專利名稱：Duffy血型抗原的克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Duffy血型抗原的主要亞單位gpD蛋白及其在檢測和治療瘧疾中的應(yīng)用。
瘧疾是人類最流行的傳染疾病。其廣泛的地理分布及該傳染嚴(yán)重的病理結(jié)果使瘧疾成為許多發(fā)展中國家主要的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
有幾種不同類型的瘧疾，其中一種由寄生蟲間日瘧原蟲(Plas-modium vivax)引起，它能攻擊敏感個人的血紅細(xì)胞。對于間日瘧原蟲特別令人感興趣的一個遺傳特性就是缺少由血型系統(tǒng)編碼被稱為Duffy(F.B.Livingston，“The Duffy Blood Groups，Vivax Malariaand Malaria Sections in Human PopulationsReview，”Human Biol，56，413，(1984))的抗原。已經(jīng)顯示血紅細(xì)胞缺少Duffy基因產(chǎn)物的個人對間日瘧原蟲的侵入是不敏感的，這是由于Duffy分子能作為該寄生蟲的受體。(L.H.Miller，H.J.Mason，D.F.Clyde and M.H.Mc Ginnis，“The Resistanse Factor to Plasmodium Vivax in Blacks，The Duffy Blood Group Genotype(a-b-)”，N.Eng.J.Med，295，302(1976))。
瘧疾寄生蟲是由按蚊屬的幾種吸血雌性蟲進(jìn)行宿主至宿主間傳播的。間日瘧原蟲生活周期的性階段發(fā)生在蚊子中，導(dǎo)致子孢子的產(chǎn)生。這些子孢子進(jìn)入新的宿主后寄居于肝臟的實質(zhì)細(xì)胞中并進(jìn)行無性增殖，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的破裂并把無性形式(裂殖子)釋放到血液中。在那里裂殖子以一種幾乎同步的方式活躍地進(jìn)入血紅細(xì)胞，并由于間日瘧原蟲細(xì)胞生長和分裂的速率基本一致，被感染的紅細(xì)胞同時達(dá)到使它們破裂的寄生蟲滴度階段。這就產(chǎn)生每48小時發(fā)熱的典型周期，由此得名為間日瘧疾。
間日瘧原蟲感染在不治療的情況下可持續(xù)長達(dá)五年的時間。間日瘧原蟲寄生物血癥相對低，主要因為寄生蟲喜歡存在于外周血液中的少數(shù)幼紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞中。
對間日瘧原蟲的免疫性本質(zhì)上通常只是部分的，這就使得發(fā)生重復(fù)感染，并獨立發(fā)展致使寄生蟲釋放的周期發(fā)生重疊，導(dǎo)致在較短的周期中出現(xiàn)發(fā)熱。間日瘧原蟲和其它瘧疾瘧原蟲一樣(M.Hom-mel，“Antigenic Variation in Malaria Parasites，”Immunology Today，6，28，(1985))，顯示相當(dāng)?shù)目乖鄻有院妥儺愋?，雖然最近顯示存在寄生蟲不同分離物共有的間日瘧原蟲子孢子抗原組份(F.Zavala，A.Masuda，P.M.Graves，V.Nussenzweig and R.Nussenzweig，“Ubiquity of the Repetitive Epitope of the Cs Protein in Different Iso-lates of Human Malaria Parasites，”J.Immunol，135，2790，(1985))。
考慮到間日瘧原蟲分離物間抗原性差別的來源及它們對于免疫接種的后果，間日瘧原蟲不同種的裂殖子具有進(jìn)入血紅細(xì)胞的相同受體即Duffy分子(Miller et al，N.Engl.J.Med.，supra)是很重要的。此外，不管其改變其它抗原分子的能力，寄生蟲識別分子，即結(jié)合Duffy分子的分子必須保持一致，因為正是它和恒定受體間的互補(bǔ)性使得裂殖子進(jìn)入紅細(xì)胞，由此導(dǎo)致感染的繼續(xù)。這種分子的配體專一性的變化引起寄生蟲感染能力的喪失，因為間日瘧原蟲裂殖子好象不能利用人其它的血紅細(xì)胞受體進(jìn)入體內(nèi)，這可以由Duffy陰性紅細(xì)胞的抗性看出。
Duffy血型系統(tǒng)含有兩種主要的抗原Fya和Fyb，分別由Fya和Fyb等位基因產(chǎn)生。抗血清抗-Fya和抗Fy-b定義了四種表現(xiàn)型，F(xiàn)y(a+b-)，F(xiàn)y(a-b+)，F(xiàn)y(a+b+)和Fy(a-b-)。W.L.Marsh，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，5，387，(1975)。沒有一種抗血清能聚合Duffy·Fy(a-b-)細(xì)胞，此細(xì)胞類型為黑人中主要的表現(xiàn)型。定義為其它表現(xiàn)型的抗血清，F(xiàn)y3，F(xiàn)y4和Fy5非常稀少。一鼠的單克隆抗體，抗-Fy6，定義了存在于所有Duffy陽性細(xì)胞中的新的Duffy抗原決定簇，但它不存于Fy(a-b-)細(xì)胞中。M.E.Nichols，P.Rubinstein，J.Barnwell，S.R.de Cordoba，和R.E.Rosenfield，J.Exp.Med.，166，776(1987)。具有Fy(a-b-)紅細(xì)胞的黑人不被間日瘧原蟲感染。這些細(xì)胞對諾爾斯氏瘧原蟲(P.knowlesi)的侵入也具有抗性。諾爾斯氏瘧原蟲是一種入侵Fy(a+b-)和Fy(a-b+)人紅細(xì)胞的猴寄生蟲。L.H.Miller，S.J.Mason，J.A.Dvorak，M.H.McGinniss和K.I.Rothman，Science，189，561(1985)。因此這些寄生蟲入侵紅細(xì)胞的受體與Duffy血型系統(tǒng)相關(guān)。
如下的氨基酸在別處描述中可能由以下3或1個字母的代碼表示。氨基酸3-字母代碼 1-字母代碼丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺Asn N天冬氨酸Asp D半胱氨酸Cys C谷氨酰胺Gln Q谷氨酸 GluE甘氨酸 GlyG組氨酸 HisH異亮氨酸 IleI亮氨酸 LeuL賴氨酸 LysK甲硫氨酸 MetM苯丙氨酸 PheF脯氨酸 ProP絲氨酸 SerS蘇氨酸 ThrT色氨酸 TrpW酪氨酸 TyrY纈氨酸 ValV利用一抗Fy6單克隆抗體，現(xiàn)已發(fā)展了一種從人紅細(xì)胞中純化Duffy抗原的程序。Duffy抗原看來是由不同亞單位組成的多體紅細(xì)胞膜蛋白。一種命名為gpD分子量為35-45kDa的糖蛋白是此蛋白復(fù)合物的主要亞基，并且具有由抗Fya、抗Fyb和抗-Fy6抗體確定的抗原決定簇。在分子水平對這一新的蛋白質(zhì)的描述對發(fā)現(xiàn)其在紅細(xì)胞膜上的功能、了解寄生蟲—紅細(xì)胞識別的過程和解開寄生蟲入侵的分子機(jī)制是重要的。本發(fā)明涉及一編碼gpD蛋白質(zhì)的mRNA的分離、序列分析及組織表達(dá)。
gpD蛋白和人及兔的白細(xì)胞介素-8受體有顯著的序列同源性，因此gpD蛋白極有可能是一類新的趨化細(xì)胞因子受體。gpD蛋白cDNA和一人海馬cDNA克隆HHCMF86有準(zhǔn)全同源性，因此很有可能gpD蛋白或一同源蛋白以一種神經(jīng)肽受體存在于大腦中。gpD存在于所有的紅細(xì)胞祖細(xì)胞中，并存在作為細(xì)胞增殖和/或分化受體的可能性。gpD蛋白cDNA能識別人腎中和骨髓中同樣大小的mRNA。由于腎不是促細(xì)胞生成器官也沒有成為促細(xì)胞生成器官的潛能，所以有可能這一推定的趨化物受體具有必需的腎功能。
