本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)方法，具體涉及一種豬肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

豬肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)作為一種體外的培養(yǎng)模型，對于豬營養(yǎng)的基礎(chǔ)研究、生物化學(xué)的物質(zhì)代謝及其肝臟生物學(xué)功能研究均具有重要生物學(xué)意義。豬的原代肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)有較好的重復(fù)性，基本保持原有的肝細(xì)胞分化狀態(tài)與代謝功能。豬的原代細(xì)胞與體內(nèi)情況保持一致，可以在最接近體內(nèi)狀態(tài)下研究豬的營養(yǎng)作用及其調(diào)控機(jī)制。迄今，尚無成熟的可供參考的豬肝細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。由此本實(shí)驗(yàn)對豬肝原代細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，可為新生仔豬肝鐵作用與信號傳導(dǎo)機(jī)制的科學(xué)研究提供肝細(xì)胞材料。

現(xiàn)在肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法一般參考使用如下3種：1.直接分離培養(yǎng)方法：直接取出動物肝臟，機(jī)械破碎肝臟組織，采用胰蛋白酶或膠原蛋白酶消化分離肝細(xì)胞。此方法操作簡單，成本較低，但該法存在分離得到的肝細(xì)胞數(shù)量少，活性較低的缺陷。2.原位“seglen二步膠原酶灌注法”：在動物體內(nèi)建立肝臟循環(huán)系統(tǒng)，先用無ca²⁺、mg²⁺的edta灌注液灌注肝臟，然后用蛋白酶或膠原蛋白酶消化分解細(xì)胞間的連接蛋白，反復(fù)離心，即得到細(xì)胞懸液。但該法存在操作復(fù)雜、成本高、容易污染的缺陷。3.半原位灌注法：在原位seglen二步膠原酶法基礎(chǔ)上，將肝臟取出，在體外進(jìn)行灌注。但該法增加了環(huán)境因素對肝細(xì)胞分離培養(yǎng)的不利影響。上述3種肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法均存在操作復(fù)雜、細(xì)胞培養(yǎng)過程麻煩、增加環(huán)境影響因素、因使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶致使成本較高的缺陷和不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種豬肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中直接分離培養(yǎng)方法分離得到的肝細(xì)胞數(shù)量少、活性較低，原位“seglen二步膠原酶灌注法”和半原位灌注法分離操作復(fù)雜、成本高、肝細(xì)胞容易污染的問題。

為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種豬肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，包括依次進(jìn)行的肝臟的獲取、肝臟組織壓塊、肝細(xì)胞培養(yǎng)、原代細(xì)胞鑒定，其中，所述肝臟組織壓塊是將肝臟于滅菌培養(yǎng)皿中，剪碎后放置在30～60目網(wǎng)篩中碾壓，收集濾過的肝臟組織壓塊于滅菌容器中。

本申請采用網(wǎng)篩碾壓組織塊培養(yǎng)法，通過網(wǎng)篩碾壓得到合適的豬肝臟組織壓塊，大小適宜貼壁生長，肝細(xì)胞長勢良好。

若使用篩網(wǎng)的網(wǎng)孔偏大，則細(xì)胞無法充分分離；若使用篩網(wǎng)的網(wǎng)孔偏小，則肝細(xì)胞分離效果不佳。且使用篩網(wǎng)的網(wǎng)孔偏大或網(wǎng)孔偏小，肝臟組織壓塊都不易貼壁，不利于肝細(xì)胞生長。

采用網(wǎng)篩碾壓組織塊法培養(yǎng)豬肝細(xì)胞，具有操作簡單、由取出肝臟至肝臟組織塊培養(yǎng)于co2培養(yǎng)箱期間，不需要添加胰蛋白酶或膠原蛋白酶、降低了肝細(xì)胞培養(yǎng)成本、具有培養(yǎng)的肝細(xì)胞活性高等優(yōu)勢，是一種較好的可供基礎(chǔ)營養(yǎng)和生物化學(xué)研究使用豬肝細(xì)胞培養(yǎng)方法。

