專利名稱：使用nap樣和sal樣肽模擬物的神經(jīng)保護(hù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及NAP樣和SAL樣肽模擬物、多肽或從它們衍生的小分子，以及它們?cè)谥?療神經(jīng)元功能障礙、神經(jīng)變性疾病、認(rèn)知障礙、神經(jīng)精神疾病和自體免疫疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
NAP, 一種8個(gè)氨基酸的肽(NAPVSIPQ，SEQ ID NO 1)，源自于活性依賴性神經(jīng)保護(hù) 蛋白 ADNP (美國(guó)專利 No. 6，613，740 ；Bassan 等，J. Neurochem. 72 1283-1293 (1999))。ADNP 基因中的NAP序列，在嚙齒動(dòng)物和人類中是一致的(美國(guó)專利No. 6，613，740 ；Zamostiano 等，J. Biol. Chem. 276 :708_714 (2001))。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，已經(jīng)顯示出飛摩爾(femtomolar)濃度的NAP具有針對(duì)多種多 樣毒素的神經(jīng)保護(hù)活性(Bassan 等，1999 ；Offen 等，Brain Res. 854 :257_262 (2000))。在 模擬阿茨海默氏病部分病理學(xué)的動(dòng)物模型中，NAP也是保護(hù)性的(Bassan等，1999 ；Gozes 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 293 1091-1098 (2000)；也參見美國(guó)專利 No. 6，613，740)。在 正常的衰老大鼠中，NAP鼻內(nèi)給藥改善了在Morris水迷宮(Morris watermaze)中的表現(xiàn) (Gozes等，J. Mol. Neurosci. 19 175-178 (2002))。此外，局部缺血損傷后，NAP通過減少凋 亡(Leker等，Stroke 33 =1085-1092(2002))和在小鼠中通過減少炎癥而降低由閉合性頭 部外傷引起的損傷(Beni Adani 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 296 :57_63(2001) ；Romano 等， J.Mol Neurosci. 18 :37-45 (2002) ；Zaltzman 等，NeuroIteport 14 :481_484 (2003))，降低 了梗塞體積和運(yùn)動(dòng)機(jī)能缺損。在胎兒酒精綜合征模型中，NAP處理抑制了腹膜內(nèi)注射酒精后 胎兒的死亡(Spong 等，J.Pharmacol. Exp. Ther. 297 :774-779 (2001)；也參見國(guó)際 PCT 申請(qǐng) 公布No.WOOO/53217)。利用放射性標(biāo)記的肽，這些研究顯示，NAP可以跨過血腦屏障，并在 鼻內(nèi)處理(Gozes等，2000)或靜脈內(nèi)注射(Leker等，2002)或腹膜內(nèi)給藥(Spong等，2001) 后，可以在嚙齒動(dòng)物的腦中檢測(cè)到。SAL, 一種 9 個(gè)氨基酸的肽(SALLRSIPA，SEQ ID NO 19)，也被稱為 ADNF-9 或 ADNF-1，被鑒定為ADNF的最短活性形式(參見美國(guó)專利No. 6，174，862)。在體外分析和體 內(nèi)疾病模型中，已經(jīng)顯示SAL對(duì)各種不同攻擊作出響應(yīng)，保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元存活 (例如 Gozes 等，2000 ；Brenneman 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 :619_627 (1998))。D-SAL 是SAL的全D-氨基酸衍生物，它是穩(wěn)定的，口服可利用(Brermeman等，J Pharmacol Exp Ther. 309 1190-7 (2004))，并且出人意料地在測(cè)試的系統(tǒng)中表現(xiàn)出與SAL相似的生物學(xué)活 性(潛能和功效)。ADNF-I復(fù)合物描述在國(guó)際PCT申請(qǐng)公布No. W003/022226中。神經(jīng)活性肽，例如NAP和SAL，對(duì)即使單個(gè)氨基酸的保守取代也表現(xiàn)出極端的敏感 性。參見例如 Brenneman 等，J. Pharm. Ex. Ther.，285 :619_627 (1998)和 Wilkemeyer 等， Proc. Natl. Acad. Sci，USA, 100 :8543_8 (2003)。因此，盡管 NAP 和 SAL 是模型神經(jīng)活性肽，但即使是它們核心序列的保守肽變異，預(yù)計(jì)也將是無治療效果的。因此，盡管在該領(lǐng)域已有進(jìn)展，但對(duì)其他神經(jīng)活性肽仍存在著需求。本發(fā)明解決了這種以及其他需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了生物活性的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，以及制造和使用 這些肽的方法。NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物的分子式是(R1)a-(R2)-(R3)bt5 R1是 含有1到大約40個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其中每個(gè)氨基酸獨(dú)立地選自天然存在的氨基 酸和氨基酸類似物。R2是下列序列之一NATLSIHQ(SEQ ID NO :4)，STPTAIPQ(SEQ ID NO 6)，NAVLSIHQ(SEQ ID NO 2)，NATLSVHQ(SEQ ID NO 3)，NATLSIVHQ(SEQ ID NO 5)， NTPVSIPQ(SEQ ID NO 7), APVSIPQ(SEQ IDNO 8)，NTPISIPQ(SEQ ID NO 9), NAPVSIP(SEQ ID NO 10), NAPVAVPQ(SEQ ID NO 11), NARVSIPQ(SEQ ID NO 12)，DAPVSVPQ (SEQ ID NO 13), ALLRSIPA(SEQ ID NO :20)，ALLRSIP(SEQ ID NO :21)，AMLRSIPA(SEQ ID NO: 22), ALLRAIPA(SEQID NO :23)，SALLRSIP (SEQ ID NO :24)，SALLRAIP(SEQ ID NO 25), ALLRTIPA(SEQ ID NO 26)和 ALLRSVPA (SEQ ID NO 27)。R3 是含有 1 到大約 40 個(gè)獨(dú)立選擇 的氨基酸、例如天然存在的氨基酸或氨基酸類似物的氨基酸序列，a和b獨(dú)立選擇，并且等 于 0 或 1。該分子式明確除外序列 NAPVSIPQ(SEQ ID NO 1)或 SALLRSIPA (SEQ ID N0:19)。在一個(gè)實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物包含核心序列，即選自 NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和 STPTAIPQ(SEQ ID NO 6)的 R2。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物只包含核心氨基酸序列， 即R2。也就是說，a和b都等于0。在一個(gè)實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽在核心氨基酸序列、即R2中，包含 至少一個(gè)D-氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽——即R2——的每個(gè)氨基酸都是
D-氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物包含至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物包含核心氨基酸序列 NATLSIHQ(SEQ ID NO :4)。在其他實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物由核心氨 基酸序列NATLSIHQ (SEQ IDNO 4)構(gòu)成。在其他實(shí)施方案中，核心氨基酸序列NATLSIHQ (SEQ IDNO 4)包含至少一個(gè)D-氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心氨基酸序列NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)的每個(gè)氨基酸都是D-氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物包含核心氨基酸序列 STPTAIPQ (SEQ ID NO :6)。在其他實(shí)施方案中，NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物由核心氨 基酸序列STPTAIPQ (SEQ IDNO 6)構(gòu)成。在其他實(shí)施方案中，核心氨基酸序列STPTAIPQ (SEQ IDNO 6)包含至少一個(gè)D-氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核心氨基酸序列STPTAIPQ (SEQ ID NO 6)的每個(gè)氨基酸都是D-氨基酸。另一方面，本發(fā)明提供了包含具有上述分子式的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬 物的藥物組合物。該藥物組合物也可以包含第二種神經(jīng)保護(hù)多肽，例如含有NAPVSIPQ(SEQ ID NO 1)或 SALLRSIPA(SEQID NO 19)的神經(jīng)保護(hù)多肽。另一方面，本發(fā)明提供了在對(duì)象中治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病、認(rèn)知障礙、自身免疫疾病、外周神經(jīng)毒性、運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、感覺機(jī)能障礙、焦慮、抑郁癥、精神分裂癥、精神病、與 胎兒酒精綜合征相關(guān)的病癥、涉及視網(wǎng)膜變性的病癥、影響學(xué)習(xí)和記憶的疾病或神經(jīng)精神 疾病的方法，方法是通過給需要治療的對(duì)象施用治療有效量的、具有上面列出的分子式的 NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，從而在該對(duì)象中治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病、認(rèn)知障礙、自身免疫疾病、外周神經(jīng)毒性、運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、感覺機(jī)能障礙、焦慮、抑郁癥、精神分裂癥、精 神病、與胎兒酒精綜合征相關(guān)的病癥、涉及視網(wǎng)膜變性的病癥、影響學(xué)習(xí)和記憶的疾病或神 經(jīng)精神疾病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，施用的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物包含下列氨基 酸序列之一 :NATLSIHQ(SEQ IDNO 4)和 STPTAIPQ(SEQ ID NO 6)。


圖1 在與200mM ZnCl2溫育4小時(shí)后，肽對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞存活的影響。圖顯示了 每個(gè)肽的至少3組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)各進(jìn)行5份。NATLSIHQ(SEQ ID NO 4) :* = ρ < 0. 05， ** = ρ < 0. 005，*** = ρ < 0. 0005 ；STPTAIPQ(SEQ ID NO 6) # = ρ < 0. 05 (與陰性對(duì) 照一一沒有添加——相比)。圖2 在用β _淀粉樣肽中毒后，肽對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物的存活的影響。圖顯示了每 個(gè)肽的3組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)各進(jìn)行5份。NATLSIHQ(SEQ ID NO 4) :* = ρ < 0. 05，** = ρ < 0. 005 ；STPTAIPQ(SEQ IDNO 6) # = ρ < 0. 05 (與陰性對(duì)照——沒有添加——相比)。定義詞組“NAP樣肽模擬物”和“NAP樣肽”同樣都是指與NAP(NAPVSIPQ) (SEQ ID NO 1)具有相似性的肽和模擬物。因此，這些詞組是指含有具有下式序列的肽和模擬 物=(R1)a-(R2)-(R3)b-,其中R1和R3獨(dú)立選擇并且是含有1到大約40個(gè)氨基酸的氨基 酸序列，其中每個(gè)氨基酸獨(dú)立地選自天然存在的氨基酸和氨基酸類似物；R2是NAP樣 肽，例如NAVLSIHQ(SEQ ID NO :2)，NATLSVHQ (SEQ IDNO :3)，NATLSIHQ (SEQ ID NO 4), NATLSIVHQ(SEQ ID NO. 5),STPTAIPQ(SEQ ID NO 6),NTPVSIPQ(SEQ ID NO :7)，APVSIPQ (SEQ ID NO :8)，NTPISIPQ(SEQ ID NO : 9)，NAPVSIP(SEQ ID NO 10), NAPVAVPQ(SEQ ID NO: 11), NARVSIPQ(SEQ ID NO 12), DAPVSVPQ(SEQ ID NO : 13)，NXPVSIPQ(SEQ ID NO: 14)， NXP+SIPQ(SEQ ID NO : 15)，NAPV++PQ(SEQ ID NO : 16)，NAXVSIPQ(SEQ ID NO 17)禾口 +APVS+PQ(SEQ ID NO :18)，其中X是指任何氨基酸，+是指保守氨基酸；a和b獨(dú)立地選擇 并且等于0或1，前提是NAP樣肽模擬物不是NAP。