專利名稱：丙型肝炎病毒抗原抗體時間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測及檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒抗原抗體時間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測及檢測試劑盒，屬于時間分辨免疫熒光分析法以及體外診斷檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus, HCV)呈球形，直徑小于80nm (在肝細(xì)胞中為36 40nm，在血液中為36_62nm)，為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有刺突。丙型肝炎病毒可引起丙型肝炎主要經(jīng)輸血，針刺，吸毒等傳播。HCV感染通常是持續(xù)性的終生感染，抗體檢測是一個非常有效的方法。但因感染HCV后，抗HCV出現(xiàn)較 慢，一般情況下，抗體的血清學(xué)轉(zhuǎn)換可以延遲到暴露后幾個月才發(fā)生，此時可發(fā)生抗HCV的 假陰性(也就是說在抗體可檢出之前或在血清學(xué)轉(zhuǎn)換之中即所謂的“窗口期”)，故在早期診斷丙肝感染上有困難。HCV核心抗原檢出時間早于抗體，HCV-cAg檢測可作為HCV抗體檢測的補充試劑。目前丙型肝炎的檢測方法主要有三類
1.丙型肝炎抗體檢測其缺點是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2-26周的潛伏期，一般到抗HCV抗體出現(xiàn)(轉(zhuǎn)陽)有一個較長的窗口期，平均為70d，有的患者窗口期可延長至6-9個月或更長。由于窗口期的存在，對潛伏期和隱形感染者容易造成漏檢，機體感染HCV后，在抗HCV抗體出現(xiàn)之前約2周左右，血循環(huán)中即可出現(xiàn)病毒顆粒，此時丙型肝炎病毒HCV的RNA經(jīng)PCR方法檢測可為陽性，血液具有感染性，而用抗體檢測方法根本無法測出；
2.丙型肝炎病毒HCV核酸檢測感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即可檢測到HCV-RNA。因此，HCV核酸檢測(HCV RT-PCR檢測)可用于丙型肝炎的早期診斷，并且通過對病毒拷貝數(shù)的定量檢測可對其臨床療效進(jìn)行監(jiān)測。因為PCR法檢測HCV-RNA影響因素較多，在樣本收集、儲存和檢測方面都有嚴(yán)格的要求，并且PCR的檢測操作過程復(fù)雜、費時；
3.丙型肝炎抗原檢測丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最為保守的部分編碼而來，在HCV-RNA出現(xiàn)后的l-2d內(nèi)即出現(xiàn)丙型肝炎病毒HCV抗原，且與HCV-RNA的水平相平行，可以作為HCV復(fù)制的標(biāo)志。有研究表明，HCV抗原檢測與抗HCV抗體檢測相比，HCV抗原的檢測可使檢測的窗口期平均提前49天，縮短窗口期HCV感染者的獻(xiàn)血的風(fēng)險。與RT-PCR方法相比具有操作簡便、時間短、對環(huán)境要求低的特點，在臨床上可用于早期急性丙型肝炎診斷。時間分辨免疫突光分析(Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)是在突光分析(FIA)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種特殊的熒光分析法。它利用了具有獨特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物，標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞，以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強度和相對熒光強度的比值，準(zhǔn)確地測定反應(yīng)體系中被分析物的濃度。TRFIA所使用的熒光標(biāo)記物是鑭系稀土金屬，由于鑭系稀土金屬離子螯合物有很長的突光壽命(微秒級)，有別于傳統(tǒng)突光的短突光壽命，使其能通過時間分辨方式區(qū)別于背景熒光(鈉秒級)，正是由于熒光衰變時間長，可以延緩測量時間，待測樣品中短壽命的本底熒光衰變后再測稀土離子的特異熒光，因此可完全消除本底熒光的干擾。鑭系稀土金屬離子螯合物熒光很寬的Stokes位移使其容易通過波長分辨方式進(jìn)一步區(qū)別于背景熒光，提高方法學(xué)的穩(wěn)定性。鑭系稀土金屬離子螯合物狹窄的熒光發(fā)射峰使其熒光檢測具有很高的效率，進(jìn)一步提高了信號檢測的特異性和靈敏性。此外，由于檢測時加入了熒光增強液，它可使原來熒光增強100萬倍，以上各種因素使TRFIA的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性大大提聞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于丙型肝炎病毒抗原抗體時間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測及檢測試劑盒，主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作煩瑣及污染環(huán)境等技術(shù)問題。最主要解決的問題是縮短窗口期，可用于早期急性丙型肝炎診斷。