作為優(yōu)選的，所述肝臟來源于非病死的新生仔豬，所述新生仔豬的豬齡小于5h。由于新生仔豬的細(xì)胞活性高、容易分離，所以肝臟優(yōu)選于新生仔豬。

作為優(yōu)選的，所述肝臟的獲取是將新生仔豬浸泡于酒精中消毒后，頸部處死，移至超凈工作臺，取出肝臟，剝除纖維成分，所述纖維成分包括被膜和血管。

作為優(yōu)選的，所述酒精為體積分?jǐn)?shù)75%的酒精，消毒時間為15-20s。

作為優(yōu)選的，碾壓肝臟時不斷用含血清dmem沖洗后離心，得到肝臟組織壓塊。

本申請中碾壓肝臟是將肝臟置于篩網(wǎng)上，然后用與篩網(wǎng)大小相配的物體碾壓肝臟，使得符合要求的肝臟組織壓塊從篩網(wǎng)上透過，然后將其收集于滅菌的容器中。

作為優(yōu)選的，所述肝細(xì)胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液為高糖型dmem培養(yǎng)液，其中還含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8-10%胎牛血清和0.8-1%雙抗培養(yǎng)基。

使用dmem培養(yǎng)液，胎牛血清（gibco），由取出肝臟至肝臟組織塊培養(yǎng)于co2培養(yǎng)箱期間，不需要使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶消化細(xì)胞、具有操作簡單、降低了肝細(xì)胞原代培養(yǎng)成本、具有培養(yǎng)的肝細(xì)胞活性高等優(yōu)勢。

作為優(yōu)選的，將所述含肝臟組織塊的培養(yǎng)液置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

作為優(yōu)選的，從取出肝臟至將含肝臟組織塊的培養(yǎng)液置于co2培養(yǎng)箱中所經(jīng)過的時間小于90min。

若肝細(xì)胞原代培養(yǎng)處理時間過長，會導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，對細(xì)胞后期的培養(yǎng)也會有不利影響。

作為優(yōu)選的，培養(yǎng)的細(xì)胞為豬原代肝細(xì)胞。

采用網(wǎng)篩碾壓組織塊培養(yǎng)分離的肝細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，明確肝細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，與dirk等研究報(bào)道肝細(xì)胞形態(tài)一致。且將本方法培養(yǎng)的細(xì)胞送到國家細(xì)胞庫鑒定，鑒定結(jié)果也明確網(wǎng)篩碾壓法培養(yǎng)的為豬的原代肝細(xì)胞。迄今，未見網(wǎng)篩碾壓組織塊培養(yǎng)法得到的豬原代肝細(xì)胞。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果至少是如下之一：

（1）由取出肝臟至肝臟組織塊培養(yǎng)于co2培養(yǎng)箱期間，不經(jīng)胰酶消化，對細(xì)胞損失較小。

（2）網(wǎng)篩研磨過網(wǎng)，雜細(xì)胞較少，操作簡單，不易受到污染。

（3）相較于胰酶灌注法，節(jié)約成本，方法簡單。

（4）無需其它營養(yǎng)因子如細(xì)胞生長因子等，節(jié)約成本。

（5）本法培養(yǎng)的肝細(xì)胞可以供豬的基礎(chǔ)營養(yǎng)、生物化學(xué)等科學(xué)研究和使用。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明方法培養(yǎng)的豬肝細(xì)胞的放大圖。

圖2為細(xì)胞培養(yǎng)液中l(wèi)dh含量隨時間的變化曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例提供了一種豬肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，包括依次進(jìn)行的肝臟的獲取、肝臟組織壓塊、肝細(xì)胞培養(yǎng)、原代細(xì)胞鑒定，其中，所述肝臟組織壓塊是將肝臟置于滅菌培養(yǎng)皿中，剪碎后放置在30～60目網(wǎng)篩中碾壓，收集濾過的肝臟組織壓塊于滅菌容器中。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步限定了：所述肝臟來源于新生仔豬，所述新生仔豬的豬齡小于5h，所述豬齡是指豬從出生至獲取肝臟的時間。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步限定了：所述肝臟的獲取是將新生仔豬浸泡于酒精中消毒后，頸部處死，移至超凈工作臺，取出肝臟，剝除纖維成分，所述纖維成分包括被膜和血管。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例是在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步限定了：所述酒精為體積分?jǐn)?shù)75%的酒精，消毒時間為20s。

