專利名稱：用于檢測(cè)磺胺類藥物的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能識(shí)別磺胺類藥物的單克隆抗體和一種用于檢測(cè)磺胺類藥物的酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)與試劑盒。
背景技術(shù)：
磺胺類藥物是一類化學(xué)合成抗菌藥，為畜禽抗感染治療中的重要藥物之一。由于不遵守休藥期，造成了磺胺類在可食性動(dòng)物組織中殘留，這對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。研究表明體內(nèi)殘留過(guò)多的磺胺藥可能引起過(guò)敏反應(yīng)，容易引起耐藥菌的產(chǎn)生等。因此，如何控制磺胺類殘留仍然是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題，有關(guān)部門規(guī)定了動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留限量為ΙΟΟμ g/kg?；前奉愃幬餁埩舻臋z測(cè)方法主要有微生物法、儀器法、免疫法。微生物法敏感性差，耗時(shí)較長(zhǎng)，且易受到其他抗生素的干擾；儀器法靈敏度高，特異性強(qiáng)，已逐漸成為殘留分析主流方法，但是主要用于藥物的確證，而且儀器昂貴，要求有技術(shù)的檢測(cè)人員，不適用廣泛推廣；免疫分析法是以抗原抗體結(jié)合反應(yīng)為原理，在簡(jiǎn)化前處理和分析過(guò)程、降低檢測(cè)成本方面具有特殊意義，特別是酶聯(lián)免疫測(cè)定法的出現(xiàn)和使用，大大提高了殘留分析的效率， 已經(jīng)迅速發(fā)展成為大量樣品的快速篩選方法。酶聯(lián)免疫方法是基于對(duì)藥物有識(shí)別能力的抗體?；前奉愃幬锟贵w的制備主要是針對(duì)單個(gè)的磺胺類藥物，通過(guò)N4端芳香氨基與載體蛋白連接，暴露出NI端不同的R基團(tuán)， 例如制備磺胺喃唳、磺胺喹惡啉等藥物的抗體。當(dāng)保留磺胺類藥物的共同結(jié)構(gòu)對(duì)氨基苯磺酰胺不變，在NI端通過(guò)R基團(tuán)連接載體蛋白，免疫后卻沒(méi)有得到對(duì)常用磺胺類藥物敏感的抗體。Sheth和Sporns(1991)合成了具有磺胺噻唑衍生物結(jié)構(gòu)的半抗原,得到的多克隆抗體對(duì)9種磺胺藥物的IC5tl值低于5mg/L。Assi (1992)又合成了具有偶氮基團(tuán)的磺胺吡啶衍生物，得到的多克隆抗體對(duì)7種磺胺的IC5tl值低于10mg/L。Muldoon (1999)采用N-磺胺-4-氨基苯甲酸-載體蛋白復(fù)合物免疫小鼠，得到的單克隆抗體對(duì)磺胺硝苯，磺胺吡啶和磺胺噻唑的IC5tl分別為I. 41,22. 8、322μ g/L。Cliquet (2003)采用了氨苯磺胺直接和蛋白相連，獲得的抗體效價(jià)較低，只能識(shí)別合成的半抗原，對(duì)原型藥物沒(méi)有結(jié)合。Franek(2006) 為了得到族特異性的抗體，合成了幾種單環(huán)和雙環(huán)半抗原分子，由雙環(huán)抗原得到的抗體建立的直接ELISA方法對(duì)15種磺胺藥物的IC5tl低于100 μ g/L。Zhang (2006)使用兩種磺胺母核結(jié)構(gòu)的半抗原連接蛋白，得到的多克隆抗體，在直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法中，11種磺胺藥在 ΙΟΟμ g/L以下有50%抑制率。Adrian (2009)獲得的多克隆抗體，能夠在MRL水平以下，同時(shí)檢測(cè)牛奶中10種磺胺類藥物?？梢?，現(xiàn)有酶聯(lián)免疫法在磺胺類藥物殘留檢測(cè)的應(yīng)用主要是針對(duì)單個(gè)磺胺類藥物，商品化試劑盒較多，而磺胺類藥物種類多，如果能夠建立一種同時(shí)檢測(cè)多個(gè)磺胺類藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，將大大減少工作量，更有應(yīng)用價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)磺胺類藥物多殘留免疫方法的研究大多處于實(shí)驗(yàn)室階段，建立的ELSIA方法大多數(shù)基于多克隆抗體，變異性較大，不夠穩(wěn)定，制備的單克隆抗體親和力較差，對(duì)大多數(shù)磺胺類藥物識(shí)別能力不夠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種能識(shí)別多種磺胺類藥物的單克隆抗體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該單克隆抗體，建立一種能用于磺胺類藥物檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供適用于磺胺類藥物檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)磺胺類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供含有所述單克隆抗體的試劑盒在檢測(cè)動(dòng)物組織磺胺類藥物殘留中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種能識(shí)別磺胺類藥物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO C201148的雜交瘤細(xì)胞4E5所分泌的。上述雜交瘤細(xì)胞4E5，保藏在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC NO C201148o所用的免疫原是由半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備的。