本發(fā)明采用時間分辨免疫熒光分析法，聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體。該發(fā)明建立雙抗夾心的基礎(chǔ)之上，在這里，樣品中的抗原抗體首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abl、丙型肝炎病毒重組抗原AgI捕獲。在洗掉樣品的其它部分，再加入銪標(biāo)記物(銪標(biāo)記抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abll、丙型肝炎病毒重組抗原AgII )，就可以形成單克隆抗體AbI-丙型肝炎病毒抗原-單克隆抗體AbII銪標(biāo)記物復(fù)合物與重組抗原AgI-丙型肝炎病毒抗體-重組抗原AgII銪標(biāo)記物復(fù)合物，洗板加入增強液，用時間分辨分析儀測量熒光值，熒光值與樣本中抗原抗體總濃度呈正相關(guān)，從而計算抗原抗體濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點
1.本發(fā)明采用丙型肝炎抗原抗體聯(lián)合檢測大大縮短窗口期?，F(xiàn)階段丙型肝炎的檢測·一般是檢測丙型肝炎抗體其缺點是感染丙型肝炎病毒后，有2-26周的潛伏期，一般到抗HCV抗體出現(xiàn)(轉(zhuǎn)陽)有一個較長的窗口期，平均為70d，有的患者窗口期可延長至6-9個月或更長。由于窗口期的存在，對潛伏期和隱形感染者容易造成漏檢。本發(fā)明采用丙型肝炎抗原檢測，丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最為保守的部分編碼而來，在HCV-RNA出現(xiàn)后的l-2d內(nèi)即出現(xiàn)丙型肝炎病毒HCV抗原，且與HCV-RNA的水平相平行，可以作為HCV復(fù)制的標(biāo)志。有研究表明，HCV抗原檢測與抗HCV抗體檢測相比，HCV抗原的檢測可使檢測的窗口期平均提前49天，縮短窗口期HCV感染者的獻(xiàn)血的風(fēng)險。本發(fā)明應(yīng)用聯(lián)合檢測能夠?qū)⒖乖c抗體檢測的優(yōu)勢據(jù)發(fā)揮出來，且本發(fā)明具有操作簡便、時間短、對環(huán)境要求低的特點，在臨床上可用于早期急性丙型肝炎診斷；
2.本發(fā)明是采用先進(jìn)的時間分辨免疫熒光分析法，具有靈敏度高，不易污染，檢測時間快等優(yōu)勢。時間分辨免疫熒光分析是在熒光分析(FIA)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種特殊的熒光分析法。它利用了具有獨特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物，標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞，以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強度和相對熒光強度的比值，準(zhǔn)確地測定反應(yīng)體系中被分析物的濃度。TRFIA所使用的熒光標(biāo)記物是鑭系稀土金屬，由于鑭系稀土金屬離子螯合物有很長的熒光壽命(微秒級)，有別于傳統(tǒng)熒光的短熒光壽命，使其能通過時間分辨方式區(qū)別于背景熒光(鈉秒級)，正是由于熒光衰變時間長，可以延緩測量時間，待測樣品中短壽命的本底熒光衰變后再測稀土離子的特異熒光，因此可完全消除本底熒光的干擾。鑭系稀土金屬離子螯合物熒光很寬的Stokes位移使其容易通過波長分辨方式進(jìn)一步區(qū)別于背景熒光，提高方法學(xué)的穩(wěn)定性。鑭系稀土金屬離子螯合物狹窄的熒光發(fā)射峰使其熒光檢測具有很高的效率，進(jìn)一步提高了信號檢測的特異性和靈敏性。此外，由于檢測時加入了熒光增強液，它可使原來熒光增強100萬倍，以上各種因素使TRFIA的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性大大提高；
3.本發(fā)明是定量檢測丙型肝炎病毒抗原抗體的含量，定量檢測可以動態(tài)觀察療效和病情監(jiān)測定量檢測丙型肝炎病毒抗原抗體濃度變化可對HCV的病程、治療、預(yù)后起一個動態(tài)監(jiān)測的作用，能夠讓醫(yī)生對病情療效作出合理的解釋提供依據(jù)，指導(dǎo)治療；
本發(fā)明的技術(shù)方案是在進(jìn)行時間分辨免疫熒光分析檢測前需完成下列準(zhǔn)備工作
首先制備包被板，所用的包被板為特異性抗原抗體包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測包被板條的制備包括以下步驟
(1)將純化的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abl、丙型肝炎病毒重組抗原AgI用50mmol/L Tris-HCl緩沖液稀釋,稀釋至O. 1-10 μ g/ml,然后加入包被板條各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測包被板條；
(2)將丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏 備用。其次是丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測銪標(biāo)記物的制備，包括以下步驟
