專利名稱：半乳糖苷酶a缺乏癥的治療的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及α-半乳糖苷酶A和對(duì)α-半乳糖苷酶A缺乏癥的治療。
彌漫性軀體血管角化瘤(Fabry)病是一種X連續(xù)遺傳性溶酶體貯積病，其特征在于有諸如嚴(yán)重腎損害、血管角化瘤和心血管異常，包括心室擴(kuò)大和二尖瓣閉鎖不全等體征。該病也影響外周神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致極度痛苦的肢端燒灼樣疼痛發(fā)作。由于α-半乳糖苷酶A(α-gal A)缺乏，導(dǎo)致中樞糖神經(jīng)鞘脂的分解代謝受阻滯，酶底物、神經(jīng)酰胺三己糖苷(trihexoside)在細(xì)胞里和血流里積聚引起此病。
由于該病是X連續(xù)遺傳類型，故基本上所有的彌漫性軀體血管角化瘤病病人都是男性。雖然已觀察到一些受嚴(yán)重影響的女性雜合體，但女性雜合體一般或沒有癥狀，或主要向限在特征性角膜混濁的輕微體征。彌漫性軀體血管角化瘤病的一種非典型變體顯示為低殘留α-半乳糖苷酶A活性，以及或癥狀很輕微，或似乎沒有與左心室肥大和心臟病病相關(guān)的彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病的其它特征性體征(Nakano等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New.Engl.J Med)333:288-293,1995)?，F(xiàn)推測(cè)α-半乳糖苷酶A的減少可能是這類心臟異常的原因。
已分離和測(cè)序了編碼人α-半乳糖苷酶A的cDNA和基因(Bishop等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4859,1986；Kornreich等，Nuc.Acids Res.17:3301,1988；Oeltjen等，哺乳動(dòng)物基因組(Mammalian Genome)6:335-338.1995)。人α-半乳糖苷酶A被表達(dá)為429個(gè)氨基酸的多肽，其中N-末端的31個(gè)氨基酸構(gòu)成了信號(hào)肽。人體此酶已在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)(Desnick，美國(guó)專利5,356,804；Ioannou等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)119:1137,1992)；在昆蟲細(xì)胞(Calhoun等，美國(guó)專利5,179,023)中表達(dá)；和在COS細(xì)胞中表達(dá)(Tsuji等，Eur.J.Biochem.165:275,1987)。已報(bào)道了用衍生于人體組織的該蛋白質(zhì)進(jìn)行α-半乳糖苷酶A的替代療法的小規(guī)模試驗(yàn)(Mapes等，Science169:987 1970；Brady等，N.Engl.J.Med.289:9,1973；Desnick等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5326,1979)，但對(duì)彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病暫時(shí)沒有有效的治療方法。
發(fā)明綜述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人細(xì)胞里表達(dá)編碼人體α-半乳糖苷酶A的DNA產(chǎn)生了一種多肽，它恰當(dāng)?shù)乇惶腔?，結(jié)果它不僅有酶活性，能作用于彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病積聚的糖神經(jīng)鞘脂底物，而且能通過細(xì)胞表面受體被細(xì)胞有效地內(nèi)化，此種細(xì)胞表面受體能將α-gal A精確導(dǎo)向此病所需的目標(biāo)受影響細(xì)胞特別是病人血管壁上的上皮細(xì)胞的溶酶體小室。該發(fā)現(xiàn)(將在下面作更詳盡的討論)意味著懷疑患有α-半乳糖苷酶A缺乏癥，如彌漫性體軀血管角質(zhì)瘤的人可用(1)已經(jīng)基因修飾能過度表達(dá)和分泌人α-半乳糖苷酶A的人細(xì)胞或(2)從培養(yǎng)的、基因修飾的人細(xì)胞獲得的純化人α-半乳糖苷酶A來治療。
如Selden等在WO93/09222中的所述(已納入本文作為)，通過第一途徑即用修飾細(xì)胞本身的療法，涉及體外或離體人細(xì)胞(如初級(jí)細(xì)胞，次級(jí)細(xì)胞或不死細(xì)胞)的基因操縱通過將這些細(xì)胞植入病人誘導(dǎo)它們表達(dá)和分泌高水平的人α-半乳糖苷酶A，細(xì)胞進(jìn)行基因修飾目的是用于基因療法或酶替代療法治療Fabry病，含α-半乳糖苷酶A cDNA或基因組DNA序列的DNA分子可被包含在表達(dá)構(gòu)建物中，并通過標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法，包括，但不限于，脂質(zhì)體-、聚凝胺-或DEAE右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法，磷酸鈣沉淀法，顯微注射或速度驅(qū)動(dòng)發(fā)射體(“biolistics”)引入初級(jí)或次級(jí)人體細(xì)胞(如，成纖維細(xì)胞，包括乳房和腸上皮細(xì)胞等上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞等血液有形成分、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或這些類型細(xì)胞的前體細(xì)胞)。另外，人們可使用病毒載體來遞送DNA的系統(tǒng)。已知用于基因轉(zhuǎn)移的病毒包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、新培斯(Sindbis)病毒和諸如金絲崔痘病毒的痘苗病毒。雖然初級(jí)或次級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物是本發(fā)明的優(yōu)選治療方法，也可使用不死的人細(xì)胞。用于本發(fā)明的不死的人細(xì)胞系包括，但不限于，Bows黑素瘤細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CRL9607),Daudi細(xì)胞(ACTT保藏號(hào)CCL213)、Hele細(xì)胞和及其衍生細(xì)胞(ACTT保藏號(hào)CCL2,CCL2.1和CCL2.2)、HL-60細(xì)胞(ACTT保藏號(hào)CCL240)、HT1080細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CCL121),Jurkat細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)TIB152)、KB癌細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CCL17)、K-562白血病細(xì)胞(ACTT保藏號(hào)CCL243)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)BTH22)、MOLT-4細(xì)胞(ACTT保藏號(hào)1582)、Namalwa細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CRL1432)、Raji細(xì)胞(ACTT保藏號(hào)CCL86)、RPMI8226細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CCL155)、U-937細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CRL1593)、WI-38VA13亞系2R4細(xì)胞(ATCC保藏號(hào)CLL75.1)和2780AD卵巢癌細(xì)胞(Van der Blick等，癌癥研究(Cancer Res)48:5927-5932,1988)及通過人細(xì)胞和另一種動(dòng)物細(xì)胞融合的異質(zhì)性雜交瘤細(xì)胞。也可使用次級(jí)人成纖維細(xì)胞株，如WI-38(ATCC保藏號(hào)CCL75)和MEC-5(ATCC保藏號(hào)CCL171)。
以編碼α-半乳糖苷酶A的DNA分子將人細(xì)胞基因工程(或用如下所述的另外的合適的基因修飾后)化產(chǎn)生了過度表達(dá)和分泌α-半乳糖苷酶A的細(xì)胞后，也許可產(chǎn)生基本上由許多遺傳上相同培養(yǎng)的初級(jí)人細(xì)胞構(gòu)成的克隆細(xì)胞株；或，當(dāng)這些細(xì)胞不死時(shí)，可產(chǎn)生基本上由許多遺傳上相同的不死的人細(xì)胞組成的克隆細(xì)胞系優(yōu)選的是，此克隆細(xì)胞株或克隆細(xì)胞系是成纖維細(xì)胞。
然后可通過合適的方法，如Selden等(WO93/09222所述的方法)來制備基因修飾的細(xì)胞并引入病人體內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的基因療法與用衍生于人體或動(dòng)物組織的酶的替代療法相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，本發(fā)明的方法不依賴于可能不穩(wěn)定的合適組織的來源，故具有治療α-半乳糖苷酶A缺乏癥的商品可行性。與用可能被已知或未知病毒和其它傳染因子感染的人體組織酶的酶替代療法相比，它相對(duì)無(wú)危險(xiǎn)。此外，本發(fā)明的基因療法與一般的酶替代療法相比還有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，本發(fā)明方法(1)提供了長(zhǎng)程治療方法的好處不需要每天注射；(2)消除了通常伴隨常規(guī)藥物遞送而出現(xiàn)的治療性蛋白質(zhì)的血清和組織濃度的極端波動(dòng)；和(3)可能比酶替代療法更便宜，因?yàn)椴恍枰a(chǎn)和純化蛋白質(zhì)供頻繁用藥。
如上所述，患有α-半乳糖苷酶A缺乏癥的個(gè)體也許可用純化的α-半乳糖苷酶A進(jìn)行治療(即酶替代療法)。經(jīng)基因修飾能過度表達(dá)人α-半乳糖苷酶A的初級(jí)、次級(jí)或不死的人細(xì)胞也可用于體外此酶蛋白的生產(chǎn)，以生產(chǎn)出可被純化、用于酶替代療法的該酶蛋白質(zhì)。可從上述的細(xì)胞中選擇次級(jí)或不死人細(xì)胞，并通過上述的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法進(jìn)行基因修飾?；蛐揎椇螅谠试S過度表達(dá)和分泌α-半乳糖苷酶A的條件下培養(yǎng)此細(xì)胞。通過收集細(xì)胞生長(zhǎng)于其中的培養(yǎng)基和/或溶解細(xì)胞以釋放其中的內(nèi)容物，然后用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離得到此酶蛋白質(zhì)。一種這類技術(shù)涉及將培養(yǎng)基或含人α-半乳糖苷酶A的樣品通過疏水性反應(yīng)樹脂，如Butyl Sepharose或其它有丁基功能團(tuán)部分的樹脂。將樣品通過這類樹脂構(gòu)成了第一層析步驟。若需要進(jìn)一步的純化，可將從疏水反應(yīng)樹脂中洗脫的含α-半乳糖苷酶A的材料通過含第二樹脂柱，如HeparinSepharose固定化肝素樹脂，羥基磷灰石，諸如Q Sepharose陰離子交換樹脂，或諸如Superdex200的分子篩樹脂。優(yōu)選的是，純化方案包括使用上述類型樹脂中的每一種。另外，可在疏水性反應(yīng)樹脂前使用一種或多種后面的樹脂，或不用疏水性樹脂。
原先制備相對(duì)高純度α-半乳糖苷酶A的方法依賴于使用親和層析，用凝集素親和層析(伴刀豆球蛋白(Con A)瓊脂糖凝膠)和基于α-半乳糖苷酶A與瓊脂糖基質(zhì)交聯(lián)的底物類似物N-6-氨基己酰基-α-D-半乳糖胺結(jié)合的親和層析(Bishop等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)256:1307-1316,1981)。使用蛋白質(zhì)性凝集素親和樹脂和底物類似物樹脂，通常伴有從固體支持物上不斷瀝濾的親和劑(參見Marikar等，Anal.Biochem.201:306-310,1992)，導(dǎo)致純化產(chǎn)物污染了游離在溶液里或與洗脫蛋白質(zhì)結(jié)合的親和劑，這類污染物使該產(chǎn)物不宜用于藥物制劑中。結(jié)合的底物類似物和凝集素對(duì)該蛋白質(zhì)的酶促、功能和結(jié)構(gòu)性能也有負(fù)面影響。此外，這類親和樹脂制備通常很昂貴，使之與常規(guī)的層析樹脂相比更不適宜以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。這樣，開發(fā)使用在供應(yīng)和質(zhì)量上都很適合大規(guī)模商業(yè)用途的常規(guī)色譜層析的純化方案是本發(fā)明的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)。
疑患有α-半乳糖苷酶A缺乏癥的個(gè)體可通過標(biāo)準(zhǔn)的給藥方法，包括，但不限于靜注、皮下注射或肌注或作為固體植入，給予藥學(xué)上可接受的純化的人α-半乳糖苷酶A進(jìn)行治療。純化的該蛋白質(zhì)可配制成治療組合物，此組合物由含生理上可接受的賦形劑，如人血清白蛋白載體的水溶液構(gòu)成，其pH為6.5或更低。本發(fā)明因此為得到大量恰當(dāng)糖基化因此可用于治療的人α-半乳糖苷酶A提供了手段。這使得α-半乳糖苷酶A缺乏癥的酶替代治療法具有商品可行性，與用人體或動(dòng)物組織酶治療相比相對(duì)無(wú)危險(xiǎn)性。
熟悉本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域的人員認(rèn)識(shí)到，人α-半乳糖苷酶A DNA序列(cDNA或基因組DNA)，或由于沉默密碼子改變或由于產(chǎn)生保守性氨基酸取代的密碼子改變而產(chǎn)生的與其不同的序列，可用于基因修飾培養(yǎng)的人細(xì)胞，使它們可過度表達(dá)和分泌此酶。也可能α-半乳糖苷酶A的DNA序列中某些突變會(huì)編碼出這樣的多肽，即它們保留了或顯示出改進(jìn)的α-半乳糖苷酶A酶活性(如本文所述，這可通過使培養(yǎng)細(xì)胞中突變的DNA分子表達(dá)，純化編碼的多肽和測(cè)定催化活性而顯現(xiàn))。例如，人們可期望保守性氨基酸替代物對(duì)其生物活性幾乎沒有或沒有影響，特別是若它們的存在量低于蛋白質(zhì)中殘留物總數(shù)的10％時(shí)，更是如此。保守性替代物通常包括在下列各組中的替代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
