止一種治療。整個程序既費時又昂貴，而且需要個體治療和護理。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、以下描述是實施本發(fā)明示例性實施方式的最佳當(dāng)前預(yù)期模式。由于本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求最佳限定，因此以下描述不應(yīng)被理解為限制性的，而僅僅是為了說明本發(fā)明的一般原理。

2、在一個實施方式中，本文提供組合物，其包括：(a)雷公藤甲素、雷公藤甲素前藥、雷公藤甲素的藥學(xué)上可接受的鹽、雷公藤甲素前藥的藥學(xué)上可接受的鹽或其任意組合；和(b)棉酚、棉酚的藥學(xué)上可接受的鹽或其組合。

3、在進一步的實施方式中，雷公藤甲素、雷公藤甲素前藥、雷公藤甲素的藥學(xué)上可接受的鹽、雷公藤甲素前藥的藥學(xué)上可接受的鹽、棉酚、棉酚的藥學(xué)上可接受的鹽或其任意組合：是提取自植物的、是合成的或是半合成的。

4、在進一步的實施方式中，本文所述的組合物還包括至少一種另外的活性成分。在一個實施方式中，所述另外的活性成分包括抗細菌劑或抗病毒劑。

5、在進一步的實施方式中，本文所述的組合物是口服劑型或可注射劑型。

6、在一個實施方式中，本文提供試劑盒，其包括：第一組合物，所述第一組合物包括：雷公藤甲素、雷公藤甲素前藥、雷公藤甲素的藥學(xué)上可接受的鹽、雷公藤甲素前藥的藥學(xué)上可接受的鹽或其任意組合；和第二組合物，所述第二組合物包括：棉酚、棉酚的藥學(xué)上可接受的鹽或其組合。

7、在一個實施方式中，本文提供用于在對象中限制生育、誘導(dǎo)避孕、誘導(dǎo)流產(chǎn)、誘導(dǎo)性不孕、不育、抑制的方法，其包括向所述對象施用治療有效量的如本文所述的組合物或如本文所述的試劑盒，從而限制生育、誘導(dǎo)避孕、誘導(dǎo)流產(chǎn)、誘導(dǎo)性不孕或不育。

8、在進一步的實施方式中，所述對象是哺乳動物、爬行動物或鳥類。

9、在進一步的實施方式中，施用包括使生殖器官與所述組合物接觸。

10、在進一步的實施方式中，所述第一組合物和所述第二組合物分別或依次施用。

11、在進一步的實施方式中，所述第一組合物和所述第二組合物同時施用。

12、在進一步的實施方式中，施用包括口服施用。

13、在進一步的實施方式中，施用包括向生殖器官施用。

14、在進一步的實施方式中，所述對象是雄性。在進一步的實施方式中，所述對象是雌性。在進一步的實施方式中，所述對象是哺乳動物或鳥類。