gpD蛋白在預(yù)防瘧疾和調(diào)節(jié)必須的紅細(xì)胞、神經(jīng)和腎功能中有醫(yī)療價值，并可以和生理可接受的稀釋劑結(jié)合產(chǎn)生適合于這些目的的治療劑。
與gpD蛋白中含受體的部分相應(yīng)的多肽也已被合成。這些多肽具有和gpD蛋白本身相同的治療應(yīng)用效果，并且和gpD蛋白情況一樣，合成的多肽可以和生理可接受的稀釋劑結(jié)合產(chǎn)生抗瘧疾的疫苗或?qū)φ{(diào)節(jié)必須的紅細(xì)胞、神經(jīng)和腎功能有用的治療劑。
gpD蛋白和相應(yīng)于gpD蛋白一部分的合成肽在生產(chǎn)治療劑如抗體、互補(bǔ)多肽及以gpD蛋白或合成多肽的三級結(jié)構(gòu)為模型的藥物中也有用處，這些蛋白和肽在治療瘧疾、調(diào)節(jié)必須的紅細(xì)胞、神經(jīng)和腎功能中也有治療價值。
現(xiàn)在將參照附圖詳細(xì)描述本發(fā)明，其中

圖1a是兩個最長的gpD蛋白cDNA克隆的圖解和部分限制性內(nèi)切酶圖譜。圖1b是編碼gpD蛋白的組合的Fyb71-81 cDNA克隆的核苷酸和氨基酸序列。
圖2a是gpD蛋白序列的親水性圖。圖2b是一個gpD蛋白膜定向的推定模型。
圖3是以Fyb71或Fyb81插入片段為探針的Northern(圖3a)和Southern印跡(圖3b)。
圖4是以Fyb81克隆的插入片段為探針對從人組織獲得的poly(A)+RNA的Northern印跡分析。
圖5是顯示gpD蛋白和海馬cDNA克隆HHCMF86間DNA序列同源性的圖表。
已分離到編碼Duffy血型抗原系統(tǒng)主要亞單位gpD蛋白的四個cDNA克隆。已從這四個cDNA克隆測定了編碼gpD蛋白的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列。序列顯示于圖1中并被指定為SEQ ID No1。由于遺傳密碼的簡并性，可能存在其它編碼相同gpD蛋白的天然DNA序列。因此本發(fā)明擴(kuò)延到這樣的其它天然DNA序列和具有SEQID No1中顯示的相同DNA序列的合成DNA序列及其它這樣的天然DNA序列?？捎扇魏纬Ｒ?guī)的方法合成DNA。
圖1也顯示了gpD蛋白的氨基酸序列。如關(guān)于結(jié)構(gòu)基因DNA序列的情況一樣，本發(fā)明擴(kuò)展到從天然來源分離的gpD蛋白或由化學(xué)合成制備的gpD?？捎扇魏纬Ｒ?guī)方法進(jìn)行化學(xué)合成。
圖1中，氨基酸殘基編號于左側(cè)；核苷酸位置編號于右側(cè)。相應(yīng)于預(yù)測氨基酸的多肽位置由單實線顯示。兩個潛在的糖結(jié)合位點的天冬酰胺殘基由向上箭頭顯示。第三個糖基化位點，第37位的天冬酰胺，由于其后是天冬氨酸而不可能存在。參見R.D.Marshall，Annu.Rev.Biochem.，41，673(1972)。位于5′末端下的雙線是被用來引物延伸5′末端的序列，而在3′末端是添加poly(A)的共有序列。
gpD蛋白質(zhì)是一高度疏水的膜內(nèi)糖蛋白，有九個推定的穿膜α-螺旋。相關(guān)基因存在于Duffy陽性和陰性個體中，但Duffy陰性個體的骨髓不合成gpD專一性mRNA。在成人腎、脾和胎肝中，這種mRNA和gpD mRNA大小一樣；但在腦中mRNA要長的多。已被表征的克隆將提供待研究的元素(i)gpD基因的結(jié)構(gòu)組份，(ii)gpD蛋白在人骨髓和其它組織中的生物合成和表達(dá)，(iii)這種可能存在于其它細(xì)胞類型中并可能作為趨化因子受體的新的紅細(xì)胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)—功能，及(iv)gpD蛋白作為間日瘧原蟲裂殖子入侵受體的作用。
P.Rubinstein等的美國專利5,101,017，已公開了一種針對于gpD蛋白的單克隆抗體(以下稱為“Rubinstein抗體”)。Rubinstein抗體通過有效地阻斷間日瘧原蟲瘧疾寄生蟲的靶分子從而阻止間日瘧原蟲瘧疾寄生蟲侵入人血紅細(xì)胞。有可能Rusinstein抗體有一個和間日瘧原蟲上配體位點立體化學(xué)相同的結(jié)合位點，并引發(fā)抗獨特型抗體與寄生蟲反應(yīng)。由于這些性能，Rusinstein抗體可用于如間日瘧原蟲感染的免疫診斷、誘導(dǎo)抗獨特型反應(yīng)(如上所述，這產(chǎn)生對抗這些寄生蟲的保護(hù)作用)，和在體內(nèi)直接阻斷寄生蟲的紅細(xì)胞受體。Rubinstein抗體的這些和其它應(yīng)用的細(xì)節(jié)在該專利中已述，其整個內(nèi)容并入本文作為參考。
Rusinstein抗體基本上按照G.Kohler和C.Milstein(Nature，256，495(1975))的方法制備。以Fy(a+b+)型人紅細(xì)胞免疫小鼠，取出脾并與鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3/NSO-Ag4-1(NS-O)(從ATCC獲得(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland))的懸浮液雜交，測定雜交瘤分泌結(jié)合人紅細(xì)胞的抗體。其中一孔發(fā)現(xiàn)含結(jié)合Fy(a+b-)和Fy(a-b+)型紅細(xì)胞的抗體，但不能結(jié)合Fy(a-b-)型的紅細(xì)胞。收集該孔中的細(xì)胞物，稀釋并克隆。發(fā)現(xiàn)其中一個克隆能分泌Rubinstein抗體。
如上所述，Rusinstein抗體對gpD蛋白是專一性的，現(xiàn)已被克隆。因此，本發(fā)明的gpD蛋白對制備與Rusinstein抗體有相同專一性的單克隆抗體也是有用的。制備這些抗體的方法基本是Rusin-stein抗體采用的相同方法，只是以gpD蛋白免疫而不是以人紅細(xì)胞免疫鼠。
此外，gpD蛋白的N-末端(胞外)區(qū)域已被確認(rèn)參予瘧疾寄生蟲和紅細(xì)胞的相互作用。目前正在進(jìn)行以合成多肽確認(rèn)參予相互作用的精確氨基酸殘基的工作。以下的多肽已發(fā)現(xiàn)在ELISA測試中與Rubinstein抗體結(jié)合(1)MASSGYVLQAELSPSTENSSQLDFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYDANLEAAAPCHSCNLLDDSALPF，其被稱為SEQ ID No8；(2)MASSGYVLQAELSPSTENSSQLDFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYD，其被稱為SEQ ID No9；和(3)AELSPSTENSSQLDFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYD，其被稱為SEQ ID No10.以下多肽在ELISA測試中與Rubinstein抗體結(jié)合(4)DFEDVWNSSYGVNDSFPDGDYD，其被稱為SEQID No11；
(5)ANLEAAAPCHSCNLLDDSALPF，其被稱為SEQID No12；和(6)AELSPSTENSSQL，其被稱為SEQ ID No13.