該詞組也指D-氨基酸類似物，例如其中 少至1個(gè)或多至所有氨基酸是D構(gòu)型的。詞組“SAL樣肽模擬物，，和“SAL樣肽”同樣都是指與SAL (SALLRSIPA) (SEQ ID NO :19)具有相似性的肽和模擬物。因此，這些詞組是指含有具有下式序列的肽 (R1)a-(R2)-(R3)b-,其中R1和R3獨(dú)立地選擇，并且是含有1到大約40個(gè)氨基酸的氨基 酸序列，其中每個(gè)氨基酸獨(dú)立地選自天然存在的氨基酸和氨基酸類似物；R2是SAL樣 肽，例如ALLRSIPA(SEQ ID NO :20)，ALLRSIP (SEQ ID NO :21)，AMLRSIPA (SEQ ID NO: 22)，ALLRAIPA(SEQ ID NO :23)，SALLRSIP(SEQ ID NO :24)，SALLRAIP(SEQ ID NO: 25)，ALLRTIPA(SEQID NO :26)，ALLRSVPA(SEQ ID NO :27)，A+LRSIPA(SEQ ID NO :28)， ALLR+IPA(SEQ ID NO 29)，SALLR+IP (SEQ ID NO 30)和 ALLRS+PA(SEQ ID NO :31)，其中 X 是指任何氨基酸，+是指保守氨基酸；a和b獨(dú)立地選擇并且等于0或1，前提是SAL樣肽模擬物不是SAL。該詞組也指D-氨基酸類似物，例如其中少至1個(gè)或多至所有氨基酸是D構(gòu)型的。詞組“ADNF多肽”是指一個(gè)或多個(gè)活性依賴性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ADNF)，它們具有包 含氨基酸序歹Ij NAPVSIPQ(SEQ ID NO 1)(被稱為“NAP”)或 SALLRSIPA(SEQ ID NO 19)(被 稱為“SAL”)的活性核心位點(diǎn)，并且在使用由例如Hill等，Brain Res. 603 =222-233(1993)； Brenneman & Gozes，J. Clin. Invest. 97 :2299_2307(1996)；禾口 Forsythe & Westbrook， J. Physiol. Lond. 396 515 (1988)描述的體外皮層神經(jīng)元培養(yǎng)分析進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)/神經(jīng)保護(hù)活性。ADNF多肽可以是ADNF I多肽，ADNF III多肽，它們的等位基因、 多態(tài)性變異體、類似物、種間同系物、其任何子序列(例如SALLRSIPA (SEQ IDNO 19)或 NAPVSIPQ(SEQ ID NO 1))或親脂性變異體，它們?cè)隗w外或體內(nèi)對(duì)例如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起 源的神經(jīng)元表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)/神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用?！癆DNF多肽”也可以是指ADNF I多肽和ADNF III多肽的混合物。詞組“ADNF III多肽”或“ADNF III”，也被稱為活性依賴性神經(jīng)保護(hù)蛋白(ADNP)， 是指一個(gè)或多個(gè)活性依賴性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ADNF)，它們具有包含氨基酸序列NAPVSIPQ (SEQ ID NO 1)(被稱為“NAP，，)的活性核心位點(diǎn)，并且在使用由例如Hill等，Brain Res. 603， 222-233(1993)；和 Gozes 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,427-432(1996)描述的體外皮 層神經(jīng)元培養(yǎng)分析進(jìn)行測(cè)量時(shí)，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)/神經(jīng)保護(hù)活性。ADNF多肽可以是ADNF III 多肽，等位基因或多態(tài)性變異體，類似物，種間同系物，或其任何子序列(例如NAPVSIPQ) (SEQID NO :1)，它們?cè)隗w外或體內(nèi)對(duì)例如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起源的神經(jīng)元表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù) /神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。ADNF III多肽的范圍可以從大約8個(gè)氨基酸起，可以具有例如8-20個(gè)、 8-50個(gè)、10-100個(gè)或大約1000個(gè)或以上的氨基酸。全長(zhǎng)人類ADNF III的預(yù)計(jì)分子量為123，562. 8Da (> 1000個(gè)氨基酸殘基)，理 論P(yáng)l為大約6. 97。正如上面描述的，ADNF III多肽具有包含氨基酸序列Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO 1)(也被稱為 “NAPVSIPQ” 或 “NAP”)的活性位點(diǎn)。參 見 Zamostiano 等，J. Biol. Chem. 276 708-714(2001)禾口 Bassan 等，J. Neurochem. 72 1283-1293(1999)。除非另外指明，否則“NAP”是指具有氨基酸序列Asn-Ala-Pro-Val-Ser -Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO. 1)的肽，而不是具有氨基酸序列 Asn-Ala-Pro 的肽。ADNF III 的全長(zhǎng)氨基酸和核酸序列，可以在國(guó)際PCT申請(qǐng)公布Nos. WO 98/35042、WO 00/27875、美 國(guó)專利No' s 6，613，740和6，649，411中找到。人類序列的登記號(hào)是NP_852107，也參見 Zamostiano 等，同上。術(shù)語“ADNF I”是指分子量為大約14，000道爾頓、pi為8. 3士0. 25的活性依賴 性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子多肽。如上所述，ADNF I多肽具有包含氨基酸序列Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO 19)(也被稱為 “SALLRSIPA” 或 “SAL” 或 “ADNF-9”) 的活性位點(diǎn)。參見 Brenneman & Gozes，J. Clin. Invest. 97 :2299_2307 (1996)，Glazner 等，Anat. Embryol. (Berl). 200 65-71 (1999)，Brenneman 等，J. Pharm. Exp. Ther.，285 619-27 (1998)，Gozes & Brenneman，J. Mol. Neurosci. 7 :235_244 (1996)禾口 Gozes 等，Dev. Brain Res. 99 167-175 (1997)。除非另外指明，否則“SAL”是指具有氨基酸序列Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO 19)的肽，而不是具有氨基酸序列 Ser-Ala-Leu 的肽。ADNF I的全長(zhǎng)氨基酸序列可以在國(guó)際PCT申請(qǐng)公布No. WO 96/11948中查到。
術(shù)語“對(duì)象”是指處于生命任何階段的任何哺乳動(dòng)物，特別是人類。術(shù)語“接觸”在本文中可以與下列互換使用與…組合，添加到…，與…混合，傳給…，與…溫育，流過…，等等。此外，本發(fā)明的多肽或核酸可以通過任何常規(guī)方法“給藥”， 例如腸胃外、口、表面、鼻和吸入途徑。在某些實(shí)施方案中，使用腸胃外和鼻或吸入途徑。術(shù)語“生物活性的”是指肽序列將與天然存在的生物分子相互作用，在體外或體內(nèi) 激活或抑制那些分子的功能。術(shù)語“生物活性的”在本文中最通常用于指稱在體外或體內(nèi)都 對(duì)源自于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)/神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的NAP樣肽模擬物。因此， 本發(fā)明提供了多肽子序列，其在測(cè)試、例如用神經(jīng)毒素處理大腦皮層培養(yǎng)物時(shí)，具有與NAP 相同或相似的活性(參見 Gozes 等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 93 :427_432 (1996))。也可 以按照本文的描述對(duì)肽進(jìn)行測(cè)試，以確定它們與NAP-微管蛋白結(jié)合進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的能力至少 為2-10%，優(yōu)選超過10%。術(shù)語“神經(jīng)變性疾病或認(rèn)知障礙”包括但不限于下列病癥中樞運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的疾病包 括影響基底神經(jīng)節(jié)的變性病癥(亨廷頓(Huntington’ s)病，威爾森氏(Wilson’ s)病，紋 狀體黑質(zhì)變性，皮層基底神經(jīng)節(jié)變性)，抽動(dòng)穢語綜合征，帕金森氏(Parkinson's)病，進(jìn)行 性核上性麻痹，進(jìn)行性延髓麻痹，家族性痙攣性截癱，脊髓性肌萎縮，ALS及其變體，齒狀核 紅核萎縮，橄欖體腦橋小腦萎縮，副腫瘤性小腦變性和多巴胺毒性；影響感覺神經(jīng)元的疾病 例如弗里德里希(Friedreich' s)共濟(jì)失調(diào)，糖尿病，周圍神經(jīng)病和視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性；邊 緣和皮層系統(tǒng)的疾病例如大腦淀粉樣變性，Pick' s萎縮和Retts綜合征；涉及多個(gè)神經(jīng) 元系統(tǒng)和/或腦干的神經(jīng)變性疾病，包括阿茨海默氏(Alzheimer’ s)病，帕金森氏癥，AIDS 相關(guān)性癡呆，Leigh' s病，彌漫性Lewy小體病，癲癇，多系統(tǒng)萎縮癥，Guillain-Barre綜合 征，溶酶體貯積癥例如脂褐素沉積病，唐氏綜合征的晚期變性階段，Alper' s病，由CNS變 性引起的眩暈，ALS，皮層基底節(jié)變性和進(jìn)行性核上性麻痹；與發(fā)育遲緩和學(xué)習(xí)障礙有關(guān)的 疾病，唐氏綜合征和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡；由衰老和慢性酒精或藥物濫用引起的疾 病，包括例如(i)伴隨酒精中毒，藍(lán)斑、小腦、膽堿能基底前腦中的神經(jīng)元變性，(ii)隨著衰 老，小腦神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元變性，導(dǎo)致認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙，以及(iii)隨著慢性安非他明濫 用，基底節(jié)神經(jīng)元變性，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙；由病灶性創(chuàng)傷例如中風(fēng)、病灶性局部缺血、血管機(jī)能 不全、缺氧-缺血性腦病、高血糖癥、低血糖癥、閉合性頭部創(chuàng)傷和直接外傷導(dǎo)致的病理性 變化；由治療性藥物和療法的不利副作用引起的疾病(例如對(duì)抗驚厥劑量的NMDA類型的谷 氨酸受體拮抗劑作出響應(yīng)，扣帶與內(nèi)嗅皮質(zhì)神經(jīng)元的變性)?！巴庵苌窠?jīng)毒性”可以在對(duì)象中通過各種不同技術(shù)來鑒定和診斷。它通?？梢酝ㄟ^ 運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、肌肉消瘦，或嗅覺、視覺或聽覺感覺的變化，或深部腱反射、震顫感、皮膚感 覺、步態(tài)和平衡、肌肉力量、直立血壓的變化，以及慢性或間歇性疼痛來測(cè)量。在人類中，這 些癥狀有時(shí)也證明了在PNS和CNS中的毒性效應(yīng)。最終，有數(shù)百種可能的外周神經(jīng)病變可 能源自于神經(jīng)毒性。根據(jù)反映PNA活性的范圍，癥狀可以涉及感覺、運(yùn)動(dòng)或自主功能。它們 可以按照受影響的神經(jīng)的類型和癥狀的長(zhǎng)短進(jìn)行分類。外周神經(jīng)毒性可以由化學(xué)治療藥劑 (抗癌，抗微生物等)或由疾病過程誘導(dǎo)。(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)No. 11/388,634)?！吧婕耙暰W(wǎng)膜變性的病癥”包括但不限于激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷和眼病，例如青光 目艮、視網(wǎng)膜色素變性、Usher綜合征、動(dòng)脈或靜脈阻塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維增 生癥或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(R. L. F. /R. 0. P.)、視網(wǎng)膜先天性裂、格狀變性和黃斑變性。
