專利名稱：葡糖胺二糖類、其制備方法和用途、以及含有這些二糖的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特定的葡糖胺二糖類，特別是涉及2-N-和/或2’-N-酰化葡糖胺二糖類(其中至少一個(gè)?；侵ф湹?和包含這些二糖的化合物。本發(fā)明還涉及從包含脂多糖脂質(zhì)A部分的起始物質(zhì)出發(fā)對(duì)其進(jìn)行特定的堿處理來制備這些二糖的方法。本發(fā)明也涉及以這些二糖為活性成分的藥物組合物。此外本發(fā)明還涉及這些二糖在治療和預(yù)防方面的用途。
脂多糖構(gòu)成微生物(例如革蘭氏陰性菌)的內(nèi)毒素，并包括一種多糖組分和一種脂質(zhì)組分。這一脂質(zhì)組分(也稱為脂質(zhì)A)決定脂多糖的內(nèi)毒性特性(Rietschel E.Th.et al.，Immuno-biology，Volume 186，Pages 169-190〔1993〕)。
US-A-4,912,094中公開了一些修飾脂多糖，所述脂多糖在保持其抗原性質(zhì)和免疫刺激性質(zhì)的同時(shí)表現(xiàn)出降低的內(nèi)毒性。這些修飾脂多糖是3-O-脫?；?，并經(jīng)酸水解可以轉(zhuǎn)化成3-O-脫酰化二糖。在這些化合物中，一磷?；?-O-脫?；潜榷柞；?-O-脫酰化二糖毒性要低。
本發(fā)明涉及二糖類，這些二糖是3-O-脫酰化的和3’-O-脫?；幕蛘咴?-O-位和/或3’-O-位具有一個(gè)短的O-連烷基或酰基，并且在2位、2’位、或2位和2’位兩者上至少具有一個(gè)N-連支鏈?；＿@些化合物在保持生物學(xué)活性(例如免疫調(diào)節(jié)作用)的同時(shí)表現(xiàn)出更低的內(nèi)毒性，并且具有抗癌活性。
令人驚奇地是，這些特定的葡糖胺二糖集較低的內(nèi)毒性和保持的生物學(xué)活性于一體，因?yàn)楸M管在2和2’位具有N-連?；暮铣?-O-和3’-O-脫?；咸前范穷?化合物307，Takada，H.et al.，CRC Critical Reviews in Microbiology，Volume16，Pages 477-523〔1989〕；和化合物L(fēng)A-19-PP，Rietschelet al.，〔1993〕)在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出某些免疫生物學(xué)活性，但這些活性比參照的細(xì)菌脂質(zhì)A樣品的活性弱得多。它們也缺乏典型的內(nèi)毒活性。
因此，本發(fā)明涉及具有以下通式的β(1→6)葡糖胺＝糖和其鹽， 其中R1是羥基、二羥膦酰氧基或其荷電形式、(C1-C5)酰氧基、(C1-C5)烷氧基、或者基團(tuán)X；R2和R2’各自為?；蚧鶊F(tuán)Y，其條件是至少R2或R2’是基團(tuán)Y；R3和R3’各自為氫原子，(C1-C3)烷基或(C1-C3)?；籖4是氫原子、(C1-C3)烷基或(C1-C3)酰基；R4’是氫原子、(C1-C5)酰基、(C1-C5)烷基、二甲氧膦?；⒒蛘哽Ⅴ；蚱浜呻娦问?；且R6’是氫原子、羥基、二羥膦酰氧基、羥磺酰氧基、它們的荷電形式、或者基團(tuán)Z；其中所述的基團(tuán)X選自由以下基團(tuán)組成的組羧基(C1-C5)烷氧基、-O-CH-〔(CH2)mCOOH〕〔(CH2)nCOOH〕基(其中m＝0-5，n＝0-5)、膦酰(C1-C5)烷基、二甲氧膦酰氧基、羥磺酰氧基、羥磺酰(C1-C5)烷基、和基團(tuán)X的荷電形式；其中所述的基團(tuán)Y選自由下列基團(tuán)組成的組酰氧?；?、酰氨酰基、酰硫?；?、(C1-C24)烷氧?；?C1-C24)烷氨?；?、(C1-C24)烷硫酰基；且其中所述的基團(tuán)Z選自由下列基團(tuán)組成的組(C1-C24)烷氧基、(C1-C24)酰氧基、3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)、(KDO)n(其中n＝1-10)、多糖側(cè)鏈(例如來源于天然脂多糖的側(cè)鏈)、核心組分(例如來源于天然脂多糖的組分)、和氨基-(C1-C8)烷基-羧基。
在鱟阿米巴樣細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(LAL)試驗(yàn)中測(cè)定時(shí)，這些葡糖胺二糖表現(xiàn)出比得自例如大腸桿菌的脂多糖(LPS)、按照US-A-4,912,094的脂質(zhì)A和修飾脂質(zhì)A低得多的內(nèi)毒性。此外，這些按照本發(fā)明的葡糖胺二糖誘導(dǎo)一氧化氮反應(yīng)性中間體和細(xì)胞因子(例如白細(xì)胞介素1-α(IL1-α)、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)和前列腺素(PGE))的產(chǎn)生。
此外，這些二糖表現(xiàn)出抗腫瘤(例如腹膜癌)活性。
最后，這些二糖的急性毒性非常低。在以每公斤體重100mg二糖靜脈內(nèi)給藥后，沒有觀測(cè)到Swiss小鼠死亡。
本發(fā)明也涉及制備這些葡糖胺二糖的方法，該方法使用得自生物源的起始物質(zhì)，即，任何包含得自微生物(例如革蘭氏陰性菌)的脂多糖的脂質(zhì)A部分的起始物質(zhì)。按照本發(fā)明，對(duì)這一起始物質(zhì)進(jìn)行至少一次堿處理，以除去糖O-連?；?或O-連氧?；?。如果適當(dāng)，可以對(duì)堿處理過的起始物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的處理，以除去多糖和核心組分(經(jīng)酸處理)、改變或交換1位、2位、3位、4位、2’位、3’位、4’位和6’位上的取代基。
然而，按照本發(fā)明的葡糖胺二糖也可以從相應(yīng)的葡糖胺二糖出發(fā)經(jīng)合成在2和/或2’位引于目的取代基來獲得。
由于結(jié)合了極低的內(nèi)毒性以及以上所述的生物學(xué)活性，這些按照本發(fā)明的二糖構(gòu)成了藥物組合物的出色的活性成分。這種藥物組合物和二糖本身可以用作免疫調(diào)節(jié)劑、抗腫瘤劑和疫苗組分。
按照本發(fā)明的葡糖胺二糖(一種β(1→6)D-葡糖胺二聚體)的特征是每一個(gè)葡糖胺有3和3’位上都含有羥基或基本上不改變內(nèi)毒性和/或生物學(xué)活性的短的O-連烷基或?；⑶以?或2’位或者2和2’位兩者上具有至少一個(gè)N-連支鏈?；?。剩下的2’或2位是N-?；摹？赡茉?位和2’位上的兩個(gè)疏水鏈(其中至少一個(gè)以支鏈?；问?的存在使所述二糖集極低的內(nèi)毒性和保持生物學(xué)活性于一體。
支鏈?；?本文總稱為基團(tuán)Y)選自由酰氧酰基、酰氨酰基、酰硫酰基、(C1-C24)烷氧酰基、(C1-C24)烷氨基和(C1-C24)烷硫酰基組成的組。
在酰氧?；那闆r下，兩個(gè)?；?jīng)氧原子連接，在酰氨酰基的情況F經(jīng)NH基連接，在酰硫?；那闆r下經(jīng)硫原子連接?；鶊F(tuán)Y的其它成員(C1-C24)烷氧?；?C1-C24)烷氨?；?C1-C24)烷硫酰基可以從相應(yīng)的羥基脂肪酸獲得。
優(yōu)選地，基團(tuán)Y代表一種在其3位有支鏈的N-連?；?，例如3-酰氧酰基、3-酰氨?；?-酰硫?；?。以上提及的(C1-C24)烷基等同物與之相同。
基團(tuán)Y的優(yōu)選成員包含一個(gè)或兩個(gè)?；糠?，優(yōu)選地選自脂肪酸殘基、羥基脂肪酸殘基和氧代脂肪酸殘基。當(dāng)酰氧?；?-酰氧?；鶗r(shí)，這些?；糠职?-羥基脂肪酸殘基或由酯鍵連接的基團(tuán)3-氧代脂肪酸殘基。酰氧?；牡湫偷睦邮窃?-羥基位與(C1-C24)羧酸經(jīng)酯鍵連接的3-羥基(C1-C24)脂肪酸?；?yōu)選的酰氧酰基是在3-羥基位與(C10-C18)脂肪酸經(jīng)酯鏈連接的3-羥基(C8-C18)脂肪酸?；＿@些酰氧?；嬖谟诟锾m氏陰性菌的脂質(zhì)A中，所述的革蘭氏陰性菌例如為大腸桿菌、流感嗜血桿菌、Campylobacter jejuni.Rhodocyclusgelatinosus、紫色桿菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、明尼蘇達(dá)沙門氏菌。
在按照本發(fā)明的第一組優(yōu)選的葡糖胺二糖中，酰氧?；窃?羥基位經(jīng)酯鍵與C12脂肪酸連接的N-連3-羥基C14脂肪酸酰基，這一酰氧?；?’位上。在按照本發(fā)明的另一優(yōu)選的葡糖胺二糖中，酰氧?；窃?-羥基位經(jīng)酯鍵與C14脂肪酸連接的N-連3羥基C14脂肪酸?；?，該酰氧?；鶅?yōu)選地在2’位上。
在按照本發(fā)明的另一優(yōu)選的葡糖胺二糖中，酰氧酰基是在3-羥基位經(jīng)酯鍵與C12脂肪酸連接的N-連3-羥基C14脂肪酸?；?，這一酰氧?；?位上。在按照本發(fā)明的另一優(yōu)選的葡糖胺二糖中，酰氧酰基是在3-羥基位經(jīng)酯鍵與C12脂肪酸連接的N-連3-羥基C14脂肪酸?；?，該酰氧酰基在2位和2’位兩者上。
當(dāng)基團(tuán)Y含有手性中心時(shí)，本發(fā)明包括所有的R和S對(duì)映體以及任何外消旋混合物。
其它N-連取代基可以是?；蛘咭部梢允酋Ｑ貂；?。按第二組本發(fā)明的二糖，?；?-羥基(C4-C24)脂肪酸，優(yōu)選地是3-羥基(C10-C18)脂肪酸。在本發(fā)明的優(yōu)選的二糖中，?；?-羥基C14脂肪酸，該?；?位或2’位上。