多肽(3)結(jié)合Rusinstein抗體而多肽(4)和(6)不結(jié)合這一事實暗示多肽(6)的C-末端和多肽(4)N-末端間的連接對結(jié)合是重要的。被指定為SEQ ID No14的氨基酸序列AELSP-STENSSQLDFEDVWNSS，可能含有Rubinstein抗體的表位。因此本發(fā)明也擴(kuò)展至含SEQ ID No14中描述的氨基酸序列的多肽。
指定為SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.14的肽以及含SEQ ID No.14的肽在體內(nèi)與寄生蟲結(jié)合，因此可用作抗瘧疾疫苗的免疫原。因而本發(fā)明還涉及這種疫苗以及保護(hù)溫血動物(特別是人)抗間日瘧原蟲感染的方法，該方法包括給予這種動物有效量的所述免疫原。因為合成肽一般講免疫原性差，最好將肽與一載體偶聯(lián)，例如蛋白載體如破傷風(fēng)類毒素、鑰孔血藍(lán)素(KLH)等，或脂質(zhì)載體，如R.Neurath等在美國專利4,847,080和5,204,096(其公開內(nèi)容并入本文作為參考)或T.Hoppe在美國專利5,019,383(其公開內(nèi)容并入本文作為參考)中介紹的那些。
本發(fā)明的多肽可從天然來源中形成，例如通過gpD蛋白質(zhì)的蛋白酶裂解，或通過化學(xué)合成。多肽的化學(xué)合成及多肽與載體的連接的細(xì)節(jié)可以在美國專利4,847,080和5,204,096中找到。
在本發(fā)明的疫苗中，本發(fā)明的多肽通常和一種生理可接受的稀釋劑(介質(zhì))如含一種佐劑的磷酸緩沖鹽水一起存在。一般說來，生理可接受稀釋劑中多肽的量為每劑量大約1微克到1毫克。
利用gpD蛋白以相似量在相似的稀釋劑中也可以形成合適的疫苗，雖然對大多數(shù)應(yīng)用來說使用合成多肽更實際一些。
在每一種情況下，本發(fā)明的疫苗可通過皮下、靜脈、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射使用。而優(yōu)選的途徑依賴特異的疫苗，肌肉內(nèi)注射一般將更合適。使用的頻率將根據(jù)疫苗而異。
已經(jīng)知道在所有瘧原蟲瘧疾蛋白中確認(rèn)的結(jié)合區(qū)域都是同源的，如J.H.Adams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，7085(1992)。因此gpD蛋白和本發(fā)明的多肽結(jié)合并妨礙所有瘧原蟲與紅細(xì)胞的結(jié)合。這就意味著本發(fā)明的疫苗一般對抵抗所有的瘧疾都有作用，因此本發(fā)明擴(kuò)展到一種保護(hù)溫血動物抵抗由任何瘧原蟲所引起的瘧疾的方法。
gpD蛋白和紅細(xì)胞上的白細(xì)胞介素-8受體有顯著的同源性。這與最近的一篇報道相一致，該報道提出Duffy血型抗原和紅細(xì)胞趨化因子受體是同一種蛋白。R.Horuk等，“A Receptor for theMalaria Parasite Plasmodium vivaxThe Erythrocyte Chemokine Re-ceptor”，Science，261，1182(1993)。紅細(xì)胞受體明顯不同于中性白細(xì)胞上的IL-8受體、IL-8RA和IL-8RB。紅細(xì)胞受體結(jié)合一個家族的趨化和炎癥前可溶性多肽，包括IL-8、黑素瘤生長刺激活性(MGSA)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)及激活時調(diào)節(jié)的正常T表達(dá)和分泌蛋白(RANTES)。引入gpD蛋白(或本發(fā)明的合成多肽)干擾這些蛋白與紅細(xì)胞受體的正常結(jié)合，因此對調(diào)節(jié)分泌這些蛋白的生理學(xué)效應(yīng)有用。例如已經(jīng)假定紅細(xì)胞受體作為某些炎癥介質(zhì)(包括IL-8)的凈化劑。gpD蛋白的引入(或本發(fā)明的合成多肽)因此將加強(qiáng)IL-8的清除，由此減輕任何IL-8引起的炎癥。為此目的，上述的本發(fā)明疫苗適于作為一種治療劑。
gpD蛋白與一人海馬cDNA克隆HHCMF86也顯示出顯著的同源性，因此極有可能gpD蛋白或另一同源蛋白以一種神經(jīng)肽受體存在于腦中。gpD蛋白在人腎中識別一和骨髓中同樣大小的mR-NA，因此，gpD蛋白或一種同源蛋白在調(diào)節(jié)腎功能中起某種作用。發(fā)明的治療劑將相應(yīng)地用于這些神經(jīng)和腎功能的調(diào)節(jié)上。
與gpD蛋白或本發(fā)明的合成多肽互補(bǔ)的蛋白質(zhì)如gpD特異性抗體，將阻斷天然受體，因此也將具有上述的治療作用。在這些互補(bǔ)蛋白質(zhì)的制備中，gpD蛋白或本發(fā)明的合成多肽的使用有明顯的價值。
本發(fā)明將根據(jù)下述非限制性實施例作進(jìn)一步描述。實施例1gpD蛋白的部分氨基酸序列分析紅細(xì)胞(Fy(a-b+))用冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH7.4)洗三次，重新懸浮于同樣溶液中，與濃度為每ml壓緊的紅細(xì)胞10微克的Rubinstein抗體4℃連續(xù)混合過夜。(此濃度以放射碘標(biāo)記抗體確定，超過這一濃度需要飽和Duffy抗原位點)。未結(jié)合的抗體以冷PBS洗滌紅細(xì)胞而去除。以20倍體積含1mM苯甲基磺酰氟和每毫升100激肽稀放酶失活單位TrasylolTM(抑肽酶)的冷5mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)通過低滲裂解制備紅細(xì)胞影。然后徹底洗紅細(xì)胞影直至其變?yōu)榈奂t色。以43,000xg離心30分鐘收集紅細(xì)胞影，倒掉上清，沉淀懸于50mM Hepes-NaOH，pH8.0，1mM苯甲磺酰氟，每毫升100個激肽釋放失活單位的Trasylol中，在-20℃冰凍。
冰凍的紅細(xì)胞影隨后融化，43,000xg離心30分鐘。沉淀重新懸浮于50mM Hepes-NaOH，pH8.0，1mM苯甲磺酰氟、每毫升100個激肽釋放酶失活單位TrasylolTM中，體積為壓緊紅細(xì)胞最初體積的3倍。加入Triton X-100TM(無過氧化物)去污劑至最終濃度為1％，溶液在室溫溫和混合1小時。43,000xg離心30分鐘去除外殼。上清液在氮壓下以PMY10濾膜(Amicon Corp.)通過Amicon濃縮器濃縮10倍。
加0.1倍體積、10倍于正常濃度的PBS溶液于去污劑提取液中。去污劑提取物然后和偶聯(lián)了抗—鼠IgG的Sepharose 4BTM珠在室溫下溫育1小時。Sepharose 4BTM珠與去污劑提取物的比例為1∶100(v/v)。通過離心去除抗—鼠IgG Sepharose珠，用含有PBS和0.5％Triton X-100的溶液洗滌，珠與洗滌溶液的比例為1∶20(v/v)。洗滌在室溫下進(jìn)行，重復(fù)三次。通過把珠子在含有62.5mMTris-HCl(pH6.8)，0.5％十二磺基硫酸鈉(SDS)的溶液中溫育進(jìn)行洗脫，珠和洗脫溶液的比例為1∶2(v/v)。溫育在65℃進(jìn)行10分鐘并重復(fù)三次。洗脫物用PMY10TM濾膜在Amicon濃縮器中在氮壓下濃縮。
根據(jù)U.K.Laemmli，Nature，227，680(1970)，在0.1％SDS存在的條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，但作以下修改丙烯酰胺的濃度為10％，聚合反應(yīng)過夜破壞氧化劑，在上面槽中加入0.1mM的巰基乙酸鹽。向親和純化物的濃縮溶液中加入以下化合物尿素至4M，SDS至2％，和β-巰基乙醇至5％。電泳后凝膠在10％異戊醇和5％醋酸中固定30分鐘，并用0.002％考馬斯亮藍(lán)R-250染色直至看見標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶。相應(yīng)于34-46kDa間和96kDa以上的區(qū)域被切下，用5％醋酸脫色幾次，并用雙蒸水洗滌。膠片于-20℃保存或立即使用。