通過特定的基因操作可使細(xì)胞產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶A最大量化。例如，編碼α-半乳糖苷酶A的DNA分子也可編碼異源性信號(hào)肽，如人體生長(zhǎng)激素(hGH)的信號(hào)肽，紅細(xì)胞生成素，因子Ⅷ，因子Ⅸ，胰高血糖素，低密度脂蛋白(LDL)受體，或非α-半乳糖苷酶A的溶酶體酶類。優(yōu)選的是，該信號(hào)肽是hGH信號(hào)肽(SED ID NO:21)，位于該編碼蛋白的N-端。編碼信號(hào)肽的DNA序列可含諸如hGH基因的第一內(nèi)含子的內(nèi)含子，得到諸如SEQ ID NO:27的序列(參見

圖10)。此外，此DNA分子也可含3’非翻譯序列(UTS)，其長(zhǎng)度至少為6個(gè)核苷酸(與人體發(fā)現(xiàn)的α-半乳糖苷酶A的mRNA相反，后者沒有3’UTS，這要求多腺苷酸化位點(diǎn)在此編碼序列內(nèi))。UTS處于該編碼序列的末端密碼子的3’旁，并包括多腺苷酸化位點(diǎn)。較優(yōu)的長(zhǎng)度至少為6個(gè)核苷酸，更優(yōu)的是至少12個(gè)，最好至少有30個(gè)核苷酸，在所有情況下都含有序列AATAA或促進(jìn)多腺苷酸化的相關(guān)序列。這里所述的DNA序列，即，編碼連接于α-半乳糖苷酶A的hGH信號(hào)肽，并含有包括多腺苷酸化位點(diǎn)的3’UTS，和較優(yōu)地包括表達(dá)控制序列，也在本發(fā)明中。在本發(fā)明的范圍里還有一個(gè)DNA分子，它編碼的蛋白質(zhì)包括與α-半乳糖苷酶A或任何其它異源多肽(即，非hGH或非hGH類似物的多肽)連接的hGH信號(hào)肽。該異源多肽通常是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，例如任何醫(yī)學(xué)上需要的人多肽。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)可從下列詳盡的闡述和權(quán)利要求書中看出。
本文用于細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“基因修飾”意指包括在將編碼基因產(chǎn)物的DNA分子和/或控制編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件引入后，表達(dá)特定基因產(chǎn)物的細(xì)胞?？赏ㄟ^基因定向引入DNA分子(即，將DNA分子引入特定的基因組位點(diǎn))；此外，同源重組使有缺陷的基因本身得以代替(在彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病病人的自身細(xì)胞里有缺陷的α-半乳糖苷酶A基因或其部分可用該全基因或其部分代替)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“α-半乳糖苷酶A”指沒有信號(hào)肽的α-半乳糖苷酶A，信號(hào)肽見SEQ ID NO:26(圖9)。有一些跡象表示，SEQ ID NO:26(圖9)的殘基371到398，或373到398可在溶酶體中除去；但是，除去該推定的前肽據(jù)信不會(huì)影響酶的活性。這提示，可刪去此推定前肽的任何部分而不影響活性。這樣，本文的術(shù)語(yǔ)“α-半乳糖苷酶A”也覆蓋了一個(gè)蛋白質(zhì)，它具有SEQ ID NO:26，相對(duì)應(yīng)的序列，除了該序列C未端28個(gè)殘基外。
“α-半乳糖苷酶A缺乏癥”指病人此酶的量或活性缺乏。該缺乏可能會(huì)誘發(fā)通常在患有彌漫性軀體角質(zhì)瘤病男性中所見到的嚴(yán)重癥狀，或可能僅僅在雜接合的女有缺陷基因攜帶者中所看到的相對(duì)輕的癥狀。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“初級(jí)細(xì)胞”包括存在于從脊椎動(dòng)物組織源分離的細(xì)胞懸液里的細(xì)胞(在它們被接種前，即貼附到組織培養(yǎng)物如平皿或燒瓶前)，在衍生于此細(xì)胞首次接種前組織的外植體中的細(xì)胞，和衍生于這些接種細(xì)胞的細(xì)胞懸液。
“次級(jí)細(xì)胞”指培養(yǎng)中所有后續(xù)步驟中的細(xì)胞。即第一次接種后的初級(jí)細(xì)胞從培養(yǎng)底物中取出后再接種(傳代)，它被稱為次級(jí)細(xì)胞，是如同后續(xù)傳代中的所有細(xì)胞。
“細(xì)胞株”由傳代一次或多次的次級(jí)細(xì)胞構(gòu)成；顯示在培養(yǎng)中平均群體倍增的數(shù)量有限；顯示接觸-抑制性質(zhì)、貼壁依賴性生長(zhǎng)性質(zhì)(在懸浮培養(yǎng)中繁殖的細(xì)胞除外)；而且是不死的。
“不死細(xì)胞”指建立的細(xì)胞系細(xì)胞，它們?cè)谂囵B(yǎng)中顯示明顯無(wú)限的壽命。
術(shù)語(yǔ)“信號(hào)肽”指一種肽序列，它引導(dǎo)它所連接的新合成的多肽附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以進(jìn)行下一步的翻譯后加工和/或分布。
本文對(duì)α-半乳糖苷酶A使用的術(shù)語(yǔ)“異源信號(hào)肽”，指不是人α-半乳糖苷酶A信號(hào)肽的信號(hào)肽(即，被SEQ ID NO:18的核苷酸36-128編碼)。它通常是一些非α-半乳糖苷酶A的哺乳動(dòng)物蛋白的信號(hào)肽。
術(shù)語(yǔ)“第一層析步驟”指樣品首先用的層析柱(所有與樣品制備有關(guān)的步驟都除外)。
附圖簡(jiǎn)述圖1是代表用于從人成纖維細(xì)胞cDNA庫(kù)分離α-半乳糖苷酶A的210bp的探針(SEQ ID NO:19)。該序列來自α-半乳糖苷酶A的外顯子7。該探從人體基因組DNA中通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分離得到。圖中有下劃線的區(qū)域相應(yīng)于擴(kuò)增引物的序列。
圖2代表完成α-半乳糖苷酶A cDNA克隆5’末端的DNA片斷的序列(SEQID NO:20)。該片斷從人體基因組DNA用PCR擴(kuò)增。下劃線區(qū)域相應(yīng)于擴(kuò)增引物的序列。也顯示了NcoⅠ和SacⅡ限制內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，如在實(shí)施例1A中所述用于亞克隆。
圖3代表了α-半乳糖苷酶A的cDNA序列，包括編碼信號(hào)肽的序列(SEQ IDNO:18)。
圖4是pXAG-16的示意圖，pXAG-16是α-半乳糖苷酶A的表達(dá)構(gòu)建物，包括CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子和內(nèi)含子，hGH信號(hào)肽編碼序列和第一內(nèi)含子，α-半乳糖苷酶A的cDNA(即缺乏α-半乳糖苷酶A信號(hào)肽的序列)和hGH3’UTS。
圖5是pXAG-28的示意圖，pXAG-28是α-半乳糖苷酶A表達(dá)的構(gòu)建物，包括膠源Iα2啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子，hGH信號(hào)肽編碼序列和第一內(nèi)含子，α-半乳糖苷酶A的cDNA(即缺乏α-半乳糖苷酶A信號(hào)肽的序列)和hGH3’UTS。
圖6是α-半乳糖苷酶A純化步驟用Butyl Sepharose樹脂的色譜層析圖。它顯示了280nm處的吸光值(普通線)和所選組分的α-半乳糖苷酶A活性(帶點(diǎn)線)。
圖7是描述Fabry成纖維細(xì)胞內(nèi)化本發(fā)明制備的人α-半乳糖苷酶A的直線圖。用本發(fā)明制備的增加濃度的人α-半乳糖苷酶A培養(yǎng)細(xì)胞后，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)α-半乳糖苷酶A活性和總蛋白質(zhì)濃度。顯示了潛在的內(nèi)化-抑制劑甘露糖-6磷酸(M6P；空心方塊)和甘露聚糖(空心圓)的作用。
圖8是一個(gè)設(shè)計(jì)用來在α-半乳糖苷酶A內(nèi)化后檢查Fabry成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性示例的示意圖。Fabry細(xì)胞在接觸正常的或培養(yǎng)在TranswellTM插入物中的α-半乳糖苷酶A過度表達(dá)的人成纖維細(xì)胞后測(cè)定該細(xì)胞的α-半乳糖苷酶A活性?！癕6P”=甘露糖-6-磷酸；“UntrfHF”=未轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞；“BRS11”=轉(zhuǎn)染的、α-半乳糖苷酶A過度表達(dá)的成纖維細(xì)胞株。
圖9代表人體α-半乳糖苷酶A氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。
圖10代表編碼hGH信號(hào)肽和含第一hGH內(nèi)含子(劃線部分)的DNA序列(SEQ ID NO:27)。
圖11代表沒有內(nèi)含子的編碼hGH信號(hào)肽的DNA序列(SEQ ID NO:22)。
圖12代表hGH信號(hào)肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。
圖13代表編碼人α-半乳糖苷酶A的cDNA序列(沒有信號(hào)肽)(SEQ IDNO:25)。
發(fā)明詳述諸如α-半乳糖苷酶A的溶酶體酶通過與甘露糖-6-磷酸鹽(M6P)受體相互作用而導(dǎo)向細(xì)胞的溶酶體小室，它與(預(yù)定為)溶酶體小室酶的寡糖部分中存在的M6P殘基結(jié)合(Kornfeld,S.和Mellman,I.Ann.Rev.Cell Biol.5:483-525,1989)。初級(jí)相互反應(yīng)在高爾基體中發(fā)生，其中與高爾基體M6P受體結(jié)合的酶被分開隔離，以運(yùn)送到溶酶體。次級(jí)相互反應(yīng)據(jù)信發(fā)生在細(xì)胞外α-半乳糖苷酶A和細(xì)胞表面的M6P受體之間。被細(xì)胞內(nèi)化的細(xì)胞外物質(zhì)以胞吞小泡經(jīng)細(xì)胞質(zhì)運(yùn)送，小泡與初級(jí)溶酶體融合并將其內(nèi)含物排空入溶酶體。在該過程中，細(xì)胞表面的M6P受體也摻入胞吞小泡并運(yùn)送到溶酶體。
在細(xì)胞外環(huán)境里的α-半乳糖苷酶A，若帶有M6P殘基，則結(jié)合到細(xì)胞表面M6P受體，從而與受體一起運(yùn)送入溶酶體小室。一旦由于此捕獲通路而進(jìn)入溶酶體小室里，此酶可執(zhí)行它合適的功能。這樣，即使細(xì)胞有基因缺陷不能產(chǎn)生其自體的α-半乳糖苷酶A，也存在攝入外源產(chǎn)生酶的機(jī)制。條件是(a)此酶是恰當(dāng)糖基化的，和(b)缺陷的細(xì)胞帶有M6P受體。
在彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病中，腎臟和心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞已顯示出嚴(yán)重的組織病理學(xué)異常，導(dǎo)致該病的臨床病理學(xué)變化；不攜帶M6P受體的這些細(xì)胞，是本發(fā)明的特定目標(biāo)。本發(fā)明生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶A可通過基因療法(即在病人體內(nèi)種植表達(dá)和分泌糖化酶的基因修飾細(xì)胞)或通過常規(guī)的給藥途徑經(jīng)局部或全身遞送給受影響細(xì)胞。以N-連接的寡糖形式存在于α-半乳糖苷酶A中的M6P對(duì)于本發(fā)明的療法極為重要。
此外，α-半乳糖苷酶A的N-連接的寡糖的被唾液酸化修飾的程度也是很重要的。缺乏合適的唾液酸化時(shí)，α-半乳糖苷酶A由于被肝無(wú)唾液酸糖蛋白受體結(jié)合而被迅速?gòu)难h(huán)中清除，然后被肝細(xì)胞內(nèi)化并分解(Ashwell和Harford,Ann.Rev.Biochem.51:531-554,1982)。這減少了循環(huán)中可與細(xì)胞上M6P受體結(jié)合的α-半乳糖苷酶A的量，所述的細(xì)胞與彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病的臨床病理學(xué)變化相關(guān)，如腎臟和心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。令人驚奇的是，本申請(qǐng)人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞所分泌的α-半乳糖苷酶A具有糖化性質(zhì)，它適合用基因療法或常規(guī)地給予純化的分泌蛋白質(zhì)來治療彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病。這與最佳研究的溶酶體酶、葡糖腦苷脂酶的情況相反，其中從人體胎盤純化的此酶或由轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞分泌到體內(nèi)臨床相關(guān)細(xì)胞的此酶的遞送，要求在純化后對(duì)此酶進(jìn)行復(fù)雜的酶促修飾(參見Beutiler,New Engl.J.Med.325:1354-1360,1991)。
本發(fā)明的療法可以兩種一般方法進(jìn)行通過給病人引入治療有效量的純化的從培養(yǎng)的基因修飾過能過度表達(dá)和分泌此酶的人細(xì)胞中得到的、人α-半乳糖苷酶A，或通過給病人引入過度表達(dá)的細(xì)胞本身。下面討論進(jìn)行必須的基因修飾的技術(shù)，純化的方法、配制和治療。
實(shí)施例Ⅰ．用來傳遞和表達(dá)α-gal A的構(gòu)建物的制備及其應(yīng)用構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒pXAG-16和pXAG-28。這些質(zhì)粒含有編碼α-gal A酶398個(gè)氨基酸(沒有α-gal A信號(hào)肽)的人α-gal A cDNA；人生長(zhǎng)激素(hGH)信號(hào)肽基因組DNA序列，它被hGH基因的第一個(gè)內(nèi)含子所間斷；以及hGH基因的含有聚腺苷酸化信號(hào)的3′非翻譯序列(UTS)。質(zhì)粒pXAG-16有人巨細(xì)胞病毒立即早期(CMVIE)啟動(dòng)子和第一個(gè)內(nèi)含子(側(cè)接非編碼的外顯子序列)，而pXAG-28是由膠原Iα2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，它還含有β-肌動(dòng)蛋白基因的5′非翻譯序列，該序列中含有β-肌動(dòng)蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子。