“精神障礙”或“精神疾患”或“精神病”或“精神或神經(jīng)精神性疾病或疾患或障礙”是指情緒障礙(例如重性抑郁癥，躁狂癥和雙相情感障礙)，精神疾病(例如精神分裂癥， 分裂情感性障礙，精神分裂癥樣精神障礙，妄想性精神障礙，短期性精神失常和共有型精神 病)，人格障礙，焦慮性障礙(例如強(qiáng)迫癥和注意力缺乏障礙)，以及其他精神障礙例如藥物 相關(guān)障礙，兒童期障礙，癡呆，自閉性障礙，順應(yīng)障礙，譫妄，多發(fā)梗死性癡呆和抽動(dòng)穢語綜 合征，如《精神障礙的診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》(第四版)(Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders,Fourth Edition, (DSM IV))中所描述(也參見Benitez-King G.等， Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2004Dec ；3 (6) =5I5-33,綜述)，典型地，這樣的障 礙具有復(fù)雜的遺傳和/或生物化學(xué)因素?！扒榫w紊亂”是指?jìng)€(gè)體在一段較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的感覺基調(diào)或情緒狀態(tài)的失常。情緒障 礙包括重性抑郁癥(即單相障礙)，躁狂癥，煩躁不安，雙相障礙，精神抑郁癥，循環(huán)性精神 病和許多其他病癥。參見例如《精神障礙的診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》(第四版)(Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders, Fourth Edition, (DSM IV))?！爸匦砸钟舭Y”、“重性抑郁性障礙”或“單極障礙”是指涉及任何下述癥狀的情緒障 礙持續(xù)悲傷，焦慮或“空白”情緒；感覺無望或悲觀；感覺負(fù)疚、無價(jià)值或無助；對(duì)以前喜愛 的嗜好或活動(dòng)、包括性失去興趣或滿足；精力減退，疲勞，變得“遲鈍”；難以專心、回憶或做 決定；失眠，過早醒或睡過頭；食欲和/或體重降低或過度飽食和體重增加；想到死亡或自 殺或者試圖自殺；坐立不安或易怒；或?qū)χ委煙o響應(yīng)的持續(xù)性身體癥狀，例如頭痛、消化紊 亂和慢性疼痛。抑郁癥的各種不同亞型描述在例如DSM IV中?！半p相障礙”是一種情緒障礙，其特征為交替的極端情緒階段?；加须p相障礙的人 經(jīng)歷的情緒周期通常從過度興奮或易怒(躁狂癥)變到憂慮和無望(抑郁癥)，然后再次返 回，中間是正常情緒的時(shí)期。雙相障礙的診斷描述在例如DSM IV中。雙相障礙包括I型雙 相情感障礙(躁狂癥伴有或不伴有重性抑郁癥)和II型雙相情感障礙(輕躁狂伴有重性 抑郁癥)，參見例如DSM IV。“焦慮”、“焦慮癥”和“焦慮相關(guān)病癥”是指精神綜合征，其特征是主觀感覺不安、恐 懼或預(yù)兆感，例如恐慌癥，廣泛性焦慮癥，注意力缺乏癥，注意力缺乏多動(dòng)癥，強(qiáng)迫癥，和應(yīng) 激障礙，例如急性和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙。這些病癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來 說是公知的(參見例如《Harrison內(nèi)科醫(yī)學(xué)原理》(Harrison' sPrinciples of Internal Medicine) ,2486-2490 頁(Wilson 等主編，第 12 版，1991)和 DSM IV)?！白陨砻庖哒系K”是指自身免疫疾病，例如多發(fā)性硬化癥，重癥肌無力， Guillan-Barre綜合征(抗磷脂綜合征)，全身性紅斑狼瘡，Behcet綜合征，Sjogrens綜 合征，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，橋本氏病/甲狀腺功能減低癥，原發(fā)性膽汁性肝硬化，混合結(jié)締 組織病，慢性活動(dòng)性肝炎，Grave病/甲狀腺功能亢進(jìn)，硬皮病，慢性特發(fā)性血小板減少性 紫癜，糖尿病性神經(jīng)病變和膿毒性休克(參見例如Schneider Α.等，J BiolChem. 279 55833-9(2004))?！斑\(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙”包括肌肉消瘦，步態(tài)、平衡和肌肉力量改變?！案杏X機(jī)能障礙”可 以通過嗅覺、視覺或聽覺感覺的變化，或深部腱反射、震顫感、皮膚感覺的變化，或慢性或間 歇性疼痛來度量。有時(shí)，感覺機(jī)能障礙與疾病相關(guān)，可能經(jīng)歷例如足部或小腿中的疼痛或針 刺、燒灼、蠕動(dòng)或刺痛感。在人類中，運(yùn)動(dòng)和感覺機(jī)能障礙均表明了可能由化學(xué)物質(zhì)(例如化學(xué)治療劑)或疾病狀態(tài)引起的在PNS和CNS中的效應(yīng)。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。一般來說，肽是指短的多肽。這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在 的氨基酸的類似物或模擬物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及作用方式與天然存在的氨基 酸相似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是指由遺傳密碼編碼的氨基 酸，以及隨后被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。出于 本申請(qǐng)的目的，氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)、即碳與 氫、羧基、氨基和R基團(tuán)相連的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸 甲基硫鐺。這樣的類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但是保持 了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。出于本申請(qǐng)的目的，氨基酸模擬物是指結(jié)構(gòu) 與氨基酸的通用化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但是作用方式與天然存在的氨基酸相似的化學(xué)化合物。氨基酸可以包含具有非天然存在的D-手性的氨基酸，如在國(guó)際PCT申請(qǐng)公布 No. WO 01/12654中所公開的，它們可以改進(jìn)化合物的口服利用度和其他藥物樣特征。在這 樣的實(shí)施方案中，NAP樣或SAL樣肽模擬物的一個(gè)或多個(gè)、以及可能所有的氨基酸，將具有 D-手性。通過使用D-氨基酸以提供較長(zhǎng)的半衰期和作用時(shí)間，可以增進(jìn)肽的治療性應(yīng)用。 但是，許多受體表現(xiàn)出對(duì)L-氨基酸的強(qiáng)烈偏好性，但與天然存在的L-肽具有等同活性的 D-肽例子已有報(bào)道，例如成孔抗生素肽、β-淀粉樣肽(毒性沒有改變)和CXCR4受體的內(nèi) 源配體。就此而言，NAP樣或SAL樣肽模擬物在D-氨基酸形式下也保留了活性。氨基酸可以用它們公知的三字母符號(hào)或用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì) (IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號(hào)指稱。同樣地，核 苷酸可以用它們通常認(rèn)可的單字母編碼指稱。“保守修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列二者。對(duì)于具體的核酸序列來說， 保守修飾的變體是指編碼相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者當(dāng)核酸不編 碼氨基酸序列時(shí)，是指基本相同的序列。具體來說，通過產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)選定的(或 所有的)密碼子的第三個(gè)位置被簡(jiǎn)并堿基(mixed-base)和/或脫氧次黃嘌呤核苷殘基 取代的序列，可以獲得簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res. 19 =5081(1991)； Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 2605-2608 (1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 91-98(1994))。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，任何給定的蛋白由大量功能一致的核酸編碼。例 如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定的丙氨酸的 每個(gè)位置上，密碼子可以改變成所述相應(yīng)密碼子的任何一個(gè)，而不改變所編碼的多肽。這樣 的核酸變異體是“沉默變異體”，是保守修飾變異體的一種。本文中編碼多肽的每個(gè)核酸序 列，也描述了核酸的每個(gè)可能的沉默變異體。專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，核酸中的每個(gè)密碼 子(除了 AUG和TGG之外，前者通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，后者通常是色氨酸的唯一密 碼子)都可以被修改，以產(chǎn)生功能一致的分子。因此，在每個(gè)描述的序列中蘊(yùn)含了編碼多肽 的核酸的每個(gè)沉默變異體。對(duì)于氨基酸序列來說，專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白序列所 進(jìn)行的改變、添加或刪除了編碼序列中單個(gè)氨基酸或少部分氨基酸的各種取代、缺失或添 力口，當(dāng)改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代時(shí)，是“保守修飾的變體”。提供功能相似的氨基酸的保守取代表在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。這樣的保守修飾變體是除本發(fā)明的多態(tài) 性變體、種間同系物和等位基因之外還有的，并且不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同系物 和等位基因。下面的組各包含了彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；3)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
4)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；5)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)；6)精氨酸(R)，賴氨酸⑷，組氨酸(H)；7)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，纈氨酸(V)；和8)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(參見例如Creighton，《蛋白》(Proteins) (1984))。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本文提供的核酸和多肽序列的許多保守變異 體產(chǎn)生了功能上一致的產(chǎn)物。例如，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，“沉默取代”(即核酸序列的取 代不導(dǎo)致所編碼的多肽的變化)是編碼氨基酸的每個(gè)核酸序列的默認(rèn)特點(diǎn)。同樣地，在氨 基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸中的“保守氨基酸取代”，是用具有高度相似性質(zhì)的不同氨基 酸進(jìn)行的取代(參見定義部分)，也容易被鑒定為與公開的氨基酸序列、或與編碼氨基酸的 公開的核酸序列高度相似。此外，某些保護(hù)基團(tuán)可以添加到本發(fā)明的肽上。保護(hù)基團(tuán)可以添加到肽的N-末端 或C-末端，或兩者上。本文中使用的術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”是指賦予功能基團(tuán)不反應(yīng)性、但是也 可以被移除以便將功能基團(tuán)恢復(fù)到其初始狀態(tài)的化合物。這樣的保護(hù)基團(tuán)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域 的普通專業(yè)人員來說是公知的，并包括在《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》(ProtectiveGroups in Organic Synthesis),第 4 版，Τ·W. Greene 禾口 P. G. Μ· Wuts, John Wiley & Sons, New York, 2006中公開的化合物。保護(hù)基團(tuán)的例子包括但不限于 !110(3(9-芴甲氧羰酰胺)，80(3，芐氧 羰基(Z)，alloc(烯丙氧基羰基)和蝕刻保護(hù)基團(tuán)。術(shù)語“分離的”、“純化的，，或“生物純的，，是指材料實(shí)質(zhì)上或基本上不含在其天然 狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的通常與其相伴的成分?！白銐蛄俊被颉坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊笔侵附o定的NAP樣或SAL樣肽模擬物的量， 其表現(xiàn)出所需活性或提供了主觀的癥狀緩解、或被臨床醫(yī)生或其他有資格的觀察者注意到 的客觀上可鑒定的改進(jìn)。在治療性應(yīng)用中，本發(fā)明的NAP樣或SAL樣肽模擬物以足以減輕 或消除癥狀的量給藥于患者。足以達(dá)到此目的的量被定義為“治療有效劑量”。劑量范圍隨 著所用的NAP樣或SAL樣肽模擬物、給藥途徑和具體的NAP樣或SAL樣肽模擬物的潛力、以 及在藥物組合物中存在或不存在其他治療性化合物而變化。表達(dá)或活性的“抑制劑”、“激活劑”和“調(diào)節(jié)劑”，分別被用于指使用表達(dá)或活性的 體外和體內(nèi)分析方法鑒定到的抑制、激活或調(diào)節(jié)分子，例如配體、激動(dòng)劑、拮抗劑以及它們 的同系物和模擬物。術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”包括抑制劑和激活劑。