專利名稱：:免疫刺激單克隆抗體的制作方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來說屬于免疫治療領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及治療各種適應癥如治療癌癥中所使用的單克隆抗體?，F(xiàn)有技術(shù)下面列出的是作為現(xiàn)有技術(shù)的參考文獻，這些文獻與后面說明書所描述的內(nèi)容相關(guān)1.Clark，E.A.，和Ledbetter，J.A.，興奮性抗體對免疫反應的放大作用，Imunol.，Today，7267-270，1986.2.Meuer，S.C.，Huspey，R.E.，Cantrell，D.A.，Hodgdon，J.C.，Schlornman，F(xiàn).，Smith，K.A.和Reinberg，E.L.，觸發(fā)T3-T1抗原-受體復合物導致T細胞克隆通過白細胞介素2依賴型自分泌途徑擴增，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，311509-1513，1984.3.VanWauve，J.P.，DeMey，J.R.，和Gooser，J.G.，OKT3一種單克隆抗人T淋巴細胞抗體及強促有絲分裂特性，J.Immunol.，1242708-2713，1980.4.Jung，G.，Martin，D.E.，和Muller-Eberhard，J.H.，單克隆抗體OKT3誘導人外周血單核細胞中的細胞毒性，J.Immunol.139639-644，1987.5.VanLier，R.，Blocmena，E.，Brouwer，M.，VanHeijm，J.，Weinreich，S.，和Aarden，L.，抗CD2抗原I和II區(qū)的單克隆抗體誘導的T細胞增殖的單核細胞依賴性的研究，Immunology，67333-338，1989.6.Ellenhorn，J.D.，Hirsch，R.，Schreiber，H.，和Bluestone，J.A.，一種抗CD3抗體的體內(nèi)施用抑制惡性腫瘤的生長，Science(WashingtonDC)，242569-571，1988.7.Gallinger，S.，Hoskins，D.W.，Mullen.J.B.M.，Wong，A.H.C.，和Roder，J.C.，細胞免疫治療和抗CD3抗體在C57BL/6小鼠MCA-38-LD實驗性肝遷移治療中的對比，CancerRes.，502476-2480，1990.8.Ledbetter，J.A.，Martin，P.J.，Spooner，C.E.，Wofsy，D.，Tsu，T.T.，Beatty，P.G.，和Gladstone，P.，抗Tp67和Tp44抗體強化并維持依活化T細胞的增殖，J.Immunol.，1352331-2336，1985.9.Moretta，A.，Goggi，A.，Pende，D.，Tripodi，G.，Orengo.，A.，Pella，N.，Augugliao，R.，Bottino，C.，Ciccone，E.，和Moretta，I.，CD69介導的淋巴細胞激活途徑抗CD69單克隆抗體觸發(fā)除表達T細胞α/β受體的溶細胞性的T淋巴細胞外的淋巴效應細胞的活性，J.Exp.Med.，1741393-1398，1991.10.VanLier，R.A.，Brouwer，M.，和Aarden，L.A.，T細胞活化所涉及的信號。通過抗CD28和抗CD2單克隆抗體的協(xié)同作用誘導的T細胞增殖，Eur.J.Immunol.13167-172，1988.11.Jenkins，M.K.，Taylor，P.S.，Norton，S.D.，和Urdahl，K.B.，CD28釋放與人T細胞產(chǎn)生抗原特異性IL-2相關(guān)的共刺激信號，J.Immunol.，1472461-2466，1991.12.Townsend，S.E.和Allison，J.P.，用B7轉(zhuǎn)染的黑素瘤細胞直接共刺激CD8+T細胞之后的腫瘤排斥反應，Science(WashingtonDC)，259368-370，1993.13.Hardy，B.，Dotan，D.，和Novogrodsky，A.，一種人B淋巴母細胞的單克隆抗體激活人和鼠的T淋巴細胞，CellImmunol.，11822-29，1989.這里引用的上述任一篇參考文獻，是為了使讀者獲知現(xiàn)有技術(shù)的內(nèi)容。但這種引用從任何意義上都不應被認為這些參考文獻與后述權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的專利性主題有關(guān)。通過標明上面列舉的參考文獻的序號引用這些參考文獻。發(fā)明背景各種形式的癌癥是引起人類死亡的一個主要原因。在美國有1/3的人患有癌癥，20％的人死于癌癥(1988年有494,000人)。