然而，N連取代基也可以是以上定義的酰氧?；?，且包括在3-羥基位經(jīng)酯鍵與(C1-C20)羧酸連接的N連3-羥基(C4-C24)脂肪酸酰基，優(yōu)選在3-羥基位經(jīng)酯鍵與(C10-C18)脂肪酸連接的N-連3-羥基(C8-C18)脂肪酸?；?。更優(yōu)選的二糖是其中R2是在3-羥基位經(jīng)酯鍵與C12脂肪酸或C16脂肪酸連接的N連3-羥基C14脂肪酸?；移渲蠷2’是在3-羥基位經(jīng)酯鍵與C12脂肪酸或C14脂肪酸連接的N連3-羥基C14脂肪酸?；?br> 注意在基團(tuán)Y中，酰基和/或?；屯榛梢曰ミB。
在本說明書中，“脂肪酸殘基”意指C2-C30個(gè)原子的基本上疏水的鏈，該鏈可以是直鏈的、支鏈的、飽和的、單或多不飽和的，具有插入其中的一個(gè)或多個(gè)朵原子(例如氮、氧、硫)，倘若對(duì)生物學(xué)活性基本上無不利的影響，該鏈可以是由一個(gè)或多個(gè)取代基(例如羥基、氧代、酰氧基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、鹵素、巰基)取代的。Onozuka，K.等在Int.J.ImmunopHarmac，Vol15，Pages 657-664〔1993〕中公開了取代的脂肪酸的一個(gè)例子(包含酰胺鍵連接的取代基)。
倘若葡糖胺二糖的性質(zhì)不受不利影響，取代基R1可以是(C1-C5)酰氧基或(C1-C5)烷氧基，而R4’可以是(C1-C5)?；?C1-C5)烷基。此外，R1可以是羥基，且R4’可以是氫原子。優(yōu)選地，R1和R4’各自可以是含磷的基團(tuán)。特別是在1位和4’位的這種基團(tuán)可以影響生物學(xué)活性，例如對(duì)細(xì)胞因子的不同的刺激作用(參見Takada，H.，and Kotani，S.，Bacterial EndotoxicLipopoly-saccharides，Morrison，D.C.and Ryan，J.，CRC Press，Volumel，pages 107-134〔1992〕，具體地說在123頁上)。按照本發(fā)明的優(yōu)選的二糖含有在1位上的二羥基膦酰氧基和在4’位的膦?；?，1位上的該基團(tuán)優(yōu)選地是α-構(gòu)型。
取代基R1也可以由基團(tuán)X代表?；鶊F(tuán)X在生理PH下一般帶負(fù)電荷?；鶊F(tuán)X可以是羧(C1-C5)烷氧基?；鶊F(tuán)X也可以是具有通式-O-CH-〔(CH2)mCOOH〕〔(CH2)nCOOH〕(其中m＝0-10，且n＝0-10，例如m和n＝0；m和n＝1；m＝1，n＝3)的二羧酸。Onozuka等(1993)公開了其中m和n＝1的在1位的二羧酸取代基。基團(tuán)X可以不是二羧酸而是膦酰(C1-C5)烷基，例如膦酰甲基或膦酰乙基。
取代基X也可以具有硫酸酯基團(tuán)或羥基磺酰(C1-C5)烷基(例如羥基磺酰甲基)形式。
取代基R3和R3’可以是短的烷基或?；?，該基團(tuán)對(duì)按照本發(fā)明的葡糖糖胺二糖的內(nèi)毒性和/或生物學(xué)活性無不利影響。它們的例子是(C1-C3)烷基和(C1-C3)?；?yōu)選地，取代基R3和R3’兩者都是氫原子，這意味著3位和3’位是非?；摹?br> 在4位上的取代基R4可以是(C1-C3)烷基或(C1-C3)?；?其含義以上已說明過)?？梢允褂肒usumoto S.等在ACSSymposium Series 231卷237-254頁(1983)上公開的方法合成4-O-?；恰Ｈ欢?，4位上羥基(R4＝OH)是優(yōu)選的。
取代基R6’可以是氫原子、羥基、二羥基膦酰氧基、二羥基磺酰氧基和它們的荷電形式。
為了改善按照本發(fā)明的葡糖胺二糖的水溶性，6’位上的取代基可以具有明顯的親水特性(該特性由基團(tuán)Z賦予)?；鶊F(tuán)Z可以是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)或幾個(gè)KDO分子，例如存在于緊靠脂質(zhì)A組分的天然多糖的內(nèi)核中的所述分子。
基團(tuán)Z也可以是完整的或部分的多糖鏈，例如來源于天然脂多糖的側(cè)鏈，或者來源于天然脂多糖的核心組分。
基團(tuán)Z也可以是氨基-(C1-C8)烷基-羧基。
按照本發(fā)明的二糖的水溶性另一方面由荷電基團(tuán)的存在和6’位上取代基的親水性決定。另一方面，當(dāng)葡糖胺二糖以鹽的形式存在時(shí)，其水溶性也可以得到改善，所述鹽例如，含有一種或多種堿金屬陽離子和/或銨離子(與存在的例如二羥基膦酰氧基、羧酸膦?；?、羥基磺酰氧基和羥基磺酰烷基形成離子對(duì))的鹽。
應(yīng)注意，任何烷基和?；溁虿糠挚梢允侵辨湹?、支鏈的、飽和的、單或多不飽和的，具有插入其中的一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如氮、氧、硫)，并且倘若對(duì)生物學(xué)活性基本上無不利影響，所述鏈可以被一種或多種取代基(例如羥基、氧代、酰氧基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、鹵素、巰基)取代。
按照本發(fā)明的葡糖胺二糖可以從含有存在于微生物(例如革蘭氏陰性菌)中的脂多糖的脂質(zhì)A部分的起始物質(zhì)獲得。這些脂多糖存在于例如這些微生物的包含表面結(jié)構(gòu)的部分中和來源于此的脂多糖中。用作起始物質(zhì)源的優(yōu)選的革蘭氏陰性菌是大腸桿菌和流感嗜血桿菌。然而，市售的LPS或脂質(zhì)A也可以用作起始物質(zhì)。
用堿處理進(jìn)行3位和3’位的選擇性脫?；＿x擇堿處理?xiàng)l件使兩個(gè)葡糖胺都3-羥基脫?；??？梢杂脷溲趸铩⑻妓猁}和磷酸鹽(例如氫氧化鈉或碳酸鉀)進(jìn)行堿處理。作為例子的有機(jī)堿性試劑是烷基胺，如二乙胺和三乙胺。堿處理通常在水或有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行。PH值通常在10-14(例如11-13)范圍內(nèi)，在實(shí)際條件下，PH是例如12.2。堿處理通常在室溫和70℃之間(例如37℃)的溫度下進(jìn)行。時(shí)間長(zhǎng)短取決于起始物質(zhì)的類型。從微生物開始，時(shí)間期限在1小時(shí)和10天之間變化，例如8小時(shí)和5天，但通常在8-40小時(shí)范圍內(nèi)。從脂多糖或脂質(zhì)A開始，時(shí)間期限可以是0.2-10小時(shí)，例如1-5小時(shí)。在實(shí)際中時(shí)間期限是約1.5到3小時(shí)。
當(dāng)起始物質(zhì)在6’位具有待除去的核心組分時(shí)，需對(duì)起始物質(zhì)進(jìn)行酸處理以除去所述核心組分。這一酸處理可以在以上所述堿處理之前或之后進(jìn)行。該酸處理在PH1-5(優(yōu)選地在PH2.5-4.5)范圍內(nèi)進(jìn)行，通常在PH高于3和低于4.5(例如3.5)下進(jìn)行。在PH1或PH1以下時(shí)，葡糖胺二糖脫磷酸化，形成單磷酸化形式?？梢允褂玫乃崾菬o機(jī)和有機(jī)酸，例如鹽酸和冰乙酸。酸處理的時(shí)間長(zhǎng)短為約30分鐘到5小時(shí)，例如1-2小時(shí)。在酸處理期間，溫度升高到約70-100℃，例如80℃-100℃，實(shí)際中為95℃。接著溫度降低至室溫。
按照本發(fā)明的葡糖胺二糖也可以從相應(yīng)的脫一、單一、或二-磷酸化葡糖胺二聚體出發(fā)通過在2位和2’位兩者上連接酰氧?；?、酰氨?；?或酰硫?；@得。
在按照本發(fā)明的這些葡糖胺二糖部分脫酰化和產(chǎn)物分離后，獲得2位或2’位上具有支鏈?；钠咸前范?。
按照本發(fā)明的葡糖胺二糖可以用于藥物組合物或藥物中，并可用作抑制、刺激或誘導(dǎo)-氧化氮反應(yīng)性中間體和細(xì)胞因子產(chǎn)生之耐受性(tolerisation)(取決于施用頻率和采用的劑量)的免疫調(diào)節(jié)劑，用作抗腫瘤劑、用于例如T-細(xì)胞復(fù)活、用作疫苗組分、用作內(nèi)毒素結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)者和用作白細(xì)胞介素的調(diào)節(jié)物。由于極低的內(nèi)毒性，這些二糖幾乎或基本上無副作用。
按照本發(fā)明的二糖可經(jīng)靜脈注射、皮下注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉注射等途徑全身性或局部性使用。劑量隨動(dòng)物或病人年齡、體重、待治療的癥狀或疾病、所需的治療效果、給藥路線、治療期等變化。按每公斤體重0.001到500mg劑量以一次或多次日劑量或持續(xù)釋放形式給藥，會(huì)獲得滿意的效果。
所述藥物組合物可以包含藥學(xué)上可接受的、例如含水或非水溶液、懸浮和乳液適于非口服給藥的載體或稀釋劑。含水溶液或懸浮可以包括蒸餾水或生理鹽水。非水溶液可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、醇類。該組合物可以含有其它添加劑，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑等。
為了更加完整地理解本發(fā)明，提供供參考的下列實(shí)施例，這里提供這些實(shí)施例僅為了說明目的，無意用其限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1在培養(yǎng)基(表1列出了其組成)中培養(yǎng)大腸桿菌I-1147(1991年10月3日以保藏號(hào)I-1147保藏在CNCM)。
