專利名稱：高準(zhǔn)確率生物酶血型診斷試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血型血清學(xué)免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)診斷試劑及其制備方法。特別是用木瓜蛋白酶等試劑在制備Rh、Kidd等血型及交叉配血診斷試劑的方法。
背景技術(shù)：
一般人群的血型在以ABO主要血型分類情況下，大多數(shù)同時(shí)并存著Rh血型抗原或血型抗體，由于人群逐漸趨于城市化，醫(yī)療、生育、人口流動(dòng)將使得要進(jìn)行常規(guī)血型實(shí)驗(yàn)和交叉配血實(shí)驗(yàn)的人數(shù)大幅度增加，特別對(duì)Rh血型抗原或血型抗體必須要嚴(yán)格診斷，以保證輸血、婚姻、生育的安全。目前國(guó)外基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究發(fā)達(dá)國(guó)家，對(duì)Rh血型系統(tǒng)的免疫學(xué)診斷方法，已通過醫(yī)療行政部門進(jìn)行立法，成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)、血液中心的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。中國(guó)衛(wèi)生部《中國(guó)輸血技術(shù)操作規(guī)程》和《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(97版)，也明確將開展血型免疫學(xué)試驗(yàn)作為三甲醫(yī)院輸血科、血庫(kù)驗(yàn)收內(nèi)容之一。特別在一九九九年，國(guó)家衛(wèi)生部又下文國(guó)內(nèi)省、市各大醫(yī)院要對(duì)患者的Rh血型系統(tǒng)免疫反應(yīng)進(jìn)行診斷，以杜絕醫(yī)療事故出現(xiàn)。
但我國(guó)在Rh血型系統(tǒng)免疫反應(yīng)診斷水平上還落后于國(guó)外一些醫(yī)學(xué)發(fā)達(dá)國(guó)家，以前所做的實(shí)驗(yàn)只是針對(duì)那些特殊患者而做，實(shí)驗(yàn)所采用的方法及試劑全依賴國(guó)外技術(shù)和藥品，不但費(fèi)用高，操作復(fù)雜，而且還伴隨著實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)“假陽(yáng)性”、“假陰性”的現(xiàn)象，極大地影響診斷的準(zhǔn)確性。對(duì)于血型及交叉配血的診斷，目前國(guó)際上普遍使用的間接抗人球蛋白法(IAF法)，對(duì)IgG血型系統(tǒng)的抗D、抗C、抗E、抗c、抗K、抗K血清、抗Lea血清、抗Leb血清以及抗AB型血清所進(jìn)行(血型)抗體特異性鑒定實(shí)驗(yàn)，其準(zhǔn)確率為75％左右，而應(yīng)用國(guó)外進(jìn)口1％木瓜蛋白酶法(1％Pa法)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率為62.5％左右，實(shí)踐證明這兩種血型血清學(xué)免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)試劑還存在著相當(dāng)比例成份的缺陷，還存在著一定導(dǎo)致醫(yī)療事故出現(xiàn)的危險(xiǎn)因素，而Rh血型系統(tǒng)的免疫反應(yīng)在人體內(nèi)部同ABO型血型免疫反應(yīng)同等重要，一旦診斷失誤，將使受血者死亡，終生殘疾，孕婦及新生兒溶血，死胎等事故發(fā)生，這無(wú)疑對(duì)醫(yī)院及受血者會(huì)產(chǎn)生極大的恐懼。
本發(fā)明人宋開泉研究了以我國(guó)南方的特有植物提取的木瓜乳膠進(jìn)行化學(xué)處理和生物處理，發(fā)明了用木瓜蛋白酶制作血型及交叉配血診斷試劑的方法，現(xiàn)已獲得了中國(guó)專利，專利號(hào)99108817.4，用該發(fā)明提供的一種純的木瓜蛋白酶粉，能修飾紅細(xì)胞膜蛋白的抗原，增強(qiáng)Rh、Kidd等血型系統(tǒng)抗原體免疫反應(yīng)，但也破壞部分血型抗原的抗原性，如M、N、Fya、Fyb等血型，故能使血型及交叉配血檢測(cè)一步法和二步法診斷出正確的結(jié)果，該木瓜蛋白酶診斷試劑既能檢測(cè)紅細(xì)胞Rh(D)血型系統(tǒng)或換成抗E、抗C、抗Jka，也能準(zhǔn)確地鑒別出陰性及陽(yáng)性，可以參照國(guó)際輸血學(xué)會(huì)的要求來(lái)控制酶活力，并以酶的酶活力激活力達(dá)到分子級(jí)水平上，從而杜絕醫(yī)療事故的發(fā)生。
但采用木瓜蛋白酶制作血型及交叉配血診斷試劑也存在著一些不足之處，因?yàn)槟竟系鞍酌竵?lái)自于天然植物的提取，因此存在天然酶固有的缺陷，主要表現(xiàn)于各不同廠家的不同批次產(chǎn)品，在進(jìn)行生產(chǎn)過程的分離、純化、反應(yīng)、制劑及應(yīng)用過程中酶活力大小差異，活力不穩(wěn)定，因而反應(yīng)速度不統(tǒng)一，反應(yīng)生成物的濃度也有差別，另外絕大多數(shù)天然酶對(duì)人體來(lái)說(shuō)是異體物質(zhì)，酶的本身具有抗原性，酶作為一種蛋白質(zhì)易于被人的一些蛋白質(zhì)，抑制劑和抗體作用而影響酶的活力發(fā)生變化，這樣也會(huì)影響到反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的真實(shí)結(jié)果，更主要的缺陷是在應(yīng)用木瓜蛋白酶以及其它診斷試劑對(duì)血液紅細(xì)胞膜蛋白表面的水解程度引起抗原的激活而出現(xiàn)非特異性凝集的“假陽(yáng)性”結(jié)果，另一方面，試劑對(duì)添加進(jìn)入實(shí)驗(yàn)時(shí)的血型抗體產(chǎn)生降解而出現(xiàn)“假陰性”的的結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不因?yàn)槊讣霸噭┍旧淼摹凹儭倍玫浇鉀Q，因此當(dāng)前醫(yī)學(xué)血型血清免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)上的“假陽(yáng)性”、“假陰性”是國(guó)際上普遍存在的難題。因此，本發(fā)明人認(rèn)為應(yīng)當(dāng)利用人工的方法改造酶的酶學(xué)性質(zhì)和功能，也就是說(shuō)，其最終的解決辦法是把酶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和穩(wěn)定化并進(jìn)行修飾。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明人在原有采用木瓜蛋白酶制作血型及交叉配血診斷試劑的基礎(chǔ)上，幾年來(lái)又進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)某些蛋白酶抑制劑，對(duì)木瓜蛋白酶有較好的抑制作用，能修飾木瓜蛋白酶的酶活力，增強(qiáng)了木瓜蛋白酶在IgG血型免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)紅細(xì)胞膜蛋白限制性水解的選擇性，突出了對(duì)IgG血型抗體的識(shí)別能力，能真實(shí)地得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而強(qiáng)化了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率。