最廣泛應用的治療癌癥的方法有外科手術(shù)、放射療法和化學療法。近年來，提出另一種治療方法，其以使用生物反應調(diào)節(jié)物(BRM)為基礎(chǔ)。所用的BRM主要包括細胞因子(例如白細胞介素-2(IL-2)和干擾素-α(INF-α))、激活的單核細胞(如淋巴細胞活素激活的殺傷細胞(LAK))和抗體。這些BRM既直接作用于腫瘤也通過增強非特異性或特異性免疫機制和細胞毒性機制間接作用于腫瘤。迄今為止，使用BRM沒有獲得臨床方面的實質(zhì)成功，這主要是因為BRM具有毒性和副作用。也曾提出使用抗腫瘤癌的活化免疫接種，但發(fā)現(xiàn)沒有什么效果。并且，對癌癥診斷和治療中使用的幾種單克隆抗體(mAb)進行評估但仍沒有一種單克隆抗體在癌癥病人的標準治療程序中被證明是有效的。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能與T細胞表面決定簇結(jié)合的各種mAb能誘發(fā)這些細胞的增殖、活化或分化(1)。人們已經(jīng)證明，抗T細胞上CD3/TCR復合物的mAb的結(jié)合(2-4)，抗T細胞上CD2(5)受體抗原的mAb的結(jié)合，以及上述這兩種抗體同時與T細胞的結(jié)合會T使細胞增殖、IL-2受體得到表達，以及在T細胞中產(chǎn)生IL-2，由此增強這些細胞中的溶細胞過程。抗CD3mAb表明能在動物模型(6-7)中體內(nèi)引發(fā)抗腫瘤活性。人們還報道了定向抗T-淋巴細胞抗原的各種其它mAb，這些單抗在與細胞結(jié)合后，會使細胞活化。這種單抗的例子有定向抗CD5(8)的mAb，定向抗CD69(9)的mAb和定向抗CD28(10，11)的mAb。據(jù)報道，抗CD28mAb能減小鼠黑素瘤的生長速度，但并不能成功地從鼠體內(nèi)徹底消除腫瘤(12)。一種稱為“Daudi”的定向抗人B淋巴母細胞系的單克隆抗體表明刺激鼠淋巴和人外周T細胞(13)。發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供了一種單克隆免疫刺激抗體，該抗體與B淋巴母細胞結(jié)合，誘發(fā)外周血淋巴細胞的增殖和活化，該單克隆抗體的特征在于當被注射入長有腫瘤的動物體時，能引發(fā)抗腫瘤效果?？鼓[瘤效果是一種生物效果，通過腫瘤體積縮小、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少、壽命延長或各種與癌癥相關(guān)的生理癥狀的改善來體現(xiàn)這種效果。也可通過mAb在腫瘤首發(fā)位置抑制腫瘤發(fā)生的能力來體現(xiàn)抗腫瘤效果。本發(fā)明單克隆抗體由于具有這些性質(zhì)，能用于癌癥的治療以及癌癥的預防中。首先用免疫原免疫動物，免疫原是B淋巴母細胞、裂解的B淋巴母細胞或其膜制備物。免疫接種并在免疫動物體內(nèi)形成免疫反應后，從該動物體中提取出B淋巴細胞，形成細胞系并篩選出具有可以與免疫原結(jié)合的分泌抗體的細胞系。然后從所選的mAb中再進一步篩選出能誘發(fā)外周血細胞增殖和活化的單克隆抗體。為獲得本發(fā)明的mAb，對上述篩選出的抗體再進一步進行篩選，以使所選抗體能夠達到抗腫瘤的效果。為篩選這種抗體，通常可使用癌癥動物模型。有時也可以在各種體外模型中檢測抗癌效果。例如，這種模型可以是實驗室中任意一種已被誘發(fā)癌癥的動物。特定相關(guān)地，特別選擇鼠作為人類治療應用的模型，其可以誘發(fā)出人源腫瘤。后一種類型的動物模型例子有免疫損害鼠，如SCID鼠或裸鼠，這些鼠注射了或植入了來自癌癥病人的腫瘤細胞或組織。篩選時，通過與對照動物(沒有以mAb處理的或以不相關(guān)的mAb處理的類似的長有腫瘤的動物)相比較，來確定本發(fā)明mAb減小腫瘤體積、延長存活時間等能力。篩選也可包括在適當?shù)膭游锬Ｐ椭袡z測本發(fā)明mAb預防癌癥發(fā)生的能力。例如，對具有癌癥易發(fā)基因的動物可注射本發(fā)明mAb，然后將這種用mAb處理的組與用別的方法處理且同樣地飼養(yǎng)的對照組進行比較，比較腫瘤發(fā)生率和動物存活率。不使用具有腫瘤易發(fā)基因的動物，可在各種以mAb處理的其它動物被實驗性地給予動物惡性腫瘤細胞之前檢測本發(fā)明mAb抑制癌癥的能力。為達到這種抗腫瘤效果，須給予實驗對象有效量的本發(fā)明mAb。術(shù)語“有效量”應被理解為為達到治療效果所需要的mAb的量。這種達到最終治療結(jié)果所需的有效量取決于多種因素，包括例如腫瘤的類型、病人病癥的嚴重程度(即癌癥狀態(tài))以及該mAb是否與另一種試劑一同施用，該試劑以加和方式或協(xié)同方式(注意這種共同施用，如下所述)與該mAb共同起作用?？赏ㄟ^各種實質(zhì)上眾所周知的方法獲得分泌本發(fā)明mAb的無限增殖細胞系，如通過與無限增殖細胞系融合產(chǎn)生雜交瘤；通過EBV轉(zhuǎn)化；通過基因工程化細胞系，如CHO細胞系這樣的能以各種已知的方法獲得的細胞系來實現(xiàn)。