A．全長(zhǎng)α-gal A cDNA的克隆以及α-gal A表達(dá)質(zhì)粒pXAG-16的構(gòu)建從按照下述方式構(gòu)建的人成纖維細(xì)胞cDNA文庫(kù)中克隆出人α-gal AcDNA。從全部RNA中分離出Poly-A+mRNA，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)(Stratagene Inc.,LaJolla,CA)用λZapⅡ系統(tǒng)用的試劑合成cDNA。簡(jiǎn)言之，在含有內(nèi)部XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的寡脫氧胸苷引物的存在下，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA的“第一鏈”。用RNA酶H處理后，用DNA聚合酶Ⅰ將cDNA切口平移，產(chǎn)生雙鏈cDNA。用T4DNA聚合酶將該cDNA變成平頭，連接到EcoRⅠ銜接頭上。該連接產(chǎn)物用T4 DNA激酶處理并用XhoⅠ消化。cDNA用Sephacryl-400層析組分。合并大的和中等大小的組分，將cDNA連接到EcoRⅠ和XhoⅠ消化的λZapⅡ臂上。然后包裝該連接產(chǎn)物并滴定。該初級(jí)文庫(kù)的滴度為1.2×107pfu/ml，插入物平均大小為925bp。
用人α-gal A基因外顯子7的210bp的探針(圖1,SEQ ID NO:19)來分離該cDNA。探針本身是采用下列寡核苷酸通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從基因組DNA中分離獲得的5′-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3′(寡核苷酸1；SEQ ID NO:1)和5′-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3′(寡核苷酸2；SEQ ID NO:2)。然后用PCR產(chǎn)物來篩選成纖維細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，分離陽(yáng)性克隆作進(jìn)一步的性質(zhì)鑒定。根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)，對(duì)一個(gè)陽(yáng)性克隆噬菌體3A進(jìn)行λZapⅡ系統(tǒng)切割步驟(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA)。該步驟產(chǎn)生了質(zhì)粒pBSAG3A，該質(zhì)粒在pBluescriptSK-TM質(zhì)粒骨架中含有α-gal A cDNA序列。DNA測(cè)序揭示了該質(zhì)粒不含此cDNA序列完整的5′端。因此，用從人基因組DNA擴(kuò)增得到的PCR片段重新構(gòu)建5′端。為了實(shí)現(xiàn)這一過程，用下列寡核苷酸擴(kuò)增268bp的基因組DNA片段(圖2,SEQ ID NO:20):5′-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3′(寡核苷酸3；SEQID NO:3)和5′-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3′(寡核苷酸4；SEQ ID NO:4)。將該片段亞克隆入“TA”克隆質(zhì)粒(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pTAAGEI。用SacⅡ和NcoⅠ各自消化含有大部分α-gal A cDNA序列的質(zhì)粒pBSAG3A和含有α-gal A cDNA 5′末端的質(zhì)粒pTAAGEI。擴(kuò)增的DNA片段中相關(guān)的SacⅡ和NcoⅠ位點(diǎn)的位置顯示在圖2中。分離pTAAGEI中0.2kb的SacⅡ-NcoⅠ片段并連接到同樣方式消化的pBSAG3A中。該質(zhì)粒pAGAL含有全部的α-gal AcDNA序列，包括編碼α-gal A信號(hào)肽的序列。對(duì)cDNA進(jìn)行完整的測(cè)序(如圖3所示，包括α-gal A信號(hào)肽；SEQ ID NO:18)，發(fā)現(xiàn)與人α-gal A cDNA的公開序列(Genbank sequence HUMGALA)相同。
如下所示，通過幾個(gè)中間產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒pXAG-16。首先，用SacⅡ和XhoⅠ消化pAGAL并使其成平頭。其次，使全長(zhǎng)α-gal A cDNA的末端與XbaⅠ接頭連接，并亞克隆入XbaⅠ消化的pEF-BOS(Mizushima等，Nucl.Acads Res.18:5322,1990)中，產(chǎn)生pXAG-1。該構(gòu)建物含有人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的3′非翻譯序列和側(cè)接編碼α-gal A加上α-gal A信號(hào)肽的cDNA的人延伸因子-1α(EF-1α)啟動(dòng)子，使得α-gal A cDNA的5′末端與EF-1α啟動(dòng)子融合。為了產(chǎn)生具有CMV IE啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子的構(gòu)建物，從pXAG-1中取出α-gal A cDNA和G-CSF3′UTS作為2kb的XbaⅠ-BamHⅠ片段。使該片段變成平頭，與BamHⅠ接頭連接并插入BamHⅠ消化的pCMVflpNeo(按照下述方式構(gòu)建)中。取向是α-gal AcDNA的的5′末端融合到CMV IE啟動(dòng)子區(qū)域中。
按如下所示生產(chǎn)pCMVflpNeo。用作為模板的CMV基因組DNA和下列寡核苷酸通過PCR擴(kuò)增獲得CMV IE基因啟動(dòng)子片段5′-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3′(SEQ ID NO:23)和5′-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3′(SEQ ID NO:24)。所得產(chǎn)物(1.6kb片段)用BamHⅠ消化,產(chǎn)生具有BmaHⅠ消化的粘性末端、含有CMV啟動(dòng)子的片段。從質(zhì)粒pMClneopA(Stratagene Inc.,La Jolla,CA)分離獲得neo表達(dá)單元，為1.1kb的XhoⅠ-BamHⅠ片段。將含有CMV啟動(dòng)子的片段和neo片段插入BamHⅠ、XhoⅠ消化的質(zhì)粒(pUC12)中。值得注意的是，pCMVflpNeo含有CMV IE啟動(dòng)子區(qū)域(從Genbank sequence HS5MISP的核苷酸546開始到核苷酸2205結(jié)束)以及緊靠CMV IE啟動(dòng)子片段5′端的受單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶啟動(dòng)子(Thneo基因)驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性基因。neo基因的轉(zhuǎn)錄方向與CMV啟動(dòng)子片段相同。該中間構(gòu)建物稱為pXAG-4。
為了加入hGH3′非翻譯序列，從pXAG-4中取出成為XbaⅠ-SmaⅠ片段的GCSF3′非翻譯序列，并使pXAG-4的末端變成平頭。從pXGH5(Selden等，Mol.Cellular Biol.6:3173-3179,1986)中取出hGH3′非翻譯序列，它是0.6kb的SmaⅠ-EcoRⅠ片段。在將片段變成平頭后，將其連接到pXAG-4中緊靠pXAG-4的平頭XbaⅠ位點(diǎn)后。該中間產(chǎn)物稱為pXAG-7。從該質(zhì)粒中取出TKneo片段(HindⅢ-ClaⅠ片段)，通過“填入”DNA聚合物Ⅰ的Klenow片段使該質(zhì)粒末端變平。連接入來自pcDNeo(Chen等，Mol.Cellular biol.7:2745-2752,1987)消化物的受SV40早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素抗性基因(ClaⅠ-BsmBⅠ平頭片段)，將neo轉(zhuǎn)錄單元放在α-galA轉(zhuǎn)錄單元的相同取向上。該中間產(chǎn)物稱為pXAG-13。
為了完成有26個(gè)氨基酸hGH信號(hào)肽編碼序列和hGH基因的第一個(gè)內(nèi)含子的pXAG-16，首先除去pXAG-13中2.0kb的EcoRⅠ-BamHⅠ片段。該片段包括α-gal AcDNA和hGH3′非翻譯序列。該大片段用3個(gè)片段代替。第一個(gè)片段由pXGH5的0.3kb PCR產(chǎn)物組成，它含有hGH信號(hào)肽編碼序列，并包括hGH的第一個(gè)內(nèi)含子序列，從正好位于Kozak共有序列上游的合成的BamHⅠ位點(diǎn)到hGH信號(hào)肽編碼序列末端。用下列寡核苷酸來擴(kuò)增該片段(片段1)5′-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3′(寡核苷酸HGH101；SEQ ID NO:5)和5′-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3′(寡核苷酸HGH102；SEQ ID NO:6)。第二個(gè)片段由0.27kb的PCR產(chǎn)物組成，該產(chǎn)物含有對(duì)應(yīng)于從編碼398個(gè)氨基酸(即缺少α-gal A信號(hào)肽)的α-gal A酶的cDNA起始部位到NheⅠ位點(diǎn)的序列。用下列寡核苷酸來擴(kuò)增該片段(片段2):5′-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3′(寡核苷酸AG10；SEQ ID NO:7)和5′-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3′(寡核苷酸AG11；SEQ ID NO:8)。第三個(gè)片段由含有其余α-gal A序列以及hGH3′非翻譯序列的pXAG-7的NheⅠ-EcoRⅠ片段組成(片段3)。
使片段1(用BamHⅠ和NaeⅠ消化)、片段2(用PvuⅡ和NheⅠ消化)、片段3與6.5kb、含有neo基因和CMV IE啟動(dòng)子的pXAG-13的BamHⅠ-EcoRⅠ片段混合，并連接在一起形成質(zhì)粒pXAG-16(圖4)。
B．α-gal A的構(gòu)建質(zhì)粒pXAG-28的表達(dá)分離獲得人膠原Iα2啟動(dòng)子，以用于下述的α-gal A表達(dá)構(gòu)建物pXAG-28中。用下列寡核苷酸分離含有人膠原Iα2啟動(dòng)子部分的人基因組DNA的408bp PCR片段5′-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3′(寡核苷酸72；SEQ IDNO:9)和5′-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3′(寡核苷酸73；SEQ IDNO:10)。
用該片段來篩選EMBL3中的人白細(xì)胞庫(kù)(Clontech Inc.Palo Alto,CA)。分離獲得含有3.8kb EcoRⅠ片段的陽(yáng)性克隆(噬菌體7H)，并將其克隆入pBSIISK+(Stratagene Inc.,La Jolla,CA)的EcoRⅠ位點(diǎn)上(產(chǎn)生pBS/7H.2)。通過SpeⅠ消化使pBSIISK+多接頭斷裂，“填入”DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，插入寡核苷酸5′-CTAGTCCTAGGA-3′(SEQ ID NO:11)，在PBSIISK+中引入一個(gè)AvrⅡ位點(diǎn)。用BamHⅠ和AvrⅡ消化該pBSIISK+變體，將其連接到上述最初的408bp膠原Iα2啟動(dòng)子PCR片段的121bp BamHⅠ-AvrⅡ片段上，產(chǎn)生pBS/121COL.6。
用XbaⅠ消化質(zhì)粒pBS/121COL.6，使其在pBSIISK+多接頭序列中斷裂，“填入”DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，用ArvⅡ消化。分離獲得pBS/7H.2中3.8kb的BamHⅠ-AvrⅡ片段，通過Klenow酶處理使BamHⅠ位點(diǎn)變成平頭。然后用AvrⅡ消化該片段，并將其連接到AvrⅡ消化的載體上，從而產(chǎn)生膠原啟動(dòng)子質(zhì)粒pBS/121bpCOL7H.18。
然后，將膠原啟動(dòng)子融合到含有人β-肌動(dòng)蛋白基因第一個(gè)內(nèi)含子的人β-肌動(dòng)蛋白基因5′非翻譯序列上。為了分離該序列，用下列寡核苷酸從人基因組DNA中分離獲得2kb PCR片段5′-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3′(寡核苷酸BAl；SEQ ID NO:12)和5′-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3′(寡核苷酸BA2；SEQ ID NO:13)。
用BamHⅠ和BsiHKAⅠ消化該片段，釋放出含有β-肌動(dòng)蛋白5′非翻譯序列和內(nèi)含子的0.8kb片段。然后按如下所述從膠原啟動(dòng)子質(zhì)粒pBS/121bpCOL7H.18中分離獲得3.6kb的SalⅠ-SrfⅠ片段。用BamHⅠ部分消化pBS/121bpCOL7H.18(BamHⅠ位點(diǎn)在膠原Iα2啟動(dòng)子片段的5′末端)，通過Klenow片段處理使其變?yōu)槠筋^，連接到SalⅠ接頭(5′-GGTCGACC-3′)上，從而將SalⅠ位點(diǎn)放在膠原Io2啟動(dòng)子的上游。然后用SalⅠ和SrfⅠ消化該質(zhì)粒(SrfⅠ位點(diǎn)在膠原Iα2啟動(dòng)子CAP位點(diǎn)上游110bp處)，分離獲得3.6kb的片段。使0.8kb和3.6kb片段與SalⅠ和BamHⅠ消化的pBSIISK-(Stratagene Inc.,La Jolla,CA)、以及由下列四個(gè)寡核苷酸一起退火(形成有平頭和BsiHKAL末端的片段)組成的一個(gè)片段結(jié)合，四個(gè)寡核苷酸是5′-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCCGTAT-3′(寡核苷酸COL-1；SEQ ID NO:14)、5′-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3′(寡核苷酸COL-2；SEQ ID NO:15)、5′-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3′(寡核苷酸COL-3；SEQID NO:16)和5′-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3′(寡核苷酸COL-4；SEQ ID NO:17)。這四個(gè)寡核苷酸在退火時(shí)對(duì)應(yīng)于始于膠原啟動(dòng)子SrfⅠ位點(diǎn)并延續(xù)到β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子BsiHKAⅠ位點(diǎn)的區(qū)域。所得質(zhì)粒命名為pCOL/β-肌動(dòng)蛋白。