為了尋找木瓜蛋白酶的抑制劑，本發(fā)明人從多種微生物中反復(fù)篩選，發(fā)現(xiàn)了有一些符合抑制木瓜蛋白酶的酶，這種酶是采用一種新的以放線菌培養(yǎng)濾液分離而獲得的特種蛋白酶抑制劑，它們包括類似鏈霉菌michigaensis菌株MB561、類似鏈霉菌yokosnkaensis菌株MC829等微生物培養(yǎng)得到的生產(chǎn)菌，并經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)液分離的酶產(chǎn)物，這種蛋白酶的抑制劑為一種抗血纖維溶酶，有的醫(yī)藥文獻(xiàn)資料上亦稱為抗痛素。該蛋白酶抑制劑可以對(duì)木瓜蛋白酶的酶活力進(jìn)行化學(xué)修飾，改變酶的酶學(xué)性質(zhì)和功能，使木瓜蛋白酶具選擇性的抑制作用，并消除木瓜蛋白酶內(nèi)具有天然酶的固有抗原及酶活，使得血型及交叉配血診斷試劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。
本發(fā)明的血型及交叉配血診斷試劑包括木瓜蛋白酶粉劑、木瓜蛋白酶稀釋液、酶抑制劑、酶抑制劑稀釋液幾個(gè)組分。
以上所述的木瓜蛋白酶粉是經(jīng)嚴(yán)格工藝制成的木瓜蛋白酶粉劑，采用本發(fā)明人1999年申請(qǐng)的專利方法(專利號(hào)99108817.4)，獲得的純凈木瓜蛋白酶制劑(粉劑)。
以上所述的木瓜蛋白酶稀釋液選用0.1-0.5摩爾濃度的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖溶液(PH6.8-7.8)。
以上所述的酶抑制劑粉選自類似鏈霉菌michigaensis菌株MB561、類似鏈霉菌yokosndaensis菌株MC829等微生物培養(yǎng)得到的擴(kuò)大菌，并經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)液分離的酶產(chǎn)物。
以上所述的酶抑制劑稀釋液也選自0.1-0.5摩爾濃度的磷酸鹽或醋酸鹽緩沖溶液(PH6.8-7.8)。
以上所述的血型及交叉配血診斷試劑根據(jù)需要可做成制劑盒，制劑盒的組成可以按以下組成木瓜蛋白酶粉劑18-35單位/瓶、玻璃瓶密封裝；木瓜蛋白酶稀釋液1-10毫升/瓶、塑料瓶封裝；酶抑制劑(抗血纖維溶酶)粉劑10-100微克/瓶、玻瓶密封裝；酶抑制劑稀釋液1-10毫升/瓶、塑料瓶封裝；出廠時(shí)成套按大盒半打裝(六個(gè)小包裝盒)每一小盒內(nèi)裝，包裝給醫(yī)院或血液中心直接使用，可在5-10℃的冰箱保存，無(wú)須再另外配制。
使用本發(fā)明的血型及交叉配血診斷試劑進(jìn)行Rh、Kidd等血型及交叉配血診斷的方法是在準(zhǔn)備好血樣的同時(shí)，將1-10毫升木瓜蛋白酶稀釋液倒入木瓜蛋白酶粉劑18-35單位/瓶的玻璃瓶?jī)?nèi)，1-10毫升酶抑制劑稀釋液倒入酶抑制劑(抗血纖維溶酶)粉劑內(nèi)，輕輕搖動(dòng)使它們?nèi)咳芙?，先將木瓜溶解稀釋的蛋白酶溶液滴進(jìn)血樣中，經(jīng)孵育5分鐘，然后迅速滴入稀釋的酶抑制劑，反應(yīng)5分鐘后再添加不同血型抗體，即可得到真實(shí)結(jié)果。
以下是本發(fā)明各種試劑的制備方法一、木瓜蛋白酶試劑的制備采用本發(fā)明人宋開泉1999年申請(qǐng)的專利方法(專利號(hào)99108817.4)，獲得的純凈木瓜蛋白酶制劑，這里重復(fù)敘述如下(1)用去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無(wú)機(jī)酸使雜質(zhì)沉淀分離；(2)加入氫氧化鈉或氫氧化鉀、氫氧化鈣中和，并用半透膜滲析脫鹽；(3)去除痕量重金屬；(4)層析和純化；(5)木瓜蛋白酶的洗脫；(6)用超濾膜超濾；(7)低溫真空升華干燥；(8)加隋性氣體或氮?dú)饷芊獗４?。得到的木瓜蛋白酶技術(shù)指標(biāo)為木瓜蛋白酶粉酶活力≥0.7U/50ul；水份≤1-3％(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)≤3％)；無(wú)菌存在。
二、酶抑制劑的制備選用鏈霉菌michigaensis菌株MB561-CZ或者鏈霉菌yokosnkanensis菌株MC829-ASI兩種的任意一種菌種(可以從微生物中心購(gòu)買或自己留種)，先將菌種用活化培養(yǎng)基培養(yǎng)，再擴(kuò)大培養(yǎng)，最后在發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)滅活、純化、濃縮、干燥得成品。
以下詳細(xì)介紹具體工藝過程1、活化培養(yǎng)基培養(yǎng)外購(gòu)回來(lái)由冷藏保存的菌種，在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于低溫休眠的狀態(tài)，據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)獲悉，冷藏超過10天后的一級(jí)種子便生長(zhǎng)緩慢，甚至?xí)绊懓l(fā)酵目的代謝物的正常合成產(chǎn)出，為此使用前必須進(jìn)行活化處置，活化的過程如下
于無(wú)菌接種箱內(nèi)，利用無(wú)菌操作法將經(jīng)冷藏的純凈菌種用移種環(huán)挑取一環(huán)移植到經(jīng)過滅菌處理并冷卻后的試管培養(yǎng)基斜面上，放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，控溫恒定于25-32℃活化培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，且無(wú)雜菌便成為一代活化菌種，由一代活化菌種接著移植到另一支活化培養(yǎng)基斜面上，同樣培養(yǎng)，便產(chǎn)生第二代活化菌種，由二代活化菌種接到同樣活化培養(yǎng)基斜面上同樣培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生第三代活化種子，經(jīng)過一帶或若干代活化后才能用于下一階段培養(yǎng)。
以上所述的活化培養(yǎng)基的選擇可以選用淀粉10-20克、硝酸鉀0.5-1克、磷酸氫二鉀0.8-2克、氯化鈉0.5-1、硫酸鎂0.3-0.8克、硫酸鐵0.01-0.05克、瓊脂15-20克、去離子水1000毫升，并調(diào)節(jié)溶液的PH在7.0-7.5之間。