表1大腸桿菌I-1147培養(yǎng)基(溶解在水中)的組成物質(zhì) 量/L肌苷 0.200g檸檬酸單水合物 0.300g谷氨酸 1.300gNH4Cl 1.050gMgSO4·7H2O 1.110gKH2PO41.360g精氨酸 0.300g尿嘧啶 0.100gCaCl20.017gNaCl 2.000gOligometals(原液，1000×濃度)1mlL-亮氨酸 10.0gL-賴氨酸·HCl10.0gL-絲氨酸 10.0gL-蛋氨酸 10.0gL-纈氨酸 10.0gL-丙氨酸 10.0gL-天冬酰胺 10.0g葡萄糖(貯液500g/l) 5mlOligometals原液2.5g FeCl2·4H2O、0.25gCoCl2·6H2O、0.25g NaMoO4·7H2O、0.25gMnSO4·4H2O、0.25g ZnSO4·7H2O、0.25g NiSO4·7H2O、0.05g H3BO4、0.05g CuSO4，然后加入1.0L H2O，混合并加入1.1ml H2SO4(85％)。
用5N NaOH、5％氨或25％ HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值。在通氣和攪拌(500rpm)下于37℃和PH6.9下培養(yǎng)大腸桿菌。
接著用熱處理(105℃ 2分鐘)滅活發(fā)酵罐中的物質(zhì)。
對(duì)發(fā)酵罐中的滅活的物質(zhì)進(jìn)行超濾(閾值為1000kD)，用0.6％NaCl水溶液洗滌滯留的細(xì)菌。用超濾濃縮洗滌的細(xì)菌懸液。得生物量264g干重。
將該生物量稀釋成7.0g/l，并經(jīng)加入345ml10.77N NaOH進(jìn)行堿處理，然后在37℃下溫育40小時(shí)(PH12.2)。
將堿抽提物進(jìn)行第一次超濾(閾值1000kD)，對(duì)滲出液進(jìn)行第二次超濾(10kD)。將第二次超濾的滯留物進(jìn)行酸處理。
用7.0l水稀釋滯留物，并用370ml冰乙酸酸化(最終PH3.52)。在攪拌下將混合物在120分鐘內(nèi)加熱到95℃。接著將酸懸液冷卻到25℃。經(jīng)離心(4000×g，50分鐘)分離沉淀。將離心沉淀再懸浮到水(3.7l)中，用異丙醇(4.3l)進(jìn)行抽提，在25℃ F60分鐘后加入252ml三乙胺(PH9.0)，繼續(xù)攪拌24小時(shí)。
經(jīng)離心(4000×g，25℃50分鐘)回收上清液，用異丙醇(90％)再抽提離心沉淀兩次。合并上清液并進(jìn)行反相層析(Waters No.10001，制備型C18，125A)。
也可以將酸處理抽提物進(jìn)行超濾，將滯留物(＞1000KD)濃縮并對(duì)5倍體積水透析。用9倍體積異丙醇稀釋透析滯留物，并用三乙胺(TEA)將PH調(diào)至9。在攪拌下進(jìn)行抽提2小時(shí)。
按以上描述除去上清液，用異丙醇再抽提沉淀。合并上清液并進(jìn)行真空濃縮(40℃ 12托)，最后進(jìn)行C18Prep Sep Pak(Waters No.10001)反相層析。
用兩倍體積水稀釋兩種上清液的每一種，并與5mM磷酸四丁胺(TBAP)混合，上樣到包含50g反相Prep Sep Pak(WatersNo.10001，制備型C18，125A)并用250ml CH3CN∶H2O 1∶1V/V)+5mM TBAP平衡過的柱上。用60％ CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP和40％異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mMTBAP洗滌該柱。按照本發(fā)明的二糖洗脫到在30％ CH3CN∶H2O1∶1(V/V)+5mM TBAP和70％異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP時(shí)的流份中。
用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP稀釋在反相層析中獲得的二糖，并上樣到制備型HPLC柱(Millipore-WatersBondapak C18300A 15M，300mm×47mmφ)上。按照本發(fā)明的二糖流份在異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+25mM TBAP和33％CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP時(shí)洗脫。這一流傷含有55mg按照本發(fā)明的二糖A。
二糖的脫鹽按以下方法從一份二糖A流份除鹽。通過連續(xù)加入5ml CHCl3-CH3OH2∶1(V/V)、5ml CH3CN和5ml CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡Sep Pak Vac C18Plus柱(二氧化硅C18，0.6ml，Waters No.20515)。在用3倍體積水稀釋HPLC流份，總共得到6ml稀釋樣品后，將樣品加到此柱上。然后用10ml CH3CN∶H2O(V/V)+10ml mM HCl，接著用10ml CH3CN除去TBAP。然后用5ml CHCl3-CH3OH以2∶1(V/V)洗出純的二糖。
在35℃下真空(12托)蒸發(fā)干燥所得流份。將脫過鹽的二糖A重新溶解到H2O∶TEA 1000∶1(V/V)中用于生物學(xué)和生物化學(xué)試驗(yàn)，或者溶解到氯仿∶甲醇2∶1(V/V)中用于FAB-MS分析。
鈉鹽形式的制備連續(xù)用50ml CH3CN和50ml CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡包含10g反相C18Prep Sep Pak的柱(Waters No.10001，制備型C18，125A)。
在用1倍體積水稀釋后，將樣品(HPLC流份)上到該柱上。吸附后，用100ml CH3CH∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP洗滌該柱。然后用50ml異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP洗出二糖。
按以下方法純化所形成的流份。用30ml 1M NaOH洗滌，然后水洗至中性，接著用30ml 1M HCl洗滌，再水洗至中性來連續(xù)處理含20mlQ-SepHarose fast flow(PHarmacia 17-0510-01)的柱。
將樣品直接上到柱上。吸附后，用200ml H2O和100ml異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)除去未吸附的物質(zhì)，用100ml 0.9％ NaCl∶異丙醇1∶1(V/V)洗脫二糖。
按以下方法進(jìn)行最后的純化。連續(xù)用50ml CH3CN、50mlCHCl3-CH3OH 2∶1(V/V)、50ml CH3CN和50ml 50％CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡包含10g反相C18Prep Sep Pak的柱。用1倍體積水稀釋后，將樣品加到柱上。吸附后，連續(xù)用200ml H2O、200ml異丙醇∶水9∶1(V/V)和50ml CH3CN洗滌該柱。用50ml CHCl3-CH3OH 2∶1(V/V)洗脫二糖。在35℃下真空(12托)蒸發(fā)干燥該流份。
該鈉鹽在水中任意溶解(直到100mg/ml)。
實(shí)施例2在培養(yǎng)基(其組成在表2中列出)中培養(yǎng)流感嗜血桿菌(從National Collection of type Cultures)購得(ATCC 9795))。
表2流感嗜血桿菌主培養(yǎng)基的組成物質(zhì) 量/lNaCl 2gNa2HPO42gCH3COONa 0.5g維生素B10.003g煙酸 0.003g70％乳酸鈉溶液2ml60％乳酸銨溶液2ml肉羹 7.5g蛋白胨15g大豆蛋白胨1g胰化蛋白胨3g酵母膏7.5g葡萄糖 3g將氯高鐵血紅素(10mg/l)和NADH(4mg/l)補(bǔ)加進(jìn)培養(yǎng)基。用5N NaOH或25％ HCl將PH調(diào)至7.0±0.3。在開始形成靜止生長(zhǎng)期后停止培養(yǎng)，經(jīng)熱處理(100℃ 100秒鐘)使發(fā)酵罐中的物質(zhì)失活。將失活的培養(yǎng)物離心，用0.6％ NaCl水溶液(約60g/l)稀釋分離出來的生物量。加入10N NaOH(使NaOH終濃度達(dá)0.2N)進(jìn)行堿處理。在連續(xù)攪拌下于37℃進(jìn)行該處理5天。
在用冰乙酸酸化至PH3.5后直接將堿處理過的胞溶物進(jìn)行酸處理。將混合物加熱到95℃保持120分鐘，接著冷卻至室溫。
將沉淀離心(10,000×g、30分鐘4℃)，棄去上清液。
將沉淀重新懸浮在CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)中，用TEA將PH調(diào)至9。離心(15,000×g，10分鐘)后，將上清液調(diào)至5mM TBAP。將上清液上樣到用50ml CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡過的Sep Pak Vak C18柱(10g二氧化硅C18、35ml、WatersNo.43345)上。用50ml異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP洗脫含有本發(fā)明二糖B的部分。