抑制劑是例如抑制本發(fā)明的多肽 或多核苷酸的表達(dá)、或結(jié)合以部分或完全阻斷刺激或酶活性，降低、阻止、延遲激活，失活、 脫敏或下調(diào)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的活性的藥劑，例如拮抗劑。激活劑是例如誘導(dǎo)或激活本發(fā)明的多肽或多核苷酸的表達(dá)、或結(jié)合以刺激、增加、打開、激活、促進(jìn)、增強(qiáng)激活或酶 活性，致敏或上調(diào)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的活性的藥劑，例如激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)劑包括天然存 在的和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、小的化學(xué)分子等。鑒定抑制劑和激活劑的分析方法包 括，例如在存在或不存在本發(fā)明的多肽或多核苷酸的情況下，向細(xì)胞施加假定的調(diào)節(jié)劑化 合物，然后測(cè)定對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸活性的功能影響。將含有用潛在的激活劑、抑 制劑或調(diào)節(jié)劑處理過的本發(fā)明的多肽或多核苷酸的樣品或分析，與不含抑制劑、激活劑或 調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以檢測(cè)作用的程度。對(duì)照樣品(未用調(diào)節(jié)劑處理)被指定為 相對(duì)活性值為100%。當(dāng)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的活性值相對(duì)于對(duì)照為大約80%、任選 50%或25-1%時(shí)，達(dá)到抑制。當(dāng)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的活性值相對(duì)于對(duì)照為110%、任 選150%、任選200-500%或1000-3000%以上時(shí)，達(dá)到激活。 本文中使用的術(shù)語“測(cè)試化合物”或“藥物候選物”或“調(diào)節(jié)劑”或語法等價(jià)物，描 述了任何天然存在的或合成的分子，例如蛋白，寡肽(例如從大約5到大約25個(gè)氨基酸長(zhǎng)， 優(yōu)選為大約10到20個(gè)或12到18個(gè)氨基酸長(zhǎng)，優(yōu)選為12、15或18個(gè)氨基酸長(zhǎng))，小的有機(jī) 分子，多糖，脂類，脂肪酸，多核苷酸，寡核苷酸等。測(cè)試化合物可以是測(cè)試化合物的文庫的 形式，例如提供了足夠范圍的多樣性的組合或隨機(jī)文庫。測(cè)試化合物任選與融合配偶體連 接，例如靶向化合物、援救化合物、二聚化化合物、穩(wěn)定化合物、可尋址化合物和其他功能部 分。通常，通過鑒定具有某些所需性質(zhì)或活性、例如抑制活性的測(cè)試化合物(被稱為“先導(dǎo) 化合物”)，產(chǎn)生先導(dǎo)化合物的變體，以及評(píng)估那些變體化合物的性質(zhì)和活性，來產(chǎn)生具有有 用性質(zhì)的新的化學(xué)實(shí)體。對(duì)于這樣的分析往往使用高通量篩選(HTS)方法?！靶〉挠袡C(jī)分子”是指天然存在的或合成的有機(jī)分子，其分子量高于大約50道爾頓 并低于大約2500道爾頓，低于大約2000道爾頓，在大約100到大約1000道爾頓之間，或在 大約200到大約500道爾頓之間。
具體實(shí)施例方式I.簡(jiǎn)介以前，我們已經(jīng)顯示NAP(NAPVSIPQ，SEQ ID NO :1)通過與腦微管蛋白的相互作 用保護(hù)了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Divinski 等，J. Biol. Chem. 279，28531-28538 (2004))， 并刺激微管蛋白的組裝以增加與微管組裝相關(guān)的軸突突起(Gozes和Spivak-Pohis，Curr Alzheimer Res，3 197-199 (2006))。通過親和層析，也顯示出NAP與β III微管蛋白特異 性相互作用(Divinski等，J.Neurochem，98，973-984(2006))。SAL也同樣顯示出提供了神 經(jīng)保護(hù)作用(例如Gozes等，2000 ；Brenneman等，1998)。以前認(rèn)為，8個(gè)氨基酸的NAP核心 序列和9個(gè)氨基酸的SAL核心序列不能被修飾而不喪失功能。本申請(qǐng)第一次證明了與NAP 和SAL核心序列具有序列相似性的肽也具有生物學(xué)功能，例如促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活。鑒 定了 NAP樣和SAL樣肽模擬物，它們列于本文的表1和2中。在至少兩種NAP樣肽模擬物 或SAL樣肽模擬物中發(fā)現(xiàn)了生物學(xué)活性NATLSIHQ(SEQ ID NO :4)和STPTAIPQ (SEQ ID NO: 6)。這些化合物可以用作治療分子，用于神經(jīng)變性疾病或病癥的治療。II. NAP樣和SAL樣肽 模擬物的設(shè)計(jì)和合成含有核心NAP樣或SAL樣肽模擬物活性位點(diǎn)的多肽和肽的修飾，可以通過例如本 文所述的系統(tǒng)性地在活性核心位點(diǎn)的N-或C-末端一次添加一個(gè)氨基酸，和篩選獲得的肽的生物學(xué)活性來進(jìn)行。此外，在這樣的肽中各種不同氨基酸殘基的側(cè)鏈作出的貢獻(xiàn)，可以通過用特定氨基酸例如丙氨酸進(jìn)行系統(tǒng)性掃描來探測(cè)。也可以制造源自于NAP樣或SAL樣肽 的多肽。具有NAP樣和SAL樣序列和性質(zhì)的肽，可以源自于具有在例如公眾可利用的數(shù)據(jù) 庫中發(fā)現(xiàn)的序列的已知蛋白。例子包括NCBI，0ΜΙΜ, UniProtKB/Swiss-Prot，EMBOSS兩兩 比對(duì)算法(PairwiseAlignment Algorithms)，Clustalff, Tcoffee, BLAST, RADAR, PROS ITE, Phylogenetic Tree 禾口 Selection。NCBI (國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnologylnformation, USA))包括 PubMed，一種美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館(U. S. National Library of Medicine)的服務(wù)，包含了來自MEDLINE和追溯到1950s年代的其他生命科 學(xué)雜志的生物醫(yī)學(xué)文章的超過一千六百萬條引用資料。PubMed包含了對(duì)全文文章和其 他相關(guān)資料的鏈接。NCBI還開發(fā)了 OMIM(在線人類孟德爾式遺傳(Online Mendelian Inheritancein Man))，這是人類基因和遺傳疾病的目錄。OMIM包含文本信息、參考文獻(xiàn)、對(duì) MEDLINE和Entrez系統(tǒng)中的序列記錄的鏈接，以及對(duì)NCBI和別處的其他相關(guān)資源的鏈接。UniProtKB/Swi ss-Prot是人工注釋的蛋白知識(shí)庫，與其計(jì)算機(jī)注釋增補(bǔ) UniProtKB/TrEMBL—起，允許訪問所有公眾可利用的蛋白序列。該數(shù)據(jù)庫自身與其他蛋 白序列數(shù)據(jù)庫的差別在于三個(gè)獨(dú)特的標(biāo)準(zhǔn)與其他數(shù)據(jù)庫的整合，最低冗余度和高度注釋 (例如蛋白的功能，翻譯后修飾，結(jié)構(gòu)域和位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)，四級(jí)結(jié)構(gòu)，與蛋白序列中的缺陷 相關(guān)的疾病，變體，等等)。EMBOSS是“歐洲分子生物學(xué)公開軟件套裝”(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)。EMBOSS兩兩比對(duì)工具被用于兩個(gè)序列的比較。ClustalW是用于 DNA或蛋白的通用目的的多序列比對(duì)程序。它產(chǎn)生趨異序列的生物學(xué)意義的多序列比對(duì)，為 選定的序列計(jì)算最佳匹配，并將它們對(duì)齊，以便可以了解同一性、相似性和差異。T-coffee 是類似于ClustalW的另一個(gè)選擇。基本局部比對(duì)搜索工具(BasicLocal Alignment Search Tool) (BLAST)發(fā)現(xiàn)序 列之間局部相似性的區(qū)域。該程序?qū)⒑塑账峄虻鞍仔蛄信c序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，并計(jì)算匹 配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。BLAST可用于推測(cè)序列之間的功能和演化關(guān)系，并幫助鑒定基因家族的 成員。PR0SITE是蛋白家族和結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫，根據(jù)它們序列中的相似性將蛋白分類成 有限數(shù)量的家族。屬于特定家族的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域一般共有功能屬性，并源自于共同的 祖先。目前，PR0SITE含有特異性針對(duì)超過一千個(gè)蛋白家族或結(jié)構(gòu)域的樣式和情況。這些 特征每個(gè)都有記錄，提供了關(guān)于這些蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的背景信息。系統(tǒng)進(jìn)化樹(Phylogenetictree)依賴于 Saitou 和 Nei 的 NJ (鄰接(Neighbour Joining))方法，它首先計(jì)算來自多重比對(duì)的所有序列對(duì)之間的距離(趨異百分?jǐn)?shù))，然后 將NJ方法用于距離矩陣。Selector!能夠檢測(cè)單個(gè)氨基酸位點(diǎn)處的選擇力。不同義(氨基 酸改變)與同義(沉默)取代的比率，稱為Ka/Ks比率，被用于估算每個(gè)氨基酸位點(diǎn)處的正 性和純化選擇。專業(yè)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到在給定核酸序列中產(chǎn)生改變的許多方式。這樣的眾所周 知的方法包括位點(diǎn)定向誘變，使用簡(jiǎn)并寡核苷酸的PCR擴(kuò)增，將含有核酸的細(xì)胞暴露于誘變劑或輻射，化學(xué)合成所需寡核苷酸(例如與連接和/或克隆相結(jié)合，以產(chǎn)生大的核酸)，以及其他眾所周知的技術(shù)(參見GiIiman & Smith，Gene 8:81-97(1979) ；Roberts等，Nature 328 :731-734(1987))。最通常是通過改變相應(yīng)的核酸序列并表達(dá)多肽，來改變多肽序列。但是，多肽序 列也任選使用可商購(gòu)的肽合成儀合成產(chǎn)生，以生產(chǎn)任何所需的多肽(參見Merrifield， Am. Chem. Soc. 85 :2149_2154 (1963) ；Stewart & Young，《固相肽合成》(第 二版)(Solid Phase PeptideSynthesis)(2nd ed. 1984))。專業(yè)技術(shù)人員可以根據(jù)所提供的序列和本技術(shù)領(lǐng)域關(guān)于蛋白的通用知識(shí)，來選擇 本發(fā)明的所需核酸或多肽。關(guān)于蛋白和核酸的性質(zhì)的知識(shí)，允許專業(yè)技術(shù)人員選擇與本文 公開的核酸和多肽具有相似或等同的活性的適合序列。上文的定義部分，描述了示例性的 保守氨基酸取代。在適合的分析方法中，通過篩選技術(shù)來評(píng)估多肽的所需特征。例如，多肽的免疫學(xué) 特性的變化可以通過適合的免疫分析方法來檢測(cè)。其他性質(zhì)的改變，例如核酸與靶核酸的 雜交，蛋白的氧化還原或熱穩(wěn)定性，疏水性，對(duì)蛋白水解作用的易感性或?qū)奂膬A向性， 都按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行分析。在本文中，評(píng)估了含有NAP樣或SAL樣模擬活性位點(diǎn)的多肽的 生物學(xué)活性，例如減少或抑制神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。更具體來說，可以通過使用本技術(shù)領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的適合的分析方法和動(dòng)物模 型來篩選本發(fā)明的小肽。使用這些分析方法和模型，本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員可以根據(jù)本發(fā)明的講述， 從大量NAP樣和SAL樣肽模擬物中篩選具有所需活性的模擬物。本發(fā)明的肽可以通過廣泛的各種公知技術(shù)來制備。尺寸相對(duì)短的肽，一般在固 相支持物上或溶液中按照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行合成(參見例如Merrifield，Am. Chem. Soc. 85 2149-2154(1963))。各種自動(dòng)化合成儀和測(cè)序儀是可商購(gòu)的，可以根據(jù)已知的方案來使用 (參見例如 Stewart &Young，《固相肽合成》(第二版)(Solid Phase Peptide Synthesis) (2nded. 1984))。固相合成是用于本發(fā)明的肽的化學(xué)合成的優(yōu)選方法，其中序列的C-末端 氨基酸被連接到不溶性支持物上，然后相繼添加序列中其余的氨基酸。用于固相合成的 技術(shù)描述在《肽分析，合成，生物學(xué)》，第二卷肽合成中的特殊方法，A部分中Barany & Merrfield 的“固相Jj太合成，，，3-284 頁(Solid-Phase Peptide Synthesis, pp. 3_284inThe Peptides :Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2 Special Methods inPeptide Synthesis, Part A.) ；Merrifield 等，1963 ；Stewart 等，1984 中。NAP 和相關(guān)肽使用標(biāo)準(zhǔn) Fmoc 方案來合成(Wellings & Atherton，Methods Enzymo 1. 289 :44_67 (1997))。 除了上述技術(shù)，用于本發(fā)明的肽還可以通過重組DNA方法來制備。一般來說，這包 括產(chǎn)生編碼蛋白的核酸序列，將核酸置于表達(dá)盒中特定的啟動(dòng)子控制之下，并在宿主細(xì)胞 中表達(dá)蛋白。本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的重組工程細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌、酵母、植物、 絲狀真菌、昆蟲(特別是使用桿狀病毒載體)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 重組核酸與用于在選定宿主中表達(dá)的適合的控制序列可操作地連接。對(duì)于大腸桿 菌(E.coli)來說，控制序列的例子包括T7、trp或λ啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，并優(yōu)選轉(zhuǎn) 錄終止信號(hào)。對(duì)于真核細(xì)胞來說，控制序列典型地包括啟動(dòng)子，并優(yōu)選源自于免疫球蛋白基 因、SV40、巨細(xì)胞病毒等的增強(qiáng)子，以及多聚腺苷化序列，可以包含剪接供體和受體序列。