活化培養(yǎng)基的選擇也可以選用蛋白胨2-10克、葡萄糖3-10克、氯化鈉1-5克、瓊脂10-20克、去離子水1000毫升，PH7.0-7.4。
2、擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)可以采用搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)通常用250-500毫升三角瓶進(jìn)行。三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基50-100毫升或用1000毫升三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基250毫升，經(jīng)滅菌冷卻后在接種箱內(nèi)，采用無(wú)菌操作下，用移種環(huán)挑取一環(huán)活化菌種接入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，搖勻，于搖床室中放入搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)，控溫范圍23——32℃，培養(yǎng)70-72小時(shí)，鏡檢菌種強(qiáng)壯、無(wú)雜菌便可移植于下一階段進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)可視二級(jí)種子的需量而定培養(yǎng)數(shù)量，為減少雜菌侵染機(jī)會(huì)，搖瓶培養(yǎng)不宜用過多的三角瓶培養(yǎng)作二級(jí)培養(yǎng)種子，并要求各瓶經(jīng)搖瓶培養(yǎng)出的一級(jí)種子，經(jīng)挑選后在無(wú)菌室內(nèi)匯集于一接種瓶?jī)?nèi)置于冰箱短期存貯備用，或一移入種子罐中進(jìn)一步培養(yǎng)成生產(chǎn)菌種。
以上所述的液體生產(chǎn)擴(kuò)大培養(yǎng)菌種專用培養(yǎng)基葡萄糖5-20％、酵母膏0.2-0.5％、氯化鈉0.2-0.5％、硫酸鎂0.1-0.3％、磷酸氫二鉀0.1-0.6％、硫酸銅0.0005-0.001％、硫酸鐵0.0005-0.001％、硫酸鋅0.0005-0.003％、氯化鎂0.0005-0.002％。
3、發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵罐發(fā)酵采用肉湯培養(yǎng)基，裝罐量為罐容積五分之三體積，種子用量與培養(yǎng)基之比為液∶種＝50∶1，發(fā)酵罐和培養(yǎng)基經(jīng)嚴(yán)格滅菌、冷卻后，于無(wú)菌操作條件下移入菌種于培養(yǎng)基中，在一定的發(fā)酵溫度和通風(fēng)量條件下開始發(fā)酵。從投種開始的零時(shí)計(jì)起，每2-4小時(shí)采樣進(jìn)行測(cè)定發(fā)酵肉湯的PH值，發(fā)酵生殖期測(cè)量0.005毫升發(fā)酵液中對(duì)番木瓜蛋白酶的抑制力。
具體工藝操作技術(shù)培養(yǎng)基由進(jìn)料管送入發(fā)酵罐內(nèi)后由夾套或通氣通入蒸汽進(jìn)行滅菌、維持清毒蒸汽壓力0.1Mpa、保持壓力30分鐘，然后于夾層套中通入冷水冷卻，待溫度下降到28℃以下時(shí)，再在無(wú)菌條件下將三角瓶種子送入罐內(nèi)，一邊通風(fēng)一邊攪拌，恒溫于28-32℃培養(yǎng)22-28小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，無(wú)雜菌便加入種子罐中培養(yǎng)后即可作為發(fā)酵罐發(fā)酵的生產(chǎn)菌種。
將擴(kuò)大培養(yǎng)菌種送入發(fā)酵罐內(nèi)，一邊通風(fēng)一邊攪拌，恒溫于28-32℃培養(yǎng)22-28小時(shí)，鏡檢合格后，得到發(fā)酵罐發(fā)酵的產(chǎn)物時(shí)，用發(fā)酵液經(jīng)10倍稀釋后對(duì)木瓜蛋白酶活力產(chǎn)生50％抑制力時(shí)即可放罐。
以上所述的發(fā)酵罐發(fā)酵肉湯培養(yǎng)基牛肉膏0.2-1.0％、蛋白胨0.4-0.8％、酵母膏0.1-0.4％、氯化鈉0.2-1.5％、葡萄糖1-3％，去離子水1000毫升，溶液的PH7.0-7.5。
酶抑制劑的實(shí)罐發(fā)酵過程中，各階段的PH值與其對(duì)木瓜蛋白酶產(chǎn)生的抑制力有如下關(guān)系，可從百分比數(shù)據(jù)得知發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)第一天PH7.7抑制力52％第二天PH6.5抑制力87％第三天PH6.5抑制力87％第四天PH8.3抑制力53％第五天PH8.6抑制力12％第六天PH8.5抑制力5％第七天PH8.8抑制力0％所以選擇第二、第三天的發(fā)酵物是最好的。
工藝條件的控制發(fā)酵是生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵階段，其中許多工藝條件直接影響發(fā)酵的成積，除配料和種子的質(zhì)量因素外，控制PH值，發(fā)酵溫度，通風(fēng)量，酵液檢查]等都是發(fā)酵過程中的日常操作。
4、酶抑制劑的滅活、分離及純化(1)得到發(fā)酵罐發(fā)酵的產(chǎn)物后，須先采用高溫進(jìn)行滅活，然后用高速離心機(jī)將發(fā)酵液中的液體及培養(yǎng)基殘留物分離，去除固形物。
(2)將上述滅活、分離的發(fā)酵液體通過陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附，用復(fù)合溶劑進(jìn)行洗提，收集洗脫液，洗提液經(jīng)減真空壓濃縮后回收溶劑，再將濃縮液干燥而獲得酶抑制劑粗品。所述的復(fù)合溶劑采用醇類溶劑如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇二甲亞砜等配置。
(3)純化酶抑制劑，將粗品經(jīng)用復(fù)合溶劑稀釋上CMC-纖維素載體分離柱進(jìn)一步分離純化，洗脫。收集洗脫液。洗脫液真空減壓濃縮，回收溶劑，濃縮液真空低溫冷凍升華干燥得成品，本發(fā)明采用的洗脫劑選用醇類洗脫劑，優(yōu)選甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二甲亞砜。