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種適用于磺胺類藥物檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法，該方法包括免疫原、包被原和抗體的制備以及樣品的處理和檢測(cè)等步驟，具體如下(I)將半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原；(2)將半抗原磺胺嘧啶(H3)與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合與篩選得到保藏號(hào)為CCTCC NO C201148的雜交瘤細(xì)胞4E5 ；(4)用保藏號(hào)為CCTCC NO C201148的雜交瘤細(xì)胞4E5制備單克隆抗體；(5)用步驟⑵的包被原包被固相載體(如酶標(biāo)板)；(6)將待測(cè)樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH8-9)提取，離心后取上清，得到待測(cè)物；(7)對(duì)步驟￠)的待測(cè)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)，步驟(6)磷酸鹽緩沖液(pH8_9)的配制方法為準(zhǔn)確稱取KH2PO4 O. 41g, K2HPO4 5. 59g加雙蒸水至1000mL。本發(fā)明以上述單克隆抗體和包被原作為核心試劑與常規(guī)的其他試劑組合，制成了能檢測(cè)多種磺胺類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)合上述酶聯(lián)免疫方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種磺胺類藥物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果是(I)本發(fā)明制備的單克隆抗體能夠識(shí)別16種磺胺類藥物，現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有抗體能識(shí)別相同種類的藥物；(2)本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫方法可以同時(shí)檢測(cè)16種磺胺類藥物的殘留，提高了磺胺類藥物的檢測(cè)效率，方法適用范圍廣；(3)本發(fā)明涉及的樣品處理方法簡(jiǎn)便，易操作，而且回收率高，準(zhǔn)確度和精密度好。


圖I為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。圖2為本發(fā)明的以磺胺二甲嘧啶為標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，X軸為磺胺二甲嘧啶(SM2)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)數(shù)值，Y軸為磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例I免疫原和包被原的制備免疫原的制備準(zhǔn)確稱取半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)60mg，N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 34mg，I，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 45mg，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)l. 5mL溶解， 磁力攪拌下，于4°C反應(yīng)18小時(shí)，過(guò)濾除去沉淀，濾液用于連接蛋白。取牛血清白蛋白IOOmg溶解于IOmL的PBS緩沖液，在磁力攪拌下，將上述濾液ImL 逐滴加入到蛋白溶液中，4°C反應(yīng)21小時(shí)。將反應(yīng)液裝入透析袋中，于PBS緩沖液中透析3 天，每6h更換一次透析液，即得偶聯(lián)物H1-BSA，作為免疫原用。包被原的制備依據(jù)上述免疫原制備步驟，將Hl換成磺胺嘧啶(H3)，BSA換成 0VA,即得偶聯(lián)物H3-0VA，作為包被原用。實(shí)施例2單克隆抗體的制備雜交瘤細(xì)胞的制備參照薛慶善《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》(科學(xué)出版社2001年版)中的方法以實(shí)施例I制備的偶聯(lián)物Hl-BSA為免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基礎(chǔ)免疫及數(shù)次加強(qiáng)免疫。首次免疫時(shí)用與等體積的弗氏完全佐劑乳化的含 IOOyg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的頸背部皮下進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐劑乳化的含ΙΟΟμ g免疫原的蛋白乳液進(jìn)行加強(qiáng)免疫。從免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分離血清，間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。免疫合格的小鼠(效價(jià)高、靈敏度好)停止免疫以備融合。在融合前3天(最好與上次免疫相隔3周以上)給免疫合格的小鼠腹腔注射含 IOOyg免疫原的蛋白溶液(不加佐劑)，強(qiáng)化免疫。根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，取3 5 X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞混合(比例為I : 10 5 : 10)。