切成4×4mm立方體的膠片放入一ElutrapTM裝置(Schleichorand Schuell)的洗脫室中，用50mM碳酸氫銨、0.1％SDS溶液在100伏(穩(wěn)壓)洗脫過夜。加入新鮮的50mM碳酸氫銨、0.1％SDS溶液，再繼續(xù)電洗脫6-8小時。洗脫物用CentriconTM微濃縮器(AmiconCorp.)濃縮。
純化的蛋白質(zhì)按如下被烷基化并用溴化氰(CNBr)裂解純化的蛋白質(zhì)用冷丙酮在1mM HCl存在條件下-20℃沉淀兩小時。沉淀用100％冷丙酮洗滌，室溫蒸發(fā)至干并溶于加有0.5％SDS的0.1MTris-HCl(pH8.0)中。向溶液中加入固體DTT使其終濃度為10mg/ml，溶液在85℃還原兩小時。向溶液中加入十分之一體積的2.68M碘乙酰胺，試管用氮氣吹洗，于室溫下在黑暗中溫育30分鐘。溫育后，加入固體DTT至10mg/ml，對加有0.5％SDS的0.1M Tris-HCl(pH8.0)透析過夜。蛋白用丙酮按如上述沉淀并風(fēng)干。將沉淀溶于96μl 70％甲酸和4μl溶于70％甲酸的1M CNBr溶液中，黑暗中在室溫溫育48小時。將酸蒸發(fā)干，用水洗滌沉淀，蒸發(fā)至干、反復(fù)幾次。消化的蛋白或進(jìn)行高壓液相(HPLC)或進(jìn)行聚丙烯酰凝膠分級分離。
通過利用鄰苯二甲醛(OPA)阻斷試劑(見，A.W.Brauer等，Anal Biochem.，137，134(1983))對未分級分離的CNBr消化產(chǎn)物測序而獲得Pe1(SEQ ID No2)多肽。Pe5(SEQ ID No6)多肽是從經(jīng)過三層SDS-PAGE系統(tǒng)(參見，H.Shagger et al.，Anal.Biochem.，168，368(1987))的CNBr消化產(chǎn)物中分離得非常好的唯一片段(～4KDa)的部分序列。跑完電泳后，將此肽片段電印跡至Prob lottTM(Applied Biosystems)并測序(見，N.LeGendre et al.，APractical Guide to Protein and Peptide Purification for Microse-quencing，P.T.Matsudaira，ed.，(Academic Press，New York)，49～69(1989))。另一份用胃蛋白酶(50/1比率)37℃消化過夜，應(yīng)用Vydac C-18柱經(jīng)反相HPLC分離這些片段。Pe2(SEQ ID No3)，Pe3(SEQ ID No4)，Pe4(SEQ ID No5)和Pe6(SEQ ID No7)肽作為單峰從反相HPLC柱上洗脫，為經(jīng)反相HPLC產(chǎn)生的少數(shù)幾種胃蛋白酶肽，對它們進(jìn)行測序。根據(jù)廠商的說明使用Applied Biosys-tems Protein/Peptide SequencerTM470或477型。以100/1比率，4℃30分鐘或60分鐘進(jìn)行胃蛋白酶消化沒有產(chǎn)生大的肽。實施例2引物設(shè)計和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)Pe5(SEQ ID No6)為最有希望來制備用以篩選gpD蛋白克隆的探針。Pe2(SEQ ID No3)，Pe3(SEQ ID No4)，Pe4(SEQ ID No5)和Pe6(SEQ ID No7)肽太短不適于PCR擴(kuò)增，Pe1(SEQ ID No2)肽較大，但它有三個不明確的殘基。
引物(每個含23個堿基)的核苷酸序列由Pe5(SEQ ID No6)(見圖1b)的N-末端和C-末端氨基酸序列推演而來。因為Pe5(SEQ ID No6)肽是通過CNBr裂解而產(chǎn)生的，所以N-末端包含一甲硫氨酸從而將肽的長度增加至24個殘基。按照R.Lathe在J.Mol.Biol.，183,111(1985)中描述的密碼子優(yōu)先原則選擇堿基，該文獻(xiàn)內(nèi)容并入本文作為參考；在除3′端外簡并超過三倍的位置引入脫氧肌苷(I)。
化學(xué)合成了兩個的針對N-末端氨基酸(引物A)和C-末端氨基酸(引物B)的引物，并用于從混合的Fy(a-b+)個體的人骨髓mRNA中擴(kuò)增Pe5(SEQ ID No6)的編碼序列。引物A(正義的)針對于殘基245至252(見圖1b)，并由12重簡并度的5′-ATGAAX-ATYXTITGGGCITGGTT(其中I＝脫氧肌苷；X＝C或T；和Y＝C，T或A)組成。引物B(反義的)針對于殘基261-268(見圖1b)，并由32重簡并度的5′-ACIAGMAAMTCIAGICCIAMNAC(其中I＝脫氧肌苷；M＝A或G；和N＝G，A，T，或C)組成。
應(yīng)用來自BRL(Bethesda，Maryland)的預(yù)擴(kuò)增試劑盒并以寡聚dT作為引物從Fy(a-b+)表型的mRNA中合成cDNA的第一條鏈。為了酶法擴(kuò)增，cDNA、引物A、引物B和Taq聚合酶(Strata-gene)被孵育于一Perkin-Elmer DNA熱循環(huán)儀上。將預(yù)期大小(72bp)的擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到pBluescript-SK載體(Stratagene)上。插入片段的推演氨基酸序列與Pe5(SEQ ID No6)肽(見圖1b)的序列匹配。根據(jù)肽Pe5(SEQ ID No6)的序列WFIFWWPH，化學(xué)合成了寡聚核苷酸TGGTTTATTTTCTGGTGGCCTCAT(SEQ IDNo16)，通過T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)在5′末端用32P標(biāo)記，并用作標(biāo)針以篩選人骨髓cDNA文庫(見下文)。該具有針對氨基酸251至258的密碼習(xí)慣的24堿基寡核苷酸成功地鑒定出了真正的gpD蛋白cDNA克隆。實施例3人mRNA和DNA的分離
Poly(A)+RNA提取如下洗滌人骨髓抽吸物，并在5％β-巰基乙醇加6M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉(pH7.0)，50mM乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液中裂解細(xì)胞，使胍終濃度為5M。溶液通過一25G皮下注射針頭以剪切DNA，并加入2％的Sarkosyl。溶液在一5.7MCsCl，50mM EDTA(pH7.0)墊層上在SW41轉(zhuǎn)子中以32krpm 20℃離心18小時。沉淀用6M鹽酸胍洗滌，最后用干冰預(yù)冷的無水乙醇洗滌。沉淀重新懸浮于焦碳酸二乙酯處理的水中，調(diào)整至0.3M乙酸鈉(pH5.2)，并用乙醇沉淀。沉淀重新懸浮于蛋白酶K降解緩沖液中并于37℃降解2小時，酚-氯仿抽提并用乙醇沉淀。將沉淀溶解于水中，調(diào)整至1×DNase降解緩沖液，并用不含RNase的DNase(BRL)處理。使用Invitrogen的mRNA提取試劑盒FASTTRACKTM，根據(jù)廠商的操作流程提取PolyA+RNA。源于白種成人肝、脾、腎、腦和胎肝，及紅白血病細(xì)胞K562的mRNA從CLON-TECH LABORATORIES獲得。通過用0.83％NH4Cl pH7.4裂解全血中血紅細(xì)胞，接著應(yīng)用由T.Maniatis，E.F.Fritsh和J.Sam-brook在Molecular Cloning.A Laboratory Mannal(Cold Spring Har-bor Lab.，Cold Spring Harbor，N.Y.)(1982)中所述的DNA提取標(biāo)準(zhǔn)流程(其全部內(nèi)容特此引用作為參考)，從四種Duffy表型的外周血白細(xì)胞中得到DNA。實施例4gpD蛋白cDNA克隆的核苷酸序列一種從混合的Fy(a-b+)個體mRNA構(gòu)建的非擴(kuò)增人骨髓cDNA文庫，用24堿基探針進(jìn)行篩選。從1.9×106重組λZAPIITM噬菌體中，篩選出4個陽性克隆并測序。所有克隆具有重疊序列但沒有覆蓋gpD cDNA的全長。Fyb81和Fyb71是最長的，1085bp的Fyb81是唯一含有最終的5′末端的克隆，1083bp的Fyb71包括核苷酸185位至poly(A)+尾。989bp的Fyb31和726bp的Fyb82分別包括從核苷酸275和527位至Poly(A)尾。Fyb81和其它任何克隆組合，產(chǎn)生gpD蛋白的全長cDNA。圖1a表示了兩個最長克隆的重疊和組合。