與現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的血型及交叉配血診斷試劑相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、由木瓜蛋白酶與酶抑制劑組合而成的試劑，經(jīng)過國(guó)家醫(yī)學(xué)有關(guān)權(quán)威部門和多家名醫(yī)院的臨床檢驗(yàn)對(duì)比，表明其實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率高達(dá)100％，而同時(shí)采用間接抗人球蛋白法(IAF法>和純木瓜蛋白酶法，僅為75％左右，說(shuō)明本發(fā)明已經(jīng)達(dá)到了國(guó)內(nèi)外先進(jìn)水平。(在國(guó)內(nèi)首次提出利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)木瓜蛋白酶酶活力參照國(guó)際輸血學(xué)會(huì)(ISBT)、國(guó)際血液標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)血型血清學(xué)蛋白酶應(yīng)用參比標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和穩(wěn)定化。“參”的技術(shù)數(shù)據(jù)要求為精確誤差率≤千萬(wàn)分之一。)2、試劑配備以一種新的放線菌培養(yǎng)濾液分離純化后獲得的蛋白酶抑制劑作為特定的血型血清學(xué)免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作過程中使用木瓜蛋白酶時(shí)，待木瓜蛋白酶對(duì)紅細(xì)胞膜表面蛋白進(jìn)行限制性水解，加入酶抑制劑快速、完全抑制木瓜蛋白酶活力，防止木瓜蛋白酶對(duì)紅細(xì)胞膜蛋白的過度水解而激活T抗原，導(dǎo)致產(chǎn)生“假陽(yáng)性”結(jié)果，又可防止木瓜蛋白酶的固有抗原對(duì)血型抗原，抗體的干擾而產(chǎn)生酶對(duì)血型抗體的降解出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果。本發(fā)明人在認(rèn)真研究當(dāng)前通用的血型血清學(xué)免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作方法及規(guī)程中，首先提出了“木瓜蛋白酶對(duì)血液紅細(xì)胞蛋白的表面限制性水解”的理論研究課題，以求徹底解決免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程中的“假陽(yáng)性”、“假陰性”的醫(yī)學(xué)難題。實(shí)踐證明這一木瓜蛋白酶在血型血清學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)的限制性修飾后，能對(duì)IgG血型抗體的識(shí)別能力增強(qiáng)，強(qiáng)化了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率。這種新型血型試劑盒，目前在國(guó)際血型診斷規(guī)程中前所未有，也未見有文獻(xiàn)資料所報(bào)導(dǎo)。
3、該血型及交叉配血診斷試劑生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單，成本較低。
以下是本發(fā)明進(jìn)行血液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所進(jìn)行實(shí)驗(yàn))紅細(xì)胞血型檢測(cè)抗體鑒定實(shí)驗(yàn)一、方法用紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞為指示細(xì)胞，采用室溫鹽水實(shí)驗(yàn)方法(20℃NS法)、37度鹽水實(shí)驗(yàn)方法(37℃NS法)、1％木瓜蛋白酶實(shí)驗(yàn)方法(1％Pa法)、木瓜蛋白酶一抗痛素實(shí)驗(yàn)方法(P-a法)、間接抗人球蛋白清實(shí)驗(yàn)方法(IAT法)，對(duì)IgG抗D、抗C、抗E、抗c、抗K、抗k血清，抗Lea血清、抗Leb血清以及AB型血清進(jìn)行(血型)抗體特異性鑒定實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果如下(1)AB型血清在平行實(shí)驗(yàn)中均未對(duì)紅血胞血型譜細(xì)胞產(chǎn)生凝集與溶血反應(yīng)。結(jié)果提示受檢AB型血清無(wú)意外性抗體，可作為木瓜蛋白酶-抗痛素試劑盒相應(yīng)實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照血清。
(2)P-a法在相應(yīng)血型抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞中準(zhǔn)確鑒定出8種抗血清(血型)抗體特異性，無(wú)假陽(yáng)性反應(yīng)與溶血反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率為100％。
(3)IAT法在紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞中對(duì)抗體的鑒定結(jié)果如下●在已知相應(yīng)血型抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞中鑒定出Ig6抗D、抗C、抗E、抗c、抗K、抗k等6種抗血清(血型)抗體特異性。
●已知血型抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞中未能鑒定出抗Lea血清(血型)抗體特異性一產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
●在已知血型抗原陽(yáng)性R1R1 B4109 R1wR1 B4010 R2R2 C941紅細(xì)胞中，顯示出抗Leb血清(血型)抗體特異性，在已知血型抗原陽(yáng)性r’r E429 R1rR1026 Ror D382紅細(xì)胞中未能顯示出抗Leb血清(血型)抗體特異性，鑒定過程中出現(xiàn)部分漏檢一產(chǎn)生假陰性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率為75％。
(4)1％Pa法在紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞中對(duì)抗體的鑒定結(jié)果如下●在已知相應(yīng)血型抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞中鑒定出IgG抗D、抗C、抗E、抗c、抗K、等5種抗血清(血型)抗體特異性。
●在已知相應(yīng)血型抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞中未能鑒定出抗k血清(血型)抗體特異性一產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
●在抗Leb血清抗體鑒定實(shí)驗(yàn)過程中，全部受試紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞出現(xiàn)非特異性凝集一產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