將該部分蒸發(fā)(35℃，12托)濃縮至約2ml。離心(15,000×g，5分鐘)該部分，將上清液上樣到半制備型HPLC C18柱(Macherey-Nagel No.715806，250mm×10mmφ，Nucleosil300-7C18)上。含有本發(fā)明的二糖B的部分洗脫到包含28％CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP和72％異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+25mM TBAP的流份中。
用類似實(shí)施例1的方法使二糖B脫鹽。
實(shí)施例3在37℃下將大腸桿菌O111B4(Sigma，ProductNo.L3024)的脂多糖在0.2M NaOH中進(jìn)行堿處理1.5小時(shí)，用1M磷酸中和該溶液。
經(jīng)超濾(Millipore Ultrafree-MC，UFC3 LGC00，閾值10kD)濃縮400μl堿處理過的LPS溶液。
用400μl H2O稀釋滯留物(＞10kD)，并用冰乙酸(調(diào)至0.2M冰乙酸)進(jìn)行酸處理。將酸化的溶液加熱到95℃保持120分鐘。在冷卻至25℃后，經(jīng)離心(15,000×g，10分鐘)沉降沉淀，棄去上清液。將沉淀溶解到20μl H2O∶TEA 1000∶1(V/V)中，把該溶液上樣到分析型HPLC C18柱(Supelco No.58985，Supelcosil LC-18，3μm，150mm×4.6mmφ)上。本發(fā)明的二糖洗脫到包含42％ CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP和58％異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP的流份中。
實(shí)施例4在H2O∶TEA 1000∶1中制備大腸桿菌F-583(Sigma，Product No.L5399)和2mg/ml脂質(zhì)A溶液。在37℃下將該溶液用0.2M NaOH進(jìn)行堿處理2.5小時(shí)。用1M磷酸中和該溶液。
將中和過的溶液上樣到分析型HPLC柱(Supelco No.58958，Supelcosil LC-18，3μm，150mm×4.6mmφ)上。本發(fā)明的二糖在流動(dòng)相為42％ CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+5mM TBAP和58％異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP時(shí)洗脫。
實(shí)施例5將2-氨基-2-脫氧-6-O-(2-氨基-2-脫氧-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基)-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯〔Holst et al.，Eur.J.Biochem.214(1993)695-701〕在甲醇中用甲醇鈉(正好4.0mol當(dāng)量)處理，然后用(R)-3-十二酰氧十四酸酐(2.2mol當(dāng)量)〔由(R)-3-十二酰氧十四酸在無水二氯甲烷中與DCC(0.5mol當(dāng)量)反應(yīng)制備，參見Charon et al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.(1984)2291-2295〕處理。室溫下12小時(shí)后，加入水(甲醇體積的2倍)，混合物用乙醚抽提(除支3-十二酰氧十四酸)。將水相濃縮，本發(fā)明的二糖C粗品進(jìn)行反相HPLC。將產(chǎn)物溶解在H2O∶TEA1000∶1(V/V)中，加入磷酸四丁胺〔TBAP〕(達(dá)到濃度為5mM)。然后將這一溶液上樣到制備型HPLC柱(Millipore-WatersBondapak C18300A 15M，300mm×47mmφ)上。用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP(溶劑A)和異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+25mM TBAP(溶劑B)梯度(50％A/50％B到0％A/100％B，1％/分鐘)洗脫(流速80ml/分鐘)二糖C。按以下方法脫鹽。用水稀釋含有二糖C的HPLC流份，然后上樣到C18-Sep Pak Vac Plus柱(Waters)〔連續(xù)用CHCl3∶CH3OH2∶1(V/V)、CH3CN、CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)平衡過的C18反相硅膠柱〕上。經(jīng)連續(xù)用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)、10mMHCl和CH3CN洗滌除去TBAP。純的二糖用CHCl3∶CH3OH 2∶1(V/V)洗脫。
實(shí)施例6用氫氧化鈉水溶液(恰好1.0ml當(dāng)量，該濃度使起始PH為12.5)處理實(shí)施例5中獲得的含有二糖C的水相(純化前)。室溫下4小時(shí)后，將混合物調(diào)至PH6.5到7，并上樣到制備型HPLC柱(Millipore-Waters Bondapak C18 300 15M，300mm×47mmφ)上。用CH3CN∶H2O 1∶1(V/V)+25mM TBAP(溶劑A)和異丙醇∶水9∶1(V/V)+25mM TBAP(溶劑B)梯度(75％A25％B到0％A100％B，1％/分鐘)洗脫(流速80ml/分鐘)二糖A和D。按實(shí)施例5中描述的使二糖C脫鹽的方法使含有二糖A和D的HPLC流法份脫鹽。
比較實(shí)施例(非本發(fā)明)在H2O∶三乙胺1000∶1(V/V)中制備大腸桿菌F-583(Sigma Product No.L5399)的10mg/ml脂質(zhì)A溶液，接著在37℃下用0.2M NaOH進(jìn)行堿處理20分鐘。這一時(shí)間長(zhǎng)度僅對(duì)3-O脫?；|(zhì)A足夠(Myers et al.，Cellular and MolecularAspects of Endotoxin Reactions，Pages 145-156〔1990〕、ElsevierScience Publishers)。
用正磷酸中和該溶液。為進(jìn)行生物學(xué)試驗(yàn)，將其稀釋成0.1％TEA/0.9％NaCl的溶液，不進(jìn)行進(jìn)一步的純化。
為進(jìn)行FAB-MS分析，用反相HPLC(Supelco No.58985，Supelcosil LC18，3μm，15mm×4.6mmφ)純化這一堿處理過的脂質(zhì)A的樣品。在實(shí)施例1描述的條件下使在18％ CH3CN∶H2O1∶1(V/V)+5mM TBAP和82％異丙醇∶H2O 9∶1(V/V)+5mM TBAP下洗脫的主要峰脫鹽。FAB-MS分析給出1570.1質(zhì)量單位的分子離子峰(計(jì)算值為1569.1質(zhì)量單位)。
本發(fā)明二糖的理化特征將實(shí)施例1和2獲得的二糖A和B進(jìn)行理化性質(zhì)分析。
在酸水解(4M HCl，16小時(shí)，100℃，氬氛圍)和異硫氰酸苯酯衍生后，接著用HPLC定量分析(參見Anumula，K.R.et al.，Analytical.Biochemistry，Volume 179，Pages 113-122〔1992〕)，由此來測(cè)定葡糖胺。
在酸水解(4M HCl，4小時(shí)，100℃)和甲醇存在下用BF3甲基化后，用氣相色譜(OV-1柱，Hewlett Packard)(參見Miller，L.，Gas-Liquid ChromatograpHy of Cellular Fatty Acidsas a Bacterial Identification Acid，Gas ChromatograpHyApplication Note，Pages 228-237〔1984〕)定量測(cè)定，由此來測(cè)定總脂肪酸。
在用NaOCH3處理后經(jīng)氣相色譜來測(cè)定酯鍵連接的脂肪酸(參見Rietschel E.T.et al.，European Journal of Biochemistry，Volume 28，Page 166-173〔1972〕)。
按Ames的方法(參見Ames，B.N.，Methods in Enzymology，Volume 8，Page 115-118〔1966〕)測(cè)定磷酸(pHospHate)。
使用Karkhanis，Y.D.等的方法(Analytical Biochemistry，Volume 8，pages 595-601〔1978〕)測(cè)定3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)。
二糖A溶液含有2.1μmol/ml磷酸、1.9μmol/ml葡糖胺、1.0μmol/ml C120脂肪酸和2.2μmol/ml 3OH-C140脂肪酸。在釋放酯鍵連接的脂肪酸殘基后僅測(cè)得C120脂肪酸，表明3OH-C140脂肪酸殘基靠酰胺鍵連接。未測(cè)得KDO(＜1mol/10mol二糖A)。
因此，該二糖每摩爾含有2mol磷酸、2mol葡糖胺、2mol3OH-C140脂肪酸和1mol C120脂肪酸。
快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)是在CHCl3∶CH3OH 1∶1(V/V)中樣品的負(fù)離子質(zhì)譜(negative mode)(濃度1mg/ml)。設(shè)定在Vacc 8KV的VG ZAB-2SE質(zhì)譜儀用來產(chǎn)生30KV的能譜和1μA的發(fā)射電流。該質(zhì)譜儀用碘化銫校準(zhǔn)。