1500r/分鐘離心5 分鐘，將離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上，控干水滴。輕輕地敲擊管底，使管底細(xì)胞成糊狀，將其放置于37°C水浴中，將吸有O. 8mL預(yù)溫至37°C的50% PEG(購(gòu)自Amersco)的ImL 刻度吸管插入到管底，60秒內(nèi)緩緩加PEG到混合細(xì)胞上，邊加邊輕輕攪拌，加完后靜置90 秒，將離心管插到離心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取IOmL預(yù)溫至37°C的RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(購(gòu)自Hyclone)沿管壁緩緩加到融合細(xì)胞上，邊加邊輕輕晃動(dòng)離心管，第I分鐘逐滴加入ImL (3秒/滴)，第2分鐘再加2mL，最后加完剩下的7mL (5分鐘內(nèi)加完)。加完第一個(gè)IOmL后，接著沿管壁補(bǔ)加RPMI 1640培養(yǎng)基至50mL，加完后擰緊蓋，緩慢顛倒幾次，混勻。1500r/分鐘離心5分鐘，棄去上清，用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的72mL HAT完全培養(yǎng)基輕輕將融合細(xì)胞攪拌重懸。將融合細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2滴/孔。一次融合可接種 5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從融合當(dāng)天算起為0d，前面3天盡量不要?jiǎng)蛹?xì)胞板，保持培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。第3天每孔補(bǔ)加I滴HAT完全培養(yǎng)基(購(gòu)自Amersco)并觀察集落生長(zhǎng)情況；第5天每孔吸出 1/2培養(yǎng)上清(100 μ L)，再加入I滴HT完全培養(yǎng)基(購(gòu)自Amersco)；以后每隔3天同上法吸去1/2培養(yǎng)上清，換入HT完全培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔底面積 1/4左右即可取細(xì)胞培養(yǎng)上清，以發(fā)明人制備的H3-0VA偶聯(lián)物為包被原，利用ELISA方法篩選出分泌磺胺類抗體的陽(yáng)性細(xì)胞孔。對(duì)篩選出來(lái)的陽(yáng)性細(xì)胞孔利用有限稀釋法連續(xù)3次克隆化,最終建立一株穩(wěn)定分泌抗磺胺類抗體的雜交瘤細(xì)胞。對(duì)該雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，平均值為103. 3條，高于親本細(xì)胞的染色體數(shù)目(SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的染色體平均數(shù)為 58條，脾細(xì)胞染色體為40條)，說(shuō)明融合細(xì)胞的確是SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。申請(qǐng)人將該雜交瘤細(xì)胞命名為4E5，并于2011年6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO :C201148。腹水單抗制備與鑒定在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射
O.5ml弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理。用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮由保藏號(hào)為CCTCC NO: C201148的雜交瘤細(xì)胞4E5擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至I X IO6個(gè)/mL，每只小鼠腹腔接種O. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)采集腹水。按照文獻(xiàn)方法(朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.北京人民軍醫(yī)出版社，2000)，純化獲得單克隆抗體。 采用購(gòu)自ROCKLAND公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)對(duì)本發(fā)明所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠IgGl亞型。實(shí)施例3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立3. I試劑配制碳酸鹽緩沖液(pH9. 6):準(zhǔn)確稱取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超純水溶解， 定容至1000mL。洗滌液(pH7.4):準(zhǔn)確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · Iffi2O 2. 90g, KC10. 20g，少量超純水溶解，加入Tween 20 0. 50mL，定容至1000mL。磷酸鹽緩沖液(ρΗ7·4):準(zhǔn)確稱取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · 12H20