總之，今天獲得無限增殖單克隆抗體分泌細胞系的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)，這里不再進行描述。通常，當mAb是用于治療人類疾病時，免疫原應是來源于人的。然而，時常存在種間交叉反應性，有時也可能使用非人源的免疫原，如來源于靈長類的免疫原進行免疫接種后獲得mAb，用于治療人類疾病。本發(fā)明抗體應理解為包括單克隆抗體，可以是IgG或IgM抗體、可以是該抗體的Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈抗體等等。此外，來自非人源如來自鼠的抗體可以通過各種基因工程手段進行“人源化”(“人源化”抗體是一種抗體，其中主要部分被人源部分取代)。本發(fā)明的抗體可用于多種適應癥的治療中，本發(fā)明優(yōu)選實施方案可用于癌癥治療。我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明單克隆抗體在減少各種腫瘤的致瘤性方面是有活性的。本發(fā)明典型的雜交瘤細胞系保藏于微生物培養(yǎng)物國家保藏中心(CollcctionNationalcdeCulturesdeMicroorganismes(CNCM))，InstitutePasteur，25，RucduDocteurRour，75724，巴黎，Ledex15，保藏號為No.I-1397，保藏時間為1994年1月28日。這里有時將此細胞系的細胞表示為“BAT-1細胞”，有時將相應的單克隆抗體表示為“BAT-1mAb”。使用具有BAT-1mAb特性的單克隆抗體，特別是BAT-1mAb本身是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。根據(jù)其與Daudi人B淋巴母細胞系細胞的結(jié)合來篩選本發(fā)明BAT-1單克隆抗體。我們發(fā)現(xiàn)BAT-1mAb與一種蛋白物質(zhì)(以下稱“BAT-1結(jié)合蛋白”)結(jié)合，該蛋白質(zhì)的表觀分子量由SDS-PAGE測定為48-50K道爾頓。本發(fā)明的另一方面是BAT-1結(jié)合蛋白?？赏ㄟ^各種已知方法使用本發(fā)明mAb分離BAT-1結(jié)合蛋白。BAT-1結(jié)合蛋白可用于動物的免疫接種，從該動物中可得到本發(fā)明mAb。本發(fā)明也可提供一種藥物組合物，組合物中包含有效量的作為活性成分的本發(fā)明mAb和生理上可接受的載體。本發(fā)明另一方面是一種治療疾病的方法，特別是癌癥的治療方法，包括給需要治療的病人施用有效量的本發(fā)明mAb。通常以非腸道形式如靜脈內(nèi)(i.v)、腹膜內(nèi)(i.p.)或肌內(nèi)(i.m.)形式施用mAb。用于施用的載體可以是任意一種已知的載體，如鹽水溶液或任何其它合適的生理溶液。如上所述，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明mAb在減少各種腫瘤的致瘤性方面是有活性的。本發(fā)明mAb在減少致瘤性中的功效與其誘發(fā)淋巴細胞細胞毒活性的能力相關(guān)。為增強這種細胞毒活性，有時將本發(fā)明mAb與其它試劑一同施用是有利的，所述其它試劑能以加和方式或協(xié)同方式與mAb一同起作用。例子包括各種細胞因子如IL-1(白細胞介素-1)、IL-2、IL-6和IFN-α(干擾素-α)。本發(fā)明mAb可用于多種非癌癥疾病的治療中，其中mAb對免疫系統(tǒng)細胞毒活性的激活作用或其它作用可能在如HIV感染(引起獲得性免疫缺損-AIDS的病毒)早期，在各種自動免疫失調(diào)中，或在一些遺傳性或獲得性免疫缺損的情況中具有治療效果。在癌癥治療中，可在檢測出初級或二級腫瘤之后對病人施用抗體，或者對患癌高危性人如放射環(huán)境中工作的人或具有遺傳傾向的人進行預防治療時施用抗體。相似地，對于AIDS病人，可對受感染個體在還未產(chǎn)生任何疾病癥狀時或?qū)μ幱贖IV感染過程早期的個體施用mAb。下面將由各實施例通過描述證明抗癌治療活性的實驗來說明本發(fā)明。但應認為這些實施例僅用于說明目的而不起限制作用。附圖的簡要描述圖1表明BAT單克隆抗體(mAb)與人純化T-淋巴細胞結(jié)合的流動細胞計數(shù)分析結(jié)果。用第二種攜帶有熒光標記的抗體，F(xiàn)ITC-山羊抗鼠抗體，評估BAT抗體的結(jié)合。圖1a-沒有BAT抗體時背景讀數(shù)；圖1b-抗CD3抗體；圖1c-BAT-1；圖1d-BAT-5；圖1e-BAT-2；圖1f-BAT-4。圖2表明了人外周血單核細胞(PBM)(左板)和JurkatT細胞(右板)流動細胞計數(shù)分析結(jié)果，其中細胞以BATmAb或抗CD3mAb這種初級抗體和第二種偶聯(lián)FITC的抗鼠IgG抗體進行雙重標記。