接合的Fyb71-81克隆預(yù)示了一起始于176位和終止于1192位的開放讀碼框架，其編碼339個氨基酸殘基的多肽(圖1b)。應(yīng)用BLASTTM網(wǎng)絡(luò)服務(wù)系統(tǒng)，在NεBI上進(jìn)行GenBankTM序列檢索(re-lease 77)，顯示與人和兔白細(xì)胞介素-8受體的明顯的蛋白序列同源性，并且與人海馬cDNA克隆HHCMF86(見下文)具有準(zhǔn)全核苷酸序列同源性。反義引物的延伸產(chǎn)物(從57至80位，圖1b)，形成一與Fyb81克隆5′末端的預(yù)期大小完全吻合的80個核苷核的序列(未顯示)。起始密碼子在176～178位上，而沒有嵌入在與哺乳動物翻譯啟始最常相關(guān)的序列中，見M.Kozak，Nucleic Acids Res.，87，8125(1987)。但是，根據(jù)下列原因可以推測它就是真正的起始密碼子(i)在5′末端，它是唯一的ATG密碼子；和(ii)從第一個甲硫氨酸開始，由重組克隆所編碼的多肽具有與去糖基化的gpD蛋白相同的分子量。見，A.Chaudhuri和A.O.Pogo(in press)的BloodCell Bio-chemistry.eds.J.P.Cartron and P.Rouger.(Plenum Press，NewYork)Vol 6。在3′末端，克隆Fyb71-81含有通用的Poly(A)加尾信號AATTAAA(圖1b)。
兩個克隆具有很好的核苷酸序列匹配，除了在5′末端幾個堿基取代產(chǎn)生6個不同的預(yù)期氨基酸。這些差異不是測序錯誤，因為兩條DNA鏈經(jīng)多次測序。它們是蛋白異源性的結(jié)果，因為該cDNA文庫是從幾個Fy(a-b+)個體的mRNA構(gòu)建的。
為了確定Fy71-81具有針對于gpD蛋白的編碼序列，將翻譯的序列與從六種肽Pe1～Pe6得到的部分氨基酸序列資料進(jìn)行比較。預(yù)期的氨基酸序列各部分與用OPA試劑測序的Pe1(SEQ ID No2)肽，與用反相HPLC分離的四種肽(Pe2(SEQ ID No3)，Pe3(SEQID No4)，Pe4(SEQ ID No5)，和Pe6(SEQ ID No7)肽)，和與用SDS-PAGE分離的Pe5(SEQ ID No6)肽相吻合。但是，在全部的62個氨基酸中有2個不吻合。因此，通過密碼子序列分析在92和327位的殘基為色氨酸，但通過氨基酸序列測定，它們分別是異亮氨酸和精氨酸。因為色氨酸是一種很不穩(wěn)定的殘基，這一差異可能是氨基酸序列分析中的技術(shù)問題。另一方面，可能是由于gpD蛋白的異源性。
Fyb71-81編碼gpD蛋白的其它證據(jù)可來自Northern印跡和ELISA分析。Fyb81在Duffy陰性個體中沒有檢測到任何mRNA，而在Duffy陽性個體中可以檢測到1～1.27kb代表全長gpD mRNA的轉(zhuǎn)錄本(圖3a)。抗-Fy6抗體可與一從Fyb71-81克隆可以預(yù)示的35個氨基酸的合成肽(9-44殘基，見圖1b)反應(yīng)，(未顯示)。Fy(a-b-)表型缺少gpD蛋白特定的mRNA(見下文)和抗-Fy6與由gpD cDNA得到的肽的反應(yīng)，強(qiáng)烈地說明該分離克隆為真正的Duffy克隆。實施例5gpD蛋白的氨基酸序列和膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fyb71-81克隆的預(yù)期翻譯產(chǎn)物，為一等電點5.65及分子量為Mr35，733的酸性蛋白。該蛋白僅在氨末端帶有兩個用于天冬酰胺殘基N-糖基化的潛在的規(guī)范序列。見R.D.Marshall，Annu.Rev.Biochem.，41，673(1972)。這與N-糖苷酶F消化增加gpD在SDS-PAGE上的遷移率和N-乙酰葡糖胺的化學(xué)檢測的早期研究相一致。見A.Chaudhuri和A.O.Pogo，supra；M.J.A.Tanner，D.J.Anstee，G.Mallison，K.Ridgwell，P.G.Mantin，N.D.Aventi，和S.F.Parsons，Carbohydr.Res.，178，203(1988)；和K.Wasniowaska，P.E-ichenberger，F(xiàn).Kugele，和T.J.Hadley，Biochem.Biophy.Res.Com-mun.，192，366(1993)。
應(yīng)用Engelman等(Ann.Rev.Biophys.Chem.15，321(1986))的親水圖從序列資料中預(yù)測跨膜螺旋的位置，并且一20殘基掃描窗顯示出大部分蛋白鑲嵌于膜中(圖2)?？梢灶A(yù)測9個跨膜α-螺旋，N-末端66個殘基的親水結(jié)構(gòu)域，C末端25個氨基酸的親水結(jié)構(gòu)域，及短的突出的親水性連接區(qū)段。一對螺旋D和E由于十分靠近，所以它們排列成一對反平行螺旋。gpD蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖示于圖2。
由Hartman等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，5786(1989))提出的電荷差規(guī)則，可預(yù)測N末端位于胞外側(cè)，蛋白的C末端位于膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)。N-末端兩個潛在N-糖基化位點的發(fā)現(xiàn)證實了N-末端的預(yù)測。而且，抗-Fy6與由該結(jié)構(gòu)域推演而來的合成肽的反應(yīng)也從試驗上確定了其胞外位置，因為該抗體與紅細(xì)胞結(jié)合。膜插入的信號錨序列可能位于N-末端區(qū)域之后的第一個α-螺旋中，見H.P.Wessels和M.Spies，Cell，55，61(1988)；和G.Blobel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，1496(1980)。根據(jù)上述，該蛋白深埋在膜中，并在殘基314開始存在于膜的胞質(zhì)側(cè)(圖2)。螺旋、親水性連接區(qū)段和C-末端片段的位置的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測，應(yīng)該通過直接的生化和免疫化學(xué)分析加以證實。