●在抗Leb血清抗體鑒定實(shí)驗(yàn)過程中，全部受試紅細(xì)胞血型譜細(xì)胞出現(xiàn)非特異性凝集一產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率為62.5％。
(5)20℃NS法實(shí)驗(yàn)結(jié)果、37℃NS法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與血型血清學(xué)文獻(xiàn)記載相符，結(jié)果屬正常范圍。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒及其給出的抗體鑒定實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，對(duì)抗體性質(zhì)鑒定能力較強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度較高，對(duì)弱抗體檢出率優(yōu)良。可作為IgG抗體篩檢實(shí)驗(yàn)、鑒定實(shí)驗(yàn)首選方法。
二、抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)抗體鑒定合格的8種抗血清，平行采用木瓜蛋白酶一抗痛素實(shí)驗(yàn)方法(P-a法)、間接抗人球蛋白血清實(shí)驗(yàn)方法(IAT法)，進(jìn)行抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果在被滴定的8種抗血清中，P-a法抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果中6例高于IAT法滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，2例與IAT法滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果持平。未出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)與溶血反應(yīng)。
抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒及其抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，操作過程簡(jiǎn)單，靈敏度較高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示過程符合量化反應(yīng)規(guī)律，可取代IAT法，用于敏感血型抗體效價(jià)鑒定實(shí)驗(yàn)。
三、lgG血型抗體鑒定實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶一抗痛素實(shí)驗(yàn)方法(P-a法)與間接人球蛋白血清實(shí)驗(yàn)方法(IAT法)，對(duì)來(lái)我所進(jìn)行體檢孕婦血清進(jìn)行IgG血型抗體鑒定實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩種實(shí)驗(yàn)方法一致檢出IgG抗A4例、IgG抗B4例。在實(shí)驗(yàn)中同步進(jìn)行的IgG抗A(B)效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒及其IgG抗A(B)鑒定實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，檢定靈敏度高于間接抗人球蛋白血清實(shí)驗(yàn)方法，無(wú)假陽(yáng)性反應(yīng)與溶血反應(yīng)。
四輸血相容性實(shí)驗(yàn)采用室溫鹽水配血實(shí)驗(yàn)方法，木瓜蛋白酶一抗痛素配血實(shí)驗(yàn)方法(P-a法)，間接抗人體球蛋白血清配血實(shí)驗(yàn)方法(IAT)，對(duì)取自四川省第二人民醫(yī)院住院患者血樣，模似臨床輸血前ABO同型輸血相容性實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果顯示P-a法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與IAT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，未出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)與溶血反應(yīng)。
在輸血醫(yī)學(xué)中，對(duì)輸血安全威脅最大的是由免疫性抗體引發(fā)的輸血事故。常規(guī)ABO同型室溫鹽水配血實(shí)驗(yàn)，不能檢測(cè)出由免疫性抗體導(dǎo)致的紅細(xì)胞免疫反應(yīng)。而P-a法、IAT法均為檢測(cè)血者與供血者之間有無(wú)免疫性抗體導(dǎo)致的紅細(xì)胞免疫反應(yīng)。
五、紅細(xì)胞RH血型鑒定實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶一抗痛素實(shí)驗(yàn)方法(P-a法)與間接抗人體球蛋白血清實(shí)驗(yàn)方法(IAT法)，隨機(jī)對(duì)來(lái)我所進(jìn)行體檢的血樣進(jìn)行紅細(xì)胞Rh血型鑒定實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果P-a法檢測(cè)結(jié)果與IAT法檢測(cè)結(jié)果一致，未出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)與溶血反應(yīng)。
本單元實(shí)驗(yàn)結(jié)果及抗體鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒及紅細(xì)胞Rh血型鑒定實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，適用于敏感型紅細(xì)胞血型鑒定實(shí)驗(yàn)。
檢定結(jié)論1、木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒檢定實(shí)驗(yàn)過程中，未出現(xiàn)意外性溶血事故，使用安全性測(cè)試合格。
2、木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒產(chǎn)品規(guī)格設(shè)計(jì)及其給定的操作規(guī)程合格，與其它介質(zhì)類試劑相比，檢測(cè)靈敏度較高，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，適用于體外血型血清學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)中抗體篩檢實(shí)驗(yàn)，抗體鑒定實(shí)驗(yàn)、抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)、輸血相容性實(shí)驗(yàn)、敏感型血型鑒定實(shí)驗(yàn)。