圖2A-未經(jīng)門控的細胞；圖2A(a)-以BATmAb處理的PBM細胞；圖2A(b)-以抗CD3mAb處理的PBM細胞；圖2A(c)-以BATmAb處理的JurkatT細胞；圖2A(d)-以抗CD3處理的Jurkat細胞；圖2B-經(jīng)門控的細胞；圖2B(a)-進入小細胞(R1)和大細胞(R2)的PBM細胞；圖2B(b)-以BATmAb處理的(R1)細胞；圖2B(c)-以抗CD3處理的(R1)細胞；圖2B(d)-以抗BATmAb處理的(R2)細胞；圖2B(e)-以抗CD3處理的(R2)細胞。圖3表明了流動細胞計數(shù)分析結(jié)果，顯示了在以偶聯(lián)FITC的BATMAB和偶聯(lián)PE的抗CD3進行雙重標記的人PBM上BAT結(jié)合蛋白和CD3的表面表達。圖3A-未經(jīng)門控的細胞圖3A(a)-用作陰性對照的Becton-DicklhsonSimliltest對照圖3A(b)-單純的PE-抗-CD3；圖3A(c)-單純的FITC-BATmAb；圖3A(d)-以FITC-BATmAb和PE-抗CD3抗體進行雙重標記；圖3B-經(jīng)門控的細胞圖3B(a)-進入小細胞(R1)和大細胞(R2)的PBM細胞圖3B(b)-以FITC-BATmAb和PE-抗CD3雙重標記的(R1)細胞；圖3B(c)-以FITC-BATmAb和PE-抗CD3雙重標記的(R2)細胞；圖4為BAT-1抗體與Daudi細胞不同溶胞產(chǎn)物結(jié)合的Western印跡分析結(jié)果。圖4(1)-Daudi細胞(未處理的)的溶胞產(chǎn)物；圖4(2)-以神經(jīng)氨酸苷酶(0.2u/ml)處理的溶胞產(chǎn)物；圖4(3)-以神經(jīng)氨酸苷酶(0.4u/ml)處理的溶胞產(chǎn)物。圖5曲線表示摻入(3H)胸腺嘧啶核苷的細胞隨一系列BATmAb濃度增加培養(yǎng)6天的結(jié)果，BATmAb為BAT-1(-▲-)，BAT-2(-×-)，BAT-3(-●-)，BAT-5(-★-)，BAT-6(-◆-)，BAT-7(-■-)。圖6曲線所示實驗是在與2.5mg/mlBATmAb一起培養(yǎng)不同培養(yǎng)時間的PBM中測試的細胞毒活性的誘導作用。HT-29(左)或RC29(右)細胞用作靶細胞。效應細胞與靶細胞比率為20∶1。對照(-○-)，BAT-1(-●-)，BAT-2(-×-)，BAT-3(-▲-)。圖7顯示了以B-16黑素瘤細胞接種的C57BL鼠的肺上排顯示的是僅以細胞接種，接種24天后的鼠肺；下排顯示的是如上述以B-16細胞接種，14天后以10μgfBAT-1mAb靜脈注射，接種24天后的鼠肺。圖8曲線是對圖7所示各項實驗的總結(jié)，顯示出用腫瘤細胞B-16黑素瘤細胞、3LLLewis肺癌細胞或MCA105纖維肉瘤細胞接種的鼠在接種后一個月肺中轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目。這一結(jié)果對用每種腫瘤所做的3-4次實驗進行了概括總結(jié)。接種腫瘤后兩周，未用BAT-1處理的鼠(-)，用BAT-1(10μg/只)處理的鼠(+)。轉(zhuǎn)移瘤(●)；沒有轉(zhuǎn)移瘤(○)。圖9表示以3LLLewis肺癌細胞接種的鼠肺。與圖7相似；上排是僅以腫瘤細胞接種的肺；下排是接種14天后用10μgBAT-1mAb靜脈內(nèi)注射的鼠肺。圖10所示實驗與圖9相似，其中腫瘤細胞為MCA105纖維肉瘤細胞。材料和方法單克隆抗體的制備用Daudi細胞的膜制劑免疫BALB/c鼠。用甘油灌注-低滲沖法(Jett，M.，Seed，T.M.，和Jamieson，G.A.，J.Biol.Chem.，2522134，(1977))制備Daudi細胞膜。50-80×106個細胞懸浮于PBS中并于37℃溫育，逐漸用30％甘油灌注。冰上溫育5分鐘后，將其離心并重新懸浮于冷的Tris溶胞緩沖液中(含10mMTris-HCl，1mMMgCl2，1mMCaCl2，pH7.4)，4℃時混合5分鐘，700g離心。分離出上清液并在3300g(10分鐘，4℃)離心。將沉淀物再次洗滌，將含細胞膜部分的兩種上清液合并。用260μl完全弗氏佐劑乳化260μl的細胞膜制劑(3mg/ml)，并腹膜內(nèi)注射入BALB/c鼠。三周后，取出鼠脾臟，脾細胞與骨髓瘤細胞系NS-0以10∶1比例融合。根據(jù)Kohler和Milstein(Kohler，G.，和Milstein，C.，Nature，(London)256495，(1975)的方法，使用聚乙二醇進行融合，并將雜交瘤生長于選擇性培養(yǎng)基中。細胞結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)從生長的雜交瘤中篩選與Daudi細胞結(jié)合的上清液(Glassy，M.C.