圖1中給出了FAB-MS譜圖。二糖A顯示出在1133.55質(zhì)量單位的分子峰(計(jì)算的質(zhì)量為1133.3)。其它峰說明在分析期間產(chǎn)物裂解，1053.5峰表示斷裂掉磷酸酯基團(tuán)，951.3峰表示斷裂掉C12脂肪酸。
圖2中給出了二糖B的FAB-MS譜圖，它顯示出在1161.8質(zhì)量單位的分子峰(計(jì)算值為1161.3)。在1183.8質(zhì)量單位的峰表示添加了鈉，在951.6質(zhì)量單位的峰表示斷裂掉C14脂肪酸，在973.6質(zhì)量單位的峰代表951.6峰與鈉離子的片段。
圖3中給出了二糖A(在D2O中的鈉鹽)的1H-NMR譜圖(Bruker 360MHz)，圖4和5(放大)中給出了其13C-NMR譜圖。
下列β-D-葡糖胺-(1→6)-α-D-葡糖胺二糖的結(jié)構(gòu)式在下面列出*二糖A(2-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羥十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯)；*二糖B(2-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)-3-十四酰氧十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羥十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯)；*二糖C(2-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯)；*二糖D(2-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)-3-羥十四酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-十二酰氧十四酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯)。
本發(fā)明二糖的內(nèi)毒性和生物學(xué)活性測(cè)定二糖A(實(shí)施例1)和二糖B(實(shí)施例2)的內(nèi)毒性和生物學(xué)活性，并與來源于大腸桿菌O111B4的脂多糖(Sigma，Product No.L 3024)、脂質(zhì)A(Sigma，Product No.L5399，在實(shí)施例4中用作起始物質(zhì))和來源于大腸桿菌F583的脂質(zhì)A的3-O-脫?；|(zhì)A(如比較實(shí)施例中制備的，但沒有經(jīng)HPLC純化)的內(nèi)毒性和生物學(xué)活性比較。
1.內(nèi)毒性在鱟阿米巴樣細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(LAL)試驗(yàn)中測(cè)定內(nèi)毒性。這一試驗(yàn)基于觀察內(nèi)毒素誘導(dǎo)大眼水蚤鱟(Limulus polypHemus)的血淋巴凝結(jié)。
在膠凝化試驗(yàn)中，將待試化合物的系列稀釋樣品與LAL 1∶1(V/V)(Haemachem Inc.，敏感性LAL 0.06內(nèi)毒素單位/ml)混合。在37℃下將該混合物溫育1小時(shí)。經(jīng)測(cè)定在405nm的光密度來監(jiān)測(cè)凝膠形成。通過轉(zhuǎn)換反應(yīng)微板測(cè)定形成凝膠的最后稀釋樣品。經(jīng)與脂多糖基準(zhǔn)物的稀釋樣品比較測(cè)定樣品中的內(nèi)毒素活性(1內(nèi)毒素單位＝0.1ng LPS)。
也在生色試驗(yàn)中測(cè)定內(nèi)毒性，在這一試驗(yàn)中，用生色劑(Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA；Bio Whittaker Kit No.50-650U)測(cè)定LAL中蛋白酶被LPS的激活作用。在405nm測(cè)定顏色形成(pNA(對(duì)硝基苯胺)的釋放)。
事先將樣品在37℃溫育10分鐘，接著加入含生色劑的LAL。測(cè)定在405nm光密度達(dá)到0.2所需時(shí)間。與從LPS基準(zhǔn)物獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算出內(nèi)毒素活性。在表3中結(jié)果表示為ng LPS/ng產(chǎn)物。表3LAL中的內(nèi)毒活性(ng/ng)試驗(yàn)類型 大腸桿菌 脂質(zhì)A 3-O-脫酰化 二糖A 二糖B 單磷酰LPS*)脂質(zhì)A 二糖A膠凝 0.9±0.4 0.6±0.31.0±0.10.003±0.0020.004±0.0020.0031±0.0013(n＝6) (n＝3) (n＝2) (n＝12) (n＝7) (n＝10)生色劑0.70 0.7±0.31.70±0.95 0.0014±0.0013 0.0008±0.0006 0.0016±0.0009(n＝1) (n＝3) (n＝3) (n＝9) (n＝7) (n＝10)LAL中LPS內(nèi)毒活性＝1ng/ng，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在0.3-3ng/ng范圍內(nèi)。
表3說明，按照本發(fā)明的二糖A和B顯示出最低的內(nèi)毒性，特別是相對(duì)于US-A-4,912,094的3-O-脫?；|(zhì)A來說。
2.在C57BL/6小鼠巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)的體外生物學(xué)活性從6周齡雄性C57 BL/6小鼠的髖部、股骨和脛骨收集骨髓。在Dulbecco改進(jìn)培養(yǎng)基中的骨髓懸液勻化和離心后，將離心沉淀重新懸浮到Dulbecco改進(jìn)培養(yǎng)基中，以4×105細(xì)胞/ml濃度在補(bǔ)加了30％L-929成纖維細(xì)胞上清液(集落刺激因子1〔CSF-1〕的通用來源)和20％馬血清的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
7天后，收集成熟的巨噬細(xì)胞，并以7×106細(xì)胞/ml濃度再懸浮到含有5％胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)培養(yǎng)基中。將這一細(xì)胞懸液與用相同培養(yǎng)基稀釋的樣品以1∶1混合，用于以70000細(xì)胞/孔在微板上進(jìn)行的生物學(xué)試驗(yàn)(在37℃下培養(yǎng)22小時(shí)，100％濕度和8％ CO2)。
一氧化氮(NO)的產(chǎn)生作為對(duì)細(xì)菌感染，特別是對(duì)LPS的反應(yīng)，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)。NO似乎具有細(xì)胞靜止和細(xì)胞毒性質(zhì)。NO非常活潑，迅速經(jīng)氧化轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽和硝酸鹽。
用Griess試驗(yàn)(加入1∶1(V/V)N-(1-萘基)乙二胺氫氯化物〔水中1g/l〕和對(duì)氨基苯磺酰胺〔5％ H3BO4中10g/l〕)測(cè)定亞硝酸鹽的形成。用與NaNO2基準(zhǔn)物比較計(jì)算活化的巨噬細(xì)胞上清液中的亞硝酸鹽濃度。
結(jié)果在表4中給出。
表4由LPS和衍生產(chǎn)物刺激的巨噬細(xì)胞上清液中NO的產(chǎn)生量產(chǎn)物最大活性 最小活性 活性 NO活性50％ 50％ 分析次數(shù)*)*)*)以NO2-/表示**LPS大腸桿菌 1000.00040.01 7 n＝6脂質(zhì)A 50 0.005 0.07 5 n＝73-O-脫?；|(zhì)A 50 0.005 0.16 5 n＝3二糖A 50 0.016 0.16 5 n＝6二糖B 16 0.00050.05 5 n＝1單磷?；茿 50 5 8 4 n＝1*以μg/ml表示的產(chǎn)物濃度，相應(yīng)于誘導(dǎo)的NO活性，**從系列稀釋曲線外推的以NO2-/ml表示的濃度。
LPS誘導(dǎo)最大量的NO產(chǎn)生，脂質(zhì)A、3-O-脫酰化脂質(zhì)A、二糖A和二糖B誘導(dǎo)相同數(shù)量級(jí)的NO產(chǎn)生。
因此，二糖A和B在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的能力與脂質(zhì)A和3-O-脫?；|(zhì)A一樣強(qiáng)。
白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)的產(chǎn)生當(dāng)用LPS刺激時(shí)，包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞產(chǎn)生IL-1α。報(bào)道的一些IL-1α活性包括激活T細(xì)胞、誘導(dǎo)T細(xì)胞中IL-2受體表達(dá)和細(xì)胞因子基因表達(dá)、輔助刺激B細(xì)胞增殖和Ig分泌、增強(qiáng)NK-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的Il-2和IFN誘導(dǎo)激活、誘導(dǎo)急相蛋白合成和發(fā)熱誘導(dǎo)。