3、抗體鑒定實(shí)驗(yàn)與抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該試劑盒及其操作規(guī)程對(duì)免疫性血型抗體的檢定能力呈特異性，對(duì)免疫性血型抗體質(zhì)與量的實(shí)驗(yàn)診斷靈敏度較高，可作為參比試劑，對(duì)相關(guān)血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。
4、該試劑盒提出的木瓜蛋白酶對(duì)紅細(xì)胞的限制性水解、修飾理論嚴(yán)謹(jǐn)合理。以此種理論為主導(dǎo)，比較好的完成了蛋白酶試劑在體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)化酶活力及最佳實(shí)驗(yàn)條件的多學(xué)科基礎(chǔ)論研究與實(shí)驗(yàn)過程化控制研究，符合國(guó)際血庫(kù)試劑的研究發(fā)展方向。
5、抗體鑒定平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1％木瓜蛋白酶試劑及實(shí)驗(yàn)方法，由于試劑中酶活力無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)過程中不規(guī)則的反應(yīng)方向，已屬淘汰類試劑。待木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒完成臨床試用考核，申報(bào)新藥證書，正式投產(chǎn)后，可高水平的替代1％木瓜蛋白酶試劑，提高使用蛋白酶試劑進(jìn)行體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷的準(zhǔn)確率。
6、木瓜蛋白酶一抗痛素試劑盒的應(yīng)用前景良好，除在體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷使用外，還可用于免疫性疾病快速鑒別實(shí)驗(yàn)診斷，對(duì)提高采血質(zhì)量，強(qiáng)化輸血安全，提高臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷水平是十分有意義的。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一1、木瓜蛋白酶粉制備采用發(fā)明人宋開泉1999年申請(qǐng)的專利方法(專利號(hào)99108817.4)，即(1)用去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無(wú)機(jī)酸使雜質(zhì)沉淀分離；(2)加入氫氧化鈉或氫氧化鉀、氫氧化鈣中和，并用半透膜滲析脫鹽；(3)去除痕量重金屬；(4)層析和純化；(5)木瓜蛋白酶的洗脫；(6)用超濾膜超濾；(7)低溫真空升華干燥；(8)加隋性氣體或氮?dú)饷芊獗４?。?jīng)檢驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌讣夹g(shù)指標(biāo)達(dá)到酶粉酶活力≥0.7u/50ul；水份≤1-3％(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)≤3％)；無(wú)菌存在。將做好的精制的木瓜蛋白酶粉精確稱量20單位，置于消毒后的玻瓶中，封口、標(biāo)明名稱、批號(hào)有效期等。
2、酶抑制劑制備選用鏈霉菌michigaensis菌株MB561-CZ，于無(wú)菌接種箱內(nèi)，利用無(wú)菌操作法將經(jīng)冷藏的純凈菌種用移種環(huán)挑取一環(huán)移植到經(jīng)過滅菌處理并冷卻后的試管培養(yǎng)基斜面上，放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，試管培養(yǎng)基的組成為淀粉10-20克、硝酸鉀0.5-1克、磷酸氫二鉀0.8-2克、氯化鈉0.5-1、硫酸鎂0.3-0.8克、硫酸鐵0.01-0.05克、瓊脂15-20克、去離子水1000毫升，并調(diào)節(jié)溶液的PH在7.0-7.5之間，控溫恒定于25-32℃活化培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，且無(wú)雜菌便成為一代活化菌種，經(jīng)三代培養(yǎng)，再采用搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)通常用250-500毫升三角瓶進(jìn)行。三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基50-100毫升或用1000毫升三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基250毫升，培養(yǎng)基的成分和含量為葡萄糖5-20％、酵母膏0.2-0.5％、氯化鈉0.2-0.5％、硫酸鎂0.1-0.3％、磷酸氫二鉀0.1-0.6％、硫酸銅0.0005-0.001％、硫酸鐵0.0005-0.001％、硫酸鋅0.0005-0.003％、氯化鎂0.0005-0.002％。經(jīng)滅菌冷卻后在接種箱內(nèi)，采用無(wú)菌操作下，用移種環(huán)挑取一環(huán)活化菌種接入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，搖勻，于搖床室中放入搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)，控溫范圍23-32℃，培養(yǎng)70-72小時(shí)，經(jīng)鏡檢菌種強(qiáng)壯、無(wú)雜菌，備用，同時(shí)將培養(yǎng)基牛肉膏0.2-1.0％、蛋白胨0.4-0.8％、酵母膏0.1-0.4％、氯化鈉0.2-1.5％、葡萄糖1-3％，去離子水1000毫升，溶液的PH7.0-7.5由進(jìn)料管送入種子罐內(nèi)后由夾套或通氣通入蒸汽進(jìn)行滅菌、維持清毒蒸汽壓力0.1Mpa、保持壓力30分鐘，然后于夾層套中通入冷水冷卻，待溫度下降到28℃以下時(shí)，再在無(wú)菌條件下將三角瓶種子送入罐內(nèi)，一邊通風(fēng)一邊攪拌，恒溫于28-32℃培養(yǎng)22-28小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，無(wú)雜菌便可作為發(fā)酵罐發(fā)酵的生產(chǎn)菌種。
3、生產(chǎn)菌種經(jīng)大罐操作得到發(fā)酵罐發(fā)酵的產(chǎn)物后，須先采用高溫進(jìn)行滅活，然后用高速離心機(jī)將發(fā)酵液中的液體及培養(yǎng)基殘留物分離，去除固形物。再將上述滅活、分離的發(fā)酵液體通過陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附，用洗脫劑甲醇或者乙醇、丙醇、丁醇二甲亞砜進(jìn)行洗提，收集洗脫液，洗提液經(jīng)減真空壓濃縮后回收溶劑，再將濃縮液干燥而獲得酶抑制劑粗品。純化酶抑制劑，將粗品經(jīng)用洗脫劑甲醇或者乙醇、丙醇、丁醇二甲亞砜進(jìn)行洗提稀釋上CMC—纖維素載體分離柱進(jìn)一步分離純化，洗脫。收集洗脫液。洗脫液真空減壓濃縮，回收溶劑，濃縮液真空低溫冷凍升華干燥得成品。