(1)取待標(biāo)記物抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI稀釋至5mg/ml、丙型肝炎病毒重組抗原AgI稀釋至3mg/ml,按照1:1的體積混合。按總質(zhì)量比為2:1的比例(DTTA-Eu:總抗原抗體)邊振蕩邊加入DTTA-Eu，室溫下在振板機上慢速振蕩I小時，然后在黑暗中靜置48小時；
(2)標(biāo)記好的抗體與游離DTTA-Eu通過SephadexG50色譜柱(I. 5 X 50cm)分離,分離過程用核酸蛋白儀監(jiān)控；
(3)用小試管依次收集流出物，同時測銪標(biāo)記物濃度；
(4)加入O.5% BSA,按照抗原抗體總濃度為20 μ g/ml稀釋備用，2_8°C保存。檢測操作過程
1.試劑的準(zhǔn)備(I)洗滌液25X濃縮洗液以1:25稀釋作為工作洗滌液備用；
(2)銪標(biāo)記物使用前一小時內(nèi)用銪標(biāo)記稀釋液按1:10倍稀釋并一次用完；
2.將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條置室溫平衡；
3.吸取100μ I丙型肝炎病毒抗原抗體校準(zhǔn)品及待檢樣本，按順序加入微孔反應(yīng)條小孔中并加貼封片；
4.微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育60分鐘；
5.在第一次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng)條放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液350 μ 1，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌4次，最后一次將微孔反應(yīng)條拍干；
6.每孔中加入100μ I銪標(biāo)記物工作液，并加貼封片；
7.微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育60分鐘；8.第二次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng)條放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液350 μ 1，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌6次，最后一次將微孔反應(yīng)條拍干；
9.每一孔中加入增強液100μI(加樣過程中避免碰到小孔邊緣或其中的試劑，盡量避免污染)；
10.微孔反應(yīng)條在室溫下，用振蕩儀輕搖5分鐘后測定熒光值，分析結(jié)果。具體實施實例 I制備包被板，所用的包被板為特異性抗原抗體包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測包被板條的制備包括以下步驟
(1)將純化的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI用50mmol/LTriS-HCl緩沖液稀釋至3 μ g/ml、丙型肝炎病毒重組抗原AgI用50mmol/LTris-HCl緩沖液稀釋至6 μ g/ml,然后將兩種包被液按照1:1比例混合后加入包被板條各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測包被板條；
(2)將丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用;
2丙型肝炎病毒抗原抗體聯(lián)合檢測銪標(biāo)記物的制備，包括以下步驟
(1)取待標(biāo)記物抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI稀釋至5mg/ml、丙型肝炎病毒重組抗原AgI稀釋至3mg/ml,按照1:1的體積混合。按總質(zhì)量比為2:1的比例(DTTA-Eu:總抗原抗體)邊振蕩邊加入DTTA-Eu，室溫下在振板機上慢速振蕩I小時，然后在黑暗中靜置48小時；
(2)標(biāo)記好的抗體與游離DTTA-Eu通過SephadexG50色譜柱(I. 5 X 50cm)分離,分離過程用核酸蛋白儀監(jiān)控；
(3)用小試管依次收集流出物，同時測銪標(biāo)記物濃度；
(4)加入O.5% BSA,按照抗原抗體總濃度為20 μ g/ml稀釋備用，2-8°C保存。3.分析緩沖液的制備。4. HCV抗原抗體陰陽性對照品的制備。5. 25 X濃縮洗滌液。6.增強液的制備。7.檢測操作過程
O.試劑的準(zhǔn)備(I)洗滌液25X濃縮洗液以1:25稀釋作為工作洗滌液備用；
(2)銪標(biāo)記物使用前一小時內(nèi)用銪標(biāo)記稀釋液按1:10倍稀釋并一次用完；
2).將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條置室溫平衡；
3).吸取100μ I丙型肝炎病毒核心抗原校準(zhǔn)品及待檢樣本，按順序加入微孔反應(yīng)條小孔中并加貼封片；
4).微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育60分鐘；
5).在第一次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng)條放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液350 μ 1，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌4次，最后一次將微孔反應(yīng)條拍干；
6).每孔中加入100μ I銪標(biāo)記物工作液，并加貼封片；7).微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育60分鐘；
8).第二次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng)條放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液350 μ 1，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌6次，最后一次將微孔反應(yīng)條拍干； 9).每一孔中加入增強液100μI ;
10).微孔反應(yīng)條在室溫下，用振蕩儀輕搖5分鐘后測定熒光值，分析結(jié)果。
權(quán)利要求
1.“丙型肝炎病毒抗原抗體時間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測”，其特征在于如下檢測原理本發(fā)明采用時間分辨免疫熒光分析法，聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體；該發(fā)明建立雙抗夾心的基礎(chǔ)之上，在這里，樣品中的抗原抗體首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abl、丙型肝炎病毒重組抗原AgI捕獲；在洗掉樣品的其它部分，再加入銪標(biāo)記物(銪標(biāo)記抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abll、丙型肝炎病毒重組抗原Agll)，就可以形成單克隆抗體AbI-丙型肝炎病毒抗原-單克隆抗體AbII銪標(biāo)記物復(fù)合物與重組抗原AgI-丙型肝炎病毒抗體-重組抗原AgII銪標(biāo)記物復(fù)合物，洗板加入增強液，用時間分辨分析儀測量熒光值，熒光值與樣本中抗原抗體總濃度呈正相關(guān)，從而計算抗原抗體濃度。
2.丙型肝炎病毒抗原抗體時間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測檢測試劑盒，其特征在于包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的包被板和設(shè)在盒體內(nèi)試劑及不干膠封片和使用說明書。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述包被板，其特征在于包被板上包被的是抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體與丙型肝炎病毒重組抗原，制備工藝是將包被抗體用Tris-HCl緩沖溶液稀釋作為包被液，包被反應(yīng)板，并用封閉液封閉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述Tris-HCl緩沖溶液，其特征在于Tris-HCl緩沖溶液為PH為7. 2 濃度為 50mmol/L Tris-HCl。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述包被液，其特征在于包被液中抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體與丙型肝炎病毒重組抗原的濃度均為O. 1-20 μ g/mlo
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述設(shè)在盒體內(nèi)試劑，其特征在于所述試劑包括銪標(biāo)記物、HCV抗原抗體陰陽性對照品、分析緩沖液、25 X濃縮洗滌液、增強液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述銪標(biāo)記物，其特征在于用鑭系元素離子Eu3+標(biāo)記抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體與丙型肝炎病毒重組抗原取待標(biāo)記抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體與丙型肝炎病毒重組抗原均稀釋，用常規(guī)方法進(jìn)行標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明公開了丙型肝炎病毒抗原抗體時間分辨免疫熒光分析法聯(lián)合檢測及檢測試劑盒。本發(fā)明通過分析丙型肝炎病毒序列而得到2株抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體(AbI，AbII)，2種丙型肝炎病毒重組抗原(AgI，AgII)，且2株抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體與2種丙型肝炎病毒重組抗原之間兩兩不發(fā)生交叉反應(yīng)。使用其中的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI、丙型肝炎病毒重組抗原AgI作為包被原料，其中的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbII、丙型肝炎病毒重組抗原AgII作為標(biāo)記原料，用雙抗體夾心法檢測丙型肝炎病毒抗原，用雙抗原夾心法檢測丙型肝炎病毒抗體。
文檔編號G01N21/64GK102928595SQ20121038547
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者張年 申請人:武漢康苑生物醫(yī)藥科技有限公司