用ELISA試驗(yàn)(Kit GENZYME，Intertest-1α)測(cè)定巨噬細(xì)胞上清液中IL-1α的濃度。
結(jié)果概括在表5中。
表5由LPS和衍生產(chǎn)物刺激的巨噬細(xì)胞上清液中IL-1α的產(chǎn)生量產(chǎn)物 濃度 檢測(cè)的最小活性試驗(yàn)的最高濃度 500μg/ml濃度 IL-1αIL-1α濃度IL-1α[μg/ml] [pg/ml] [pg/ml] [μg/ml][pg/ml]空白＝TEA 0.1％ 500 ＜15*)＜15*)＜15*)LPS大腸桿菌 1600 295±129 170**)1.56 18±4脂質(zhì)A 500 53±3553±35 50 17±83-O-脫?；|(zhì)A 500 56±1956±19 16021±6二糖A 500 75±4575±45 16 19±11*)試驗(yàn)檢測(cè)極限為約15pg/ml。
**)從系列稀釋曲線外推的IL-1α濃度。
測(cè)定IL-1α的最大產(chǎn)生量是不可能的，因?yàn)樵谑褂米罡邼舛葧r(shí)，其產(chǎn)生量仍在增加。
在濃度為500μg/ml時(shí)，脂質(zhì)A、3-O-脫?；|(zhì)A和二糖A對(duì)IL-1α產(chǎn)生的誘導(dǎo)無明顯不同。LPS誘導(dǎo)IL-1α產(chǎn)生能力更強(qiáng)。
二糖A誘導(dǎo)IL-1α產(chǎn)生的能力至少與脂質(zhì)A和3-O-脫?；|(zhì)A相當(dāng)。
白細(xì)胞介素-6(IL-6)的產(chǎn)生激活的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。除別的性質(zhì)外，IL-6還誘導(dǎo)某些類型細(xì)胞的增殖、某些黑素瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制、B-淋巴細(xì)胞的分化和IgG分泌的刺激、細(xì)胞毒T細(xì)胞的分化和弱的抗病毒活性。
用ELISA試驗(yàn)(Kit ENDOGEN，EM-IL-6)測(cè)定巨噬細(xì)胞上清液中的IL-6濃度。
結(jié)果概括在表6中。
表6由LPS和衍生產(chǎn)物否刺激的巨噬細(xì)胞上清液中IL-6的產(chǎn)生量產(chǎn)物 最大活性最小活性 50％活性濃度IL-6濃度 IL-6 濃度 IL-6[μg/ml][pg/ml] [μg/ml] [pg/ml] [μg/ml] [pg/ml]空白＝TEA 0.1％500 1150±80 0 710±240 ------LPS大腸桿菌 25 13860±2750 0.006 2400±960 0.36950脂質(zhì)A160 to 0.016*)3000 to 2200*)0.016 2460±50 ND**)ND**)3-O脫酰化脂質(zhì)A160 to 0.016*)2850 to 2200*)0.016 2410±160 ND**)ND**)二糖A50 5700±2650 0.016 850±350 1 2850*)在試驗(yàn)范圍內(nèi)誘導(dǎo)活性相對(duì)恒定，且不給出最大值。
**)未測(cè)得由試驗(yàn)產(chǎn)物最低濃度(0.016)誘導(dǎo)的活性仍然高于50％活性。
二糖A對(duì)IL-6分泌的刺激作用明顯低于LPS。然后，二糖A在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生能力較脂質(zhì)A和3-O-脫酰化脂質(zhì)A更強(qiáng)。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產(chǎn)生TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生。由TNF-α誘導(dǎo)的活性特別是抗病毒活性、某些細(xì)胞類型的細(xì)胞裂解和細(xì)胞靜止(cytostasis)、某些細(xì)胞系的生長(zhǎng)、抗原表達(dá)(例如主要組織相容性復(fù)合物I和II類)、甲基膽蒽誘導(dǎo)的肉瘤的壞死、多形核白細(xì)胞(PMN)的激活、破骨細(xì)胞激活和骨吸收。TNF-α也是毒性休克和膿毒病的主要介導(dǎo)物。
用ELISA試驗(yàn)(Kit GENZYME Factor-test m TNF-α)測(cè)定巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度。
結(jié)果列于表7中。
表7由LPS和衍生產(chǎn)物刺激的巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α的產(chǎn)生量產(chǎn)物濃度檢測(cè)的最小活性試驗(yàn)的最高濃度 500μg/ml濃度 TNF-αTNF-α 濃度TNF α[μg/ml] [pg/ml] [pg/ml][μg/ml][pg/ml]空白＝TEA 0.1％ 500138±9138±9 0 ＜100*)LPS大腸桿菌100 to 6.25257 to 284130***)0.006 175±55脂質(zhì)A 500223±64 223±64 0.016 118±93-O-脫?；|(zhì)A 500311±72 311±72 0.016 155±6二糖A 500530±139 530±1390.16 159±43
*)試驗(yàn)檢測(cè)極限在100pg/ml左右。
**)LPS濃度在100和6.25μg/ml之間時(shí)，TNF-α的濃度相對(duì)恒定。
***)從系列稀釋曲線外推的TNF-α濃度。
測(cè)定TNF-α的最大產(chǎn)生量是不可能的，因?yàn)樵谧罡叩脑囼?yàn)濃度時(shí)產(chǎn)生量仍在增加。
與其它試驗(yàn)相反，LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生量比二糖A的要低。二糖A誘導(dǎo)的TNF-α的量等于或高于脂質(zhì)A或3-O-脫?；愼誘導(dǎo)的量。
前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生PGE1和PGE2是花生四烯酸的主要代謝產(chǎn)物，所述花生四稀酸是由LPS、TNF-α或IL-1刺激經(jīng)巨噬細(xì)胞合成的。PGE類表現(xiàn)出對(duì)T和B淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。它似乎誘導(dǎo)Th2的刺激、Th1T淋巴細(xì)胞亞群的抑制和免疫球蛋白同種型的轉(zhuǎn)化。
用RIA試驗(yàn)(Kit PAESEL+LOREI，36-104-6001Prostaglandin E2 3H-RIA Kit)測(cè)定巨噬細(xì)胞上清液中PGE2濃度。
結(jié)果概括在表8中。
表8由LPS和衍生產(chǎn)物刺激的巨噬細(xì)胞上清液中PGE2的產(chǎn)生量產(chǎn)物 最高濃度誘導(dǎo)活性最低濃度誘導(dǎo)活性濃度PGE2濃度PGE2[μg/ml][pg/ml] [μg/ml][pg/ml]空白＝TEA 0.1％ 500 ＜80*)---＜80*)LPS大腸桿菌16001120±1356.25 153±29脂質(zhì)A 500＜80*)---＜80*)3-O-脫?；|(zhì)A 500240±25 500240±25二糖A 500540±65 16 80±41*試驗(yàn)檢測(cè)極限在80pg/ml左右。
測(cè)定PGE2的最大產(chǎn)生量是不可能的，因?yàn)樵谧罡呤褂脻舛葧r(shí)，產(chǎn)量量仍在增加。由二糖A引起的對(duì)PGE2產(chǎn)生的刺激作用明顯低于LPS。然而二糖A比脂質(zhì)A和3-O-脫?；愼活性要高。脂質(zhì)A不誘導(dǎo)PGE2產(chǎn)生，3-O-脫?；|(zhì)A僅在最高使用濃度時(shí)誘導(dǎo)PGE2產(chǎn)生。
結(jié)論本發(fā)明的二糖是體外活性的，且誘導(dǎo)NO、IL-1α、IL-6、TNF-α和PGE2產(chǎn)生。本發(fā)明的二糖與脂質(zhì)A和3-O-脫?；|(zhì)A活性一樣，甚至比后兩者活性更強(qiáng)，但用LAL試驗(yàn)測(cè)定時(shí)表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性降低的內(nèi)毒性。脂質(zhì)A和3-O-脫?；|(zhì)A的較低的活性可能歸因于純度不同。二糖A和B由HPLC純化、脂質(zhì)A是市售的生物制劑(Sigma L-5399)、3-O-脫?；|(zhì)A是按照US-A-4,912,054的方法從市售脂質(zhì)A制劑出發(fā)制法備的。具有較高活性的唯一產(chǎn)物是LPS，它一般誘導(dǎo)較高的應(yīng)答，且誘導(dǎo)顯著信號(hào)僅需要較低的濃度。
3.體內(nèi)生物學(xué)活性以對(duì)BDIX大鼠體內(nèi)誘生的腹膜癌的抗腫瘤活性來研究二糖A的體內(nèi)生物學(xué)活性。將按Martin的方法(Martin，F(xiàn).et al.，International Journal of Cancer，Volume 32，Pages 623-627〔1983〕)獲得的Pro b細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到大鼠中(每只大鼠106細(xì)胞)。10天后，在腸系膜中出現(xiàn)許多乳色斑狀固體結(jié)，并逐漸侵入腹膜腔(參見Lagadec，P.et al.，Invasion and Metastasis，Volume 7，pages 83-95〔1987〕)。4-5周后出現(xiàn)血性腹水，并且所有的大鼠在8-12周內(nèi)死亡。