本發(fā)明的質(zhì)?？梢酝ㄟ^眾所周知的方法轉(zhuǎn)移到選定的宿主細(xì)胞中。這樣的方法 包括例如用于大腸桿菌的氯化鈣轉(zhuǎn)化方法，和用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的磷酸鈣處理或電穿孔 方法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以通過質(zhì)粒上包含的基因所賦予的抗生素抗性來進(jìn)行篩選，例如 amp、gpt、neo 禾口 hyg 基因。表達(dá)后，重組肽可以按照本技術(shù)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行純化，包括硫酸銨沉淀，親和柱，柱層析，凝膠電泳等(參見例如Scopes，《多肽純化》(Polyp印tide Purification) (1982) ；Deutscher，《酶學(xué)方法》第 182 卷(Methods in Enzymology Vol.182)多肽純化指 南(Guide toPolyp印tide Purification) (1990)) 任選的其他步驟包括將表達(dá)的蛋白分 離到較高程度，以及如果需要，剪切或修飾肽，包括任選的蛋白復(fù)性?；瘜W(xué)合成、生物表達(dá)或純化后，肽可能具有與成分肽的天然構(gòu)象明顯不同的構(gòu)象。 在這種情況下，將肽變性和還原，然后使肽重新折疊成優(yōu)選的構(gòu)象，是有幫助的。還原和變 性肽以及誘導(dǎo)重新折疊的方法，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是公知的(參見Debinski φ, J. Biol. Chem. 268 14065-14070 (1993) ；Kreitman & Pastan， Bioconjug. Chem. 4 581-585 (1993)；以及 Buchner 等，Anal. Biochem. 205 :263_270 (1992))。例如，Debinski 等 描述了在胍-DTE中變性和還原包含體肽。然后將肽在含有氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的 氧化還原緩沖液中重新折疊。專業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)肽進(jìn)行修飾而不降低它們的生物學(xué)活性。可以進(jìn)行 一些修飾以便于靶向分子克隆、表達(dá)或整合到融合蛋白中。這樣的修飾對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的 專業(yè)人員來說是熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位點(diǎn)，或在任一末 端放置附加的氨基酸(例如多聚組氨酸)以產(chǎn)生方便定位的限制性位點(diǎn)或終止密碼子或純 化序列。III. NAP樣和SAL樣肽模擬物的功能分析的治療性應(yīng)用確定NAP樣或SAL樣肽模擬物的生物學(xué)活性的一種方法，是分析它們保護(hù)神經(jīng) 元細(xì)胞免于死亡的能力。一種這樣的分析方法，是使用按照描述(Brermeman & Gozes， J. Clin. Invest. 97 =2299-2307(1996))制備的解離的大腦皮層培養(yǎng)物進(jìn)行的。試驗(yàn)范例包 括向用河豚毒素(TTX)進(jìn)行協(xié)同處理的培養(yǎng)物中添加測(cè)試肽。TTX在這些培養(yǎng)物中產(chǎn)生了 凋亡性死亡，因此被用作模型物質(zhì)，以證明對(duì)抗這種“程序化細(xì)胞死亡“以及產(chǎn)生這種類型 死亡機(jī)制的所有其他手段的功效。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為5天，通過特征性形態(tài)學(xué)和通過用神經(jīng) 元的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)志物、例如神經(jīng)元特異性烯醇化酶進(jìn)行證實(shí)，對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒 定。其他基于細(xì)胞的分析方法，包括分析NAP樣或SAL樣肽促進(jìn)暴露于例如β-淀粉樣蛋 白或高水平ZnCl2的神經(jīng)元細(xì)胞存活的能力。這些分析方法在本文實(shí)施例2中進(jìn)行了示范。 也在存在神經(jīng)毒素例如來自HIV的包膜蛋白gpl20和N-甲基-D-天冬氨酸的情況下，測(cè)量 了由NAP樣和SAL樣蛋白促進(jìn)的神經(jīng)元細(xì)胞存活。另一方面，本發(fā)明提供了用于減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡的方法，方法包括將神經(jīng)元細(xì) 胞與足以減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡的量的NAP樣或SAL樣肽模擬物相接觸。另一方面，NAP樣 或SAL樣肽模擬物在其活性核心位點(diǎn)中包含至少一個(gè)D-氨基酸，優(yōu)選位于活性核心位點(diǎn)的 N-末端和/或C-末端。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核心NAP樣或SAL樣肽的每個(gè)氨基酸都是D-氨 基酸。優(yōu)選的NAP樣或SAL樣肽模擬物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和STPTAIPQ (SEQ ID NO 6)。
本發(fā)明的NAP樣和SAL樣肽模擬物可用于治療神經(jīng)疾病和用于預(yù)防神經(jīng)元細(xì)胞死 亡。例如，本發(fā)明的NAP樣肽模擬物可用于防止神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，神經(jīng)元細(xì)胞包括但不限 于脊髓神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元、大腦皮層神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元。更具體來說，本發(fā)明的NAP 樣和SAL樣肽模擬物可用于預(yù)防與下列物質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞死亡(1) gpl20，來自HIV的包膜蛋 白；(2) N-甲基-D-天冬氨酸(興奮毒性)；(3)河豚毒素(阻斷電活動(dòng))；和⑷β -淀粉 樣肽，一種與阿茨海默氏病中神經(jīng)元變性有關(guān)的物質(zhì)。優(yōu)選的NAP樣或SAL樣肽模擬物包 括例如 NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和 STPTAIPQ(SEQ ID NO :6)。 同樣地，通過向HIV病毒感染的患者給藥有效量的本發(fā)明的NAP樣肽模擬物，本發(fā) 明的NAP樣和SAL樣肽模擬物可用于減少gpl20誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。本發(fā)明的NAP樣 和SAL樣肽模擬物也可用于減少與N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性有關(guān)的神經(jīng)元細(xì) 胞死亡，方法包括將神經(jīng)元細(xì)胞與足以防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡的量的本發(fā)明的NAP樣和SAL 樣肽模擬物相接觸。本發(fā)明的NAP樣和SAL樣肽模擬物還可用于在患有阿茨海默氏病或受 到阿茨海默氏病損害的患者中減少由淀粉樣肽誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，方法包括向患者給藥 足以防止神經(jīng)元細(xì)胞死亡的量的本發(fā)明的NAP樣和SAL樣肽模擬物。NAP樣和SAL樣肽模 擬物還可用于在患有阿茨海默氏病或受到阿茨海默氏病損害的患者中緩解由膽堿能阻斷 所產(chǎn)生的學(xué)習(xí)障礙。例如，NAP樣和SAL樣肽模擬物可用于在阿茨海默氏病患者中提高短 期和/或參照記憶。優(yōu)選的NAP樣或SAL樣肽模擬物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和 STPTAIPQ(SEQ ID NO 6)。同樣地，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，顯然本發(fā)明的NAP樣和SAL樣肽模擬物 可以以類似的方式用于防止與許多其他神經(jīng)疾病和缺陷有關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。將從本 發(fā)明的治療性和診斷性應(yīng)用受益的病理狀況，包括導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡的病癥(疾病和損 傷)和/或尚不致命的神經(jīng)元病癥，包括例如下列中樞運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的疾病包括影響基底神 經(jīng)節(jié)的變性病癥(亨廷頓病，威爾森氏病，紋狀體黑質(zhì)變性，皮層基底神經(jīng)節(jié)變性)，抽動(dòng)穢 語綜合征，帕金森氏病，進(jìn)行性核上性麻痹，進(jìn)行性延髓麻痹，家族性痙攣性截癱，脊髓性肌 萎縮，ALS及其變體，齒狀核紅核萎縮，橄欖體腦橋小腦萎縮，副腫瘤性小腦變性和多巴胺毒 性；影響感覺神經(jīng)元的疾病例如弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，糖尿病，周圍神經(jīng)病和視網(wǎng)膜神經(jīng)元 變性；邊緣和皮層系統(tǒng)的疾病例如大腦淀粉樣變性，Pick' s萎縮，Retts綜合征；涉及多個(gè) 神經(jīng)元系統(tǒng)和/或腦干的神經(jīng)變性疾病，包括阿茨海默氏病，AIDS相關(guān)性癡呆，Leigh' s 病，彌漫性Lewy小體病，癲癇，多系統(tǒng)萎縮癥，Guillain-Barre綜合征，溶酶體貯積癥例如 脂褐素沉積病，唐氏綜合征的晚期變性階段，Alper' s病，由CNS變性引起的眩暈；與發(fā)育 遲緩和學(xué)習(xí)障礙有關(guān)的疾病，唐氏綜合征和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡；由衰老和慢性酒 精或藥物濫用引起的疾病，包括例如伴隨酒精中毒，藍(lán)斑、小腦、膽堿能基底前腦中的神經(jīng) 元變性；隨著衰老，小腦神經(jīng)元和皮層神經(jīng)元變性，導(dǎo)致認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙；以及隨著慢性安 非他明濫用，基底節(jié)神經(jīng)元變性，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙；由病灶性創(chuàng)傷例如中風(fēng)、病灶性局部缺血、 血管機(jī)能不全、缺氧缺血性腦病、高血糖癥、低血糖癥、閉合性頭部創(chuàng)傷和直接外傷導(dǎo)致的 病理性變化；由治療性藥物和療法的不利副作用引起的疾病(例如對(duì)抗驚厥劑量的NMDA類 型谷氨酸受體拮抗劑作出響應(yīng)，扣帶與內(nèi)嗅皮質(zhì)神經(jīng)元的變性，源自于例如化療治療的周 圍神經(jīng)病，以及來自激光眼部治療的視網(wǎng)膜損傷)。本發(fā)明的NAP樣和SAL樣肽模擬物還 可用于治療自身免疫疾病例如多發(fā)性硬化癥，以及精神疾病例如精神分裂癥和抑郁癥。優(yōu)選的NAP樣或SAL樣肽模擬物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和STPTAIPQ (SEQ ID NO: 6)。因此，可以使用在1997年2月7日提交的國(guó)際PCT申請(qǐng)公布No. W098/35042和1998年11月6日提交的美國(guó)專利No. 6613740中描述的各種不同方法，篩選減少神經(jīng)元細(xì) 胞死亡的NAP樣和SAL樣肽模擬物。例如，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，很顯然的是使 用上面給出的關(guān)于NAP樣和SAL樣肽模擬物的設(shè)計(jì)和合成教導(dǎo)和本文描述的分析方法，本 技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員可以鑒定在其活性核心位點(diǎn)中含有至少一個(gè)D-氨基酸的其他生 物活性 NAP 樣肽模擬物。