和Surh，C.D.，J.Immunol.Method，81115(1985))。使用〔3H〕胸腺嘧啶核苷攝入分析，根據(jù)雜交瘤上清液誘導人PBM增殖的能力進一步篩選陽性雜交瘤上清液。用有限稀釋法對陽性克隆進行亞克隆、重復測試、擴大培養(yǎng)成培養(yǎng)物。用50％硫酸銨沉淀，隨后進一步在PBS中透析從培養(yǎng)基中純化的mAb。通過結(jié)合有抗鼠抗體的Sepharose(瑞典Pharmacia公司的一個商標)柱親和層析完成進一步純化。培養(yǎng)基所有細胞均懸浮于補充有10％胎牛血清(FCS)、丙酮酸鈉(1.1mg/ml)、L-谷氨酰胺(0.3mg/ml)和抗生素(青霉素200u/ml和鏈霉素10μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中，并于5％CO2濕度培養(yǎng)箱中溫育。所用IL-2單位為Cetus(1單位Cetus相當于3個國際單位)。細胞制備通過ficoll-hypaque密度離心(Histopaque，Sigma公司的一個商標，Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州，美國)從健康成年人獲取人外周血單核細胞(PBM)，用Sephadex(瑞典Pharmacia公司的一個商標)G10柱除盡PBM中的單核白細胞。通過SRBC玫瑰花結(jié)法分離T細胞。通過免疫磁性技術(shù)除盡CD3陽性細胞和Leu19陽性細胞。用PBS清洗PBM培養(yǎng)物或?qū)φ諛悠啡?，其中PBM與BATmAb共同溫育了5-6天。未與CD3或Leu19(CD56)偶聯(lián)的抗體被加入到完全RPMI培養(yǎng)基中的細胞中，并于4℃溫育1小時，加入包被抗鼠抗體的磁珠30分鐘。利用磁性除去吸附于珠上的細胞，對未吸附的細胞分析其細胞毒性并以流動細胞計數(shù)染色。細胞毒性分析測定細胞毒性測定方法如下2-4×106個靶細胞與200μCi的51Cr-鉻酸鹽在無血清培養(yǎng)基中混合1小時。細胞用完全培養(yǎng)基洗滌3次，并最終重新懸浮于RPMI-10％FCS中，以每孔104個細胞置于培養(yǎng)板上。培養(yǎng)效應細胞，從正常的外周血中制備的淋巴細胞與不同mAb、同族型對照IgG或IL-2共同溫育不同時間。在測定之前，將細胞在RPMI培養(yǎng)基中洗滌三次，用1％臺盼藍對細胞活性染色，在圓底微量滴定板中以各種效應細胞-靶細胞比例將細胞與靶細胞混合，并于5％CO2中37℃溫育3小時15分。收集培養(yǎng)物上清液并在β-閃爍計數(shù)儀上計數(shù)。通過靶細胞與Triton(Sigma公司的一個商標，Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州，美國)x-100共同溫育而達到最大同位素釋放量(MR)。通過將靶細胞單獨與培養(yǎng)基一起溫育測定自發(fā)釋放量(SR)。通過(ER-SR/MR-SR)×100計算細胞溶解的百分數(shù)，其中ER是實驗測得的效應細胞釋放量。人淋巴細胞亞群中細胞毒性的誘導作用在BATmAb存在情況下培養(yǎng)PBM細胞(4×106個/ml)6天。然后將細胞洗3次，并使用包被有抗鼠f(ab’)2的磁珠除盡CD3和Leul9細胞，測試抗K562和Daudi細胞的細胞毒性。流動細胞計數(shù)使用FACS440(Becton-Dickinson)通過流動細胞計數(shù)法檢測細胞表面抗原。每次測定使用106個細胞，通過與所生產(chǎn)的最適濃度的針對于人CD3、IL-2受體的鼠mAb或mAbBAT1-9連續(xù)溫育對細胞進行染色。在這種間接染色過程中使用與FITC偶聯(lián)的山羊抗鼠F(ab’)2作為第二種抗體。每次溫育均在pH7.4含1％BSA和5％疊氮鈉的PBS中4℃時進行30分鐘，隨后用同樣的緩沖液洗滌3次。測定104個染色細胞。BATmAb結(jié)合決定簇的檢測使用Western印跡法進行DaudiB淋巴母細胞溶解產(chǎn)物上BATmAb結(jié)合決定簇的檢測。簡而言之，懸浮于PBS中的50×106細胞/ml以30％甘油逐漸灌注，通過連續(xù)離心分離出細胞膜。用SDS-PAGE(12％)分離細胞膜制備樣品，然后將細胞膜樣品轉(zhuǎn)移至浸泡于含1％低脂奶的PBS中的硝酸纖維素印跡膜上。室溫下將該印跡膜與BATmAb一起溫育2小時，然后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗體70抗鼠IgG(Fab’)2一起溫育30分鐘，來檢測硝酸纖維素印跡上的BATmAb結(jié)合蛋白。然后浸洗細胞并以鄰聯(lián)茴香胺底物進行檢測。鼠腫瘤模型使用了三種鼠腫瘤模型B16黑素瘤、Lewis肺癌(3LL)和甲膽蒽誘發(fā)的纖維肉瘤(MCA105)。向C57BL鼠(8周齡)靜脈注射50-200×106個細胞。