為了完成pXAG-28的構(gòu)建，分離獲得含有膠原Iα2啟動(dòng)子和β-肌動(dòng)蛋白5′非翻譯序列的pCOL/β-肌動(dòng)蛋白的SalⅠ-BamHⅠ片段。將該片段連接到來自pXAG-16的兩個(gè)片段(參見實(shí)施例1A和圖4)上(1)6.0kb BamHⅠ片段(含有neo基因、質(zhì)粒骨架、編碼398個(gè)氨基酸α-gal A酶的cDNA以及hGH3′非翻譯序列)；和(2)0.3kb的BamHⅠ-XhoⅠ片段(其含有pcDneo的SV40聚腺苷酸序列)。pXAG-28含有與人β-肌動(dòng)蛋白5′非翻譯序列融合的人膠原Iα2啟動(dòng)子、hGH信號(hào)肽(被hGH第一內(nèi)含子隔斷)、編碼α-gal A酶的cDNA以及hGH3′非翻譯序列。圖5顯示了完整的表達(dá)構(gòu)建物pXAG-28的圖譜。
C．用α-gal A表達(dá)質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞和選擇為了在成纖維細(xì)細(xì)胞中表達(dá)α-gal A，根據(jù)已在頒布的步驟(Selden等，WO93/09222)培育并轉(zhuǎn)染次級(jí)成纖維細(xì)胞。
將質(zhì)粒pXAG-13,pXAG-16和pXAG-28通過電穿孔轉(zhuǎn)染到人包皮成纖維細(xì)胞中，以產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆細(xì)胞株，如實(shí)施例ID所述監(jiān)測(cè)所得α-gal A表達(dá)水平。正常的包皮成纖維細(xì)胞分泌α-gal A的速度在2-10單位/106細(xì)胞/24小時(shí)的范圍內(nèi)。相反，經(jīng)轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出的平均表達(dá)水平如表1所示表1α-gal A平均表達(dá)水平(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)pXAG-13 420±344U/106細(xì)胞/天N=26個(gè)克隆株(范圍為3-1133U/106細(xì)胞/天)pXAG-16 2051±1253U/106細(xì)胞/天N=24個(gè)克隆株(范圍為422-5200U/106細(xì)胞/天)pXAG-28 141±131U/106細(xì)胞/天N=38個(gè)克隆株(范圍為20-616U/106細(xì)胞/天)這些數(shù)據(jù)顯示所有這三個(gè)表達(dá)構(gòu)建物均能使α-gal A表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞提高許多倍。用pXAG-13(它編碼與α-gal A信號(hào)肽相連的α-gal A)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞的表達(dá)比用pXAG-16轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞的表達(dá)低得多，其不同之處只是信號(hào)肽是hGH信號(hào)肽，hGH信號(hào)肽的編碼序列被hGH基因的第一個(gè)內(nèi)含子隔斷。
在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞每次傳代時(shí)，測(cè)定分泌的α-gal A活性，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞的密度。根據(jù)收獲的細(xì)胞數(shù)以及α-gal A分泌的時(shí)間，確定了α-gal A的表達(dá)比速度(specific expression rate)，并報(bào)告在表2和3中，以每106個(gè)細(xì)胞每24小時(shí)期間分泌的α-gal A單位表示。基因治療所需的或用于生產(chǎn)純化α-gal A的材料所需的細(xì)胞株，應(yīng)在幾次傳代后呈現(xiàn)穩(wěn)定的生長(zhǎng)和表達(dá)。細(xì)胞株的數(shù)據(jù)顯示在表2和3中，它們用α-gal A表達(dá)構(gòu)建物pXAG-16穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，這說明了在幾次傳代后α-gal A表達(dá)保持穩(wěn)定的事實(shí)。
表2含有α-gal A表達(dá)構(gòu)建物pXAG-16的BRS-11細(xì)胞的生長(zhǎng)和表達(dá)
表3含有α-gal A表達(dá)構(gòu)建物pXAG-16的HF503-242細(xì)胞的生長(zhǎng)和表達(dá)
D．α-gal A表達(dá)的定量分析用Ioannou等(J.Cell Biol.119:1137-1150,1992)所述的方案的改進(jìn)方法，以4-甲基傘形基(umbelliferyl)-α-D-半乳糖吡喃糖苷(4-MUF-gal；Research Products-Inc.)作為水溶性底物，測(cè)定α-gal A活性。將底物溶解在底物緩沖液(0.1M檸檬酸磷酸鹽，pH4.6)中至濃度為1.69mg/ml(5mM)。通常是將10μl培養(yǎng)上清液加入75μl底物溶液中。將試管加蓋，使其在37℃水浴中培育60分鐘。在培育的最后，用2ml甘氨酸-碳酸鹽緩沖液(130mM甘氨酸，83mM碳酸鈉，pH10.6)來終止反應(yīng)。用TK0100型熒光計(jì)(Hoefer Scientific Instruments)(此儀器有365nm的固定激發(fā)(excitation)波，并檢測(cè)460nm的固定發(fā)射波)測(cè)定每個(gè)樣品的相對(duì)熒光度。將樣品的讀數(shù)與從1μM甲基傘形酮(Sigma Chemical Co.)儲(chǔ)存液制得的標(biāo)準(zhǔn)品作比較，計(jì)算水解的底物量。α-gal A的活性用單位表示；一單位的α-gal A活性等效于37℃下每小時(shí)水解1納摩爾底物。細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)大致上用106細(xì)胞/24小時(shí)分泌的α-gal A活性/單位表示。該試驗(yàn)也用來測(cè)定細(xì)胞裂解物中以及α-gal A純化各步驟取(如下所述)樣中的α-gal A活性。
實(shí)施例Ⅱ從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞株條件培養(yǎng)基中純化α-gal A實(shí)施例ⅡA-ⅡE描述了α-gal A可以從培育的人細(xì)胞株的條件培養(yǎng)基中純化至接近勻質(zhì)，該人細(xì)胞株已被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以生產(chǎn)酶。
A．使用丁基瓊脂糖(Butyl Sepharose)層析作為純化α-gal A的第一步將冷的條件培養(yǎng)基(1.34升)離心并過濾通過0.45μm乙酸纖維素濾膜(以玻璃纖維預(yù)過濾)，使澄清。在攪拌時(shí)，滴加入1N HCl，將冷的過濾的培養(yǎng)基pH調(diào)至5.6，通過滴加入3.9M超純硫酸銨貯備液(室溫)，使得加入硫酸銨最終濃度為0.66M。將培養(yǎng)基4℃再攪拌5分鐘，如前所述且樣過濾，并上樣于丁基瓊脂糖4快速柱(81ml柱體積，2.5×16.5cm；Pharmacia,Uppsala,Sweden)中，此柱已經(jīng)用含有0.66M硫酸銨的pH5.6、10mM MES-Tris(緩沖液A)平衡過。層析于4℃在Gradi-FracTM系統(tǒng)(Pharmacia,Uppsala,Sweeden)中進(jìn)行，該系統(tǒng)裝備有串聯(lián)的UV(280nm)和電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)器分別用于評(píng)估總蛋白和鹽濃度。在以10ml/min的流速施加完樣品后，用10倍柱體積的緩沖液A洗柱。用14倍柱體積的從緩沖液A(含有硫酸銨)至pH5.6,10mM MES-Tris的線性梯度液將α-gal A從丁基瓊脂糖TM柱上洗脫下來。用4-MUF-gal試驗(yàn)測(cè)定組分的α-gal A活性，合并含有顯著酶活的那些組分。如圖6和純化總結(jié)(表3)所示，該步驟除去了大約99％的雜蛋白(柱純化前樣品為8.14g總蛋白；柱純化后樣品為0.0638g總蛋白)。
表4從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基純化α-gal A
B．使用肝素瓊脂糖層析作為α-gal A純化的第二步4℃用pH5.6,10mM MES-Tris(4升)液透析了基瓊脂糖柱峰組分(換液一次)。4℃按需加入水或NaCl，將透析物電導(dǎo)率調(diào)至1.0mMHO。隨后，將樣品加入肝素瓊脂糖6快速柱(Pharmacia,Uppsala,sweden；29ml柱體積，2.5×6cm)中，該柱已用含有9mM NaCl的pH5.6,10mM MES-Tris(緩沖液B)平衡過。加樣在4℃下進(jìn)行，流速為10ml/min。用串聯(lián)的UV(280nm)和電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)器測(cè)定總蛋白和鹽濃度。加樣后，用10倍柱體積的緩沖液B，然后是3倍柱體積至8％緩沖液C/92％緩沖液B(其中緩沖液C是含有250mM NaCl的pH5.6,10mM MES-Tris)的線性梯度液洗柱，再用10倍柱體積的8％緩沖液C洗柱。然后用1.5倍柱體積至29％緩沖液C的線性梯度液，隨后用10倍柱體積至35％緩沖液C的線性梯度液洗脫α-gal A。測(cè)定組分的α-gal A活性，合并含有顯著活性的那些組分。
C．使用羥基磷灰石層析作為α-gal A純化步驟過濾肝素柱合并物，直接加入陶土羥基磷灰石HC柱(40μm；AmericanInternational Chemical,Natick,MA；12ml柱體積，1.5×6.8cm)中，該柱已用pH6.0.1mM磷酸鈉(緩沖液D)平衡過。層析在室溫下、雜交Gradi-FracTM/FPLC系統(tǒng)(Pharmacia,Uppsala,Sweden)中進(jìn)行，該系統(tǒng)裝備有串聯(lián)的UV(280nm)和電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)器。加入樣品(5ml/min)后，用10倍柱體積的緩沖液D洗柱。用7倍柱體積至42％緩沖液E/58％緩沖液D(其中緩沖液E是pH6.0,250mM磷酸鈉)的線性梯度液，然后用10倍柱體積至52％緩沖液E的梯度液洗脫α-gal A。測(cè)定組分的α-gal A活性，合并含有顯著活性的組分。
D．用瓊脂糖陰離子交換層析作為α-gal A純化的一個(gè)步驟在室溫下用水將羥基磷灰石柱合并物稀釋約1.5倍至最終電導(dǎo)率為3.4-3.6mMHO。過濾后，將樣品加入Q瓊脂糖HP柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden:5.1ml柱體積，1.5×2.9cm)中，該柱已用10％緩沖液G/90％緩沖液F平衡過，其中緩沖液F是pH6.0,25M磷酸鈉，緩沖液G是含250mM NaCl的pH6.0,25mM磷酸鈉。層析在室溫下、Gradi-FracTM/FPLC雜交系統(tǒng)(Pharmacia,Uppsala,Sweden)中進(jìn)行，總蛋白和鹽濃度由串聯(lián)的監(jiān)測(cè)器測(cè)定。樣品以5ml/min的流速加入，然后進(jìn)行下列步驟(1)用5倍柱體積的10％緩沖液G,(2)7倍柱體積的12％緩沖液G,(3)3倍柱體積至50％緩沖液G的線性梯度液，(4)10倍柱體積至53％緩沖液G的線性梯度液，(5)3倍柱體積液至100％緩沖液G的梯度液和(6)10倍柱體積的100％緩沖液G洗柱。α-gal A主要在步驟3和4時(shí)被洗脫。合并含有顯著活性的組分(“Q合并物”)。
E．用Superdex-200凝膠過濾層析作為α-gal A純化的一個(gè)步驟用Centriprep-10離心濃縮裝置(Amicon,Beverly,MA)將Q合并物濃縮大約5倍，并上樣于Superdex200柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden；189ml柱體積，1.6×94cm)中。該柱用含150mM NaCl的pH6.0.25mM磷酸鈉液平衡并洗脫。在室溫下FPLC系統(tǒng)(Pharmacia,Uppsala,Sweden)中進(jìn)行層析，用串聯(lián)的UV監(jiān)測(cè)器(280nm)來跟蹤蛋白質(zhì)的洗脫。加入柱中的樣品體積≤2ml，流速為0.5ml/min，組分體積為2ml。進(jìn)行多個(gè)柱操作；測(cè)定組分的α-gal A活性，合并含有顯著活性的組分。
用Centriprep-10裝置濃縮來自Superdex200柱的合并組分，分成等分，快速冷凍，并在-80℃下保藏較短的時(shí)間。這一純化α-gal A的實(shí)施例的小結(jié)顯示在表3中。α-gal A的最終得率為原料活性的59％，純化產(chǎn)物的比活為2.92×106單位/毫克蛋白。在還原條件下4-15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后銀染，所得產(chǎn)物顯示出高純度。
實(shí)施例Ⅲ．純化α-gal A的配方和保藏當(dāng)高度純化的α-gal A以純化蛋白稀溶液(≤1mg蛋白/ml)保存時(shí)，不能穩(wěn)定地保藏較長(zhǎng)時(shí)間。因此，設(shè)計(jì)了一種配方以提高α-gal A在長(zhǎng)時(shí)間保藏(即持續(xù)幾周到至少幾個(gè)月)時(shí)的穩(wěn)定性。用離心濃縮器將純化酶濃縮到至少為1mg/ml(在含25mM磷酸鈉(pH6.0)和150mM NaCl組成的酶緩沖液中)。加入人血清白蛋白(HSA；Buminate,Baxter-Hyland)至最終濃度為2.5mg/ml。然后用附有注射器的0.2μm乙酸纖維素濾膜(Schleicher和Schuell)除菌過濾此蛋白質(zhì)溶液。將α-gal A溶液分裝到無(wú)菌、無(wú)熱原的玻璃管中，用Telfon封口帶密封，快速冷凍，保藏在-20℃下。