例如，Brenneman 等，Nature 335:639-642(1988)和 Dibbern 等， J. Clin. Invest. 99 =2837-2841 (1997)講述的分析方法，可用于篩選能夠減少與來自HIV的 包膜蛋白(gpl20)相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的ADNF多肽。另外，Brenneman等，Dev. Brain Res. 51 63-68(1990)和 Brenneman & Gozes，J. Clin. Invest. 97 :2299_2307 (1996)講述的 分析方法，可用于篩選能夠減少與N-甲基-D天冬氨酸刺激所誘導(dǎo)的興奮毒性有關(guān)的神經(jīng) 元細(xì)胞死亡的NAP樣和SAL樣肽模擬物。其他在例如國(guó)際PCT申請(qǐng)公布No. W098/35042中 描述的分析方法，也可用于鑒定其他生物活性NAP樣和SAL樣肽模擬物。此外，可以在體內(nèi)篩選減少神經(jīng)元細(xì)胞死亡的NAP樣和SAL樣肽模擬物。例如，可 以測(cè)試NAP樣和SAL樣肽模擬物能夠針對(duì)與膽堿能阻斷相關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶缺損進(jìn)行保護(hù)的 能力。例如，在大鼠中通過給藥膽堿毒素AF64A，可以獲得膽堿能阻斷，可以鼻內(nèi)給藥ADNF 多肽，并可以進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)(Gozes 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :427_432 (1996))。使 用有效的NAP樣肽模擬物治療的動(dòng)物，與對(duì)照相比，將顯示出它們學(xué)習(xí)和記憶能力的改善。此外，可以在體內(nèi)篩選NAP樣和SAL樣肽模擬物能夠保護(hù)或減少與阿茨海默氏 病相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的能力。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)來說，可以使用載脂蛋白E(ApoE)缺陷 的純合小鼠(Plump 等，Cell71 :343_353 (1992) ；Gordon 等，Neuroscience Letters 199 1-4 (1995) ；Gozes 等，J. Neurobiol. 33 :329_342 (1997))。NAP樣和SAL樣肽模擬物抑制免疫細(xì)胞增殖的能力，可以按照Offen等，J Mol Neurosci. 15(3) 167-76 (2000)和國(guó)際PCT申請(qǐng)公布No. W004/060309中的描述進(jìn)行分析， 二者都描述了 MOG誘導(dǎo)的慢性EAE小鼠模型，在此以所有目的引為參考。STOP蛋白缺陷小 鼠是業(yè)內(nèi)接受的精神分裂癥模型，可用于評(píng)估NAP樣和SAL樣肽模擬物的抗精神分裂癥活 性。參見，例如 Andrieux 等，Genes & Develop.，16 :2350_2364 (2002)，在此以所有目的引 為參考。NAP樣和SAL樣肽模擬物的抗焦慮活性可以使用小鼠模型和Morris水迷宮范式進(jìn) 行評(píng)估，它們公開在國(guó)際PCT申請(qǐng)公布NO.W004/080957中，在此以所有目的引為參考。通 過NAP-樣和SAL樣肽模擬物對(duì)周圍神經(jīng)毒性的降低，可以使用大鼠模型和旋轉(zhuǎn)棒以及爪痛 測(cè)試進(jìn)行評(píng)估。參見例如國(guó)際PCT申請(qǐng)公布W006/099739，在此以所有目的引為參考。IV.藥物發(fā)現(xiàn)鑒定微管蛋白為NAP相互作用蛋白以及發(fā)現(xiàn)微管蛋白中的NAP樣序列，允許使用 微管蛋白和微管蛋白衍生肽作為靶進(jìn)行進(jìn)一步的藥物發(fā)現(xiàn)，用于例如治療神經(jīng)元疾病如神 經(jīng)變性疾病(例如阿茨海默氏病，AIDS相關(guān)的癡呆，亨廷頓病和帕金森氏病)，認(rèn)知障礙， 周圍神經(jīng)毒性，運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙，感覺機(jī)能障礙，焦慮癥，抑郁癥，精神病，與視網(wǎng)膜變性有關(guān) 的病癥，影響學(xué)習(xí)和記憶的疾病或神經(jīng)精神疾病，與神經(jīng)元細(xì)胞死亡和氧化應(yīng)激有關(guān)的疾 病，HIV相關(guān)的智力減退復(fù)合征，中風(fēng)，頭部創(chuàng)傷，腦性麻痹，與胎兒酒精綜合征有關(guān)的病癥，以及自身免疫疾病例如多發(fā)性硬化癥。這樣的治療藥物也可用于產(chǎn)前和產(chǎn)后增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶的方法中?？梢允褂猛暾奈⒐艿鞍捉Y(jié)構(gòu)以及NAP作為置換劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以發(fā)現(xiàn)與 NAP 結(jié)合相同位點(diǎn)的藥劑(參見，例如 Katchalski-Katzir 等，Biophys Chem. 100(1-3) 293-305(2003) ；Chang 等，J Comput Chem. 24(16) 1987-98 (2003)的描述)。初步篩選可以通過篩選能夠結(jié)合本發(fā)明的多肽或微管蛋白的藥劑來進(jìn)行，因?yàn)?至少一些這樣鑒定到的藥劑可能是結(jié)合活性的調(diào)節(jié)劑。結(jié)合分析方法通常包括將本發(fā) 明的多肽與一種或多種測(cè)試藥劑相接觸，并允許蛋白和測(cè)試藥劑有足夠的時(shí)間形成結(jié) 合復(fù)合物。任何形成的結(jié)合復(fù)合物，可以使用多種已建立的分析技術(shù)中的任何一種來檢 測(cè)。蛋白結(jié)合分析方法包括但不限于測(cè)量共沉淀、在非變性SDS聚丙烯酰胺凝膠上的共 遷移和在Western印跡上的共遷移的方法(參見例如《神經(jīng)遞質(zhì)受體結(jié)合》中Bermet和 Yamamura,神經(jīng)遞質(zhì)、激素或藥物受體結(jié)合方法(Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor BindingMethods, in Neurotransmitter Receptor Binding)(Yamamura 等主 編)，pp. 61-89(1985))。在這樣的分析方法中使用的蛋白可以是天然表達(dá)的、克隆的或合 成的。通過任何上述篩選方法最初鑒定到的藥劑，可以進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試以驗(yàn)證表觀活 性。優(yōu)選這樣的研究使用適合的動(dòng)物模型來進(jìn)行。這樣的方法的基本格式包括向用作人類 模型的動(dòng)物給藥在最初篩選過程中鑒定到的先導(dǎo)化合物，然后測(cè)定本發(fā)明的多核苷酸或多 肽的表達(dá)或活性是否事實(shí)上上調(diào)了。在驗(yàn)證研究中使用的動(dòng)物模型一般是任何種類的哺乳 動(dòng)物。適合的動(dòng)物的具體例子包括但不限于靈長(zhǎng)動(dòng)物、小鼠和大鼠。檢驗(yàn)為本發(fā)明的多肽調(diào)節(jié)劑的藥劑，可以是任何小的化學(xué)化合物，或生物學(xué)實(shí)體， 例如蛋白、糖、核酸、RNAi或脂類。典型地，測(cè)試化合物是小的化學(xué)分子和肽?；旧先魏位?學(xué)化合物都可以在本發(fā)明的分析中用作潛在調(diào)節(jié)劑或配體，盡管最通常使用可以溶解在水 性或有機(jī)(特別是基于DMSO的)溶液中的化合物。分析方法被設(shè)計(jì)成通過自動(dòng)化分析步 驟和向分析提供來自任何方便來源的化合物，來篩選大的化學(xué)文庫，所述分析通常平行運(yùn) 行(例如在機(jī)械手分析方法中微量滴定板上的微量滴定格式)。應(yīng)該理解，有許多化學(xué)化合 物供應(yīng)商，例如 Sigma (St. Louis, MO)、Aldrich (St. Louis, M0)、Sigma-Aldrich (St. Louis, M0) ,Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs，Switzerland)等。調(diào)節(jié)劑也包括被設(shè) 計(jì)用于降低本發(fā)明的mRNA水平的藥劑(例如反義分子，核酶，DNA核酶等)或降低mRNA翻 譯水平的藥劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，高通量篩選方法包括提供含有大量潛在治療性化合物 (可能的調(diào)節(jié)劑或配體化合物)的組合化學(xué)或肽文庫。然后按照本文的描述在一個(gè)或多個(gè) 分析方法中篩選這樣的“組合化學(xué)文庫”或“配體文庫”，以鑒定文庫中表現(xiàn)出所需的特征活 性、例如微管蛋白結(jié)合的成員(特定的化學(xué)物類或亞類)。這樣鑒定的化合物可用作常規(guī)的 “先導(dǎo)化合物”，或它們本身可用作可能的或?qū)嶋H的治療劑?？捎玫暮Y選小的活性分子的文 庫包括可用化學(xué)品目錄(AvailableChemical Directory) (ACD, 278，000種化合物)，ACD篩 選文庫(> 1，000，000 種化合物)，CRC 聯(lián)合化學(xué)品名單(Combined ChemicalDictionary) (大約 350，000 種化合物)，Anisex (115，000 種化合物)，Maybridge (62，000 種化合物)， Derwent 禾口 NCI 文庫。V.發(fā)現(xiàn)的化合物的活性分析方法
其他的藥物發(fā)現(xiàn)方法包括篩選神經(jīng)保護(hù)活性。這種活性可以按照例如Divinski等(2006)和Gozes等(2005)中的描述，在經(jīng)典的神經(jīng)元應(yīng)激和存活的組織培養(yǎng)物模型中 進(jìn)行測(cè)試。這些分析方法在本技術(shù)領(lǐng)域是公知的，集中于待測(cè)化合物對(duì)微管重新組織、軸突 突出和針對(duì)有毒因子的保護(hù)作用的影響。在動(dòng)物模型中測(cè)試神經(jīng)保護(hù)作用的體內(nèi)分析方法，在本技術(shù)領(lǐng)域中也是已知的。 測(cè)量各種不同待測(cè)物質(zhì)對(duì)運(yùn)動(dòng)活性的影響的測(cè)試，包括例如大鼠中的旋轉(zhuǎn)棒測(cè)試。嗅覺 能力可用于測(cè)量待測(cè)物質(zhì)對(duì)感覺活性的影響。這樣的分析方法描述在例如美國(guó)申請(qǐng)公布 No. 2006/0247168 中。公認(rèn)的用于胎兒酒精綜合征的模型，可用于對(duì)待測(cè)化合物的效能進(jìn)行測(cè)試 (Webster等，Neurobehav. Toxicol 2:227-234(1980))。該范式是針對(duì)酒精施用產(chǎn)生的嚴(yán) 重氧化性應(yīng)激的功效進(jìn)行測(cè)試(Spong等，2001)。該模型允許對(duì)有效對(duì)抗嚴(yán)重氧化性應(yīng)激 以及胎兒酒精綜合征的藥劑進(jìn)行快速和相關(guān)的評(píng)估。為了評(píng)估待測(cè)化合物的保護(hù)效應(yīng)，可 以測(cè)定胎兒死亡的數(shù)量。測(cè)試待測(cè)化合物對(duì)例如激光外科手術(shù)中暴露于激光的視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)的 實(shí)驗(yàn)，描述在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60，776，329中。簡(jiǎn)單來說，將大鼠暴露于激光光致凝結(jié)，并 立即使用保護(hù)性化合物進(jìn)行全身性或玻璃體內(nèi)治療。處死動(dòng)物，觀察視網(wǎng)膜組織切片的組 織學(xué)和形態(tài)學(xué)異常。正如上面討論的，可以分析NAP樣和SAL樣肽模擬物的調(diào)節(jié)劑抑制免疫細(xì)胞增殖 的能力、抗精神分裂活性、抗焦慮活性以及降低外周神經(jīng)毒性的能力。VI.藥物給藥本發(fā)明提供了大量用于藥物給藥的神經(jīng)保護(hù)性NAP樣和SAL樣肽模擬物和組 合物。例如，藥物組合物可以包含本文描述的NAP樣或SAL樣肽模擬物中的一種，或一 種以上的組合。優(yōu)選的NAP樣或SAL樣肽模擬物包括例如NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和 STPTAIPQ(SEQID NO 6)。藥物組合物可以包含其它的神經(jīng)保護(hù)性化合物，例如ANDF多肽， 與NAP樣或SAL樣肽模擬物相組合。神經(jīng)保護(hù)性ADNF多肽包括含有NAP (SEQ ID N0:1)或 SAL (SEQ ID NO 19)的多肽。NAP樣肽模擬物可以包含至少一個(gè)D-氨基酸，并且多至全部 的氨基酸都可以是D-手性的。在某些實(shí)施方案中，其它的神經(jīng)保護(hù)性肽具有至少一個(gè)、以 及多至全部的D-氨基酸。本發(fā)明的藥物組合物適合用于各種不同的藥物投送系統(tǒng)中。具有跨過血腦屏 障能力的肽，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的方法進(jìn)行例如全身、鼻部給藥等。 不能跨過血腦屏障的較大的肽，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員公知的技術(shù)，經(jīng)腦室內(nèi) (ICV)注射或經(jīng)插管給藥于哺乳動(dòng)物腦部(參見，例如Motta & Martini，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168 62-64(1981) ；Peterson 等，Biochem. Pharamacol. 