注射腫瘤Pro b細(xì)胞后14天開始免疫治療，該治療由腹膜內(nèi)注射二糖A構(gòu)成，按每公斤體重0.1、0.3和0.8mg給藥。二糖A溶解在0.9％ NaCl和0.1％三乙胺水溶液中。大鼠接受5次注射，每3.5天一次。用水溶液注射對(duì)照組。兩組均包括10只大鼠。
注射腫瘤細(xì)胞6周后進(jìn)行尸檢。粗略估計(jì)腹膜癌發(fā)病程度，并按癌病發(fā)生程度增加的順序?qū)⒋笫蠓诸悺?br> 按結(jié)大小分類的類別如下0類無可見腫瘤結(jié)；1類少數(shù)幾個(gè)小于0.2cm大小的結(jié)；2類大小達(dá)0.5cm的數(shù)不清的結(jié)，3類大小達(dá)1cm的腫瘤；4類大小達(dá)幾cm的腫瘤完全侵入腫瘤腔。
結(jié)果列于表9中。
表9二糖A對(duì)腹膜癌的體內(nèi)抗腫瘤活性二糖A 患有以下類癌 產(chǎn)物的腹水體積 產(chǎn)物的(劑量) 病的大鼠的數(shù)目 作用 〔ml/大鼠〕作用0 1 2 3 4(1) 范圍 平均(2)0mg/kg 0 1 1 2 6 0-64 40±240.1mg/kg0 2 0 4 4NS0-18 7±7p＜0.0010.3mg/kg2 3 2 2 1p＜0.01 0-20 2±6p＜0.0010.8mg/kg1 6 1 1 1p＜0.01 0-2 0±1p＜0.001經(jīng)Kruskal-Wallis試驗(yàn)(1)或(2)用方差分析計(jì)算抗腫瘤活性的統(tǒng)計(jì)顯著性。
二糖A明顯具有劑量依賴性抗腫瘤作用。
4.急性毒性將二糖A注射到雄性和雌性NMRI小鼠(6-7周齡)的尾靜脈中，劑量高達(dá)100mg/kg體重時(shí)未導(dǎo)致任何死亡。
實(shí)施例7起始物質(zhì)是得自銅綠色假單胞菌的脂多糖(Sigma，ProductNo.L7018)。脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)是已經(jīng)已知的(參見Kulshin et al.，Eur.J.Biochem.198(1991)697-704)。與得自大腸桿菌的脂質(zhì)A不同，占優(yōu)勢(shì)的種類在二葡糖胺二磷酸酯骨架的兩個(gè)氨基上都具有酰氧?；鶜埢?。此外在3’位上有一個(gè)3-羥基癸酸，但在一小部分中僅在3位上存在相同的脂肪?；鶜埢?br> 除去3’位上的酯肪?；鶜埢鶗?huì)導(dǎo)致產(chǎn)生二糖C的類似物。進(jìn)一步水解將導(dǎo)致喪失2位或2’位酰氧?；系孽セ闹觉；鶜埢?。這些結(jié)果與二糖C和D類似。
將得自銅綠色假單胞菌的脂多糖(Sigma L7018)以5mg/ml溶解在0.1M乙酸鈉(PH4.0)中，加熱120分鐘(100℃下)。冷卻后，加入0.5體積異丙醇，接著加入磷酸四丁胺(TBAP)(至2mM終濃度)。加入三乙胺至PH9.0(大約值，pH試紙測(cè)定)。將該混合物上樣到帶循環(huán)(10支管)的C18Sep-Pak(Waters)柱上。用10ml乙腈∶H2O 1∶1(V/V)中5mM TBAP溶液洗滌該Sep-Pak柱，接著用10ml乙腈洗滌。用4ml CHCl3∶CH3OH2∶1(V/V)洗脫吸附的物質(zhì)。
用HPLC純化兩個(gè)主要的峰PsA1和PsA2(圖6)，并分析脂肪酸。脂肪酸的組成相應(yīng)于Kulshin等描述的分子(下表)。PsA1比PsA2的疏水性差，因其從柱上洗脫的保留時(shí)間(Rt)較短。這相應(yīng)于具有2個(gè)2OH-C120酸殘基的分子。PsA2具有2OH-C120和C120兩者。峰鑒定的脂肪酸PsA1 3OH-C1002OH-C1203OH-C120PsA2 3OH-C100C1202OH-C1203OH-C120經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘?jiān)匦氯芙獾?.2％TEA水溶液中。
向銅綠色假單胞菌脂質(zhì)A溶液中加入NaOH(達(dá)到0.2M濃度)，在室溫下溫育該溶液60分鐘。然后用正磷酸(8.5％)中和該溶液。然后將其上樣到反相HPLC系統(tǒng)(具有Supelco LC18的HP1050、3μm反相柱，帶前置柱)上，該HPLC系統(tǒng)用75％溶劑A(5mM TBAP/乙腈∶水1∶1(V/V))和25％溶劑B(5mMTBAP/異丙醇∶水9∶1(V/V))平衡過，以每分鐘增加2％溶劑B最后達(dá)100％ B的方式進(jìn)行梯度洗脫收集主要峰(參見圖7)。用2倍體積的水稀釋它們，上樣到用溶劑A平衡過的C18 Sep-Pak柱上。用10ml 0.45％ NaCl/異丙醇∶H2O 1∶3(V/V)、10ml水和10ml乙腈洗滌Sep-Pak柱。用4ml CHC3∶CH3OH 2∶1(V/V)洗脫吸附的物質(zhì)，在氮?dú)庀鲁ト軇?。將該組分再溶解到100μl水中。
在用4M HCl 100℃下水解4小時(shí)后，經(jīng)氣相色譜分析該組分的脂肪?；俊０碝iller的方法(Miller，L.GasChromatograpHy application note 228-37〔Hew lett Packard〕)將釋放的脂肪酸轉(zhuǎn)化成甲酯。以標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯(Supelco)為內(nèi)標(biāo)物，在具有熔凝硅膠柱的Hewlett-Packard 5890。氣相色譜儀(Supelco 2-4026)上分析。
脂質(zhì)A抽提物水解后，在反相HPLC上觀察到許多峰，從HPLC收集主要峰(PsAOH 1、2、4和6)。每一流份中鑒定的脂肪酸示于下表峰 鑒定的脂肪酸PsAOH1 3OH-C1202OH-C120PsAOH2 3OH-C1202OH-C120PsAOH4 3OH-C120C120PsAOH6 3OH-C1202OH-C120C120
下列這些二糖的結(jié)構(gòu)式在下面給出*PsAOH12-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)-3-〔(S)-2-羥基十二酰氧〕-十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羥基十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯；*PsAOH22-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)-3-羥基-十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-〔(S)-2-羥基十二酰氧〕-十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯；*PsAOH42-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)-3-十二酰氧十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-羥基十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯；*PsAOH62-脫氧-6-O-〔2-脫氧-2-〔(R)3-十二酰氨基〕-4-O-膦酰-β-D-吡喃葡萄糖基〕-2-〔(R)-3-〔(S)-2-羥基十二酰氧〕-十二酰氨基〕-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯；二糖 E(PsAOH1) 二糖 F(PsAOH2) 二糖G(PsAHO4) 二糖H(PsAOH6)
也以負(fù)離子質(zhì)譜用電子噴射質(zhì)譜(ES-MS)分析各組分。VG Biotech BIO-Q儀器與三聯(lián)(triple)四極分析儀一起使用。2到4μl各樣品稀釋到10μl乙腈∶水∶25％氨溶液50∶50∶1(V/V)中。然后直接將10μl注射到質(zhì)譜儀樣品池中。乙腈∶水∶25％氨溶液50∶50∶1(V/V)用作洗脫劑(7μl/min)。為了分析主要離子片段，在第二四極中使用氬作為碰撞氣體進(jìn)行來自第一四級(jí)的母離子的碰撞活化分解。在第三四極中檢測(cè)子離子。
計(jì)算的每一個(gè)峰的質(zhì)量和由ES-MS實(shí)測(cè)的質(zhì)量給出如下峰 計(jì)算的質(zhì)量實(shí)測(cè)的質(zhì)量PsAOH11093.5 1093.4PsAOH21093.5 1093.1PsAOH41077.5 1077.0PsAOH61275.8 1275.7在每一種情況下都有非常好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
在PsAOH1和PsAOH2的情況下，其質(zhì)量是相同的。這表明它們代表分子的兩種異構(gòu)體，在某種質(zhì)譜分析條件下脂質(zhì)A的片段是已知的(Kulshin，1991；和Cotter et al.，Biomed.Encl.MassSpectrom.14(1987)，591-598)。產(chǎn)生了代表多102質(zhì)量單位的分子非還原部分的離子。這樣，用兩個(gè)MS串聯(lián)，主要離子可以在第一MS中裂解，子離子可以在第二MS中檢測(cè)。這消除了觀察到的第二離子是污染物的可能性。它們必定是來源于原離子的裂解。每一組分的預(yù)期的子離子的質(zhì)量和ES-MS上實(shí)測(cè)到的質(zhì)量在以下給出。
計(jì)算的片段 實(shí)測(cè)的片峰質(zhì)量段質(zhì)量PsAOH1558.5或756.8756.1PsAOH2558.5或756.8557.7PsAOH4558.5或740.8739.9PsAOH6558.5或740.8740.1這些實(shí)測(cè)值明顯鑒別了二糖E、F、G和H的結(jié)構(gòu)。
為了內(nèi)部比較，也用ES-MS分析了二糖A。計(jì)算的質(zhì)量是768.9，片段的實(shí)測(cè)質(zhì)量是768。
按前文描述的方法經(jīng)在鼠腹膜巨噬細(xì)胞中刺激亞硝酸鹽的產(chǎn)生來試驗(yàn)各組分的生物學(xué)活性。
參照二糖A的量，從在HPLC上的吸附來測(cè)定原料溶液中各類似物的量。各組分表現(xiàn)出與二糖A相同數(shù)量級(jí)的活性(圖8)。有兩上脫氧酰基且無其它脂肪?；鶜埢亩荋活性最高。酰氧?；奈恢?2位還是2’位)對(duì)活性僅有小的影響。
為了消除活性是由其它物質(zhì)(例如LPS)污染樣品產(chǎn)生的可能性，在反相HPLC上再次純化二糖E、F、G和H，并用與含有物質(zhì)峰的流份相同的方法收集和處理緊靠峰的峰前和峰后HPLC基線區(qū)。試驗(yàn)峰流份和基線流份的活性。含有二糖E、F、G和H的峰表現(xiàn)出與第一次試驗(yàn)中觀察到的類似的活性。代表緊靠脂質(zhì)A類似物峰的峰前和峰后HPLC基線區(qū)的空白樣品沒有活性。因此，對(duì)亞硝酸鹽產(chǎn)生的刺激作用與脂質(zhì)A類似物特異性相關(guān)。
采用生色劑LAL試驗(yàn)(參見上文)測(cè)定二糖E、F和G的內(nèi)毒性。但使用0.1mg/ml而不使用1mg/ml牛血清白蛋白。在兩個(gè)系列的試驗(yàn)中獲得結(jié)果，該結(jié)果示于下面。樣品 LAL中的內(nèi)毒性(mg/mg)大腸桿菌LPS 0.58±0.14大腸桿菌脂質(zhì)A 0.32±0.06二糖E 0.000005±0.000002二糖F 0.000025±0.000026二糖G 0.00006 ±0.00003二糖A 0.000003±0.00000權(quán)利要求
1.具有以下通式的β(1→6)葡糖胺二糖， 共中R1是羥基、二羥膦酰氧基或其荷電形式、(C1-C5)酰氧基、(C1-C5)烷氧基、或者基團(tuán)X；R2和R2’各自為?；蚧鶊F(tuán)Y，其條件是至少R2或R2’是基團(tuán)Y；R3和R3’各自為氫原子、(C1-C3)烷基或(C1-C3)?；籖4是氫原子、(C1-C3)烷基或(C1-C3)?；籖4’是氫原子、(C1-C3)酰基、(C1-C5)烷基、二甲氧膦?；?、或者膦酰基或其荷電形式；且R6’是氫原子、羥基、二羥膦酰氧基、羥磺酰氧基、它們的荷電形式、或者基團(tuán)Z；其中所述的基團(tuán)X選自由以下基團(tuán)組成的組羧基(C1-C5)烷氧基、-O-CH-〔(CH2)mCOOH〕〔(CH2)nCOOH〕基(其中m＝0-5，n＝0-5)、膦酰(C1-C5)烷基、二甲氧膦酰氧基、羥磺酰氧基、羥磺酰(C1-C5)烷基和基團(tuán)X的荷電形式；其中所述的基團(tuán)Y選自由下列基團(tuán)組成的組酰氧?；?、酰氨酰基、酰硫酰基，(C1-C24)烷氧酰基、(C1-C24)烷氨?；?、(C1-C24)烷硫?；磺移渲兴龅幕鶊F(tuán)Z選自由下列基團(tuán)組成的組(C1-C24)烷氧基、(C1-C24)酰氧基、3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(KDO)、(KDO)n(其中n＝1-10)、多糖側(cè)鏈(例如來源于天然脂多糖的側(cè)鏈)、核心組分(例如來源于天然脂多糖的組分)、和氨基-(C1-C8)烷基-羧基。
2.按照權(quán)利要求1的二糖，其中所述的基團(tuán)Y包括3-酰氧?；?-酰氨酰基和3-酰硫?；?br> 3.按照權(quán)利要求1或2的二糖，其中所述的基團(tuán)Y是酰氧?；?。
4.按照權(quán)利要求1-3之一的二糖，其中的酰基是脂肪酸殘基、3-羥基脂肪酸殘基、3-氧代脂肪酸殘基。
5.按照權(quán)利要求1-4之一的二糖，其中作為基團(tuán)Y的酰氧酰基、酰氨?；王Ａ蝓；x自脂肪酸殘基、3-羥基脂肪酸殘基、3-氧代-脂肪酸殘基的酰基部分。
6.按照權(quán)利要求3-5之一的二糖，其中的基團(tuán)Y是一種酰氧?；?，該酰氧?；窃?-羥基位經(jīng)酯鍵與(C1-C20)?；?優(yōu)選地是(C10-C18)脂肪酸酰基)連接的N-連3-羥基(C4-C24)?；?優(yōu)選地是(C8-C18)脂肪酸?；?。
7.按照權(quán)利要求6的二糖，其中的酰氧酰基是在3-羥基位經(jīng)酯鍵與C12脂肪酸連接的N-連3-羥基C14脂肪酸?；?。
8.按照權(quán)利要求6的二糖，其中的酰氧?；窃?-羥基位經(jīng)酯鍵與C14脂肪酸連接的N-連3-羥基C14脂肪酸?；?。
9.按照權(quán)利要求1-8之一的二糖，其中的R2’是基團(tuán)Y。
10.按照權(quán)利要求1-8之一的二糖，其中的R2是其團(tuán)Y。
11.按照權(quán)利要求1-10之一的二糖，其中的3-羥基脂肪酸殘基是3-羥基(C4-C24)脂肪酸，優(yōu)選地是(C10-C18)脂肪酸。
12.按照權(quán)利要求11的二糖，其中的3-羥基脂肪酸殘基是3-羥基C14脂肪酸。
13.按照權(quán)利要求11或12的二糖，其中的R2是3-羥基脂肪酸殘基。
14.按照權(quán)利要求11或12的二糖，其中的R2’是3-羥基脂肪酸殘基。
15.按照權(quán)利要求1-10之一的二糖，其中R2和R2’兩者都是基團(tuán)Y。
16.按照權(quán)利要求15的二糖，其中的R2和R2’兩者都是一種酰氧?；擋Ｑ貂；?-羥基位經(jīng)酯鍵與(C1-C20)?；?優(yōu)選地是(C10-C18)脂肪酸?；?連接的N-連3-羥基(C4-C24)?；?優(yōu)選地是(C8-C18)脂肪酸?；?。
17.按照權(quán)利要求16的二糖，其中的R2是在3-羥基位經(jīng)酯鍵與C16脂肪酸連接的N-連3-羥基C14脂肪酸酰基，且其中的R2’是在3-羥基位經(jīng)酯鍵與C12脂肪酸連接的N-連3-羥基C14脂肪酸酰基。
18.按照權(quán)利要求1-17之一的二糖，其中的R1是二羥膦酰氧基。
19.按照權(quán)利要求1-18之一的二糖，其中的R4是氫原子。
20.按照權(quán)利要求1-19之一的二糖，其中的R1是α構(gòu)型。
21.按照權(quán)利要求1-20之一的二糖，其中的R3是氫原子。
22.按照權(quán)利要求1-21之一的二糖，其中的R3’是氫原子。
23.按照權(quán)利要求1-22之一的二糖，其中的R6’是羥基。
24.按照權(quán)利要求1-23之一的二糖，其中的R4’是膦酰基。
25.按照權(quán)利要求1-24之一的二糖，其中的二糖是包含一種或多種陽離子的以鹽的形式存在的二糖。
26.按照權(quán)利要求25的二糖，其中的陽離子是堿金屬離子。
27.制備按照權(quán)利要求1-26之一的二糖的方法，該方法包括以下步驟i)提供一種含有包含脂多糖的微生物的類脂A部分的起始物質(zhì)；和ii)對(duì)起始物質(zhì)進(jìn)行堿處理，以使類脂A部分在3位和3’位脫酰化。
28.按照權(quán)利要求27的方法，其中的起始物質(zhì)選自包含脂多糖的微生物、革蘭氏陰性細(xì)菌、這些微生物和革蘭氏陰性細(xì)菌的包含表面結(jié)構(gòu)的組分、或這些微生物和革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖。
29.按照權(quán)利要求27或28的方法，其中的起始物質(zhì)是革蘭氏陰性細(xì)菌的類脂A。
30.按照權(quán)利要求27-29的方法，其中的堿處理在酸處理除去核心部分和多糖側(cè)鏈之前或之后進(jìn)行。
31.含有活性成份和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物，所說的活性成分是按照權(quán)利要求1-26之一的二糖，和/或權(quán)利要求27-30之一中獲得的二糖。
32.按照權(quán)利要求1-26之一的和/或權(quán)利要求27-30之一中獲得的二糖用作免疫調(diào)節(jié)劑和/或抗腫瘤劑。
33.按照權(quán)利要求1-26之一的和/或權(quán)利要求27-30之一中獲得的二糖用作疫苗組分。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有通式(I)的β(1→6)葡糖胺二糖類、制備這些二糖的方法，以這些二糖為活性成分的藥物組合物、以及這些二糖在用作免疫調(diào)節(jié)劑、抗腫瘤劑和疫苗組分上的用途，所述方法包括以下步驟i)提供一種含有含脂多糖微生物的類脂A部分的起始物質(zhì)；ii)對(duì)起始物質(zhì)進(jìn)行堿處理，以使類脂A部分在3位和3′位O-脫?；?。
文檔編號(hào)A61P37/04GK1137799SQ94194201
公開日1996年12月11日 申請(qǐng)日期1994年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月17日
發(fā)明者J·G·戴維斯, J·鮑爾, P·赫特, A·斯庫瑟斯 申請(qǐng)人:實(shí)驗(yàn)室奧姆公司, 德國(guó)奧姆藥物有限公司