3個(gè)月內(nèi)用4-MUF-gal試驗(yàn)來評(píng)價(jià)α-gal A活性的穩(wěn)定性。表5中所示數(shù)據(jù)表明在測(cè)試期間酶活性沒有損失。配方的酸性pH對(duì)高度純化的酶的穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。
表5配制的α-gal A在-20℃下的穩(wěn)定性
實(shí)施例Ⅳ，人細(xì)胞包株產(chǎn)生的α-gal A適用于治療α-gal A缺乏癥研究了根據(jù)本發(fā)明制得的純化人α-gal A在結(jié)構(gòu)和功能上的性質(zhì)，以證明本文所述的DNA分子以及轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞株表達(dá)產(chǎn)生的相應(yīng)糖蛋白可分別用于基因或酶替代治療。
A．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞在培養(yǎng)中產(chǎn)生的α-gal A的大小通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析來估計(jì)α-gal A的分子量。這些結(jié)果表明二聚物的分子量為102353道爾頓，而單體的分子量為51002道爾頓。根據(jù)氨基酸組成，預(yù)計(jì)單體的分子量為45400道爾頓。因此，可以推斷此酶的糖含量可達(dá)5600道爾頓分子量。
對(duì)純化蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸分析，結(jié)果與下述結(jié)論是一致的，即轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞產(chǎn)生的此蛋白與從人組織中純化獲得的此蛋白在氨基酸水平上是相同的。
B．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A的N-端加工人α-gal A cDNA核苷酸序列編碼429個(gè)氨基酸。31個(gè)N-端氨基酸組成了信號(hào)肽序列，它會(huì)在新生蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜時(shí)斷裂(LeDonne等，Arch.Biochem.Biophys.224:186,1983；Lemansky等，J.Biol.Chem.262:2062,1987)。為了確認(rèn)當(dāng)α-gal A與異源信號(hào)肽序列(例如人生長(zhǎng)激素信號(hào)序列)相聯(lián)并在轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞表達(dá)時(shí)被合適地加工，對(duì)分泌的蛋白的N-端氨基酸進(jìn)行微測(cè)序。對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用10mM CAPS(pH11.0),10％甲醇緩沖液系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到ProBlott(ABI.Foster City,CA)上。用考馬斯染色使ProBlott上的蛋白顯色，切下合適分子量(50k道爾頓)的條帶。用自動(dòng)進(jìn)行Edman降解的應(yīng)用生物系統(tǒng)脈沖-液相氨基酸測(cè)序儀(Applied Biosystems pulse-liquid phase amino acid sequenator)獲得N-端序列。獲得的N-端序列LDNGLARTPT(SEQ ID NO:28)與信號(hào)肽的適當(dāng)斷裂物一致，并與分泌的蛋白預(yù)計(jì)的N-端序列一致。
C．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A的C-端氨基酸用Hewlett PackardC-端自動(dòng)測(cè)序儀來鑒定根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的分泌的α-gal A的C-端氨基酸殘基。結(jié)果表明C-端為亮氨酸殘基，這與以DNA序列預(yù)計(jì)的C-端氨基酸一致。
D．穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A的糖修飾對(duì)根據(jù)本發(fā)明制得的α-gal A的糖基化方式也進(jìn)行了評(píng)價(jià)。適當(dāng)?shù)奶腔瘜?duì)α-gal A的最優(yōu)體內(nèi)活性是很重要的；非糖基化系統(tǒng)表達(dá)的α-gal A是沒有活性或不穩(wěn)定的(Hantzopolous等，Gene 57:159,1987)。糖基化對(duì)α-gal A內(nèi)化到所需靶細(xì)胞中也是重要的，并且會(huì)影響酶在體內(nèi)的循環(huán)半衰期。在α-gal A的每個(gè)亞單位上有四個(gè)能夠加入天冬酰胺連接糖鏈的位點(diǎn)，其中只有三個(gè)被占據(jù)(Desnick等.InThe Metabolic and Molecular Bases fInherited Disease,pp2741-2780,McGraw Hill,New York,1995)。
用從A.urafaciens分離獲得的神經(jīng)氨酸酶(Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A樣品，以除去唾液酸。這一反應(yīng)是在室溫下，在總體積為10μl的乙酸鹽緩沖溶液(ABS,20mM乙酸鈉，pH5.2,150mMNaCl)中用10mU神經(jīng)氨酸酶處理5μgα-gal A過夜來進(jìn)行的。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生并經(jīng)純化的α-gal A還用堿性磷酸酶(小牛腸堿性磷酸酶．Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)來去磷酸化，方法是在室溫下在ABS(pH用1M Tris升高至7.5)中用15U堿性磷酸酶處理5μgα-gal A過夜。
用Western印跡法以α-gal A特異性抗體來分析樣品。所用的抗體是兔多克隆抗肽抗體，該抗體是用代表α-gal A的68-81氨基酸的肽作為免疫原而制得。在將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF(Millipore,Bedford,MA)膜上后，用2.5％Blotto無(wú)脂肪干奶粉(20mM Tris-HCl液，pH7.5,0.05％Tween-20)液對(duì)抗血清作1∶2000稀釋來探測(cè)此膜。然后用交聯(lián)辣根過氧化物酶的山羊的抗兔IgG(Organon Teknika/Cappel,durham,NC；1∶5000稀釋)和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham,Arlington Heights.IN)的試劑來檢測(cè)。
用神經(jīng)氨酸酶處理α-gal A導(dǎo)致其分子量輕微偏移(約1500-2000道爾頓或4-6個(gè)唾液酸/單體)，這提示α-gal A已由唾液酸充分修飾。例如，血漿形式的α-galA每個(gè)單體有5-6個(gè)唾液酸殘基，而胎盤形式的每個(gè)單體有0.5-1.0個(gè)唾液酸殘基(Bishop等，J.Biol.Chem.256:1307,1981)。
另一種用來測(cè)定α-gal A的唾液酸和甘露糖-6-磷酸修飾的方法是等電點(diǎn)聚焦(IEF)，根據(jù)樣品等電點(diǎn)(pI)或凈電荷來分離樣品。這樣，預(yù)計(jì)從α-gal A中除去帶電荷的殘基如唾液酸或磷酸，能改變此蛋白質(zhì)在IEF系統(tǒng)中的遷移。
進(jìn)行IEF實(shí)驗(yàn)時(shí)，用神經(jīng)氨酸酶和堿性磷酸酶先處理根據(jù)本發(fā)明制得的α-galA樣品，然后將其按1∶1與2X Novex樣品緩沖液(8M尿素，pH3.0-7.0)混合，用Pharmalyte(Pharmacia,Uppsala,Sweden；pH3.0-6.5；Pharmalyte4-6.5和2.5-5.5.每份凝膠0.25ml)加到6M尿素IEF凝膠上。另外還加入等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品(Bio-Rad)。電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，如上所述進(jìn)行Western印跡分析。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A包括三個(gè)主要的同工型，它們的pI大約在4.4-4.65范圍內(nèi)。這些值與血漿形式以及脾形式的α-gal A(Bishop等，J.Biol.Chem.256:1307,1981)的pI相似。用神經(jīng)氨酸酶處理此酶使得三個(gè)同工型的pI均有所提高，這表明所有的同工型均一定程度上被唾液酸修飾。這些數(shù)據(jù)提示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A應(yīng)有理想的血漿半衰期，說明該物質(zhì)非常適于藥理應(yīng)用。另外，用堿性磷酸酶來處理經(jīng)神經(jīng)氨酸酶處理的α-gal A還會(huì)進(jìn)一步將部分酶蛋白的pI提高至大約5.0-5.1，這說明此酶攜帶了一個(gè)或多個(gè)甘露糖-6-磷酸殘基。該修飾是意義顯著的，因?yàn)樗前屑?xì)胞有效內(nèi)化α-gal A所需的。
E．從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞純化獲得的α-gal A的比活通過測(cè)定此酶的催化活性(用4-MUF-gal試驗(yàn)法)和蛋白濃度來計(jì)算純化的α-gal A的效能或比活。蛋白濃度可用任何標(biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)定，例如用BCA系統(tǒng)(Pierce)或通過測(cè)定280nm吸光值并用2.3(從氨基酸分析測(cè)得)的mg/ml消光系數(shù)來計(jì)算數(shù)值。用這些方法測(cè)得，從轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化獲得的α-galA比活為2.2-2.9×106單位/毫克蛋白，這與從人組織中純化獲得的α-gal A的比活相當(dāng)(Bishop等，J.Biol.Chem.256:1301,1981)。
F．甘露糖或甘露糖-6-磷酸介導(dǎo)的α-gal A的內(nèi)化為了使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A成為α-gal A缺乏癥的有效治療劑，此酶必須被受影響的細(xì)胞內(nèi)化。α-gal A在生理pH水平時(shí)沒有活性，不可能在血液或組織液中有效。它只有在內(nèi)化進(jìn)入溶酶體的酸性環(huán)境中時(shí)才會(huì)使累積的脂類底物最適地代謝。這種內(nèi)化是由α-gal A與甘露糖-6-磷酸(M6P)受體的結(jié)合來介導(dǎo)的，該受體表達(dá)在細(xì)胞表面并將酶通過內(nèi)吞通路輸送給溶酶體。M6P受體有普遍表達(dá)；大多數(shù)體細(xì)胞都有一定程度的表達(dá)。對(duì)糖蛋白上外露的甘露糖殘基有特異性的甘露糖受體，則普遍性較差。后一種受體通常只發(fā)現(xiàn)于巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞上，它們?yōu)棣?gal A進(jìn)入這些種類的細(xì)胞提供了額外的方式。
為了證明M6P介導(dǎo)α-gal A的內(nèi)化，取Fabry病患者的皮膚成纖維細(xì)胞(NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository)，在濃度漸增的本發(fā)明的純化α-galA存在下培育該細(xì)胞過夜。一些樣品含有5mM可溶的M6P,M6P競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了α-gal A結(jié)合甘露糖-6-磷酸受體并被此受體內(nèi)化的作用。其它樣品含有30μg/ml甘露聚糖，甘露聚糖抑制了α-gal A結(jié)合甘露糖受體并被此受體內(nèi)化的作用。培育后，將細(xì)胞刮到裂解緩沖液(10mM Tris,pH7.2,100mM NaCl,5mM EDTA,2mMPefablocTM(Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)和1％NP-40)中洗滌并收獲細(xì)胞。然后測(cè)定裂解樣品的蛋白濃度和α-gal A活性。結(jié)果用α-gal A活性單位/毫克細(xì)胞蛋白表示。Fabry細(xì)胞以劑量依賴方式內(nèi)化α-gal A(圖7)。這種內(nèi)化受甘露糖-6-磷酸抑制，但不受甘露糖抑制。因此α-gal A在Fabry成纖維細(xì)胞中的內(nèi)化是由甘露糖-6-磷酸受體而不是甘露糖受體來介導(dǎo)的。
α-gal A也可在體外被內(nèi)皮細(xì)胞(為治療Fabry病重要的靶細(xì)胞)內(nèi)化。將人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與7500單位的α-gal A培育過夜；一些孔中含有M6P。在培育期后，如上所述收獲細(xì)胞并測(cè)定α-gal A。只有與α-gal A一起培育的細(xì)胞的此酶水平幾乎是對(duì)照(不與α-gal A一起培育)細(xì)胞的10倍以上。M6P抑制了α-gal A的胞內(nèi)累積，揭示HUVEC內(nèi)化α-gal A是由M6P受體介導(dǎo)的。因此，本發(fā)明的人α-gal A可被臨床相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)化。
已知只有很少的培育的人細(xì)胞系能表達(dá)甘露糖受體。然而，可以用攜帶甘露糖受體和極少量(如果有的話)甘露糖-6-磷酸受體的小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系(J774.E)來確定本發(fā)明的純化α-gal A是否是通過甘露糖受體而內(nèi)化(Diment等，J.Leukocyte Biol.42:485-490,1987)。在10000單位/毫升α-gal A的存在下，將J774.E細(xì)胞培育過夜。所選樣品還含有2mM M6P，其它樣品含有100μg/ml甘露聚糖。如上所述洗滌并收獲細(xì)胞，測(cè)定每份樣品的總蛋白和α-gal A活性。結(jié)果列在表5中。M6P不抑制這些細(xì)胞攝入α-gal A，而甘露聚糖使α-gal A的累積水平降低75％。因此，本發(fā)明的α-gal A可被表達(dá)這類特定細(xì)胞表面受體(甘露糖受體)的細(xì)胞中的甘露糖受體內(nèi)化。