4、分裝試劑，將上述制備達(dá)到的木瓜蛋白酶粉劑按30單位/瓶、玻璃瓶密封裝；木瓜蛋白酶稀釋液5毫升/瓶、塑料瓶封裝；酶抑制劑(抗血纖維溶酶)粉劑50微克/瓶、玻瓶密封裝；酶抑制劑稀釋液5毫升/瓶、塑料瓶封裝；出廠時(shí)成套按大盒半打裝(六個(gè)小包裝盒)每一小盒內(nèi)裝，包裝給醫(yī)院或血液中心直接使用，可在5-10℃的冰箱保存，無(wú)須再另外配制。每一份可以做15個(gè)血樣。
實(shí)施例二1、木瓜蛋白酶粉制備采用發(fā)明人宋開泉1999年申請(qǐng)的專利方法(專利號(hào)99108817.4)，即(1)用去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無(wú)機(jī)酸使雜質(zhì)沉淀分離；(2)加入氫氧化鈉或氫氧化鉀、氫氧化鈣中和，并用半透膜滲析脫鹽；(3)去除痕量重金屬；(4)層析和純化；(5)木瓜蛋白酶的洗脫；(6)用超濾膜超濾；(7)低溫真空升華干燥；(8)加隋性氣體或氮?dú)饷芊獗４?。?jīng)檢驗(yàn)?zāi)竟系鞍酌讣夹g(shù)指標(biāo)達(dá)到酶粉酶活力≥0.7u/50ul；水份≤1-3％(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)≤3％)；無(wú)菌存在。將做好的精制的木瓜蛋白酶粉精確稱量20單位，置于消毒后的玻瓶中，封口、標(biāo)明名稱、批號(hào)有效期等。
2、酶抑制劑制備選用鏈霉菌yokosnkanensis菌株MC829-ASI，于無(wú)菌接種箱內(nèi)，利用無(wú)菌操作法將經(jīng)冷床的純凈菌種用移種環(huán)挑取一環(huán)移植到經(jīng)過滅菌處理并冷卻后的試管培養(yǎng)基斜面上，放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，試管培養(yǎng)基的組成為蛋白胨2-10克、葡萄糖3-10克、氯化鈉1-5克、瓊脂10-20克、去離子水1000毫升，PH7.0-7.4之間，控溫恒定于25-32℃活化培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，且無(wú)雜菌便成為一代活化菌種，經(jīng)四代培養(yǎng)，再采用搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)通常用250-500毫升三角瓶進(jìn)行。三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基50-100毫升或用1000毫升三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基250毫升，培養(yǎng)基的成分和含量為葡萄糖5-20％、酵母膏0.2-0.5％、氯化鈉0.2-0.5％、硫酸鎂0.1-0.3％、磷酸氫二鉀0.1-0.6％、硫酸銅0.0005-0.001％、硫酸鐵0.0005-0.001％、硫酸鋅0.0005-0.003％、氯化鎂0.0005-0.002％。經(jīng)滅菌冷卻后在接種箱內(nèi)，采用無(wú)菌操作下，用移種環(huán)挑取一環(huán)活化菌種接入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，搖勻，于搖床室中放入搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)，控溫范圍23-32℃，培養(yǎng)70-72小時(shí)，經(jīng)鏡檢菌種強(qiáng)壯、無(wú)雜菌，備用，同時(shí)將培養(yǎng)基牛肉膏0.2-1.0％、蛋白胨0.4-0.8％、酵母膏0.1-0.4％、氯化鈉0.2-1.5％、葡萄糖1-3％，去離子水1000毫升，溶液的PH7.0-7.5由進(jìn)料管送入種子罐內(nèi)后由夾套或通氣通入蒸汽進(jìn)行滅菌、維持清毒蒸汽壓力0.1Mpa、保持壓力30分鐘，然后于夾層套中通入冷水冷卻，待溫度下降到28℃以下時(shí)，再在無(wú)菌條件下將三角瓶種子送入罐內(nèi)，一邊通風(fēng)一邊攪拌，恒溫于28-32℃培養(yǎng)22-28小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，無(wú)雜菌便可作為發(fā)酵罐發(fā)酵的生產(chǎn)菌種。
3、由發(fā)酵罐培養(yǎng)得到發(fā)酵罐發(fā)酵的產(chǎn)物后，須先采用高溫進(jìn)行滅活，然后用高速離心機(jī)將發(fā)酵液中的液體及培養(yǎng)基殘留物分離，去除固形物。再將上述滅活、分離的發(fā)酵液體通過陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附，用洗脫劑甲醇或者乙醇、丙醇、丁醇二甲亞砜進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，洗提液經(jīng)減真空壓濃縮后回收溶劑，再將濃縮液干燥而獲得酶抑制劑粗品。純化酶抑制劑，將粗品用洗脫劑甲醇或者乙醇、丙醇、丁醇二甲亞砜進(jìn)行洗脫，上CMC-纖維素載體分離柱進(jìn)一步分離純化，洗脫。收集洗脫液。洗脫液真空減壓濃縮，回收溶劑，濃縮液真空低溫冷凍升華干燥得成品。
4、分裝試劑，將上述制備達(dá)到的木瓜蛋白酶粉劑按20單位/瓶、玻璃瓶密封裝；木瓜蛋白酶稀釋液2毫升/瓶、塑料瓶封裝；酶抑制劑(抗血纖維溶酶)粉劑40微克/瓶、玻瓶密封裝；酶抑制劑稀釋液2毫升/瓶、塑料瓶封裝；出廠時(shí)成套按大盒半打裝(六個(gè)小包裝盒)每一小盒內(nèi)裝，包裝給醫(yī)院或血液中心直接使用，可在5-10℃的冰箱保存，無(wú)須再另外配制。每一份可以做10個(gè)血樣。
權(quán)利要求