Duffy gpD蛋白深埋于膜中，如同條帶3的膜相關(guān)片段(見D.Jay，Annu.Rev.Biochem.，55，511(1986))、人Rh血型多肽(見，B.Chérif-Zahar et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6243(1990)；及N.D.Avent et al.，Biochem.J.，271，821(1990))，細(xì)菌視紫紅質(zhì)(見P.Carlton et al.，EMBO J.，4，1593(1985))和Lipophilin(見W.Stoffel et al.Hoppe-Seyler’Z.Physiol.Chem.，364，1455(1983))一樣。gpD蛋白與白細(xì)胞介素-8受體的顯著同源性是非常嚴(yán)格的。見W.E.Holmes et al.，Science，253，1278(1991)；和P.M.Murphy et al.，Science，253，1280(1991)。如果gpD蛋白結(jié)合趨化因子并具有激活信號傳導(dǎo)級聯(lián)系統(tǒng)的能力，這使得gpD蛋白成為新的一類炎癥前介質(zhì)。因此，白細(xì)胞內(nèi)不存在gpD蛋白，因為抗純化、失活的gpD蛋白的兔多克隆抗體(抗-gpD)與紅細(xì)胞及其前體反應(yīng)，而不與任何白細(xì)胞反應(yīng)(未發(fā)表的結(jié)果)。實施例6RNA印跡分析(Northern)對Poly(A)+RNA進(jìn)行甲醛/瓊脂糖凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到Hy-bondTMN+尼龍膜(Amersham Corp.)上。根據(jù)廠商說明，將膜在QuickHybTM(Stratagene)上雜交并洗膜。
在Norrhern印跡分析中，F(xiàn)yb71或Fyb81克隆在三個Duffy陽性表型的骨髓中檢測到～1.27kb mRNA，但在Fy(a-b-)表型個體中并未檢測到(圖3a)。在Duffy陰性個體中缺少gpD mRNA與缺乏gpD蛋白相一致?？?gpD抗體不與任何Fy(a+b-)紅細(xì)胞的紅細(xì)胞膜蛋白反應(yīng)(未顯示)。Duffy陰性個體不表達(dá)gpD蛋白，因為它們不能合成Duffy特異性mRNA。
在圖3a中，泳道1含有10μg Fy(a-b-)mRNA，泳道2和3分別含有5μg Fy(a+ b～)mRNA和Ry(a-b+)mRNA，及泳道4含有2μg Fy(a+b+)mRNA。它們于2％變性瓊脂糖凝膠上分離、印跡、雜交并在-80℃放射自顯影72小時。RNA大小標(biāo)準(zhǔn)顯示為人28S(5.1kb)和18S(2.0kb)rRNA，及1.35kb GIBCOBRL標(biāo)準(zhǔn)(LIFETECHNOLOGIES)，其用于計算gpD mRNA的大小。底部的肌動蛋白探針作為樣品上樣量的對照。在Poly(A)+組和肌動蛋白探針中存在兩種rRNA顯示出RNA的完整性。實施例7DNA印跡分析(Southern)根據(jù)供應(yīng)商(New England Biolabs)所建議的條件進(jìn)行所有的限制性酶消化。降解的DNA在0.8％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行大小分離并按Northern分析中所述方法印跡。根據(jù)廠商說明，在Quick-HybTM溶液中68℃雜交1小時。
在Soufhern印跡分析中，F(xiàn)yb71或Fyb81探針與Duffy陽性和陰性個體的DNA雜交(圖3b)。它們確定為在BamHI中的6.5kb單一帶，在EcoRI中的12kb和2kb兩條帶，及在Pst1降解的DNA中為3.5kb和1.4Kb兩條帶。這些發(fā)現(xiàn)與Fyb71和Fyb81的限制性酶譜相一致并顯示出為單拷貝基因。Duffy陽性和陰性個體的基因中結(jié)構(gòu)差異的確定，應(yīng)能闡明在陰性個體中g(shù)pD基因阻遏的機(jī)制。在其它系統(tǒng)中描述的功能性沉默子元件可以在Fy(a-b-)個體的紅細(xì)胞中選擇性地抑制gpD基因的轉(zhuǎn)錄。見L.Li，T.Suzuki，N.Mori，和P.Greengard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，1460(1993)。Duffy系統(tǒng)與ABO(F.Yamarmoto et al，Nature，345，229(1990))和Kell系統(tǒng)不同，這些系統(tǒng)中不表達(dá)血型決定簇的個體中仍可發(fā)現(xiàn)mRNA。
在圖3b中，每一泳道中含10μg降解的DNA；泳道1-4含有Fy(a-b-)DNA，泳道5-8含F(xiàn)y(a+b-)DNA，泳道9至12含F(xiàn)y(a-b+)DNA。酶降解如下泳道1，5和9為BamHI；泳道2，6和10為EcoRI；泳道3，7，和11為Hinf1；泳道4，8和12為Pst1。它們于0.8％瓊脂糖凝膠上分離、印跡、雜交并在-80℃放射自顯影7天。根據(jù)GIBCOBRL DNA標(biāo)準(zhǔn)的位置計算大小。
如圖4所示，可在成人脾和腎、胎肝中發(fā)現(xiàn)1.27Kb mRNA，但在成人肝和K562紅白血病細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)。用β-球蛋白探針雜交在骨髓和胎肝中顯示出很強(qiáng)的信號；成人脾中顯示微弱信號，但成人肝、腦和腎中沒有信號顯示(未表示)。胎肝中存在gpD mRNA是預(yù)料之中的，因為胎肝是促紅細(xì)胞生成器官。在人腦中，可檢測到一8.5kb強(qiáng)帶和2.2kb弱帶。這存在許多含人感興趣的可能性。這表明在腦中存在Duffy相關(guān)蛋白。而且，這一見解由Fyb71-81克隆與人海馬cDNA克隆HHCMF86之間的準(zhǔn)全同源性所支持，后者最近被鑒定(見M.D.Adams等，Nature，355，632(1992))并定為SEQID No15。但是，8.5kb腦mRNA不可能編碼Duffy蛋白而帶有長的5′和3′非翻譯序列。該腦mRNA可能編碼了與gpD蛋白具有廣泛同源性的較大的蛋白。這些種類的mRNA與gpD特定的mRNA之間的同源性仍有待于通過序列分析加以證實；但是，這一發(fā)現(xiàn)有力地表明在腎、非生血性脾細(xì)胞和可能在腦中產(chǎn)生gpD蛋白或一相似的蛋白。
圖5代表顯示gpD蛋白和人海馬cDNA克隆HHCMF86的DNA序列同源性的圖表。該HHCMF86 cDNA克隆來自一兩歲女性高加索人(Adams et al.Nature，355，632(1992))。在HHCMF86中存在幾個未確定的堿基，而且這兩個克隆具有相同的直到gpD蛋白623位為止的ORF(在HHCMF86中為296)。HHCMF86在此位置后有一個額外的腺嘌呤，在ORF中產(chǎn)生移碼。該額外的腺嘌呤很可能是HHCMF86 cDNA的測序錯誤。
在圖4中，泳道1，3，5和7分別含有2μg Fy(a-b+)骨髓、胎肝、成人脾和紅白血病(K562)mRNA。泳道2，4和6分別含有7μg全腦、成人肝和成人腎mRNA。它們在1.5％變性瓊脂糖凝膠上分離并于-80℃放射自顯影5天。實施例8人骨髓cDNA文庫的構(gòu)建和篩選幾個Fy(a-b+)個體mRNA的混合物，BRL SuperscriptChoiceTMSystem和作為引物的寡聚dT用以制備cDNA。將該cD-NA連接到λZAPIITM載體上并用Gigapack GoldTM(Stratagene)抽提物包裝。用上述的32P標(biāo)記的探針篩選約1.9×106個非擴(kuò)增cD-NA克隆。根據(jù)廠商的操作流程通過質(zhì)粒拯救方法分離插入到pBluescript的cDNA。應(yīng)用載體引物對DNA雙鏈進(jìn)行測序；根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的已測序的區(qū)域設(shè)計引物。實施例9引物延伸應(yīng)用預(yù)擴(kuò)增試劑盒(Preamplification Kit)(BRL)，從編碼鏈(圖1b)57至80位的32P標(biāo)記的24核苷酸的反義引物在Fy(a-b+)mRNA上延伸。產(chǎn)物在6％的測序膠上分離。M13序列梯用于確定產(chǎn)物的大小。
應(yīng)認(rèn)識到本說明書和權(quán)利要求只是說明性質(zhì)的而非限制性的，而且在不背離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的情況下可進(jìn)行各種修飾和改變。
序列表(1)一般信息(i)申請人Pogo，Angel Oscar；Chaudhuri，Asok.