表6．J774.E細(xì)胞內(nèi)化α-gal Aα-Gal活性(單位/mg總蛋白) =100μg/ml[M6P]=2mM或660μg/ml這些實(shí)驗(yàn)證明了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞產(chǎn)生的α-gal A可以通過甘露糖或甘露糖-6-磷酸受體被細(xì)胞內(nèi)化。
G．用人成纖維細(xì)胞表達(dá)α-gal A來糾正Fabry成纖維細(xì)胞就基因治療而言，種植產(chǎn)生α-gal A的自身細(xì)胞必須產(chǎn)生適當(dāng)修飾形式的此酶，以“糾正”靶細(xì)胞中的α-gal A缺乏。為了評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞在Fabry細(xì)胞上生產(chǎn)α-gal A的效果，將取自Fabry病患者的成纖維細(xì)胞(NIGMS HumenGenetics Mutant Cell Repository)在Transwells(Costar,Cambridge,MA)中與產(chǎn)生α-gal A的細(xì)胞株共同培育。實(shí)驗(yàn)方案說明見圖8。將Fabry細(xì)胞培育在12孔組織培養(yǎng)碟中，其中一些含有細(xì)胞能生長(zhǎng)在其表面上的插片(insert)(Transwells,0.4μm孔徑)。該插片的生長(zhǎng)基質(zhì)是多孔的，其使大分子從上層環(huán)境通過孔進(jìn)入下層環(huán)境。一套插片含有分泌少量α-gal A的正常人包皮(HF)成纖維細(xì)胞，而另一套含有能分泌大量α-gal A的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞株BRS-11。在與產(chǎn)生α-gal A的細(xì)胞共同培育的孔中，α-gal A可以進(jìn)入浸有Fabry細(xì)胞的培養(yǎng)基并能被Fabry細(xì)胞有效地內(nèi)化。
表7中的數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)abry細(xì)胞能內(nèi)化分泌的α-gal A。監(jiān)測(cè)胞內(nèi)α-gal A水平三天。單獨(dú)培育(沒有插片)或在非轉(zhuǎn)染的包皮成纖維細(xì)胞(HF插片)存在下的細(xì)胞的胞內(nèi)α-gal A活性水平非常低。然而，和產(chǎn)生α-gal A的細(xì)胞(BRS-11插片)一起培養(yǎng)的Fabry細(xì)胞在2天后表現(xiàn)出類似于正常細(xì)胞的酶水平(正常的成纖維細(xì)胞有25-80單位α-gal A/毫克蛋白)。這種糾正是由于通過M6P受體攝入了α-gal A,可用甘露糖-6-磷酸抑制來證明(BRS-11插片+M6P)。
表7用表達(dá)α-gal A的人成纖維細(xì)胞糾正Fabry成纖維細(xì)胞α-gal A活性(單位/毫克總蛋白)
H．其它細(xì)胞類型的使用本文描述的方法中可采用其它類型的細(xì)胞。這些細(xì)胞可從各種組織獲得，包括能維持培養(yǎng)的所有類型的細(xì)胞。例如，可用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染的初級(jí)和次級(jí)細(xì)胞包括人成纖維細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、上皮細(xì)胞(如乳房或腸上皮細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血液的有形成分(如淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞)、肌細(xì)胞以及這些體細(xì)胞的前體細(xì)胞。成纖維細(xì)胞是特別受注意的。初級(jí)細(xì)胞最好是從有待給予轉(zhuǎn)染的初級(jí)或次級(jí)細(xì)胞的個(gè)體中獲得，這樣它們就不會(huì)被患者的免疫系統(tǒng)排斥。然而，如果能適當(dāng)?shù)刈⒁獗苊饣蛞种泼庖吲懦?如下所述)，也可使用除患者以外的供者人細(xì)胞。這將使標(biāo)準(zhǔn)化建株的、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系細(xì)胞能用于所有患者。
Ⅰ．表達(dá)α-gal A的細(xì)胞的給予上述細(xì)胞可以通過各種標(biāo)準(zhǔn)化的給藥途徑導(dǎo)入患者體內(nèi)，因此它們可以定居在(例如)腎包囊下、皮下間隙、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、鞘內(nèi)腔、肝臟、腹膜內(nèi)空腔或肌肉中。細(xì)胞也可經(jīng)靜脈或動(dòng)脈內(nèi)注入，使其在個(gè)體的血流中循環(huán)。一旦植入體內(nèi)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生并分泌治療產(chǎn)物-糖基化的人α-gal A。
有待引入個(gè)體內(nèi)的基因修飾細(xì)胞的數(shù)目將有所不同，但這是本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定的。每位患者的年齡、體重、性別以及總的健康狀況、還有分布的體積、酶的半衰期和生物利用度、以及基因修飾細(xì)胞的體內(nèi)產(chǎn)率，這些是確定給藥劑量和途徑的首要考慮因素。通常，將采用1百萬(wàn)至10億個(gè)細(xì)胞，表達(dá)水平為100-100000單位/106細(xì)胞/天。如果需要，該過程可以重復(fù)或作改變，直至達(dá)到所需結(jié)果，例如解除Fabry病有關(guān)的癥狀。
如上所述，采用的細(xì)胞通常對(duì)患者是特異性的，即從有待給予轉(zhuǎn)染的初級(jí)或次級(jí)細(xì)胞的個(gè)體獲得的細(xì)胞，以使細(xì)胞不被患者的免疫系統(tǒng)排斥。然而，如果這種情況不可能或不需要，則可以從其它個(gè)體獲取細(xì)胞，如本文所述那樣進(jìn)行基因修飾，并再植入患α-gal A缺乏癥的患者體內(nèi)。
用受者以外的個(gè)體的細(xì)胞可能需要給予免疫抑制劑、改變組織相容性抗原，或采用屏蔽裝置(barrier device)來防止植入細(xì)胞被排斥。屏蔽裝置可用一種材料(例如膜，如Amicon,Beverly,MA的XM-50)制成，該種材料允許分泌產(chǎn)物進(jìn)入受者循環(huán)或組織，但可防止植入細(xì)胞與受者免疫系統(tǒng)接觸，從而防止了受者對(duì)細(xì)胞的免疫應(yīng)答(以及可能產(chǎn)生的排斥)。關(guān)于基因治療的進(jìn)一步的指導(dǎo)可以參見Selden等的WO93/09222。
或者，細(xì)胞可以包埋在基質(zhì)或凝膠材料中，如共同擁有的美國(guó)專利08/548/002中所描述的那樣，采用雜交基質(zhì)植入物，或如Jain等在PCT專利申請(qǐng)WO95/19430中描述的那樣，將分泌細(xì)胞高度膠囊化(macroencapsulation)在疏水凝膠材料中(這些內(nèi)容均納入本文作參考)。
J．常規(guī)給予α-gal A蛋白的藥物配方本文所述的由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的(或者說是遺傳上修飾的)人細(xì)胞表達(dá)和分泌并經(jīng)純化的α-gal A蛋白可給予不能產(chǎn)生或產(chǎn)生很少α-gal A蛋白的個(gè)體。該蛋白可以配制在藥學(xué)上可接受的pH低于6.5的載體中，例如如實(shí)施例Ⅲ所述的配方中?？杉尤肱浞街械馁x形劑的例子為緩沖液，例如檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液、氨基酸、尿素、醇、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(zhì)如血清白蛋白和明膠、EDTA、氯化鈉、脂質(zhì)體、聚乙烯吡咯烷酮、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、丙二醇和聚乙二醇(如PEG-4000,PEG-6000)。給藥途徑例如可以是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)或經(jīng)粘膜給藥。給藥途徑和蛋白質(zhì)遞送量可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員能進(jìn)行評(píng)價(jià)的幾個(gè)因素來決定。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，對(duì)于確定的患者，給藥途徑和治療蛋白的劑量可以不同，直至獲得治療劑量水平。通常，每公斤體重將給予0.01-100毫克劑量的α-galA。預(yù)計(jì)在患者的一生中需要有規(guī)律地重復(fù)給予此蛋白劑量。
K．酶缺乏引起的其它疾病的治療同樣，由α-gal A以外的溶酶體貯積酶的缺乏引起的其它疾病也適合用類似于本文所述的那些方法來治療。在這些情況下，編碼缺乏酶的功能形式的DNA可以在本文揭示的表達(dá)構(gòu)建物中代替編碼α-gal A的DNA。表8中列出了已經(jīng)確定且適合本文所述治療方法的酶缺乏綜合征的例子。該表中的信息來自E.Neufeld的Ann.Rev.Biochem.(60:257-280,1991)，這些內(nèi)容納入本文作參考。
表8．溶酶體貯積病的概述疾病 初級(jí)缺乏[次級(jí)缺乏]鞘酯降解疾病Fabry病α-半乳糖苷酶Farber病 神經(jīng)酰胺酶(ceramidase)Gaucher病 葡糖腦苷脂酶GM1神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥 β-半乳糖苷酶GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥 β-氨基己糖苷酶，α-亞單位Tay-Sachs病[氨基己糖苷酶A]Sandhoff病 β-氨基己糖苷酶，β-亞單位[氨基己糖苷酶A和B]激活劑缺乏癥 GM2激活劑Krabbe病 半乳糖神經(jīng)酰胺酶異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良酶缺乏形式 芳基硫酸酯酶A激活劑缺乏形式 硫腦苷脂激活劑/皂草素(saposin)粘脂病Ⅳ型 初級(jí)缺乏未知[神經(jīng)節(jié)苷脂唾液酸酶]多硫酸酯酶缺乏癥 初級(jí)缺乏未知[缺乏所有的硫酸酯酶]Niemann-Pick病 鞘磷脂酶Schindler病α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶糖蛋白降解疾病天冬氨酰氨基葡糖胺尿 天冬氨酰氨基葡糖苷酶(aspartylglycosaminuria)巖藻糖苷(貯積)病 α-L-巖藻糖苷酶半乳糖唾液酸沉積癥 保護(hù)性蛋白/組織蛋白酶(galactosialidosis)[β-半乳糖苷酶和唾液酸酶]α-甘露糖苷過多癥α-甘露糖苷酶β-甘露糖苷過多癥β-甘露糖苷酶唾液酸過多癥 唾液酸酶葡萄糖胺聚糖降解疾病Hunter綜合征 艾杜糖醛酸硫酸酯酶Hurler和Scheie綜合征 α-L-艾杜糖醛酸酶Maroteaux-Lamy綜合征 GalNAc 4-硫酸酯酶/芳基硫酸酯酶Morquio綜合征A-亞型 Gal 6-硫酸酯酶B-亞型 β-半乳糖苷酶Sanfilippo綜合征A-亞型 類肝素N-硫酸酯酶B-亞型 α-N-乙?；咸前诽擒彰窩-亞型 乙?；鵆oA葡糖胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶D-亞型 GlcNAc 6-硫酸酯酶Sly綜合征β-葡糖苷酸酶其它單一酶缺乏病Pompe病(糖原貯積?、?α-葡糖苷酶Wolman病 酸性脂肪酶溶酶體酶生物合成疾病Ⅰ-細(xì)胞病和假Hurler病6-磷-N-乙?；咸前忿D(zhuǎn)移酶多種營(yíng)養(yǎng)不良(polystrophy)[許多溶酶體酶的錯(cuò)位]溶酶體膜轉(zhuǎn)運(yùn)疾病胱氨酸(代謝)病 胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)唾液酸貯積和Salla病唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)Ⅴ．其它實(shí)施例本文所述的發(fā)明已經(jīng)部分列舉了用轉(zhuǎn)染后(即在引入編碼基因產(chǎn)物的、具有控制編碼序列表達(dá)的調(diào)控元件的構(gòu)建物后)表達(dá)特定基因產(chǎn)物的細(xì)胞來治療的方法。這些方法也可采用由其它方法遺傳修飾的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)(包括基因?qū)ぐ泻突蚣せ?參見Treco等，WO95/31560，納入本文作參考)；另見Selden等，WO93/09222)。
hGH信號(hào)肽可以與α-gal A以外的異源蛋白一起使用，以提高異源蛋白的表達(dá)和分泌水平。這些蛋白的例子包括α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ、載脂蛋白E、載脂蛋白A-1、凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和ⅩⅢ、骨生長(zhǎng)因子-2、骨生長(zhǎng)因子-7、降鈣素、催化性抗體、DNA酶、紅細(xì)胞生成素、FSH-β、球蛋白、胰高血糖素、葡糖腦苷脂酶、G-CSF、GM-CSF、生長(zhǎng)激素、免疫應(yīng)答修飾因子、免疫球蛋白、胰島素、促胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、干擾素-β、干擾素-β神經(jīng)生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-11、白細(xì)胞介素-12、IL-2受體、IL-1受體拮抗物、低密度脂蛋白受體、M-CSF、甲狀旁腺激素、蛋白激酶C、可溶性CD4、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原活化因子、TGF-β、腫瘤壞死因子、TSHβ、酪氨酸羥化酶和尿激酶。
其它實(shí)施例在下列權(quán)利要求中。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Transkaryotic Therapies,Inc.