31 2807-2810 (1982)； Rz印czynski 等，Metab. Brain Dis. 3 211-216 (1988) ；Leibowitz 等，Brain Res. Bull. 21 905-912(1988) ；Sramka 等，Stereotact. Fund. Neurosurg. 58 79-83 (1992) ；Peng 等， Brain Res. 632 57-67 (1993) ；Chem 等,Exp. Neurol. 125 72-81 (1994) ；Nikkhah 等, Neuroscience 63:57-72(1994) ；Anderson 等，J. Comp. Neurol 357:296-317(1995)；以及 Brecknel 1& Fawcett, Exp. Neurol. 138 :338_344 (1996))。適合用于本發(fā)明的制劑在《Remington藥物學(xué)》(第17版，1985年)(Remington' sPharmaceutical Sciences (17th ed. 1985))中查到。此外，對(duì)于藥物投送方法的簡(jiǎn)要綜述， 參見Langer，Science 249:1527-1533(1990)。適合的劑量范圍描述在本文提供的實(shí)施例 以及國(guó)際PCT申請(qǐng)公布No. WO 9611948中。同樣地，本發(fā)明提供了治療組合物或藥物，含有上文描述的一種或多種多肽與可 藥用賦形劑的組合，其中多肽的量足以提供治療效果。在治療性應(yīng)用中，本發(fā)明的多肽體現(xiàn)為打算通過任何有效手段給藥的藥物組合 物，這些給藥手段包括腸胃外、表面、口、鼻、肺(例如通過吸入)、全身或局部給藥。對(duì)于腸 胃外給藥來說，藥物組合物通過例如靜脈內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥。也可以使用鼻泵、 表面貼片和滴眼液。因此，本發(fā)明提供了用于腸胃外給藥的組合物，含有上面描述的多肽溶解或懸浮 在可接受介質(zhì)、優(yōu)選為水性載體中的溶液?？梢允褂酶鞣N不同的水性載體，包括例如水、緩 沖的水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可以通過常規(guī)的、公知的滅菌技 術(shù)滅菌，或者它們可以過濾除菌。獲得的水性溶液可以就此包裝使用或冷凍干燥，冷凍干燥 的制劑在給藥前與無菌溶液混合。如果需要，組合物可以含有可藥用的輔助物質(zhì)以接近生 理?xiàng)l件，包括PH調(diào)節(jié)和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化 鉀、氯化鈣、失水山梨糖醇單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。對(duì)于固體組合物來說，可以使用常規(guī)的無毒固體載體，包括例如藥品級(jí)甘露糖醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服給藥來說， 通過摻入任何常用的賦形劑，例如上面列出的載體，和通常10-95%的活性成分，更優(yōu)選濃 度為25% -75%，來形成可藥用的無毒組合物，。對(duì)于氣溶膠給藥來說，優(yōu)選將多肽以細(xì)分散的形式與表面活性劑和推進(jìn)劑一起提 供。當(dāng)然，表面活性劑必須是無毒的，并優(yōu)選可溶于推進(jìn)劑中。這樣的試劑的代表是含有6 到22個(gè)碳原子的脂肪酸例如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂 酸(olestericacid)和油酸與脂族多元醇或其環(huán)狀酐的酯或偏酯?？梢允褂没旌硝ィ?混合的或天然的甘油酯。如果需要，也可以包含載體，例如與卵磷脂，用于鼻內(nèi)投送。例子包 括下述溶液其中每毫升含有7. 5mg NaCl, 1. 7mg單水檸檬酸，3mg 二水磷酸氫二鈉和0. 2mg 苯扎氯銨溶液(50% ) (Gozes 等，J Mol Neurosci. 19(1-2) 167-70 (2002))。在治療性應(yīng)用中，本發(fā)明的多肽以足以減輕或消除神經(jīng)變性疾病、認(rèn)知障礙和其 他病癥的癥狀、或加強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶的量，給藥于患者。足以實(shí)現(xiàn)該目的的量被定義為“治療 有效劑量”。對(duì)這種應(yīng)用有效的量，依賴于例如所使用的具體多肽、要預(yù)防的疾病或障礙的 類型、給藥方式、患者的體重和總體健康狀態(tài)以及處方醫(yī)師的判斷。例如，每天一次(例如在晚上)鼻內(nèi)給藥IOOng到IOmg劑量范圍內(nèi)的多肽的量，將 是治療有效量。或者，劑量也可以在該范圍之外，或采用不同的時(shí)間安排。例如，每劑劑量 可以為 0. 0001mg/kg 到 10，000mg/kg，優(yōu)選為大約 0. 001mg/kg、0. lmg/kg、lmg/kg、5mg/kg、 50mg/kg或500mg/kg。藥劑的給藥可以每小時(shí)，每4、6或12小時(shí)，與進(jìn)餐同時(shí)，每日，每2、3、 4、5、6或7日，每周，每2、3、4周，每月或每2、3或4月，或其任何組合。根據(jù)要治療的病癥， 用藥時(shí)間 可以是單劑(急性)給藥，或經(jīng)過數(shù)日、數(shù)周、數(shù)月、數(shù)年的時(shí)程。本技術(shù)領(lǐng)域的專 業(yè)人員可以確定適合的劑量，可以借助于在下列文獻(xiàn)中報(bào)道的初步數(shù)據(jù)=Gozes等，2000 ； Gozes 等，2002 ；Bassan φ, 1999 ；Zemlyak 等，Regul. Pept. 96 39-43 (2000) ；Brenneman等，Biochem. Soc. Trans. 28 :452_455 (2000) ；Erratum Biochem Soc. Trans. 28 983 ； Wilkemeyer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 :8543_8548 (2003) ；Alcalay 等，Neurosci Lett. 361 128-31 (2004)；以及 Gozes 等，CNS Drug Rev. ,11(4) :353_68 (2005)。
實(shí)施例 實(shí)施例1 :NAP樣和SAL樣序列的搜索進(jìn)行了生物信息學(xué)搜索，以尋找在提供神經(jīng)保護(hù)作用(例如通過與微管相互作用)的其他蛋白中是否存在NAP樣或SAL樣序列，以及是否存在類似NAP并提供神經(jīng)保護(hù) 作用的微管蛋白特異性序列。將NAP和SAL序列提交到許多不同的搜索引擎NCBI，OMIM, UniProtKB/ Swiss-Prot, EMBOSS 兩兩比對(duì)算法，Clustalff, T-coffee, BLAST, RADAR, PPSearch, PR0SITE, 系統(tǒng)進(jìn)化樹和Selecton。在人類微管蛋白的搜索中，在UniProtKB/Swi ss-Prot中使用了智人(Homo sapiens)生物體微管蛋白的欄目描述和布爾算子。在EMBOSS中使用了帶有water比對(duì)的 Blosum62,以發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列之間最佳的相似性區(qū)域。多重比對(duì)從ClustalW獲得，其中進(jìn)一 步使用了 Jalview編輯器。對(duì)于BLAST以及類似的程序RADAR和PPSearch來說，使用人類β 3微管蛋白及其 直系同源物作為查詢。對(duì)于Selecton來說，以FASTA格式提交了微管蛋白以及12個(gè)直系 同源生物體的⑶S作為輸入文件。結(jié)果概述在下面以及表1中。微管蛋白中對(duì)于蛋白-蛋白相互作用和GTP結(jié)合重 要的結(jié)構(gòu)元件，顯示出與NAP的顯著的同源性NAVLSIHQ(SEQ ID N0:2)_ 微管蛋白 β 1NATLSVHQ(SEQ ID Ν0:3)_ 微管蛋白 β 2NATLSIHQ(SEQ ID N0:4)_ 微管蛋白 β 3各個(gè)不同的微管蛋白亞基的NCBI蛋白登記號(hào)如下微管蛋白β 1 Q9H4B7微管蛋白3 2a Q13885微管蛋白3 2b Q9BVA1微管蛋白0 2c P68371微管蛋白β 3 Q13509微管蛋白β 4 Ρ04350微管蛋白β 5 Ρ07437微管蛋白β 6 Q9BUF5序列NAVLSIHQ(SEQ ID NO 2)、NATLSVHQ (SEQ ID NO :3)禾口 NATLSIHQ (SEQ ID NO: 4)，分別在微管蛋白β 、β2和β3中發(fā)現(xiàn)，而不是在α微管蛋白中。序列位于184-191 位氨基酸。該序列與假設(shè)對(duì)于微管中β和α微管蛋白之間縱向接觸來說重要的區(qū)域重疊， 即它位于分子頂部相對(duì)暴露的區(qū)域中，在二聚體化之后變得隱蔽。該序列也靠近微管 蛋白的GTP結(jié)合袋，特別是與核糖結(jié)合相關(guān)的區(qū)域(Nogales和Wang(2006)Curr Opin Cell Biol, 18，179-184 ；Nogales 和 Wang(2006)Curr Opin Struct Biol,16，221—229)。同源性大于50%，但是沒有保留在NAP中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)脯氨酸。由于脯氨酸通常與蛋白-蛋白相互作用有關(guān)，因此可能NAPVSIPQ(SEQID NO 1)具有另外的蛋白結(jié)合或蛋白相 互作用/破壞活性，同時(shí)仍具有一些與微管的固有關(guān)聯(lián)性。與NAPVSIPQ(SEQ ID NO 1)具有增加的同源性的其他序列包括STPTAIPQ(SEQ ID NO 6)(登記號(hào)Q7KZS6)，它包含微管蛋白區(qū)段和與來自視紫紅質(zhì)家族的G蛋白偶聯(lián)受體相 關(guān)的區(qū)段。后者與色素沉著相關(guān)的黑皮素1受體具有相似性。觀察到了另外的與關(guān)鍵蛋白例如檸檬酸裂解酶的序列相似性。ATP檸檬酸裂解酶 在許多組織中是負(fù)責(zé)合成胞質(zhì)乙酰CoA的主要酶。它在脂類從頭合成中發(fā)揮核心作用。在 神經(jīng)組織中，它可能參與了乙酰膽堿的生物合成(根據(jù)相似性)。表1 :NAP(NAPVSIPQ)序列同源性 表2 :SAL(SALLRSIPA)序列同源性 實(shí)施例2 神經(jīng)保護(hù)活性的分析方法NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和 STPTAIPQ (SEQ ID NO 6)是 NAP 樣肽。測(cè)試了這些肽 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元在ZnCl2和β -淀粉樣肽中毒后存活的影響。Α.方法1.大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞按照以前的描述制備細(xì)胞培養(yǎng)物(McCarthy KD, de Vellis J. , J. Cell Biol, 85 890-902 (1980) ；Gozes I 等，J. Pharmacol. Exp. Ther.，257 959~66 (1991))。將新生 小鼠(Harlan Biotech Israel Ltd. , Rehovot, Israel)通過斷頭術(shù)處死，取出大腦。切 下皮層，除去腦膜。用剪刀將組織剪碎，放置在Hank' s平衡鹽溶液Xl (HBSS，Biological Industries, Beit Haemek, Israel), 15mM HEPES 緩沖液 pH 7. 3 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel)禾口 0. 25%胰蛋白酶(Biological Industries,BeitHaemek, Israel) 中，在溫箱中在37°C和10% CO2下放置20分鐘。然后將細(xì)胞置于8ml溶液Dl中，該溶液在 Dulbecco' s 修改的 Eagle' s 培養(yǎng)基(DMEM, Sigma, Rehovot, Israel)中含有 10%熱失 活的胎牛血清(Biological Industries, Beit Haemek, Israel),0. 硫酸慶大霉素溶液 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel)和 0. 1 %青霉素-鏈霉素-制霉菌素溶液 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel)。允許細(xì)胞沉降，然后轉(zhuǎn)移到含有 2. 5ml Dl的新管中，用巴氏滴管搗碎。該過程再重復(fù)兩次。在所有細(xì)胞都懸浮后，使用血細(xì)胞計(jì) 數(shù)器(Neubauerimproved，Germany)測(cè)定細(xì)胞密度，將IxlO6個(gè)細(xì)胞/15ml Dl接種到每個(gè) 75em2 細(xì)頸瓶中(Corning, Corning, NY, USA)。將細(xì)胞在 37°C和 10% CO2 下進(jìn)行培養(yǎng)。24 小時(shí)后更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞生長(zhǎng)至合生(一周)。2.大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)搖動(dòng)含有大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)頸瓶，以排出可能存在的殘余神經(jīng)元和少突 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。然后將細(xì)頸瓶用IOml冷HBSSxl，15mM HEPES清洗。在每個(gè)細(xì)頸瓶中加入 5ml維爾烯_胰蛋白酶溶液(BioLab，Jerusalem, Israel)，將細(xì)頸瓶在室溫溫育5分鐘以 除去星形膠質(zhì)細(xì)胞。然后搖動(dòng)細(xì)頸瓶以倒出細(xì)胞。用5ml Dl中和維爾烯-胰蛋白酶溶液。 收集細(xì)胞懸液，IOOg離心10分鐘。除去上清液，將細(xì)胞重新懸浮在Dl中。將細(xì)胞鋪于96 孔板中(Corning，Corning, NY, USA)(每個(gè)細(xì)頸瓶鋪2塊板)，在37°C和10% CO2下培養(yǎng)直 到合生。