實(shí)施例5：

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步限定了：碾壓肝臟時不斷用含血清dmem沖洗后離心，得到肝臟組織壓塊。

實(shí)施例6：

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步限定了：所述肝細(xì)胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液為高糖型dmem培養(yǎng)液，其中還含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和1%雙抗培養(yǎng)基。

實(shí)施例7：

本實(shí)施例是在實(shí)施例6的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步限定了：將所述含肝臟組織塊的培養(yǎng)液置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)施例8：

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步限定了：從取出肝臟至將含肝臟組織塊的培養(yǎng)液置于co2培養(yǎng)箱中所經(jīng)過的時間小于90min。

實(shí)施例9：

本實(shí)施例提供了一種豬肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，包括依次進(jìn)行的下列步驟：

肝臟的獲?。焊闻K來源于新生仔豬，所述新生仔豬的豬齡小于5h，豬齡是指豬從出生至獲取肝臟的時間；將新生仔豬浸泡于體積分?jǐn)?shù)75%的酒精中消毒15-20s后，頸部處死，移至超凈工作臺，取出肝臟，剝除被膜和血管等纖維成分；

肝臟組織壓塊：將肝臟于滅菌培養(yǎng)皿中，剪碎后放置在30～60目網(wǎng)篩中碾壓，本實(shí)施例中使用的網(wǎng)篩為底面是篩網(wǎng)的柱形不銹鋼網(wǎng)篩，碾壓肝臟時不斷用含血清dmem培養(yǎng)液沖洗，收集濾過的肝臟組織壓塊于已滅菌的50ml離心管中進(jìn)行離心，去除沖洗液，得到肝臟組織壓塊；

肝細(xì)胞培養(yǎng)：將肝臟組織壓塊置于高糖型dmem培養(yǎng)液中培養(yǎng)，所述高糖型dmem培養(yǎng)液中還含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和1%雙抗培養(yǎng)基；然后將含肝臟組織壓塊的培養(yǎng)液置于co2培養(yǎng)箱中，其中從取出肝臟至將肝臟組織壓塊置于co2培養(yǎng)箱中所經(jīng)過的時間小于90min；

原代細(xì)胞鑒定：將本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞送到國家細(xì)胞庫鑒定，鑒定結(jié)果明確網(wǎng)篩碾壓法培養(yǎng)的為豬原代肝細(xì)胞；對本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察：如圖1a所示，將本申請方法培養(yǎng)得到的細(xì)胞放大200倍，可見細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，貼壁生長；圖1b將本申請方法培養(yǎng)得到的細(xì)胞放大50倍，可見以肝臟組織壓塊為中心，細(xì)胞貼壁且成片生長；圖1c、圖1d將本申請方法培養(yǎng)得到的細(xì)胞放大100倍，可見視野下長滿的肝臟細(xì)胞。

另外，對本申請方法培養(yǎng)得到的豬肝臟細(xì)胞的功能進(jìn)行測定：選取培養(yǎng)組織塊分離的新鮮肝細(xì)胞1、3、5、7天得到的細(xì)胞培養(yǎng)液，測定其中l(wèi)dh含量，測定結(jié)果如圖2所示，從圖2可以看出，隨著時間的延長細(xì)胞培養(yǎng)液中l(wèi)dh含量不斷增加，也就是隨時間延長，細(xì)胞開始衰老，但衰老的速度較慢。

盡管這里參照本發(fā)明的多個解釋性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)出很多其他的修改和實(shí)施方式，這些修改和實(shí)施方式將落在本申請公開的原則范圍和精神之內(nèi)。更具體地說，在本申請公開和權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以對主題組合布局的組成部件和/或布局進(jìn)行多種變型和改進(jìn)。除了對組成部件和/或布局進(jìn)行的變形和改進(jìn)外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，其他的用途也將是明顯的。