兩周后，靜脈注射BAT-1，注射量為1-10μg/只，10天后將鼠殺死并計數(shù)所生長的肺轉(zhuǎn)移瘤。實施例實施例1a.結(jié)合特性對由B淋巴母細胞免疫接種得到的稱為BAT1-9的9個單克隆抗體(mAb)進行篩選，首先與Daudi細胞結(jié)合，然后誘導人外周血淋巴細胞增殖。通過ELISA和Ochterlony分析確定BATmAb的同族型。人們發(fā)現(xiàn)BAT1、2、3、6、7和9為IgG1類而BAT4和5為IgM類，BAT8為IgG2a。使用間接免疫熒光染色通過FACS分析法來分析上述mAb與純化的人外周T細胞的結(jié)合。圖1顯示了這一實驗的FACS分析結(jié)果。正如所看到的，BATmAb與外周血CD3+T細胞結(jié)合，結(jié)合程度各不相同，BAT-2為44％，BAT-5為38％，BAT-1為32％，BAT-4結(jié)合程度有些弱(13％)。來自同一供血者的純化外周血B淋巴細胞不與這些mAb結(jié)合(數(shù)據(jù)未示出)。b.BAT-1與人淋巴細胞亞群的結(jié)合正如圖2所示，進一步的FACS分析表明，BAT-1與帶CD3+的人PBM結(jié)合，還與JurkatT-細胞系的細胞結(jié)合。使用雙重標記細胞的FACS分析法(圖3)更進一步證實了BAT-1與帶CD3+的PBM細胞的結(jié)合。如下表1所示，BAT-1除與帶有CD3的細胞結(jié)合外，還與Leu19/NK細胞結(jié)合。表1BAT-1mAb與人淋巴樣亞群的結(jié)合使用ELISA鑒定結(jié)合情況，表示如下+(0.1-0.2OD)++(0.2-0.3OD)+++(ovcr0.3OD)實施例2BATmAb結(jié)合位點的分析和BAT-1結(jié)合蛋白的純化為測定與BAT-1mAb相作用的膜蛋白分子量，將Daudi細胞膜制備物溶解，通過SDS-PAGE分離蛋白。硝酸纖維素轉(zhuǎn)移印跡與BAT-1mAb一起溫育，再進一步與辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗抗鼠IgG(Fab’)2抗體一起溫育并使用鄰聯(lián)茴香胺作底物檢測區(qū)帶。發(fā)現(xiàn)BAT-1結(jié)合蛋白的分子量大小約為48-50KDa(圖4)。使用與Sepharose(瑞典Pharmacia公司的一個商標)偶聯(lián)的BATmAb來純化BATmAb結(jié)合蛋白。也可使用分子生物學方法通過克隆來制備該結(jié)合蛋白，對鼠施用BAT-1的體內(nèi)實驗能導致BAT抗體的誘發(fā)。實施例3BATmAb的功能特性a.BATmAb誘導胸腺嘧啶核苷的摻入在一系列濃度遞增的BATmAb存在情況下，對人外周血細胞培養(yǎng)6天，收獲前20小時加入〔3H〕胸腺嘧啶核苷。正如圖5所示，BATmAb濃度的逐漸增加，會使〔3H〕胸腺嘧啶核苷在PBM細胞中的摻入量稍有提高而非顯著改變。但是，大劑量的抗體會使細胞攝入的胸腺嘧啶核苷量減少。在對照實驗中，同族型匹配的抗體不會使PBL細胞中〔3H〕胸腺嘧啶核苷增加，這表明BATmAb的激動效應取決于它們的結(jié)合特異性。例如，我們實驗室所培養(yǎng)的抗卵巢癌細胞的IgG1同族型mAb不會引起〔3H〕胸腺嘧啶核苷攝入量的增加，與也屬IgG1類的BAT1，2，3，6，7和9mAb相反。b.BATmAb誘發(fā)人PBM細胞毒性對于BATmAb一起溫育不同時間的人外周血單核細胞培養(yǎng)物，測試其溶解腫瘤細胞系的能力。正如下表3所示，與一系列BATmAb一起溫育一周的人PBM細胞，對人紅白血病(NK敏感性的)的K562和腎癌細胞系(NK抗性的)細胞RC-29均有細胞毒性。我們研究了由BATmAb刺激的人PBM細胞毒活性增強的動力學性質(zhì)。正如圖6所示，在人PBM與BATmAb一起溫育7天后，可獲得針對于人結(jié)腸癌(HT-29)和腎細胞癌(RC-29)的最大細胞毒性。表3BATmAb誘發(fā)人PBM細胞毒性tables>*靶細胞溶解百分率，所用效應細胞∶靶細胞比率為5∶1c.在BAT誘發(fā)的細胞毒性中的淋巴細胞亞群的特性為評估BATmAb誘發(fā)的人PBM細胞毒性的增加是否是由于NK細胞的激活、T細胞的激活或這兩種細胞激活作用，對NK和T細胞進行純化，并測定其BAT誘發(fā)的細胞毒性。為純化NK和T細胞，將抗Leu19和抗CD3單克隆抗體與人PBM細胞一起溫育，隨后與包被有抗鼠IgG磁珠一起溫育。這會導致與相應抗體結(jié)合的細胞亞群被完全除去。正如下表4所示，在除去CD3和Leu19的細胞培養(yǎng)物中，溶解單位的數(shù)增大，這些實驗中使用BAT6和8，靶物為人紅白血病(K562)和人淋巴瘤(Daudi)。表4BAT在人淋巴細胞亞群中誘發(fā)細胞毒性實施例4BATmAb和IL-2在誘發(fā)細胞毒性中的協(xié)同作用將BATmAb和IL-2一起與PBM細胞溫育，研究人PBM細胞毒性的誘發(fā)。