1.一種高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于它包括木瓜蛋白酶粉和酶抑制劑、木瓜蛋白酶稀釋液、酶抑制劑稀釋液，所述的木瓜蛋白酶粉是酶活力≥0.7u/50ul的無(wú)菌木瓜蛋白酶精制粉，所述的酶抑制劑包括類似鏈霉菌michigaensis菌株MB561-CZ或者類似鏈霉菌yokosnkanensis菌株MC829-ASI微生物培養(yǎng)得到的擴(kuò)大菌，并經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)液分離的酶產(chǎn)物，所述的木瓜蛋白酶稀釋劑和酶抑制劑稀釋劑選自磷酸鹽或醋酸鹽緩沖溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于磷酸鹽或醋酸鹽緩沖溶液為0.1-0.5摩爾濃度，PH6.8-7.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于將木瓜蛋白酶粉和酶抑制劑、木瓜蛋白酶稀釋劑、酶抑制劑稀釋劑組合后做成試劑盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于酶抑制劑的制備方法是先將鏈霉菌michigaensis菌株MB561-CZ、類似鏈霉菌yokosnkanensis菌株MC829-ASI微生物兩種的任意一種菌種用活化培養(yǎng)基培養(yǎng)，再擴(kuò)大培養(yǎng)，最后在發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)滅活、純化、濃縮、干燥得成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于酶抑制劑用活化培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法是選用鏈霉菌michigaensis菌株MB561-CZ、類似鏈霉菌yokosnkanensis菌株MC829-ASI微生物兩種的任意一種菌種，于無(wú)菌接種箱內(nèi)，利用無(wú)菌操作法將經(jīng)冷藏的純凈菌種移植到經(jīng)過滅菌處理并冷卻后的試管培養(yǎng)基斜面上，放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，試管培養(yǎng)基的組成為淀粉10-20克、硝酸鉀0.5-1克、磷酸氫二鉀0.8-2克、氯化鈉0.5-1、硫酸鎂0.3-0.8克、硫酸鐵0.01-0.05克、瓊脂15-20克、去離子水1000毫升，并調(diào)節(jié)溶液的PH在7.0-7.5之間，控溫恒定于25-32℃活化培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，且無(wú)雜菌便成為一代活化菌種，經(jīng)若干代活化培養(yǎng)得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于擴(kuò)大培養(yǎng)采用搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)通常用250-500毫升三角瓶進(jìn)行，三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基50-100毫升或用1000毫升三角瓶?jī)?nèi)裝液體培養(yǎng)基250毫升，培養(yǎng)基的成分和含量為葡萄糖5-20％、酵母膏0.2-0.5％、氯化鈉0.2-0.5％、硫酸鎂0.1-0.3％、磷酸氫二鉀0.1-0.6％、硫酸銅0.0005-0.001％、硫酸鐵0.0005-0.001％、硫酸鋅0.0005-0.003％、氯化鎂0.0005-0.002％，經(jīng)滅菌冷卻后在接種箱內(nèi)，采用無(wú)菌操作下，將活化菌種接入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，搖勻，于搖床室中放入搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)，控溫范圍23-32℃，培養(yǎng)70-72小時(shí)，經(jīng)鏡檢菌種強(qiáng)壯、無(wú)雜菌，備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于酶抑制劑在發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的方法是將培養(yǎng)基牛肉膏0.2-1.0％、蛋白胨0.4-0.8％、酵母膏0.1-0.4％、氯化鈉0.2-1.5％、葡萄糖1-3％，去離子水1000毫升，溶液的PH7.0-7.5由進(jìn)料管送入發(fā)酵罐內(nèi)后由夾套或通氣通入蒸汽進(jìn)行滅菌、維持消毒蒸汽壓力0.1Mpa、保持壓力30分鐘，冷卻，待溫度下降到28℃以下時(shí)，再在無(wú)菌條件下將三角瓶擴(kuò)大培養(yǎng)的產(chǎn)物送入種子罐內(nèi)，一邊通風(fēng)一邊攪拌，恒溫于28-32℃培養(yǎng)22-28小時(shí)，鏡檢菌體強(qiáng)壯，無(wú)雜菌便可作為發(fā)酵罐發(fā)酵的生產(chǎn)菌種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于酶抑制劑滅活、純化、濃縮、干燥的方法是將得到發(fā)酵罐發(fā)酵的產(chǎn)物后，先采用高溫進(jìn)行滅活，然后用高速離心機(jī)將發(fā)酵液中的液體及培養(yǎng)基殘留物分離，去除固形物，再將上述滅活、分離的發(fā)酵液體通過陽(yáng)離子交換樹脂柱吸附，用醇類洗脫劑洗脫，收集洗脫液，洗提液經(jīng)減真空壓濃縮后回收溶劑，再將濃縮液干燥而獲得酶抑制劑粗品，再將粗品經(jīng)用醇類洗脫劑洗脫，稀釋上CMC—纖維素載體分離柱進(jìn)一步分離純化，洗脫，收集洗脫液，洗脫液真空減壓濃縮，回收溶劑，濃縮液真空低溫冷凍升華干燥得成品。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，其特征在于木瓜蛋白酶粉的制備方法包括以下幾個(gè)步驟(1)用去離子水沖稀或溶解木瓜膠乳，加入無(wú)機(jī)酸使雜質(zhì)沉淀分離；(2)加入氫氧化鈉或氫氧化鉀、氫氧化鈣中和，并用半透膜滲析脫鹽；(3)去除痕量重金屬；(4)層析和純化；(5)木瓜蛋白酶的洗脫；(6)用超濾膜超濾；(7)低溫真空升華干燥；(8)加隋性氣體或氮?dú)饷芊獗４妗?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種血型血清學(xué)免疫反應(yīng)高準(zhǔn)確率血型診斷試劑，特別是Rh、Kidd等血型及交叉配血的診斷試劑及其制備方法，它包括木瓜蛋白酶粉和酶抑制劑、木瓜蛋白酶稀釋液、酶抑制劑稀釋液，其制備方法是先將鏈霉菌用活化培養(yǎng)基培養(yǎng)，再擴(kuò)大培養(yǎng)，最后在發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)滅活、純化、濃縮、干燥得成品，該診斷試劑與其它介質(zhì)類試劑相比，具有檢測(cè)靈敏度較高，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法簡(jiǎn)單，血型及交叉配血診斷試劑結(jié)果真實(shí)可靠的特點(diǎn)，適用于體外血型血清學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)中抗體篩檢實(shí)驗(yàn)，抗體鑒定實(shí)驗(yàn)、抗體效價(jià)滴定實(shí)驗(yàn)、輸血相容性實(shí)驗(yàn)、敏感型血型鑒定實(shí)驗(yàn)。
文檔編號(hào)G01N33/80GK1525174SQ0311878
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2003年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者宋開泉, 彭德玄 申請(qǐng)人:宋開泉