(ⅱ)發(fā)明名稱半乳糖苷酶A缺乏癥的治療(ⅲ)序列數(shù)目28(ⅳ)通信地址(A)收件人Fish&Richardson P.C.
(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州MA(E)國(guó)家USA(F)郵編02110-2804(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Eelease#1.0,Verasion#1.30(ⅵ)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/712,614(B)申請(qǐng)日13-SEP-1996(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Fraser,J anis K(B)登記號(hào)34,819(C)參考/案卷號(hào)07236/003WO1(ⅸ)通訊信息(A)電話617/542-5070(B)電傳617/542-8906
(C)電報(bào)200154(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CTGGGCTGTA GCTATGATAA AC 22(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:TCTAGCTGAA GCAAAACAGT G21(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATTGGTCCGC CCCTGAGGT 19
(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:TGATGCAGGA ATCTGGGCTCT 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TTTTGGATCC ACCATGGCTA 20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TTTTGCCGGC ACTGCCCTCT TGAA 24
(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TTTTCAGCTG GACAATGGAT TGGC 24(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TTTTGCTAGC TGGCGAATCC 20(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:TTTTGGATCC GTGTCCCATA GTGTTTCCAA 30(2)SEQ ID NO:10的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:TTTTGGATCC GCAGTCGTGG CCAGTACC 28(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度12堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:CTAGTCCTAG GA 12(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:TTTTGAGCAC AGAGCCTCGC CT 22(2)SEQ ID NO:13的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TTTTGGATCC GGTGAGCTGC GAGAATAGCC 30(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度76堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GGGCCCCCAG CCCCAGCCCT CCCATTGGTG GAGGCCCTTT TGGAGGCACC CTAGGGCCAG60GAAACTTTTG CCGTAT76(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:AAATAGGGCA GATCCGGGCT TTATTATTTT AGCACCACGG CCGCCGAGAC CGCGTCCGCC60CCGCGAGCA69
(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度86堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:TGCCCTATTT ATACGGCAAA AGTTTCCTGG CCCTAGGGTG CCTCCAAAAG GGCCTCCACC60AATGGGAGGG CTGGGGCTGG GGGCCC 86(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度55堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO№1 7CGCGGGGCGG ACCGCGGTCTC GGCGGCCGTG GTGCTAAAAT AATAAAGCCC GGATC 55(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1343堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:CCGCGGGAAA TTTATGCTGT CCGGTCACCG TGACAATGCA GCTGAGGAAC CCAGAACTAC60ATCTGCGCTG CGCGCTTGCG CTTCGCTTCC TGGCCCTCGT TTCCTGGAGC ATCCCTGGGG120CTAGAGCACT GGACAATGGA TTGGCAAGGA CGCCTACCAT GGGCTGGCTG CACTGGGAGC180GCTTCATGTG CAACCTTGAC TGCCAGGAAG AGCCAGATTC CTGCATCAGT GAGAAGCTCT 240TCATGGAGAT GGCAGAGCTC ATGGTCTGAG AAGGCTGGAA GGATGCAGGT TATGAGTACC 300TCTGCATTGA TGACTGTTGG ATGGCTCCCC AAAGAGATTC AGAAGGCAGA CTTCAGGCAG 360ACCCTCAGCG CTTTCCTCAT GGGATTCGCC AGCTAGCTAA TTATGTTCAC AGCAAAGGAC 420TGAAGCTAGG GATTTATGCA GATGTTGGAA ATAAAACCTG CGCAGGCTTC CCTGGGAGTT 480TTGGATACTA CGACATTGAT GCCCAGACCT TGGCTGACTG GGGAGTAGAT CTGCTAAAAT 540TTGATGGTTG TTACTGTGAC AGTTTGGAAA ATTTGGCAGA TGGTTATAAG CACATGTCCT 600TGGCCCTGAA TAGGACTGGC AGAAGCATTG TGTACTCCTG TGAGTGGCCT CTTTATATGT 660GGCCCTTTCA AAAGCCCAAT TATACAGAAA TCCGACAGTA CTGCAATCAC TGGCGAAATT 720TTGCTGACAT TGATGATTCC TGGAAAGGTA TAAAGAGTAT CTTGGACTGG ACATCTTTTA 780ACCAGGAGAG AATTGTTGAT GTTGCTGGAC CAGGGGGTTG GAATGACCCA GATATGTTAG 840TGATTGGCAA CTTTGGCCTC AGCTGGAATC AGCAAGTAAC TCAGATGGCC CTCTGGGCTA 900TCATGGCTGC TCCTTTATTC ATGTCTAATG ACCTCCGACA CATCAGCCCT CAAGCCAAAG 960CTCTCCTTCA GGATAAGGAC GTAATTGCCA TCAATCAGGA CCCCTTGGGC AAGCAAGGGT 1020ACCAGCTTAG ACAGGGAGAC AACTTTGAAG TGTGGGAACG ACCTCTCTCA GGCTTAGCCT 1080GGGCTGTAGC TATGATAAAC CGGCAGGAGA TTGGTGGACC TCGCTCTTAT ACCATCGCAG 1140TTGCTTCCCT GGGTAAAGGA GTGGCCTGTA ATCCTGCCTG CTTCATCACA CGCTCCCTCC 1200CTGTGAAAAG GAAGCTAGGG TTCTATGAAT GGACTTCAAG GTTAAGAAGT CACATAAATC 1260CCACAGGCAC TGTTTTGCTT CAGCTAGAAA ATACAATGCA GATGTCATTA AAAGACTTAC 1320TTTAAAAAAA AAAAAAACTC GAG 1343(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度210堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CTGGGCTGTA GCTATGATAA ACCGGCAGGA GATTGGTGGA CCTCGCTCTT ATACCATCGC 60AGTTGCTTCC CTGGGTAAAG GAGTGGCCTG TAATCCTGCC TGCTTCATCA CACAGCTCCT 120CCCTGTGAAA AGGAAGCTAG GGTTCTATGA ATGGACTTCA AGGTTAAGAA GTCACATAAA 180TCCCACAGGC ACTGTTTTGC TTCAGCTAGA 210
(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度268堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:ATTGGTCCGC CCCTGAGGTT AATCTTAAAA GCCCAGGTTA CCCGCGGAAA TTTATGCTGT 60CCGGTCACCG TGACAATGCA GCTGAGGAAC CCAGAACTAC ATCTGGGCTG CGCGCTTGCG 120CTTCGCTTCC TGGCCCTCGT TTCCTGGGAC ATCCCTGGGG CTAGAGCACT GGACAATGGA 180TTGGCAAGGA CGCCTACCAT GGGCTGGCTG CACTGGGAGC GCTTCATGTG CAACCTTGAC 240TGCCAGGAAG AGCCAGATTC CTGCATCA268(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala20 25(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度78堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:ATGGCTACAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG60CTTCAAGAGG GCAGTGCC 78(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:TTTTGGATCC CTCGAGGACA TTGATTATTG ACTAG 35(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:TTTTGGATCC CGTGTCAAGG ACGGTGAC 28(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1197堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:CTG GAC AAT GGA TTG GCA AGG ACG CCT ACC ATG GGC TGG CTG CAC TGG48GAG CGC TTC ATG TGC AAC CTT GAC TGC CAG GAA GAG CCA GAT TCC TGC96ATC AGT GAG AAG CTC TTC ATG GAG ATG GCA GAG CTC ATG GTC TCA GAA 144GGC TGG AAG GAT GCA GGT TAT GAG TAC CTC TGC ATT GAT GAC TGT TGG 192ATG GCT CCC CAA AGA GAT TCA GAA GGC AGA CTT CAG GCA GAC CCT CAG 240CGC TTT CCT CAT GGG ATT CGC CAG CTA GCT AAT TAT GTT CAC AGC AAA 288GGA CTG AAG CTA GGG ATT TAT GCA GAT GTT GGA AAT AAA ACC TGC GCA 336GGC TTC CCT GGG AGT TTT GGA TAC TAC GAC ATT GAT GCC CAG ACC TTT 384GCT GAC TGG GGA GTA GAT CTG CTA AAA TTT GAT GGT TGT TAC TGT GAC 432AGT TTG GAA AAT TTG GCA GAT GGT TAT AAG CAC ATG TCC TTG GCC CTG 480AAT AGG ACT GGC AGA AGC ATT GTG TAC TCC TGT GAG TGG CCT CTT TAT 528ATG TGG CCC TTT CAA AAG CCC AAT TAT ACA GAA ATC CGA CAG TAC TGC 576AAT CAC TGG CGA AAT TTT GCT GAC ATT GAT GAT TCC TGG AAA AGT ATA 624AAG AGT ATC TTG GAC TGG ACA TCT TTT AAC CAG GAG AGA ATT GTT GAT 672GTT GCT GGA CCA GGG GGT TGG AAT GAC CCA GAT ATG TTA GTG ATT GGC 720AAC TTT GGC CTC AGC TGG AAT CAG CAA GTA ACT CAG ATG GCC CTC TGG 768GCT ATC ATG GCT GCT CCT TTA TTC ATG TCT AAT GAC CTC CGA CAC ATC 816AGC CCT CAA GCC AAA GCT CTC CTT CAG GAT AAG GAC GTA ATT GCC ATC 864AAT CAG GAC CCC TTG GGC AAG CAA GGG TAC CAG CTT AGA CAG GGA GAC 912AAC TTT GAA GTG TGG GAA CGA CCT CTC TCA GGC TTA GCC TGG GCT GTA 960GCT ATG ATA AAC CGG CAG GAG ATT GGT GGA CCT CGC TCT TAT ACC ATC 1008GCA GTT GCT TCC CTG GGT AAA GGA GTG GCC TGT AAT CCT GCC TGC TTC 1056ATC ACA CAG CTC CTC CCT GTG AAA AGG AAG CTA GGG TTC TAT GAA TGG 1104ACT TCA AGG TTA AGA AGT CAC ATA AAT CCC ACA GGC ACT GTT TTG CTT 1152CAG CTA GAA AAT ACA ATG CAG ATG TCA TTA AAA GAC TTA CTT TAA 1197(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度398氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽
(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp1 5 10 15Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys20 25 30Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu35 40 45Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp50 55 60Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln65 70 75 80Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys85 90 95Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala100 105 110Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe115 120 125Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp130 135 140Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu145 150 155 160Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr165 170 175Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys180 185 190Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile195 200 205Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp210 215 220Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly225 230 235 240Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp245 250 255Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile260 265 270Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile275 280 285Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp290 295 300Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val305 310 315 320Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile325 330 335Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe340 345 350Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp355 360 365Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu370 375 380Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu385 390 395(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度338堿基對(duì)(B)類型核酸(C)漣型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:ATGGCTACAG GTAAGCGCCC CTAAAATCCC TTTGGGCACA ATGTGTCCTG AGGGGAGAGG 60CAGCGACCTG TAGATGGGAC GGGGGCACTA ACCCTCAGGT TTGGGGCTTC TGAATGTGAG120TATCGCCATG TAAGCCCAGT ATTTGGCCAA TCTCAGAAAG CTCCTGGTCC CTGGAGGGAT180GGAGAGAGAA AAACAAACAG CTCCTGGAGC AGGGAGAGTG CTGGCCTCTT GCTCTCCGGC240TCCCTCTGTT GCCCTCTGGT TTCTCCCCAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG300GCCTGCTCTG CCTGCCCTGG CTTCAAGAGG GCAGTGCC 338(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度10氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr1 5 10
權(quán)利要求
1．一種治療方法，包括鑒別懷疑患有α-半乳糖苷酶A缺乏癥的病人，和給病人導(dǎo)入基因修飾的人細(xì)胞以過度表達(dá)和分泌人α-半乳糖苷酶A。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中細(xì)胞以一個(gè)DNA分子體外轉(zhuǎn)染，所述DNA分子具有一個(gè)編碼序列，該序列編碼包含人α-半乳糖苷酶A的一個(gè)多肽(SEQID NO:26)。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的多肽還包括一個(gè)異源信號(hào)肽。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中的異源信號(hào)肽是人生長(zhǎng)激素(hGH)信號(hào)肽(SED ID NO:21)。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中DNA分子包含一個(gè)位于編碼信號(hào)肽序列中的內(nèi)含子。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中DNA分子包含至少有6個(gè)核苷酸的非翻譯序列，它正好位于3到該編譯碼序列末端密碼子處，所述的作翻譯序列包括一個(gè)多腺苷酸化位點(diǎn)。
7．一種DNA分子，包括編碼hGH信號(hào)肽的第一序列(SEQ ID NO:21)，所述的第一序列包括一個(gè)內(nèi)含子；和連接到第一序列的3’末端的第二序列，此第二序列編碼含人α-半乳糖苷酶A的一個(gè)多肽。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA分子，它還包括含多腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯序列。
9．一種表達(dá)構(gòu)建物，它包括權(quán)利要求7所述的DNA分子，它適合在人細(xì)胞中表達(dá)。
10．一種培養(yǎng)的人體細(xì)胞，它含DNA分子，所述DNA分子(a)編碼含有與異源信號(hào)肽連接的人α-半乳糖苷酶A的一個(gè)多肽，和(b)允許此多肽在細(xì)胞中表達(dá)。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，所述的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
12．根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞選自上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或這些類型細(xì)胞的前體。
13．根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其中所述的信號(hào)肽是hGH信號(hào)肽(SEQ IDNO:21)。
14．一種克隆細(xì)胞株，它基本上由許多培養(yǎng)的人細(xì)胞構(gòu)成，所述的培養(yǎng)的人細(xì)胞被一個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)染，此DNA分子(a)編碼含有與異源信號(hào)肽連接的人α-半乳糖苷酶A的一個(gè)多肽，和(b)允許此多肽在細(xì)胞里表達(dá)。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的克隆細(xì)胞株，該細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
16．一種克隆細(xì)胞系，它基本上由許多不死的人細(xì)胞構(gòu)成，所述的不死細(xì)胞被一個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)染，此DNA分子(a)編碼含有與異源信號(hào)肽連接的人α-半乳糖苷酶A的一個(gè)多肽，和(b)允許此多肽在細(xì)胞里表達(dá)。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的克隆細(xì)胞系，其中該細(xì)胞選自Bows黑素瘤細(xì)胞、Daudi細(xì)胞，Hela細(xì)胞、HL-60細(xì)胞，HT1080細(xì)胞，Jurkat細(xì)胞，KB癌瘤細(xì)胞，K-562白血病細(xì)胞，MCF-7乳腺癌細(xì)胞，MOLT-4細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞，Raji細(xì)胞，RPMI8226細(xì)胞，U-937細(xì)胞，WI-38VA13亞系2R4細(xì)胞和2780AD卵巢癌細(xì)胞。
18．一種蛋白質(zhì)，它包括(a)hGH信號(hào)肽(SEQ ID NO:21)，此信號(hào)肽被肽鍵連接到(b)人α-半乳糖苷酶A上。
19．一種制備糖化的人α-半乳糖苷酶A的方法，它包括在允許所述的DNA分子表達(dá)人α-半乳糖苷酶A的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，并分泌糖化的人α-半乳糖苷酶A到細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中；和從培養(yǎng)介質(zhì)分離出糖化的人α-半乳糖苷酶A。
20．用權(quán)利要求19所述的方法制取純化的糖化人α-半乳糖苷酶A。
21．一種從樣品中純化人α-半乳糖苷酶A的方法，它包括第一層析步驟，其中樣品通過一個(gè)疏水反應(yīng)樹脂。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中樹脂上的功能團(tuán)部分包括丁基。
23．一種制備糖化的人α-半乳糖苷酶A的方法，它包括在允許所述的DNA分子表達(dá)人α-半乳糖苷酶A的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，并分泌糖化的人α-半乳糖苷酶A到細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中；和從培養(yǎng)介質(zhì)分離出糖化的人α-半乳糖苷酶A。
24．根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，它還包括使樣品通過第二樹脂的步驟，所述的第二樹脂選自固定了肝素的樹脂，羥基磷灰石，陰離子交換樹脂，和分子篩樹脂。
25．一種治療方法，它包括鑒別懷疑患有α-半乳糖苷酶A缺乏癥的病人，和給予病人權(quán)利要求20所述的純化的糖化人α-半乳糖苷酶A。
26．一種治療組合物，它包括藥學(xué)上可接受的純化的人α-半乳糖苷酶A，此酶在藥學(xué)上可接受的載體里有N-連接的甘露糖-6-磷酸鹽。
27．一種治療組合物，它包括權(quán)利要求20所述的純化的人α-半乳糖苷酶A和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的治療組合物，它在pH6.5或更低pH下配制。
29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的治療組合物，其中藥學(xué)上可接受的賦形劑是人血清白蛋白。
30．一種編碼一種蛋白質(zhì)的DNA分子，該蛋白包括連接到非hGH的一個(gè)多肽上的hGH的信號(hào)肽(SEQ ID NO:21)。
31．根據(jù)權(quán)利要求30所述的DNA分子，其中該DNA分子包括一個(gè)位于編碼信號(hào)肽序列中的內(nèi)含子。
32．一種培養(yǎng)的人細(xì)胞，它含DNA分子，所述的DNA分子(a)編碼含有與異源信號(hào)肽連接的人α-半乳糖苷酶A的一個(gè)多肽，和(b)允許此多肽在細(xì)胞里過度表達(dá)。
33．一種制備糖化人α-半乳糖苷酶A的方法，它包括培養(yǎng)含DNA分子的人細(xì)胞，此DNA分子在允許表達(dá)人α-半乳糖苷酶A的條件下編碼含人α-半乳糖苷酶A的多肽。
34．根據(jù)權(quán)利要求26所述的治療組合物，它還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。
35．一種從樣品中純化人α-半乳糖苷酶A的方法，它包括將所述的樣品通過疏水反應(yīng)樹脂，所述的樹脂含有丁基作為功能團(tuán)部分。
全文摘要
一種治療懷疑患有α－半乳糖苷酶A缺乏癥,如彌漫性軀體血管角質(zhì)瘤病病人的治療方法,它用(1)經(jīng)基因修飾的人細(xì)胞來過度表達(dá)和分泌α－半乳糖苷酶A或(2)從培養(yǎng)的、基因修飾的人細(xì)胞得的純化的人α－半乳糖苷酶A進(jìn)行治療。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1230220SQ97197909
公開日1999年9月29日 申請(qǐng)日期1997年9月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月13日
發(fā)明者R·F·塞爾登, M·博羅夫斯基, F·P·吉萊斯皮, C·M·基諾希塔, D·A·特雷, M·D·威廉斯 申請(qǐng)人:超卡里奧迪克治療學(xué)股份有限公司