3.混合的神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物使用新生大鼠，按照上面的描述制備大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。在將細(xì) 胞懸浮于Dl中之后，以IOOg離心5分鐘，丟棄上清液。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在溶液D2 中，該溶液在DMEM中含有5%熱失活的馬血清(Biological Industries, Beit Haemek,Israel), 0. 慶大霉素，0. 1 %青霉素_鏈霉素-制霉菌素，1 % N3 (含有培養(yǎng)物中神經(jīng)元 發(fā)育所必需的確定的培養(yǎng)基成分(Romijn HJ, Brain Res.，254 :583_9 (1981)))，15 μ g/ml 5'-氟-2-脫氧尿苷(FUDR，Sigma，Rehovot，Israel)以及 3 μ g/ml 尿苷(Sigma，Rehovot， Israel)。將細(xì)胞在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)，在D2中稀釋，將按照上述制備的8日齡星形膠質(zhì) 細(xì)胞以17，000個(gè)細(xì)胞/孔/96孔板進(jìn)行接種。第二天將培養(yǎng)基更換為不含F(xiàn)UDR和尿苷的 D2。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行之前，允許細(xì)胞在37°C和10% CO2下生長(zhǎng)1周。4. MAP2 分析使用神經(jīng)元特異性抗體MAP2分析了在淀粉樣肽中毒后神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物中 神經(jīng)元的存活。在制備混合神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)物后一周，吸出細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，向細(xì)胞加入 新鮮D2培養(yǎng)基。將溶解在水中并允許在37°C聚集至少兩周的0.25μΜ β -淀粉樣肽 1-42 (American PeptideCompany, Sunnyvale, CA, USA),與濃度從 1(Γ19 到 ICT5M ± 曾力口 的 NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)或 STPTAIPQ(SEQ ID NO 6) 一起加入到每個(gè)孔中。將細(xì)胞在 37°C 下在10% CO2中培養(yǎng)。在加入β -淀粉樣肽和肽后5天，通過從每個(gè)孔除去培養(yǎng)基并加入冷甲醇將細(xì)胞 固定。將細(xì)胞留在冰箱中過夜。按照以前的描述將細(xì)胞用抗ΜΑΡ2抗體免疫染色(Brooke SM等，Neurosci. Lett.，267 :21_4(1999))移除甲醇，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗 4次。通過將細(xì)胞在含有5%脫脂奶的PBS中、在4°C下溫育過夜，進(jìn)行非特異性抗體結(jié)合的 阻斷。然后除去阻斷溶液，向每個(gè)孔加入抗MAP2抗體(1 1000 ;Sigma，Rehovot，Israel)。 將細(xì)胞在室溫溫育30分鐘，然后用PBS清洗4次。然后向每個(gè)孔加入生物素化的抗小鼠 IgG(l 200, Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)，將細(xì)胞在室溫溫育 30 分鐘，然 后用PBS清洗4次。將細(xì)胞與按照制造商的方案制備的ABC試劑(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)在室溫溫育30分鐘，然后用PBS清洗4次。然后向每個(gè)孔加入按照 制造商的方案制備的ABTS試劑(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)，將細(xì)胞在暗 處在室溫溫育20分鐘。將板在ELISA讀板器中在405nm讀數(shù)。使用含有未處理的細(xì)胞和 無第一抗體的孔作為空白。5. MTS 分析使用MTS分析方法測(cè)試了星形膠質(zhì)細(xì)胞在用ZnCl2中毒后的存活。將星形膠質(zhì) 細(xì)胞在96孔板中傳代培養(yǎng)后一周，吸出星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，向細(xì)胞添加含有200 μ M ZnCl2 和濃度上升的 NATLSIHQ (SEQ ID NO 4)或 STPTAIPQ (SEQ ID NO :6)(濃度范圍 I(T16-IO-7M)的培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37°C下在10% CO2中溫育4小時(shí)，然后使用Celltiter96 水性非放射活性細(xì)胞增殖分析(Promega，Madison, WI，USA)，按照制造商的說明書進(jìn)行MTS 分析，在ELISA讀板器中在490nm讀數(shù)。B.結(jié)果結(jié)果顯示在圖1和2以及下面的表2中。兩種肽在神經(jīng)保護(hù)分析中都有活性。 在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞二者的存活分析中，NATLSIHQ(SEQID NO 4)的功效高于 STPTAIPQ (SEQ ID NO 6)的功效。表3 測(cè)試的肽對(duì)星 形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元存活的有效濃度的歸納 應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明描述了一類新的微管蛋白結(jié)合肽模擬物，包括含有與NAP或 SAL具有相似性的肽的模擬物，用于提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)活性，以及潛在的其他治療活 性。修飾包括常規(guī)的置換，添加40個(gè)氨基酸的N-或C-末端，親脂化(lipophylization)，
乙?；?。上面提出的實(shí)施例用于示例本發(fā)明的效果，而不打算限制本發(fā)明的實(shí)施方案或范 圍，它們由下面提出的權(quán)利要求書考慮。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員來說，本發(fā)明的其 他變體是顯而易見的，并被所附的權(quán)利要求書所涵蓋。所有在本說明書中提到的出版物、數(shù) 據(jù)庫、Genbank序列、GO術(shù)語、專利和專利申請(qǐng)，以其全文引為參考，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物 或?qū)＠暾?qǐng)被具體地、單獨(dú)地指明引為參考。
權(quán)利要求
NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中NAP樣或SAL樣肽模擬物具有式(R1)a-(R2)-(R3)b-，其中R1是含有1到大約40個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其中每個(gè)氨基酸獨(dú)立地選自天然存在的氨基酸和氨基酸類似物；R2是選自下列的成員NATLSIHQ(SEQ ID NO4)，STPTAIPQ(SEQ ID NO6)，NAVLSIHQ(SEQ ID NO2)，NATLSVHQ(SEQ ID NO3)，NATLSIVHQ(SEQ IDNO5)，NTPVSIPQ(SEQ ID NO7)，APVSIPQ(SEQ ID NO8)，NTPISIPQ(SEQ ID NO9)，NAPVSIP(SEQ ID NO10)，NAPVAVPQ(SEQ IDNO11)，NARVSIPQ(SEQ ID NO12)，DAPVSVPQ(SEQ ID NO13)，ALLRSIPA(SEQ ID NO20)，ALLRSIP(SEQ ID NO21)，AMLRSIPA(SEQ ID NO22)，ALLRAIPA(SEQ ID NO23)，SALLRSIP(SEQ IDNO24)，SALLRAIP(SEQ ID NO25)，ALLRTIPA(SEQ ID NO26)和ALLRSVPA(SEQ ID NO27)；R3是含有1到大約40個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其中每個(gè)氨基酸獨(dú)立地選自天然存在的氨基酸和氨基酸類似物；并且a和b獨(dú)立地選擇，并且等于0或1，前提是NAP樣或SAL樣肽模擬物不包含序列NAPVSIPQ(SEQ ID NO1)或SALLRSIPA(SEQ ID NO19)。
2.權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中R2是選自NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和 STPTAIPQ (SEQ ID NO 6)的成員。
3.權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中a和b等于0。
4.權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中R2的至少一個(gè)氨基酸是D-氨 基酸。
5.權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中R2的每個(gè)氨基酸都是D-氨基酸。
6.權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中NAP樣肽模擬物或SAL樣肽 模擬物還含有至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。
7.權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中肽模擬物是NATLSIHQ(SEQID NO 4)。
8.權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中肽模擬物是STPTAIPQ(SEQID NO 6)。
9.權(quán)利要求7或8的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中至少一個(gè)氨基酸是D-氨基酸。
10.權(quán)利要求7或8的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中每個(gè)氨基酸都是D-氨基酸。
11.權(quán)利要求7或8的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物，其中NAP樣肽模擬物或SAL 樣肽模擬物還含有至少一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。
12.含有權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物的藥物組合物。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，還含有神經(jīng)保護(hù)多肽，該神經(jīng)保護(hù)多肽含有選自 NAPVSIPQ(SEQ ID NO 1)禾口 SALLRSIPA (SEQ ID NO: 19)的氨基酸序列。
14.在對(duì)象中治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病、認(rèn)知障礙、自身免疫疾病、外周神經(jīng)毒性、運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、感覺機(jī)能障礙、焦慮、抑郁癥、精神分裂癥、精神病、與胎兒酒精綜合征相關(guān)的病 癥、涉及視網(wǎng)膜變性的病癥、影響學(xué)習(xí)和記憶的疾病或神經(jīng)精神疾病的方法，所述方法包括 給需要的對(duì)象施用治療有效量的、權(quán)利要求1的NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物的步驟， 從而在對(duì)象中治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病、認(rèn)知障礙、自身免疫疾病、外周神經(jīng)毒性、運(yùn)動(dòng)機(jī) 能障礙、感覺機(jī)能障礙、焦慮、抑郁癥、精神分裂癥、精神病、與胎兒酒精綜合征相關(guān)的病癥、 涉及視網(wǎng)膜變性的病癥、影響學(xué)習(xí)和記憶的疾病或神經(jīng)精神疾病。
15.權(quán)利要求14的方法，其中NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物是選自NATLSIHQ(SEQ ID NO 4)和 STPTAIPQ(SEQ ID NO 6)的成員。
16.權(quán)利要求14的方法，其中NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物通過鼻內(nèi)給藥。
17.權(quán)利要求14的方法，其中NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物口服給藥。
18.權(quán)利要求14的方法，其中NAP樣肽模擬物或SAL樣肽模擬物通過靜脈內(nèi)或皮下給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及模擬神經(jīng)保護(hù)性肽NAPVISPQ(NAP)和SALLRSIPA(SAL)的肽，以及它們?cè)谥委熒窠?jīng)元功能障礙、神經(jīng)變性疾病、認(rèn)知障礙、神經(jīng)精神疾病和自體免疫疾病中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101848934SQ200880104001
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日
發(fā)明者伊里亞納·戈澤斯, 沙侖·弗曼-阿薩夫, 阿利斯泰爾·斯圖爾特, 馬亞·馬奧爾 申請(qǐng)人:以色列特拉維夫大學(xué)拉莫特技術(shù)轉(zhuǎn)移公司;艾倫治療公司