將次最適濃度(1u/ml)的IL-2與濃度逐漸增高的BAT-2mAb一起加入。培養(yǎng)一周后，檢測對K562和HT29腫瘤細胞系的細胞毒性。如下表5所示，低濃度的BAT-2在誘發(fā)PBM細胞抗兩種靶細胞的細胞毒性中與IL-2具有協(xié)同作用。前文已表明INF-α能增強MHC-I類抗原的表達。因此，施用INF-α可能會強化BAT的抗腫瘤效果，這是通過抗各種腫瘤細胞(帶有MHCI類抗原)的細胞毒細胞的介導實現(xiàn)的。表5BAT-2mAb和IL2在誘導人PBL細胞毒性中的協(xié)同作用實施例5BAT-1鼠的免疫刺激作用a.體外實驗mAbBAT-1表現(xiàn)出在鼠脾細胞中具有類似于在人PBL中所表現(xiàn)的刺激性質(zhì)。這些性質(zhì)包括(i)通過摻入〔3H〕胸腺嘧啶核苷測得，脾細胞在體外增殖加強(表6)；(ii)通過脾細胞與BAT-1和IL-2結(jié)合物一起溫育得到協(xié)同刺激作用(表6)。表6C57BL鼠脾細胞在體外與各種濃度BAT-1及白細胞介素-2(1u和10u/ml)一起溫育5天。(iii)在BAT-1存在時鼠脾細胞培養(yǎng)物中細胞毒性增強，有IL-2存在的溫育使細胞毒性進一步增強(表7)。表7在各種濃度BAT-1及低濃度IL-2存在時體外培養(yǎng)C57BL脾細胞5天誘發(fā)的細胞毒性。a.B16黑素瘤細胞用作靶物。效應細胞與靶細胞比率為50∶1對BAT-1激活脾細胞產(chǎn)生的殺傷作用敏感的鼠腫瘤細胞包括B16黑素瘤、Lewis肺癌(3LL)、纖維肉瘤(MCA105)、腎細胞癌(MR28)和淋巴瘤(YAC)細胞(表8)。表8BAT-1在脾細胞中誘導的抗鼠腫瘤細胞的細胞毒性(體外試驗)a.在BAT-1mAb(1μg/ml)不存在時，體外培養(yǎng)脾細胞5天在效應細胞/靶細胞比率為60∶1時測定細胞毒性b.體內(nèi)實驗正如下表9所示，BAT-1表現(xiàn)出體內(nèi)施用時具有免疫刺激作用。這些作用包括(i)刺激〔3H〕胸腺嘧啶核苷在鼠脾細胞中的摻入，鼠為十天前以BAT-1注射的鼠(表9A)。BAT施用劑量為10μg/只時可獲得最大刺激作用(10倍)。(ii)在來自以BAT-1注射鼠的脾細胞中誘發(fā)細胞毒性(表9B)。在細胞毒性分析前10天以不同劑量施用BAI-1，誘發(fā)對鼠黑素瘤(B16-F10)細胞、腎細胞癌(MR-28)細胞和淋巴瘤(YAC)細胞的細胞毒性。在BAT施用劑量為10μg/只時，可獲得最佳效果。表9注射BATmAb的鼠的脾細胞的增殖和細胞毒性以不同濃度BATmAb靜脈注射鼠C57BL和BALB/c。10天后測定分離出的脾細胞的細胞毒性和〔3H〕胸腺嘧啶核苷的摻入。用來自C57BL鼠的脾細胞對B16黑素瘤靶細胞進行測試，用來自BALB/c鼠的脾細胞對MR-29和YAC細胞進行測試(效應細胞靶細胞值為50∶1)。每組包括6-16只鼠，進行3-4次獨立的實驗。對每只鼠的細胞毒性和〔3H〕胸腺嘧啶核苷摻入測三次并且計算出平均值，結(jié)果以幾只鼠的平均值±標準誤差表示，給出的P值為對照鼠和以BAT處理的動物間的差值。實施例6抗鼠腫瘤的BAT-1的免疫治療效果正如表10所示，接種黑素瘤鼠在接種腫瘤細胞后14天施用BAT-1，可以使長有B16、3LL和MCA腫瘤的鼠肺中肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少a.1.使用已建立的肺轉(zhuǎn)移瘤模型，BAT-1在接種B16黑素瘤鼠中消除肺轉(zhuǎn)移瘤用50×103個B16黑素瘤細胞注射(i.v.)C57BL鼠(表10)。注射后24天在肺中生長有大量轉(zhuǎn)移瘤(實際上已達到匯合)如圖7上排所示。與之相反，如圖7下排所示，接種B16黑素瘤后兩周以BAT-1(10μg/只)注射的鼠肺實際上沒有轉(zhuǎn)移瘤。圖8總結(jié)了在上述相似條件下所做的6個相互獨立的實驗結(jié)果。表10BATmAB的抗腫瘤效果BAT誘發(fā)的肺轉(zhuǎn)移瘤減少a在第0天接種腫瘤b在第14天靜脈內(nèi)注射BATmAb(10μg/只)c在腫瘤接種后24天，使用Zeiss立體顯微鏡計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤d鼠數(shù)e(n)只鼠肺重的平均值±SDa2.在與B16腫瘤接種相關(guān)的不同時間注射BAT-1mAb的抗腫瘤效果正如表11所示，注射黑素瘤細胞的鼠，10-14天后施用BAT-1mAb，發(fā)現(xiàn)沒有轉(zhuǎn)移瘤且肺重正常。我們注意到，在腫瘤接種后5天及腫瘤施用后19天，鼠肺中轉(zhuǎn)移瘤雖然沒有完全消失但數(shù)目明顯減少。在接種腫瘤細胞的同一天注射BAT-1，沒有治療效果。表11在與B16黑素瘤接種相關(guān)的不同時間施用BATf.