(ii)發(fā)明題目DUFFY血型抗原的克隆(iii)序列數(shù)16(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Sprung Horn Kramer & Woods(B)街道660 White Plains Road(C)城市Tarry town(D)州NeW York(E)國家USA(F)郵政編碼10591-5144(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤，3.5英寸，800kb貯存(B)計算機(jī)Apple Macintosh(C)操作系統(tǒng)System 7.0(D)軟件WordPerfect(vi)本申請資料(A)申請?zhí)栁粗付?B)申請日1994年10月20日(C)分類未指定(vii)優(yōu)先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/140,797(B)申請日1993年10月21日
(viii)律師/代理人資料(A)姓名Kurt G.Briscoe(B)注冊號33，141(C)參考/卷號NYBC 265-KGB(ix)電話聯(lián)系資料(A)電話(914)332-1700(B)傳真(914)332-1844(2)SEQ ID No1的信息(i)序列特征(A)長度1267核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No1GGCTTCCCCA GGACTGTTCC TGCTCCGGCT CTTCAGGCTC 40CCTGCTTTGT CCTTTTCCAC TGTCCGCACT GCATCTGACT 80CCTGCAGAGA CCTTGTTCTC CCACCCGACC TTCCTCTCTG 120TCCTCCCCTC CCACCTGCCC CTCAGTTCCC AGGAGACTCT 160TCCGGTGTAA CTCTG ATG GCC TCC TCT GGG TAT GTC CTC 199Met Ala Ser Ser Gly Tyr Val LeuCAG GCG GAG CTC TCC CCC TCA ACT GAG AAC TCA AGT CAG 238Gln Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn Ser Ser GlnCTG GAC TTC GAA GAT GTA TGG AAT TCT TCC TAT GGT GTG 277Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr Gly ValAAT GAT TCC TTC CCA GAT GGA GAC TAT GAT GCC AAC CTG 316Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Ala Asn LeuGAA GCA GCT GCC CCC TGC CAC TCC TGT AAC CTG CTG GAT 355Glu Ala Ala Ala Pro Cys Asn Ser Cys Asn Leu Leu AspGAC TCT GCA CTG CCC TTC TTC ATC CTC ACC AGT GTC CTG 394Asp Ser Ala Leu Pro Phe Phe Ile Leu Thr Ser Val LeuGGT ATC CTA GCT AGC AGC ACT GTC CTC TTC ATG CTT TTC 433Gly Ile Leu Ala Ser Ser Thr Val Leu Phe Met Leu PheAGA CCT CTC TTC CGC TGG CAG CTC TGC CCT GGC TGG CCT 472Arg Pro Leu Phe Arg Trp Gln Leu Cys Pro Gly Trp ProGTC CTG GCA CAG CTG GCT GTG GGC AGT GCC CTC TTC AGC 511Val Leu Ala Gln Leu Ala Val Gly Ser Ala Leu Phe SerATT GTG GTG CCC GTC TTG GCC CCA GGG CTA GGT AGC ACT 550Ile Val Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Leu Gly Ser ThrCGC AGC TCT GCC CTG TGT AGC CTG GGC TAC TGT GTC TGG 589Arg Ser Ser Ala Leu Cys Ser Leu Gly Tyr Cys Val TrpTAT GGC TCA GCC TTT GCC CAG GCT TTG CTG CTA GGG TGC 628Tyr Gly Ser Ala Phe Ala Gln Ala Leu Leu Leu Gly CysCAT GCC TCC CTG GGC CAC AGA CTG GGT GCA GGC CAG GTC 667Asn Ala Ser Leu Gly Asn Arg Leu Gly Ala Gly Gln ValCCA GGC CTC ACC CTG GGG CTC ACT GTG GGA ATT TGG GGA 706Pro Gly Leu Thr Leu Gly Leu Thr Val Gly Ile Trp GlyGTG GCT GCC CTA CTG ACA CTG CCT GTC ACC CTG GCC AGT 745Val Ala Ala Leu Leu Thr Leu Pro Val Thr Leu Ala SerGGT GCT TCT GGT GGA CTC TGC ACC CTG ATA TAC AGC ACG 784Gly Ala Ser Gly Gly Leu Cys Thr Leu Ile Tyr Ser ThrGAG CTG AAG GCT TTG CAG GCC ACA CAC ACT GTA GCC TGT 823Lys Leu Lys Ala Leu Gln Ala Thr Asn Thr Val Ala CysCTT GCC ATC TTT GTC TTG TTG CCA TTG GGT TTG TTT GGA 862Leu Ala Ile Phe Val Leu Leu Pro Leu Gly Leu Phe GlyGCC AAG GGG CTG AAG AAG GCA TTG GGT ATG GGG CCA GGC 901Ala Lys Gly Leu Lys Lys Ala Leu Gly Met Gly Phe GlyCCC TGG ATG AAT ATC CTG TGG GCC TGG TTT ATT TTC TGG 940Pro Trp Met Asn Ile Leu Trp Ala Trp Phe Ile Phe TrpTGG CCT CAT GGG GTG GTT CTA GGA CTG GAT TTC CTG GTG 979Trp Pro Asn Gly Val Val Leu Gly Leu Asp Phe Leu ValAGG TCC AAG CTG TTG CTG TTG TCA ACA TGT CTG GCC CAG1018Arg Ser Lys Leu Leu Leu Leu Ser Thr Cys Leu Ala GlnCAG GCT CTG GAC CTG CTG CTG AAC CTG GCA GAA GCC CTG1057Gln Ala Leu Asp Leu Leu Leu Met Leu Ala Glu Ala LeuGCA ATT TTG CAC TGT GTG GCT ACG CCC CTG CTC CTC GCC1096Ala Ile Leu Asn Cys Val Ala Thr Pro Leu Leu Leu AlaCTA TTC TGC CAC CAG GCC ACC CGC ACC CTC TTG CCC TCT 1135Leu Phe Cys Lys Gln Ala Thr Arg Thr Leu Leu Pro SerCTG CCC CTC CCT GAA GGA TGG TCT TCT CAT CTG GAC ACC 1174Leu Pro Leu Pro Glu Gly Trp Ser Ser Asn Leu Asp ThrCTT GGA AGC AAA TCC TAGTTCTCTT CCCACCTGTC AACCTGAATT1219Leu Gly Ser Lys SerAAAGTCTACA CTGCCTTTGT GAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA 1259AAAAAAAA1267(2)SEQ ID No2信息(i)序列特征(A)長度48個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No2CCTCTCTTCC GCTGGCAGCT CTGCCCTGGC TGGCCTGTCC 40TGGCACAG 48(2)SEQ ID No3信息(i)序列特征
(A)長度15個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No3TTCAGCATTG TGGTG(2)SEQ ID No4的信息(i)序列特征(A)長度15個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No4TTTGCCCAGG CTTTG(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度9個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No5GTGGGAATT(2)SEQ ID No6的信息(i)序列特征
(A)長度72個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No6ATGAATATCC TGTGGGCCTG GTTTATTTTC TGGTGGCCTC 40CTCATGGGGT TCTAGGACTG GATTTCCTGG TG 72(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度27個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No7CCCTCTCTGC CCCTCCCTGA AGGATGG(2)SEQ ID No8的信息(i)序列特征(A)長度66個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No8Met Ala Ser Ser Gly Tyr Val Leu Gln Ala Glu Leu Ser Pro Ser5 10 15Thr Glu Asn Ser Ser Gln Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser20 25 30Ser Tyr Gly Val Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Ala35 40 45Asn Leu Glu Ala Ala Ala Pro Cys His Ser Cys Asn Leu Leu Asp50 55 60Asp Ser Ala Leu Pro Phe65(2)SEQ ID No9的信息(i)序列特征(A)長度44個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No9Met Ala Ser Ser Gly Tyr Val Leu Gln Ala Glu Leu Ser Pro Ser5 10 15Thr Glu Asn Ser Ser Gln Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser20 25 30Ser Tyr Gly Val Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Asp35 40(2)SEQ ID No10的信息(i)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No10Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn Ser Ser Gln Leu Asp Phe5 10 15Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr Gly Val Asn Asp Ser Phe Pro20 25 30Asp Gly Asp Tyr Asp35(2)SEQ ID No11的信息(i)序列特征(A)長度22個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No11Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr Gly Val Asn Asp Ser5 l0 15Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Asp20(2)SEQ ID No12的信息(i)序列特征(A)長度22個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No12Ala Asn Leu Glu Ala Ala Ala Pro Cys His Ser Cys Asn Leu Leu5 10 15Asp Asp Ser Ala Leu Pro Phe20(2)SEQ ID No13的信息(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No13Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn Ser Ser Gln Leu5 10(2)SEQ ID No14的信息(i)序列特征(A)長度22個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No14Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn Ser Ser Gln Leu Asp Phe5 10 15Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser20(2)SEQ ID No15的信息(i)序列特征(A)長度328個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No15CCACTCCTGT AACCTGCTGG ATGACTCTGC ACTGCCCTTC40TTCATCCTCA CCAGTGTCCT GGGTATCCTA GCTAGCAGCA80CTGTCCTCTT CATGCTTTTN AGACCTCTCT TCCGCTGGCA 120GCTCTGCCCT GGCTGGCCTG TCCTGGCACA GCTGGCTGTG 160GGCAGTGCCC TCTTCAGCAT TGTGGTGCCC GTTTTGGCCC 200CAGGGCTAGG TAGCACTCGC AGCTCTGCCC TGTGTAGCCT 240GGGCTACTGT GTCTGGTATG GCTCAGCCTT TGNCCAGGCT 280TTGCTGCTAA GGGTGCCATG CCTCCCTGGG NCACAGACTG 320GGTGCAGG 328(2)SEQ ID No16的信息(i)序列特征(A)長度24個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID No16TGGTTTATTT TCTGGTGGCC TCAT
權(quán)利要求
1.分離或合成的編碼gpD蛋白的DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離或合成的DNA，其具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
3.分離或合成的未變性的gpD蛋白。
4.含有SEQ ID No14中所示的氨基酸序列的肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，其含有SEQ ID No8所示的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，其含有SEQ ID No9所示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，其含有SEQ ID No10所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的肽，其含有SEQ ID No14所示的氨基酸序列。
9.用于保護(hù)溫血動物抵抗瘧疾感染的疫苗，其包含對此有效量的權(quán)利要求3的分離或合成gpD蛋白。
10.用于保護(hù)溫血動物抵抗瘧疾感染的疫苗，其包含與生理可接受稀釋劑混合的對此有效量的權(quán)利要求4的肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其中該肽具有SEQ ID No8所示的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其中該肽具有SEQ ID No9所示的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其中該肽具有SEQ ID No10所示的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的疫苗，其中該肽具有SEQ ID No14所示的氨基酸序列。
15.保護(hù)溫血動物免于瘧疾感染的方法，包括給予所述動物對此有效量的權(quán)利要求3的分離或合成gpD蛋白。
16.保護(hù)溫血動物免于瘧疾感染的方法，包括給予所述動物對此有效量的權(quán)利要求4的肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該肽具有SEQ ID No8所示的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該肽具有SEQ ID No9所示的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該肽具有SEQ ID No10所示的氨基酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該肽具有SEQ ID No14所示的氨基酸序列。
全文摘要
分離了gpD蛋白，即Duffy血型抗原系統(tǒng)的主要亞單位。gpD蛋白含有間日瘧原蟲進(jìn)入紅細(xì)胞并引起瘧疾的受體。gpD和人及兔的白細(xì)胞介素-8受體有明顯的序列同源性，因此gpD蛋白有可能是一類新的趨化細(xì)胞因子受體。gpD蛋白cDNA和人海馬cDNA克隆HHCMF86有準(zhǔn)完全同源性，因此，gpD蛋白質(zhì)或一同源蛋白可能以一神經(jīng)肽受體存在于腦中。gpD蛋白存在于所有的紅細(xì)胞祖細(xì)胞中，可能是細(xì)胞增殖和/或分化的受體。gpD蛋白cDNA在人腎中識別大小和骨髓中一樣的mRNA。由于腎不是促紅細(xì)胞生成器官，也沒有成為促紅細(xì)胞生成器官的潛能，這種推定的趨化物受體可能具有必需的腎功能。gpD蛋白在預(yù)防瘧疾和調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成、神經(jīng)和腎功能上有治療價值并可以和生理可接受的稀釋劑結(jié)合產(chǎn)生適于這些目的的治療劑。同gpD蛋白含有受體的部分相應(yīng)的多肽也已被合成。此類多肽有與gpD蛋白相同的治療作用。gpD蛋白和這些多肽還可以用于產(chǎn)生治療劑如抗體、互補(bǔ)多肽等，它們對治療瘧疾及調(diào)節(jié)必需的促紅細(xì)胞生成、神經(jīng)和腎功能也是有用的。
文檔編號A61K39/00GK1133564SQ94193870
公開日1996年10月16日 申請日期1994年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月21日
發(fā)明者A·O·波戈, A·查德利 申請人:紐約血庫公司