2.90g, KCl 0. 20g,少量超純水溶解，定容至IOOOmL0封閉液準(zhǔn)確稱取卵清蛋白10. 00g，加入磷酸鹽緩沖液IOOOmL,攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。底物混合液準(zhǔn)確吸取底物B液(購(gòu)自武漢市飛遠(yuǎn)科技有限公司)10mL，加入 100 μ L底物A液(購(gòu)自武漢市飛遠(yuǎn)科技有限公司)，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。終止液準(zhǔn)確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中。3. 2方陣滴定法采用方陣滴定法初步選擇包被原濃度和抗體稀釋度。使用碳酸鹽緩沖液將H3-0VA 包被原倍比稀釋成32、16、8、4、2、1、0. 5,0. 25 μ g/mL,從第一至第八行依次橫向加入96 孔酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；洗滌3次，拍干，加入封閉液250μ L，37°C封閉2小時(shí)；洗滌3次，拍干，單克隆抗體使用磷酸鹽緩沖液倍比稀釋成I : 1000、1 2000,1 4000,1 8000、 I 16000、I 32000、I 64000、I 128000、I 256000，從第一至第八列依次縱向加入96孔酶標(biāo)板加入酶標(biāo)板，37°C孵育30分鐘；洗滌3次，拍干，各孔加入用磷酸鹽緩沖液 I 5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(簡(jiǎn)稱二抗，以下所指二抗均為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，購(gòu)自武漢飛羿生物技術(shù)有限公司)100yL，37°C孵育30分鐘；洗滌4次，拍干，各孔加入底物混合液100 μ L，避光顯色15分鐘；加入終止液 50 μ L ;用自動(dòng)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(0D值)。方陣滴定結(jié)果見表1，初步選擇幾個(gè)OD值接近2. 0，且相鄰兩孔OD值有較大變化的包被濃度及對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度組合。 結(jié)果表明，可選擇以下包被原濃度和抗體稀釋度組合(8，64000)和(4，32000)。表I單克隆抗體方陣滴定
權(quán)利要求
1.一種能識(shí)別磺胺類藥物的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號(hào)為CCTCC NO: C201148的雜交瘤細(xì)胞4E5所分泌的。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞4E5，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為 CCTCC NO C201148o
3.包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，該試劑盒是檢測(cè)磺胺類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒。
5.一種檢測(cè)磺胺類藥物的酶聯(lián)免疫方法，包括免疫原、包被原、抗體的制備以及樣品的處理和檢測(cè)，其步驟如下(1)將半抗原磺胺二甲嘧啶與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原；(2)將半抗原磺胺嘧啶與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合與篩選得到保藏號(hào)為CCTCCNO C201148的雜交瘤細(xì)胞4E5 ；(4)用保藏號(hào)為CCTCCNO C201148的雜交瘤細(xì)胞4E5制備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；(6)將待測(cè)樣品用PH8-9的磷酸鹽緩沖液提取，離心后取上清，得到待測(cè)物；(7)對(duì)步驟￠)的待測(cè)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
6.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)磺胺類藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在檢測(cè)動(dòng)物組織磺胺類藥物殘留中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能識(shí)別磺胺類的特異性單克隆抗體，本發(fā)明的單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞4E5所分泌的，該雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOC201148。本發(fā)明還公開了特異性單克隆抗體、包被原、免疫原的制備方法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備得到的單克隆抗體可識(shí)別多種磺胺類藥物，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及試劑盒具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102608318SQ20121004519
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉振利, 周琪, 彭大鵬, 戴夢(mèng)紅, 潘源虎, 王玉蓮, 袁宗輝, 陳冬梅, 陶燕飛, 黃玲利 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)