施用BATmAb的日期(天)，相對而言接種腫瘤的日期為第0天。b.使用已建立的肺轉(zhuǎn)移瘤模型，在接種Lewis肺癌(3LL)的鼠中，BAT-1使肺轉(zhuǎn)移瘤消除除注射2×103個3LL細胞外，實驗條件與使用B16黑素瘤的情況相似(見上所述)。圖9上排顯示了接種3LL的具有大量轉(zhuǎn)移瘤的鼠肺。圖9下排顯示接種腫瘤細胞14天后以BAT-1處理的鼠肺，正如所看到的，幾乎沒有轉(zhuǎn)移瘤。c.使用已建立的肺轉(zhuǎn)移瘤模型，在接種MCA纖維肉瘤(MCA105)的鼠中，BAT使肺轉(zhuǎn)移瘤消失實驗條件與上述3LLLewis肺癌模型中的相似。圖10上排顯示出接種MCA105的鼠肺具有大量轉(zhuǎn)移瘤。圖10下排顯示出接種腫瘤后以BAT-1處理的鼠肺，正如所示，幾乎沒有轉(zhuǎn)移瘤。實施例7BAT-1治愈生長有B16和3LL腫瘤的鼠如上所述接種B16黑素瘤細胞或3LL細胞的鼠，在接種腫瘤后25-35天死去。與此相反，正如圖11所示，腫瘤接種后14天以BAT-1(10μg/只)注射的所有鼠均能生存100多天。大多數(shù)動物在隨后5個月中沒有表現(xiàn)出疾病征兆，且病理檢查沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤。實施例8以BAT-1mAb處理的鼠脾細胞的過繼轉(zhuǎn)移(adoptivetransfer)將來自單獨以BAT-1mAb處理的鼠，或先注射有B16黑素瘤細胞再以BAT-1mAb處理的鼠的脾細胞轉(zhuǎn)移入受體鼠。該受體鼠以B16黑素瘤細胞接種或以3LL腫瘤細胞接種。正如下表12所示，得自注射有BAT-1mAb鼠的脾細胞的過繼轉(zhuǎn)移，使接受該轉(zhuǎn)移脾細胞的鼠的腫瘤消退。當108個鼠脾細胞被過繼轉(zhuǎn)移入長有腫瘤的受體鼠時，會獲得最有效的治療，其中脾細胞來自以B16黑素瘤細胞接種且14天后再注射BAT-1的鼠。正如表12所示，這種情況下，如轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和肺重的結(jié)果所示，能從長有B16腫瘤的受體中完全消除黑素瘤細胞，使長有3LL腫瘤的受體中的腫瘤顯著消退。表12過繼轉(zhuǎn)移誘發(fā)腫瘤消退a<a向接種腫瘤后14天的受體鼠靜脈注射來自三組鼠(A，B，C)的脾細胞b靜脈注射BAT(10μg/只)后20天從鼠中轉(zhuǎn)移脾細胞c條件與b相同，除了在BAT施用前14天以B16黑素瘤接種鼠d三只鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤平均值±標準誤差SDe三只鼠的肺重(gr)平均值±SD這些結(jié)果表明，來自B16接種和以BAT-1處理的鼠的單純的脾細胞對B16和3LL腫瘤均呈現(xiàn)出抗腫瘤效果。因此，看來BAT-1增強非特異性的細胞效應機制。并且，腫瘤的存在會強化BAT-1誘導這種效應細胞產(chǎn)生的增加。權(quán)利要求1.一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征，該單克隆抗體是由保藏于微生物培養(yǎng)物國家保藏中心(CNCM)保藏號為No.I-1397的雜交瘤細胞系分泌的單克隆抗體。2.分泌權(quán)利要求1的抗體的無限增殖細胞系。3.權(quán)利要求2的無限增殖細胞系，為雜交瘤細胞系。4.權(quán)利要求3的細胞系，其為保藏于CNCM保藏號為No.I-1397的雜交瘤細胞系。5.一種用于治療癌癥、艾滋病以及其它免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的藥物組合物，它們含有作為活性成分的有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的單克隆抗體和生理上可接受的載體。6.權(quán)利要求5的藥物組合物，含有除所說抗體外的另一種藥劑，其與所說抗體以加和方式或協(xié)同方式增強細胞毒性淋巴細胞的活性。7.一種能與權(quán)利要求1的抗體特異結(jié)合的蛋白物質(zhì)。8.權(quán)利要求7的物質(zhì)，其在凝膠電泳中所確立的表觀分子量約為48-50千道爾頓。專利摘要一種具有免疫刺激作用的單克隆抗體，與B淋巴母細胞特異結(jié)合，并誘導外圍血淋巴細胞的增殖和活化，當將該單克隆抗體注射入長有腫瘤的動物體內(nèi)時會產(chǎn)生抗腫瘤效果。文檔編號C07K14/705GKCN1052733SQ95192406公開日2000年5月24日申請日期1995年1月30日發(fā)明者B·哈地,A·諾沃格羅斯基申請人:莫爾研究應用有限公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan