專利名稱：以樹眼鏡蛇毒素的支架為基礎(chǔ)的雙功能或多功能分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以樹眼鏡蛇毒素(Dendroaspin)為基礎(chǔ)的嵌合分子，該分子具有抗凝血、抗血小板以及其他活性。本發(fā)明還涉及編碼這些嵌合樹眼鏡蛇毒素分子的核酸、包含這些核酸的克隆和表達(dá)載體以及該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的用來提供重組的多功能嵌合樹眼鏡蛇毒素的宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括嵌合樹眼鏡蛇毒素分子的藥用組合物及其用于預(yù)防和治療與血栓形成或血小板聚集有關(guān)的疾病的用途。本發(fā)明進(jìn)一步還涉及樹眼鏡蛇毒素的支架用于設(shè)計(jì)和產(chǎn)生嵌合樹眼鏡蛇毒素的衍生物的用途，這些衍生物能夠抑制血小板的結(jié)合整聯(lián)蛋白活性，另外還具有抗凝血或抗血栓等其他功能。
血液凝集的作用在于為止血塞的凝固和穩(wěn)定提供一種不溶性的纖維基質(zhì)。交聯(lián)的纖維凝塊的形成源于一系列血漿蛋白參與的一系列生物化學(xué)反應(yīng)。
急性血管疾病，如心肌梗死、中風(fēng)、肺栓塞、深靜脈血栓和末梢動(dòng)脈閉塞等都是由于血凝塊部分或全部閉塞血管引起的。
血管中形成的血液凝塊稱為血栓，它的形成依賴于血小板的凝聚。當(dāng)血管損傷時(shí)(也可以是由外科手術(shù)引起的)，凝塊或血栓的形成過程主要依靠血液血小板與受傷血管內(nèi)皮表面之間或與血小板與血小板之間的相互作用來完成。
現(xiàn)在，能夠預(yù)防血凝塊形成的藥物種類很多，如阿司匹林、番生丁和filopidine。這些產(chǎn)品通常抑制血小板活化和凝聚，或者延遲血液凝集進(jìn)程，但是它們有很強(qiáng)的副作用，即延長(zhǎng)出血時(shí)間。而且，僅僅通過自身形成或外源提供的新的血小板就能逆轉(zhuǎn)這些產(chǎn)品的藥效。
血小板的凝聚依靠纖維蛋白原和其他血清蛋白與血小板原生質(zhì)膜上的糖蛋白受體IIb/IIIa復(fù)合物的結(jié)合。GPIIb/IIIa是被稱做整聯(lián)蛋白的細(xì)胞粘附受體大家族中的一員，在這個(gè)家族的許多成員中都發(fā)現(xiàn)了三肽識(shí)別序列Arg-Gly-Asp(RGD)。
肝素和低分子量肝素已經(jīng)被廣泛地用于治療靜脈血栓栓塞等病癥，這些病癥中凝血酶活性是血栓形成和膨脹的原因。盡管肝素是有效的，但同時(shí)也產(chǎn)生許多副作用，如出血和血小板減少癥。因此，需要一種特異性更強(qiáng)、毒性更小的抗凝劑。
現(xiàn)在已經(jīng)得到許多直接凝血酶抑制劑，水蛭素、水蛭原(hirugen)和hirulog(后兩者是合成的水蛭素衍生物)，PPACK(一個(gè)合成三肽)以及argatroban(一種精氨酸衍生物)是其中的實(shí)例。關(guān)于這些抑制劑作用的綜述見Lefkovits J和Topol E J(1994)，Circulation 901522-1536。盡管理論上說，由于直接凝血酶抑制劑具有單一靶特異性，無直接的血小板影響以及半衰期短，所以它們引起的出血的危險(xiǎn)性要比其他抗血栓形成藥小，但是出血仍然是最值得關(guān)注的副作用。
已經(jīng)開發(fā)了一系列其他的凝血酶抑制劑(見上述Lefkovits J和Topol E J中的表1)，但是已經(jīng)證明它們的臨床毒性太大。
由于動(dòng)脈粥樣硬化引起的動(dòng)脈局部狹窄的情況，通常通過氣囊血管成形(balloon angioplasty)技術(shù)外科矯正。這種方法具有侵害性，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈壁組織損傷，而這種損傷會(huì)導(dǎo)致血栓形成。動(dòng)脈壁中的纖連蛋白等胞外蛋白與動(dòng)脈血接觸。血小板通過整聯(lián)蛋白受體結(jié)合到纖連蛋白的RGD基序上，繼而導(dǎo)致血小板聚集和啟動(dòng)形成血凝塊的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。需要一種藥物，它能夠在損傷位點(diǎn)特異性抑制血小板聚集，還能在這些位點(diǎn)處抑制血凝塊的形成。這種藥物應(yīng)該無毒，無副作用，例如不會(huì)帶來引起出血的危險(xiǎn)。
整聯(lián)蛋白是一個(gè)細(xì)胞表面受體家族，它介導(dǎo)細(xì)胞間彼此粘附或細(xì)胞粘附到胞外基質(zhì)上(Kieffer N & Philips D R(1990)Annu Rev CellBiol 6329-357；Hynes R O(1992)Cell 6911-25；Mcever R P(1992)Curr Opin Cell Biol 4840-849；Smyth S S et al(1993)Blood 812827-2843；Giancotti F G和Mainiero F(1994)Biochem Biophys Acta 119847-64)。它們由非共價(jià)相連的α和β兩種跨膜亞基構(gòu)成。共有16種不同的α亞基和8種不同的β亞基，它們之間異二聚化，生成20種不同種類的受體(Cark E A & Brugge J S(1995)Science 268233-239)。在這些整聯(lián)蛋白中，血小板膜整聯(lián)蛋白αIIbβ3是最有代表性的成員之一。細(xì)胞活化時(shí)，αIIbβ3整聯(lián)蛋白主要通過Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列(上述Pierschbacher M D Ruoslahti E(1984)；PlowE F Et Al(1987)Blood 70110-115；Pytela R Et Al(1986)Science 2311559-1562)可以結(jié)合數(shù)個(gè)糖蛋白，上述的三肽序列出現(xiàn)在下列蛋白中纖維蛋白原(Nachman R L和Nachman L L K(1992)J Clin Invest69263-269)、纖連蛋白(Gardner J M和Hynes R O(1985)Cell 42439-448)，von Willebrand因子(Ruggeri Z et al(1983)J Clin Inves721-12)、玻連蛋白(Pytela R M et al(1985)Proc Natl Acad Sci Usa 825766-5770)和凝血栓蛋白(Karczewski J et al(1989)J Bio Chem 26421322-21326)。這些糖蛋白配體和它們的整聯(lián)蛋白受體之間相互作用的本質(zhì)是復(fù)雜的，并且這些受體(Sims P J Et Al(1991)J Biol Chem2667345-7352)和配體(Ugarova T et al(1995)Thromb Haemostasis 74253-257)的構(gòu)象都發(fā)生了變化。
近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自各種蛇毒的許多蛋白是血小板聚集和整聯(lián)蛋白依賴性細(xì)胞粘附的強(qiáng)抑制劑。這些屬于所謂“解聯(lián)蛋白”家族的蛋白，其中的大部分具有高度序列同源性，分子量小(4-8 kDa)，富含半胱氨酸，并含有RGD序列(Gould R J et al(1990)Proc Soc Exp BiolMed 195168-171)或KGD序列(Scarborough R M et al(1991)J BiolChem 2669359-9362)。除了解聯(lián)蛋白家族以外，已經(jīng)從蛇類中眼鏡蛇科的毒液(Mcdowell R S et al(1992)Biochemistry 314766-4722；Willams J A et al(1922)Biom Soc Trans 2173 S)和水蛭組織勻漿(knapp a et al(1992)J Biol Chem 26724230-24234)二者中都分離到了大量非解聯(lián)蛋白的RGD蛋白，這些蛋白具有類似的抑制能力，富含二硫鍵和分子量小。所有這些蛋白對(duì)糖蛋白配體和整聯(lián)蛋白之間相互作用的抑制能力比線形RGD肽鏈高1000倍；這是對(duì)支架蛋白所含RGD基序的最有利構(gòu)象做出貢獻(xiàn)的一個(gè)特征。數(shù)個(gè)抑制劑的NMR結(jié)構(gòu)已有報(bào)道，其中包括蝮蛇毒素(Adler M et al(1991)Science253445-448；Adler M和Wanger G(1992)Biochemistry 311031-1039；Adler M et al(1993)Biochemistry 32282-289)、Flavoridin(Senn HKlaus W(1993)J Mol Biol 234907-925)、鋸鱗血抑環(huán)肽(Saudek V et al(1991)Biochemistry 307369-7372；Saudek V et al(1991)Eur JBiochemstry 202323-328；Cooke R M et al(1991)Eur J Biochemstry202323-328；Cooke R M et al(1992)Protein Eng 5473-477)、Albolabrin(Jesaja M et al(1993)Eur J Biochem 218853-860)、Decorsin(Krezel A M et al(1994)Science 2641944-1947)和樹眼鏡蛇毒素(Jesaja M et al(1994)Eur J Biochem 226861-868；Sutcliffe M J et al(1994)Nature Struct Biol 1802-807)，迄今已闡明的唯一共同結(jié)構(gòu)特征是一個(gè)暴露于溶劑的環(huán)的末端上的RGD基序的位置，該結(jié)構(gòu)特征是決定它們抑制作用的一個(gè)頭等重要的特征。
最近的研究已經(jīng)印證了RGD三肽周圍的氨基酸在調(diào)節(jié)蛇毒蛋白的結(jié)合配體特異性方面的作用。Scarborough R M et al(1993)J BiolChem 2681058-1065中測(cè)試了一些解聯(lián)蛋白，觀察到那些含有RGDW的解聯(lián)蛋白能夠非常有效地抑制纖維蛋白原和純化的αIIbβ3之間的相互作用，但不能抑制玻連蛋白和纖連蛋白分別與αvβ3和α5β1之間的相互作用，而含有RGDNP序列的解聯(lián)蛋白則正相反。其他氨基酸序列趨異的結(jié)構(gòu)域可能也起作用(Scarborough et al(1993)出處同上)。
樹眼鏡蛇毒素是含有RGD序列的短鏈神經(jīng)毒素類似物，它和解聯(lián)蛋白蝮蛇毒素之間在全序列上的序列同源性很低，但它們RGD側(cè)翼氨基酸的卻是相似的，這兩種蛋白都能強(qiáng)烈地抑制血小板粘附到纖維蛋白原上，但對(duì)血小板與固定了的纖連蛋白間的拮抗作用卻很弱(Lu X et al(1994)Biochem J 304929-936)。相反，華麗蛇鞭毒素雖然和kistrin之間的序列同源性達(dá)65％，但RGD(ARGDNP)周圍氨基酸卻顯著不同，與纖維蛋白原相反，華麗蛇鞭毒素優(yōu)選抑制血小板粘附到纖連蛋白，并結(jié)合到復(fù)合物αIIbβ3的別構(gòu)特征位點(diǎn)上。
Smith J W et al(1995)Journal of Biological Chemistry 27030486-30490設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)“環(huán)移植”實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了組織纖溶酶原激活物(t-PA)的一種變體，該蛋白可以與血小板整聯(lián)蛋白αIIbβ3結(jié)合。用互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基取代t-PA的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)結(jié)構(gòu)域中的表面環(huán)中的氨基酸形成具有抗粘附性整聯(lián)蛋白受體αIIbβ3活性的單克隆抗體的一個(gè)CDR。得到的t-PA變體(環(huán)移植后的t-PA)以納摩爾的親和力與αIIbβ3相結(jié)合，并且對(duì)于合成和天然的底物都有完全的活性?？偠灾?，環(huán)移植的效果和適用性是無法預(yù)測(cè)和不確定的。
現(xiàn)在，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)樹眼鏡蛇毒素的支架使其能被修飾。當(dāng)通過引入另外的功能性氨基酸序列修飾樹眼鏡蛇毒素(包括RGD基序)時(shí)，所得的分子作為抗凝劑特別有用，并且克服了現(xiàn)有抗凝劑相關(guān)的缺陷，上述功能性氨基酸序列的實(shí)例包括，參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)因子的激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑的活性部分或基序。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種雜合多肽，其中包括第一個(gè)氨基酸序列和一段另外的氨基酸序列，所述的第一個(gè)氨基酸序列包含RGD基序并能賦予樹眼鏡蛇毒素活性，所述的另外的氨基酸序列能賦予除樹眼鏡蛇毒素活性以外的其他活性。
本發(fā)明還提供了一種具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的雜合多肽，其中包括樹眼鏡蛇毒素的支架和一段另外的非樹眼鏡蛇毒素氨基酸序列，該序列優(yōu)選具有不同的活性。
有利地，本發(fā)明的分子具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性，當(dāng)體內(nèi)使用該分子時(shí)，該分子具有的整聯(lián)蛋白結(jié)合活性導(dǎo)致該分子與血小板結(jié)合，從而抑制損傷位點(diǎn)的血小板聚集。而且，非野生型的樹眼鏡蛇毒素結(jié)構(gòu)域提供次級(jí)的，任意的其他功能，例如，抗血栓形成功能，抑制細(xì)胞遷移和增殖以及調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。因此，本發(fā)明的分子在抗凝血的活性方面是雙功能或多功能的，具體地說是對(duì)血栓形成和損傷位點(diǎn)處動(dòng)/靜脈壁增厚的抵抗作用。本發(fā)明的多肽具有抗白細(xì)胞募集(leukocyte recruitment)、免疫系統(tǒng)激活、組織纖維化和腫瘤發(fā)生的活性。
本發(fā)明的多肽可以包括至少兩個(gè)所述的另外的氨基酸序列，優(yōu)選這兩個(gè)所述的另外的氨基酸序列是同一序列。
所述的另外的氨基酸序列可以包括兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列部分，這些氨基酸序列部分通過至少一個(gè)樹眼鏡蛇毒素的氨基酸殘基被隔開。這兩個(gè)或多個(gè)序列部分可以互換位置，變換它們?cè)谒隽硗獾陌被嵝蛄刑烊恍问街械陌被峋€性順序。換句話說，盡管每個(gè)部分的實(shí)際序列不需變化，但是這兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列部分的天然順序被改變。
所述的另外的序列可以選自血小板衍生生長(zhǎng)因子(PGDF)、糖蛋白(GP)IBα、水蛭素、凝血酶、凝血調(diào)節(jié)蛋白(特別是它的第5個(gè)類EGF結(jié)構(gòu)域)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(TGFβ1)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管緊張肽II(AngII)、因子VIII以及von Willebrand因子(vWF)。
這樣就使本發(fā)明的分子可以具有多種功能，所以它們不單能抑制血小板聚集，而且對(duì)其他例如凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的其他成分(例如凝血酶活性)或者胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的其他成分(例如生長(zhǎng)因子)也有活性。可以對(duì)本發(fā)明的修飾的樹眼鏡蛇毒素進(jìn)行工程化從而使另外的氨基酸序列具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性，因此提供了一種以樹眼鏡蛇毒素為基礎(chǔ)的分子，該分子具有增強(qiáng)的整聯(lián)蛋白結(jié)合活性。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包括一種如圖3所示的氨基酸序列。在加入所述的另外的氨基酸序列之前，本發(fā)明的樹眼鏡蛇毒素的支架包括同源性的分子，該分子與樹眼鏡蛇毒素之間的氨基酸序列同源性可以為約50％，優(yōu)選約65％，更優(yōu)選約75％，甚至更優(yōu)選約85％。
把編碼所述另外的氨基酸序列的核酸序列除外，編碼本發(fā)明多肽的核酸序列與樹眼鏡蛇毒素核酸序列之間的核苷酸序列同源性可以為約50％，優(yōu)選約65％，更優(yōu)選約75％，甚至更優(yōu)選約85％。
與樹眼鏡蛇毒素的59個(gè)氨基酸殘基相比，本發(fā)明的多肽可以包括更多或更少數(shù)目的氨基酸殘基。例如，本發(fā)明的分子可以包括45-159個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選約49-89，更優(yōu)選約53-69，甚至更優(yōu)選約57-61。
所述的另外的氨基酸序列優(yōu)選被引入樹眼鏡蛇毒素的支架的(a)環(huán)I和/或環(huán)II；(b)環(huán)I和/或環(huán)III；(c)環(huán)II和/或環(huán)III；或者(d)樹眼鏡蛇毒素的支架的環(huán)I、環(huán)II和環(huán)III。環(huán)I包括第4-16位氨基酸殘基，環(huán)II包括第23-36位氨基酸殘基，環(huán)III包括第40-50位氨基酸殘基。然而，被引入的氨基酸可以擴(kuò)展到或取代環(huán)外結(jié)構(gòu)域，即可以擴(kuò)展到或取代1-3位、17-22位以及37-39位的氨基酸殘基，從而用被插入的另外的氨基酸序列的殘基增加或取代非環(huán)結(jié)構(gòu)域的殘基。
另外的氨基酸殘基優(yōu)選被引入環(huán)I或環(huán)II。這樣，含有RGD的環(huán)III未發(fā)生變化，所以樹眼鏡蛇毒素的整聯(lián)蛋白結(jié)合功能得以保留。
可以把一個(gè)另外的RGD基序?qū)氲綐溲坨R蛇毒素的支架中，優(yōu)選導(dǎo)入到環(huán)I和環(huán)II中，從而增強(qiáng)樹眼鏡蛇毒素活性。
用于插入其他序列的部位優(yōu)選在樹眼鏡蛇毒素的支架中第4-16、18-21、23-36或52-59位氨基酸殘基之間。
每個(gè)被插入的另外的氨基酸序列或另外的氨基酸序列的一部分都優(yōu)選長(zhǎng)為3-40個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，更優(yōu)選3-16個(gè)殘基，甚至更優(yōu)選3-14個(gè)殘基。被插入的另外的氨基酸序列可以從樹眼鏡蛇毒素的支架的第1-57位中的任何一個(gè)氨基酸殘基開始。被插入的另外的氨基酸序列可以在樹眼鏡蛇毒素的支架的第3-59位中的任何一個(gè)氨基酸殘基終止。
當(dāng)把兩個(gè)另外的氨基酸序列插入到樹眼鏡蛇毒素的支架中時(shí)，二者之間的線性距離優(yōu)選1-35個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選1-14個(gè)氨基酸殘基。當(dāng)把多于兩個(gè)的另外的氨基酸序列插入到樹眼鏡蛇毒素的支架中時(shí)，優(yōu)選每?jī)蓚€(gè)另外的氨基酸序列之間都隔有至少一個(gè)天然的樹眼鏡蛇毒素氨基酸殘基。
通過插入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，對(duì)含RGD的環(huán)進(jìn)行修飾，在樹眼鏡蛇毒素的環(huán)III中，能被修飾的氨基酸的數(shù)目?jī)?yōu)選為最多8個(gè)，最少1個(gè)。
RGD環(huán)優(yōu)選具有如表1所示的氨基酸序列。對(duì)RGD環(huán)進(jìn)行修飾的優(yōu)勢(shì)在于可以提高整聯(lián)蛋白結(jié)合活性，或使其針對(duì)特定糖蛋白配體的特異性更強(qiáng)。另外，如果把一個(gè)或多個(gè)“外源”的另外的氨基酸序列移植到樹眼鏡蛇毒素的支架中就會(huì)對(duì)RGD基序產(chǎn)生空間影響，那么對(duì)RGD位點(diǎn)周圍的環(huán)III的修飾，就可以克服任何的空間位阻，從而恢復(fù)，也可能增強(qiáng)了RGD功能。
通過插入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，可以對(duì)環(huán)I和環(huán)II進(jìn)行修飾。盡管優(yōu)選在樹眼鏡蛇毒素的支架中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入14-36個(gè)的殘基，但是在樹眼鏡蛇毒素的支架中插入任何合適的氨基酸數(shù)目都會(huì)帶來期望的雙功能或多功能活性。
如果一個(gè)移植到樹眼鏡蛇毒素的支架中的“外源”的另外的氨基酸序列對(duì)另一個(gè)被移植的結(jié)構(gòu)域或含RGD的環(huán)產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，那么就需要對(duì)這些環(huán)進(jìn)行修飾。用Insight II軟件制作的電腦輔助分子模型能夠被用來預(yù)測(cè)本發(fā)明的“環(huán)移植”樹眼鏡蛇毒素的結(jié)構(gòu)。當(dāng)各環(huán)之間的空間位阻導(dǎo)致功能喪失的情況下，通過適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)樹眼鏡蛇毒素分子的合適的部分進(jìn)行修飾，能夠“消除”(“design out”)這些效應(yīng)。有時(shí)這種修飾可以是插入許多合適的氨基酸殘基擴(kuò)展一個(gè)或多個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選的修飾包括，為擴(kuò)展樹眼鏡蛇毒素的支架中的某個(gè)或多個(gè)環(huán)而把聚甘氨酸插入其中。能夠被使用的其他修飾包括，一個(gè)氨基酸殘基或多個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)單元。為擴(kuò)展樹眼鏡蛇毒素環(huán)，電腦模型研究能被用來設(shè)計(jì)所需要的環(huán)修飾。
在根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)一種雙功能或多功能分子時(shí)，通過取代或缺失單個(gè)所選的氨基酸殘基可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活性、穩(wěn)定性或其他所需的生物或生化特性的“微調(diào)”。在一個(gè)所選位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)殘基的修飾也屬于本發(fā)明的這種“微調(diào)”的范圍之內(nèi)。能夠在這種分子的一個(gè)特定位點(diǎn)處改變氨基酸序列的定點(diǎn)突變技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種編碼一種以上規(guī)定的多肽的核酸分子。
可以把這種核酸分子任意地連接到一個(gè)啟動(dòng)子，并且任意地連接到一段編碼異源蛋白或多肽的核酸序列上，從而編碼一個(gè)融合產(chǎn)物。上述啟動(dòng)子優(yōu)選是β-D-異丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，異源蛋白或多肽可以是谷胱甘肽S—轉(zhuǎn)移酶(GST)。
本發(fā)明的這個(gè)方面也可以包括一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括上述規(guī)定的核酸。該質(zhì)粒優(yōu)選是pGEX-3X。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種用上述規(guī)定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是Ecoli。
因此，本發(fā)明還提供了一種含有上述轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種生產(chǎn)上述規(guī)定的多肽的方法，該方法包括，培養(yǎng)上述用來表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)物中抽提該多肽，并將其純化。
第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)一種多功能抗凝劑的方法，其中包括如下步驟a)構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體，其中編碼樹眼鏡蛇毒素的支架的核酸序列與一個(gè)啟動(dòng)子可操縱地相連，同時(shí)為了與一個(gè)異源蛋白共表達(dá)而任意地與其編碼基因相連接。
b)通過插入、缺失或者取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基，對(duì)編碼樹眼鏡蛇毒素的支架的載體的核酸序列中除RGD基序之外的至少一個(gè)部分進(jìn)行修飾，從而使表達(dá)的樹眼鏡蛇毒素的支架中包括一段另外的氨基酸序列，該序列能帶來除樹眼鏡蛇毒素活性之外的其他活性。
c)用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使宿主細(xì)胞表達(dá)修飾的樹眼鏡蛇毒素核酸序列。
該方法優(yōu)選進(jìn)一步包括以下步驟d)從宿主細(xì)胞中抽提出修飾的樹眼鏡蛇毒素。
e)從細(xì)胞培養(yǎng)物的抽提物中純化出修飾的樹眼鏡蛇毒素，任意地包括這個(gè)步驟，即把樹眼鏡蛇毒素從共表達(dá)的異源蛋白中切割出來。
所述異源蛋白優(yōu)選是GST，所述的純化優(yōu)選利用GST純化部件中的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱進(jìn)行親和層析，接著用Xa因子介導(dǎo)的切割把修飾的樹眼鏡蛇毒素和GST切割開來。
因此，本發(fā)明提供一種通過上述規(guī)定的生產(chǎn)多功能抗凝劑的方法得到的上述規(guī)定的多肽。
本發(fā)明的第六個(gè)方面提供一種含有治療劑量的上述規(guī)定多肽的藥用組合物，任意地還包括一種藥理上可接受的賦形劑或載體。本發(fā)明的具有多種不同功能的多種多肽可以被組合在一起成為一種藥理上可接受的形式，以便提供一種滿足期望的治療。本發(fā)明的多種不同功能的多肽可以被組合在一起成為一種藥理上可接受的形式，以便提供一種滿足期望的治療。
盡管可以采用其他的給藥方式，例如皮下注射或肌內(nèi)注射，但是本發(fā)明的多肽優(yōu)選制成靜脈內(nèi)注射或靜脈內(nèi)輸注的制劑形式，期望應(yīng)該提供一種進(jìn)入個(gè)體循環(huán)系統(tǒng)的緩釋制劑。上述多肽制劑形式還可以采用植入緩釋裝置，例如用于生長(zhǎng)激素給藥的緩釋裝置。
一種制劑可以包括與本發(fā)明多肽結(jié)合的滲出血(extravasatedblood)形式，其中多肽的濃度為1 nM-60μM。該血可以以備用形式儲(chǔ)存，從而為必須避免凝血的情況提供一種及時(shí)、便捷的供輸注的血源供應(yīng)，上述情況包括外科手術(shù)過程中或外科手術(shù)后的情況等。
本發(fā)明的第七個(gè)方面提供一種用于作為一種藥物的多肽。
本發(fā)明的第八個(gè)方面提供一種上述規(guī)定的多肽用來制備一種用于治療與血栓形成有關(guān)的疾病的藥物的用途。更具體的說是血栓癥、心肌梗死、視網(wǎng)膜新血管形成(retinal neovascularization-)、內(nèi)皮損傷、異常調(diào)控凋亡(dysregulated apoptosis)、異常細(xì)胞遷移(abnomal cellmigration)、白細(xì)胞募集、免疫系統(tǒng)激活、組織纖維化和腫瘤發(fā)生。
本發(fā)明還提供了一種用來治療與血栓有關(guān)的疾病的方法，更具體地說是治療血栓癥、心肌梗死、視網(wǎng)膜新血管形成、內(nèi)皮損傷、異常調(diào)控凋亡、異常細(xì)胞遷移、白細(xì)胞募集、免疫系統(tǒng)激活、組織纖維化和腫瘤發(fā)生等病癥的方法。該方法包括施用治療有效量的上述規(guī)定的多肽。
現(xiàn)在，結(jié)合以下的實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述

圖1給出的是樹眼鏡蛇毒素分子的基本三維結(jié)構(gòu)。N代表-NH末端，C代表-COOH末端。氨基酸殘基被編號(hào)。
圖2A給出的是樹眼鏡蛇毒素的核酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列。單個(gè)的合成寡核苷酸用數(shù)字1-10標(biāo)示。
圖2B是質(zhì)粒pGEX-DEG的部分限制性酶切圖譜。
圖3A包括修飾的樹眼鏡蛇毒素序列對(duì)比，插入氨基酸序列列于樹眼鏡蛇毒素的氨基酸序列之下。
圖3B與圖3A類似，是各種修飾的樹眼鏡蛇毒素氨基酸序列(單字母代碼)的進(jìn)一步序列對(duì)比。
圖3C與圖3A類似，給出了本發(fā)明的修飾的分子。
圖3D是一個(gè)給出了本發(fā)明修飾后分子的各種活性的列表。
圖4給出的是用于克隆和表達(dá)修飾的樹眼鏡蛇毒素融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pGEM-3X。
圖5A給出的是用12.5％的SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)用含有修飾的樹眼鏡蛇毒素基因的重組質(zhì)粒pGEX-DEG轉(zhuǎn)化菌的全細(xì)胞裂解物進(jìn)行比較的電泳圖片，其中泳道1顯示的是誘導(dǎo)了的轉(zhuǎn)化菌，泳道2顯示的是未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌。
圖5B顯示的是用10％的SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)全細(xì)胞裂解物進(jìn)行比較的結(jié)果，其中泳道1是誘導(dǎo)的pGEX-DEG轉(zhuǎn)化菌的全細(xì)胞裂解物，泳道2是該裂解物的親和純化抽提物。
圖5C給出的GST-修飾的樹眼鏡蛇毒素融合蛋白經(jīng)親和純化和Xa因子消化處理所得到的產(chǎn)物在20％的SDS-PAGE凝膠上電泳分析的結(jié)果，泳道1是樹眼鏡蛇毒素，泳道2是GST-Den，泳道3是經(jīng)Xa因子消化后的GST-Den。
圖6A是重組樹眼鏡蛇毒素在Vydac C18柱上用乙腈梯度洗脫的反相HPLC洗脫圖譜(箭頭指出的是重組樹眼鏡蛇毒素的44分鐘的保留時(shí)間)。
圖6B是圖6A中44分鐘的波峰級(jí)分在類似條件下洗脫得到的反相HPLC洗脫圖譜。
圖7顯示的是用環(huán)I的抗體R38和R65、環(huán)I和環(huán)III二者的抗體R51對(duì)含PDGF的樹眼鏡蛇毒素免疫沉淀結(jié)果。觀察到了一個(gè)對(duì)應(yīng)于GST-突變體樹眼鏡蛇毒素的大小為32kDa的蛋白質(zhì)。泳道1是用R38探測(cè)GST-PDGF的結(jié)果，泳道2使用的是R65，泳道3使用的是R51。
圖8的柱形圖顯示的是用PDGF-樹眼鏡蛇毒素對(duì)PDGF誘導(dǎo)的人成纖維細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！半?”對(duì)應(yīng)于PDGF環(huán)I的線性氨基酸序列。
樹眼鏡蛇毒素是一種來自眼鏡蛇科蛇類的毒液中的短鏈神經(jīng)毒素同系物，但它無神經(jīng)毒性。與神經(jīng)毒素不同，樹眼鏡蛇毒素含有一個(gè)Arg-Gly-Asp(RGD)基序，它對(duì)血小板聚集和血小板粘附的抑制能力與來自蝰蛇科蛇類的毒液中的解聯(lián)蛋白相當(dāng)。用NMR光譜分析已經(jīng)測(cè)定了溶液中的樹眼鏡蛇毒素結(jié)構(gòu)(Sutcliffe M J et al(1994)NatureStruct Biol 1802-807)。該結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)與短鏈神經(jīng)毒素相似的核心，但是它還有一個(gè)新的環(huán)結(jié)構(gòu)和一個(gè)暴露于溶劑的RGD-基序。因此，樹眼鏡蛇毒素是一種具有結(jié)構(gòu)分明的折疊的整聯(lián)蛋白拮抗劑，該折疊與解聯(lián)蛋白的折疊不同，它是以神經(jīng)毒素的支架為基礎(chǔ)的。
樹眼鏡蛇毒素是由一個(gè)核心區(qū)域和一個(gè)由此向外伸展出的3個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這3個(gè)環(huán)被表示為環(huán)I、環(huán)II和環(huán)III(第4-16位殘基、第23-36位殘基和第40-50位殘基)(圖1)。核心結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)二硫鍵，這些鍵空間上彼此緊靠，把上述各環(huán)結(jié)合在一起。圖2所示的為樹眼鏡蛇毒素的氨基酸序列。
在以下實(shí)施例中，所用的材料包括限制性內(nèi)切酶、T4多聚核苷酸激酶、T4DNA連接酶、IPTG(異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷)和感受態(tài)細(xì)胞DH5α是從LifeTechnologies Ltd(UK)或Promega Ltd(Southampton，UK)購得。Vent(外-)DNA聚合酶由New England Biolab Ltd(Hitchin，UK)提供。寡聚核苷酸由King’S College School of Medicine & Dentistry(London，UK)或Cruachem Ltd(Glasgow，UK)合成并用15％丙烯酰胺/8M尿素凝膠變性PAGE電泳進(jìn)一步做進(jìn)一步純化。脫氧核苷三磷酸(dNTP’s)、雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP’s)和質(zhì)粒pGEM-3X是從PharmaciaBiotech Ltd(Herts，UK)購得，其中質(zhì)粒pGEM-3X是一個(gè)把克隆基因與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠CL-4B融合表達(dá)的載體。“Geneclean”試劑盒和Plasmid maxi試劑盒分別從Biol101(La Jolla CA，USA)和Qiagen Ltd(Surrey，UK)購得。測(cè)序酶2.0從Cambrige Bioscience(Cambrige，UK)獲得，[35S]dATP[αS]和125I(15.3mCi/mg碘)分別由NEN Dupont(Hert，UK)和Amersham InternationalPlc(Amersham，Bucks，England)提供。
實(shí)施例1-構(gòu)建編碼樹眼鏡蛇毒素變體的表達(dá)載體把野生型樹眼鏡蛇毒素基因成功地插入質(zhì)粒pGEX-3X(圖2)，按照Lu et al，(1996)J Biol Chem 271289-295所述的方法進(jìn)行表達(dá)。從編碼樹眼鏡蛇毒素的野生型基因起始，用重組DNA技術(shù)構(gòu)建樹眼鏡蛇毒素基因的變體。對(duì)于較長(zhǎng)的插入突變體而言，只是把編碼非-樹眼鏡蛇毒素或異源氨基酸的寡核苷酸直接插入到經(jīng)合適的限制性酶切割后的野生型樹眼鏡蛇毒素基因，并將其連接。為了作出較小的變化，例如對(duì)少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基做包括插入、替代和缺失在內(nèi)的修飾，則使用Clonetech Laboratories的轉(zhuǎn)換基因(TransformerTM)定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校凑照f明書方法進(jìn)行操作。
圖2A顯示的是合成的樹眼鏡蛇毒素(Den)基因的核苷酸序列。該基因是根據(jù)已知氨基酸序列(Williams J A et al(1992)Biochem SocTrans 2173S)并按照每個(gè)氨基酸在E coli中高表達(dá)的密碼子設(shè)計(jì)而成(Fiers W(1982)Gene 18199-209)。10個(gè)合成的寡核苷酸標(biāo)示在括號(hào)中并用數(shù)字1-10單個(gè)標(biāo)示在編碼鏈的上方或非編碼鏈的下方。終止密碼子用星號(hào)標(biāo)記。使用三字母氨基酸代碼，Den的總共59個(gè)氨基酸僅用數(shù)字1標(biāo)記N-端殘基精氨酸和數(shù)字50標(biāo)記C-端氨基酸亮氨酸。
圖2B是pGEX-DEG的部分限制性酶切圖譜。僅顯示了樹眼鏡蛇毒素(Den)基因和它的相關(guān)上游區(qū)。
圖3A顯示的是各種修飾的樹眼鏡蛇毒素分子的氨基酸序列，以下將對(duì)其進(jìn)行更詳細(xì)地描述。各種情況下，用于修飾的插入氨基酸被列在樹眼鏡蛇毒素氨基酸序列的下方。
實(shí)施例2-含有血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)結(jié)構(gòu)域的修飾的樹眼鏡蛇毒素血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)是一個(gè)30kDa的多肽，是一種主要的血清促細(xì)胞分裂原以及間充質(zhì)細(xì)胞趨化因子。最初從人的血小板中純化得到，接著發(fā)現(xiàn)其他類型的細(xì)胞也產(chǎn)生PDGF，例如平滑肌細(xì)胞、胎盤郎罕氏細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和結(jié)締組織。PDGF能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移和增殖，細(xì)胞的遷移和增殖是胚胎發(fā)生、傷口愈合等天然過程中的重要因素。PDGF還同多種病理狀態(tài)有關(guān)，例如動(dòng)脈硬化、纖維化和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Heldin C H和Westermark B(1990)Cell Regul1555-566以及Engstrom U et al(1991)J Biol Chem 26716581-16587)。PDGF是由稱為鏈A和鏈B的兩條相似的鏈組成的二聚體。
如圖3A和圖3C所示，把來自PDGF的鏈B的氨基酸序列插入到樹眼鏡蛇毒素的環(huán)II中，保留樹眼鏡蛇毒素環(huán)III中RGD序列的粘附特性。然后通過分析平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖，測(cè)試修飾的樹眼鏡蛇毒素中的PDGF活性和整聯(lián)蛋白拮抗劑活性之間的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。圖3D概括圖3C中實(shí)施例得到的結(jié)果。修飾的樹眼鏡蛇毒素分子能抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和PDGF誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖。
組裝和克隆含有PDGF環(huán)I的樹眼鏡蛇毒素基因含有PDGF環(huán)I的樹眼鏡蛇毒素基因是由以下片段組裝而成用BamH I、EcoR I、Hinf I和Hpa II消化野生型基因后得到的4個(gè)片段(77mer、76mer、42mer和44mer)以及一對(duì)互補(bǔ)性磷酸化的誘變寡核苷酸(81mer和80mer)。把含有上述6個(gè)片段的混合物85℃加熱5min，接著緩慢地冷卻到室溫(RT)復(fù)性。50μl總體積的反應(yīng)物16℃連接15小時(shí)，上述反應(yīng)物中含每種片段各1nM、Tris-HCl(pH 7.6)50mM、MgCl210mM、DTT 1mM、ATP 1mM以及5％PEG 8000和5個(gè)單位的T4連接酶。連接后，取連接混合物1μl作模板，一對(duì)5’端突出的寡核苷酸作引物，加入2個(gè)單位的Vent聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2％的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了所得到的單一產(chǎn)物的大小是符合預(yù)期目標(biāo)的。然后，把該雜合基因克隆到載體pGEX-3X中，生成含有用PDGF修飾的樹眼鏡蛇毒素基因的重組質(zhì)粒pGEX-3X。
轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒DNA的提取用含有PDGF修飾的樹眼鏡蛇毒素基因的重組質(zhì)粒pGEX-3X(約5ng)轉(zhuǎn)化50μl的E coli DH5α株。用其中只裝有感受態(tài)細(xì)胞的、裝有未連接質(zhì)粒DNA的以及裝有野生型質(zhì)粒DNA的3個(gè)小管建立實(shí)驗(yàn)對(duì)照。用SOC培養(yǎng)基(含有細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨20g/l、細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g/l、NaCl 0.5g/l、KCl 2.5mM、MgCl220μM以及20nM的葡萄糖)培養(yǎng)細(xì)菌。轉(zhuǎn)化后接著把轉(zhuǎn)化菌在不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中復(fù)壯1小時(shí)。轉(zhuǎn)化完成后，鋪平板培養(yǎng)(plate out)獲得充足量的上述每種細(xì)菌培養(yǎng)物。用含氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌。pGEX-3X的氨芐選擇性標(biāo)記賦予每個(gè)轉(zhuǎn)化菌氨芐抗性，使得轉(zhuǎn)化菌得以生長(zhǎng)，而所有未轉(zhuǎn)化菌也就相應(yīng)地被淘汰。過夜培養(yǎng)后，對(duì)照用的培養(yǎng)基平板無細(xì)菌生長(zhǎng)。
從上述培養(yǎng)基平板上挑取單個(gè)的克隆，每個(gè)這樣的克隆都意味著一個(gè)修飾的樹眼鏡蛇毒素基因。把這些克隆在含氨芐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)個(gè)小時(shí)。上述培養(yǎng)物各取少量，并轉(zhuǎn)移到新的含氨芐培養(yǎng)基中。向起初所用的培養(yǎng)基中加入滅菌的甘油可以使其能夠在-70℃下保存作為原種儲(chǔ)存物。剩余的大量培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。按照說明書方法(QIAGEN)用微量制備法(快速提取用)或大量制備法(DNA測(cè)序用)從轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌培養(yǎng)物中分離DNA。用質(zhì)粒微量提取法從每種培養(yǎng)物中再一次提取質(zhì)粒DNA；這些質(zhì)粒中的大部分都含有經(jīng)過修飾的樹眼鏡蛇毒素基因。對(duì)含有樹眼鏡蛇毒素基因片段的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)域進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證修飾是否發(fā)生以及是否正確。用Sanger et al(1997)Proc Natl Acad Sci 745463-5467的雙脫氧鏈終止法對(duì)所插入的片段進(jìn)行全序列DNA測(cè)序。
蛋白質(zhì)表達(dá)按照標(biāo)準(zhǔn)方法，具體地說是按照Sambrook et al(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中描述的方法，用修飾的質(zhì)粒pGEX-3X轉(zhuǎn)化E coil DH5α。轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)物用于蛋白質(zhì)的表達(dá)。用過夜的種培養(yǎng)物(1％，V/V)接種培養(yǎng)基，然后把該培養(yǎng)物加入到LB/amp培養(yǎng)基(100μg)中，37℃下振蕩培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基的A600為0.7。然后，加入IPTG至其終濃度為0.1繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。溫度降至30℃的條件下讓細(xì)胞培養(yǎng)物再繼續(xù)生長(zhǎng)4小時(shí)，然后離心收獲細(xì)菌。
融合蛋白質(zhì)的純化用下述方法純化重組的樹眼鏡蛇毒素用磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)懸浮細(xì)胞沉淀，置于冰上超聲波裂解，該P(yáng)BS中含有1％的triton X-100和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)(1mM)，來自大豆的胰蛋白酶抑制素(1μg/ml)，EDTA 1mM。超聲波裂解后的產(chǎn)物在4℃下47,800×g離心10min，沉淀細(xì)胞碎片和不溶物。利用谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠CL-4B層析柱，通過親和層析把重組GST-樹眼鏡蛇毒素和GST-修飾的-樹眼鏡蛇毒素從上清中純化出來，該親和層析過程先在含有150mM的PBS吸附吸附，接著用含有10mM還原性谷胱甘肽的Tris-Hcl(pH8.0)洗脫。在聚丙烯酰胺凝膠上，洗脫的得到的與谷胱甘肽吸附的物質(zhì)在大小為32kDa處遷移形成一條主帶(圖5A和圖5B)。
在含NaCl 150mM、CaCl21mM的溶液中，包括32kDa融合蛋白的適當(dāng)級(jí)分在4℃下用Xa因子(1∶100，W/W，Xa因子融合蛋白)消化24h。SDS-PAGE電泳顯示，用Xa因子處理純化的GST-蛋白質(zhì)，釋放出兩個(gè)蛋白條帶，其中的重組蛋白遷移至7-kDa，與樹眼鏡蛇毒素大小相當(dāng)，游離的GST則顯示為28-kDa的強(qiáng)帶。把消化后的混合物加到Vydac C18反相HPLC分析柱(TP104)上，用線性梯度為0-26％的含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度洗脫(1.78％每分鐘)進(jìn)行梯度，接著再用26-36％的含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度洗脫(0.25％每分鐘)洗脫。圖6A和6B顯示的就是反相HPLC實(shí)驗(yàn)的洗脫圖譜。
Western印跡SDS-PAGE(12％)電泳分離融合蛋白質(zhì)(10μg)，并經(jīng)過半干印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，其中使用的電流密度是0.8mA/cm2。把硝酸纖維素膜置于含5％奶粉的TBS/Tween緩沖液(20mM Tris，500mM NaCl，0.1％Tween)中，室溫(RT)下封閉2h，然后用一抗作為探針與硝酸纖維素膜雜交過夜，接著用連接到辣根過氧化酶上的抗-兔或抗-鼠的二抗雜交2h。然后，用氨乙基咔唑(aminoethylcarbazole)顯示印跡結(jié)果(圖7)。
抗體R51的制備用異雙功能交聯(lián)劑硫代琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己基-1-羧化物(硫代-SMCC)和γ-馬來酰亞胺丁酸鹽琥珀酰亞胺(GMBS)，分別通過兔血清白蛋白(RSA)和巰基，把多肽1(PDGF的線性氨基酸序列)偶聯(lián)到牛甲狀腺球蛋白(Tg)上。使用廠商建議的方法。把偶聯(lián)物按1mg/ml的濃度用PBS稀釋，-20℃存儲(chǔ)備用。
用Tg-肽1免疫新西蘭白兔(每只兔皮下注射含100μg Tg-肽1的溶液1ml，其中PBS∶弗氏完全佐劑為1∶1)。6周和12周后，用同等劑量加強(qiáng)免疫，但其中的佐劑為弗氏不完全佐劑。最后一次加強(qiáng)免疫10天后，取終血(final bleeds)。分裝抗血清，-20℃存儲(chǔ)備用。
抗體R38和R65的制備按照生產(chǎn)者描述的方法，用親和層析(Hi-TRAP，蛋白-G，Pharmacia，Upsala，Sweden)從上述抗血清中純化出IgG(R38和R65)。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度。把IgG的PBS溶液過濾除菌，分裝，-20℃存儲(chǔ)備用。
實(shí)施例3-RGD功能(樹眼鏡蛇毒素 活性)的鑒定血小板聚集按照Lu X et al(1994)Biochem J 304929-936中描述的方法通過光透射的增加來測(cè)量血小板的凝聚，并通過血小板的凝聚來鑒定RGD功能。簡(jiǎn)單地說，從健康個(gè)體抽取檸檬酸鹽人血，200g離心15min從中制備富含血小板的血漿(PRP)。1200g離心15min從PRP中制備血小板。用粘附/凝聚緩沖液(145mM NaCl、5mM KCl、1 mMMgCl2、2 mMCaCl2、10葡萄糖、3.5mg/ml BSA和10mMHEPES，pH7.35)漂洗和重懸血小板，并將濃度調(diào)整到3×108/ml。在纖維蛋白原的濃度為1.67mg/ml時(shí)，用10μM ADP誘導(dǎo)血小板聚集，用一個(gè)連接到圖表記錄器上的Payton Dual-Aggregometer測(cè)量凝聚結(jié)果。
血小板粘附為了鑒定RGD功能，再按照上述Lu X et al(1994)中描述的方法測(cè)量血小板粘附。簡(jiǎn)單地說，用以合適濃度(2-10μg/ml，100μl體積)重溶在PBS(pH 7.4)中的纖維蛋白原或纖連蛋白包被96孔板，4℃過夜。用合適濃度的拮抗劑處理血小板3min，然后取該混合物90μl加入到用500μM的ADP 10μl預(yù)包被過的微量板，得到終濃度為50μM，使用顯色緩沖液(乙酸鈉，10mM對(duì)硝基苯磷酸，0.1％ Triton X-100，pH5.5)130μl/孔，通過測(cè)量?jī)?nèi)源性酸性磷酸酶確定粘附的血小板的數(shù)目，用自動(dòng)板閱讀儀(automatedplate reader)在410/630nm條件下讀取數(shù)值。
配體的碘化以及配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)按照廠商建議的方法用Enzymobead Radioiodination Reagent(Biorad Laboratories)把樹眼鏡蛇毒素的所有變體全部碘化。在與上述Lu X et al(1994)基本相同的平衡條件下，讓125I-標(biāo)記的解聯(lián)蛋白、樹眼鏡蛇毒素和修飾的樹眼鏡蛇毒素結(jié)合到洗滌后的血小板上。溫育的混合物中含有洗滌后的血小板(3×l08/ml)300μl、激動(dòng)劑(1.75mM ADP終濃度為50μM)10μl、125I-標(biāo)記的蛋白樣品l0μl、重懸緩沖液5-20μl，補(bǔ)足至混合物的終體積為350μl?？贵w抑制實(shí)驗(yàn)中，在與ADP接觸前用抗體預(yù)處理血小板懸液30min，然后加入125I-標(biāo)記的蛋白樣品，混合物在室溫下再溫育60min。把混合物裝載到25％(W/V)蔗糖、1％BSA墊層上終止溫育，在12,000g離心10min。對(duì)血小板沉淀和上清都進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定結(jié)合態(tài)和游離態(tài)血小板的水平。用50倍預(yù)冷蛋白樣品或解聯(lián)蛋白或10mM EDTA，確定背景結(jié)合水平。
移植環(huán)的鑒定依靠所移植環(huán)的親本蛋白，來鑒定所移植環(huán)的功能。
實(shí)施例4-分析樹眼鏡蛇毒素中PDGF環(huán)I的作用競(jìng)爭(zhēng)ELISAs(CELISA)把相應(yīng)量的Den-PGDF和PGDF作為競(jìng)爭(zhēng)劑同時(shí)加入到適當(dāng)稀釋后的兔抗-PGDF抗血清中，溫育2h。每種兔抗血清的使用濃度都在標(biāo)準(zhǔn)直接ELISA曲線的直線部分所對(duì)應(yīng)的濃度范圍之內(nèi)，405nm處的OD值為1.2-1.5，與加入底物共育30min后，對(duì)合適的RSA-多肽偶聯(lián)物進(jìn)行分析。
細(xì)胞培養(yǎng)和[3H]-胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)人包皮成纖維細(xì)胞(使用第7-10代細(xì)胞)維持在含有10％FBS的完全DMEM中。在75cm3的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細(xì)胞至接近鋪滿單層時(shí)，用胰酶消化，記數(shù)細(xì)胞，然后以10000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在24孔(Costar)或48孔(Falcon)的平底組織培養(yǎng)板上，直至細(xì)胞長(zhǎng)到大約65％鋪滿(2天)。用含有0.2％或0.4％FBS的完全DMEM代替以前的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48-72小時(shí)使細(xì)胞休眠。整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程都是在37℃，空氣中含8％CO2的潮濕環(huán)境中進(jìn)行。
在起點(diǎn)時(shí)間(time zero)，用分別包含有不同濃度Den-PDGF和肽P1(PDGF結(jié)構(gòu)域的線性序列)的完全DMEM替換細(xì)胞培養(yǎng)液，導(dǎo)致生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖被抑制。用于誘導(dǎo)的PDGF濃度范圍為10-20ng/ml。
20-22h后，加入[3H]胸腺嘧啶(0.3mCi/100μl/孔)并培養(yǎng)至27.5-28h。吸出培養(yǎng)液，用冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，加10％TCA 500ul固定細(xì)胞，并在4℃溫育30min。接下來用70％乙醇0.5ml洗滌細(xì)胞一次，并將其儲(chǔ)存于-20℃。在每孔中加入0.1N NaOH 500ul并在室溫下作用30min裂解細(xì)胞。從每孔中各取樣品400μl用液閃記數(shù)來定量細(xì)胞摻入的[3H]胸腺嘧啶。細(xì)胞增殖的抑制百分率按以下公式算出
M*表示修飾的樹眼鏡蛇毒素圖8顯示了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在6.5-65μM范圍內(nèi)，PDGF-樹眼鏡蛇毒素對(duì)PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)10-34％(用作對(duì)照的野生型樹眼鏡蛇毒素沒有發(fā)現(xiàn)抑制作用)。
實(shí)施例5-含有一段來自凝血調(diào)節(jié)蛋白第5個(gè)類EGF結(jié)構(gòu)域的序列的修飾的樹眼鏡蛇毒素凝血調(diào)節(jié)蛋白為凝血酶的受體。凝血酶是一種類似胰酶的絲氨酸蛋白酶，在淤血和血栓形成中起中心作用。在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，凝血酶是最終的關(guān)鍵酶，它以蛋白酶剪切的形式切割纖維蛋白原，釋放出血纖肽A和B并產(chǎn)生血纖蛋白單體，該單體可以聚合形成止血栓。除了切割纖維蛋白原外，凝血酶通過產(chǎn)生凝血酶激活中的輔助因子Va和VIIIa對(duì)自身的產(chǎn)生有正反饋?zhàn)饔?。因子XIII也可以被凝血酶激活，交連并起到穩(wěn)定血纖蛋白聚合體的作用。自然的抗凝血機(jī)制是通過以下途徑來限制這些過程的絲氨酸蛋白酶抑制劑和抗凝血酶III介導(dǎo)的抑制作用以及凝血酶/凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物對(duì)蛋白C的激活。凝血調(diào)節(jié)蛋白是位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，它在將凝血酶轉(zhuǎn)變成有效的蛋白C激活劑的過程中，通過降低其催化血栓形成的能力結(jié)合并改變凝血酶的分子特異性。被激活的蛋白C能夠破壞Va和VIIIa，終止凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，原凝血機(jī)制和抗凝血機(jī)制之間的平衡可以維持正常的生理狀態(tài)，允許凝血酶在局部產(chǎn)生，同時(shí)可以防止它變成系統(tǒng)的，具有潛在危險(xiǎn)的過程。此外，凝血酶也可以激活血小板和內(nèi)皮細(xì)胞。血小板一旦被凝血酶激活，便發(fā)生形態(tài)上的改變，聚集并釋放儲(chǔ)藏的顆粒狀內(nèi)容物(例如，血小板因子-4，ADP，5-羥色胺)。凝血酶也可以增加血栓烷A2和血小板激活因子的合成和分泌。凝血酶和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用可以導(dǎo)致各種因子(如組織纖溶酶原激活因子，PDGF，內(nèi)皮素)的分泌，并加速結(jié)合凝血調(diào)節(jié)蛋白的蛋白C的活化，該凝血調(diào)節(jié)蛋白可啟動(dòng)蛋白C抗凝血途徑。
作為實(shí)例，將來自凝血調(diào)節(jié)蛋白的第5個(gè)類EGF的結(jié)構(gòu)域序列移植入樹眼鏡蛇毒素。根據(jù)其對(duì)纖維蛋白原凝血的抑制來測(cè)定這一新的蛋白同凝血酶的親和力。
根據(jù)實(shí)施例1中的程序構(gòu)建合適的表達(dá)載體，不同之處是將一凝血調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)域插入到樹眼鏡蛇毒素，如圖3A所示，序列插入到樹眼鏡蛇毒素的環(huán)II區(qū)。
按照實(shí)施例1的方法，對(duì)TM修飾的樹眼鏡蛇毒素進(jìn)行表達(dá)、分離和純化，并按照實(shí)施例2的方法對(duì)該修飾的蛋白進(jìn)行RGD功能的測(cè)定。
人凝血調(diào)節(jié)蛋白的分子量大約為100KDa，包含有一個(gè)和C型凝聚素同源的N端結(jié)構(gòu)域，6個(gè)串聯(lián)重復(fù)的類表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)富含Ser/Thr的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短的細(xì)胞質(zhì)尾。在如圖3C所示的一個(gè)具體的實(shí)施例中，我們將來自凝血調(diào)節(jié)蛋白的第5個(gè)類EGF結(jié)構(gòu)域插入到樹眼鏡蛇毒素中，并對(duì)樹眼鏡蛇毒素中的合適部分做另外的修飾，以次來防止導(dǎo)致其生物學(xué)功能喪失的空間位阻的發(fā)生。
如圖3D所示，修飾的樹眼鏡蛇毒素分子具有ADP誘導(dǎo)的以及凝血酶誘導(dǎo)的血小板凝集活性，并延長(zhǎng)了凝血酶的凝血時(shí)間。
實(shí)施例6-樹眼鏡蛇毒素中的凝血調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域的作用分析凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白原凝血時(shí)間凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白原凝血時(shí)間用Amelung KC-10儀器按照下面的方法進(jìn)行。取含有150mMNaCl和5mM CaCl2的pH7.5的50mM的凝血酶(3.3μg/ml)的Tris-HCl溶液50μl，與10μl的各種濃度的修飾的樹眼鏡蛇毒素(Den-TM)和野生型樹眼鏡蛇毒素(作為比較的對(duì)照)混合。在37℃溫育2min后，加入溶解在相同緩沖液中的纖維蛋白原100μl(160μg/ml)。
蛋白C激活為了檢測(cè)Den-TM是否對(duì)蛋白C激活有影響，按照Tsiang(1990)等在Biochemistry 2910602-10612中描述的方法，進(jìn)行了一個(gè)兩階段的分析。第一階段，將凝血酶和蛋白C以合適的終濃度加入到一個(gè)110μl的反應(yīng)體系中，該體系有或沒有野生型或突變型的樹眼鏡蛇毒素以及2mM CaCl2或1mM Na2EDTA。反應(yīng)混合物在37℃溫育30min，然后加入抗凝血酶III和肝素終止反應(yīng)?；钚缘鞍證的產(chǎn)生根據(jù)其水解底物S-2366來檢測(cè)。
所述凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集按照上述實(shí)施例3中的方法，對(duì)野生型和突變型樹眼鏡蛇毒素進(jìn)行凝血酶誘導(dǎo)洗滌過的血小板聚集的測(cè)定，不同之處是凝血酶作為激動(dòng)劑。
凝血調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合凝血調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的操作方法參見上述Tsiang等(1990)中的描述。
實(shí)施例7-包含有來自糖蛋白(GP)IB序列的修飾的樹眼鏡蛇毒素糖蛋白(GP)IBα對(duì)于在血小板上表達(dá)高親和力的α-凝血酶結(jié)合位點(diǎn)是需要的(Marco等(1994)J Biol Chem 2696478-6484)。該功能對(duì)于淤血和血栓形成的啟動(dòng)具有重要的作用，并且可能在病理性血管阻塞中起重要作用。為了創(chuàng)造一個(gè)同時(shí)具有凝血酶和整聯(lián)蛋白拮抗劑活性的分子，把來自GP IB的一段序列插入到樹眼鏡蛇毒素中構(gòu)建得到修飾的樹眼鏡蛇毒素。
按照實(shí)施例1的方法構(gòu)建一個(gè)合適的質(zhì)粒表達(dá)載體，不同之處是，糖蛋白IBα結(jié)構(gòu)域插入到樹眼鏡蛇毒素分子的環(huán)I區(qū)，如圖3A和3C所示，移植結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基與樹眼鏡蛇毒素的全氨基酸序列連接在一起。
正如圖3D中概括的那樣，修飾的樹眼鏡蛇毒素分子能抑制凝血酶活性和血小板的凝聚。
包含有糖蛋白IB(GP IB)結(jié)構(gòu)域的樹眼鏡蛇毒素基因的組裝和克隆包含有糖蛋白IB(GP IB)結(jié)構(gòu)域的樹眼鏡蛇毒素基因的組裝來自在用BamHI、EcoRI、HinfI和HpaII消化和一對(duì)磷酸化的突變寡聚體(oligos)(83mer和82mer)擴(kuò)增后，把來自野生型基因的片段(81mer，82mer，42mer和44mer)組裝在一起。退火、連接、PCR和組裝的實(shí)驗(yàn)方法同前述的Den-PDGF的相似。
按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行IBα修飾的樹眼鏡蛇毒素的表達(dá)、分離和純化，而該分子RGD功能的測(cè)定則按照實(shí)施例3中描述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例8-分析樹眼鏡蛇毒素中的GP IB結(jié)構(gòu)域的作用凝血酶同血小板結(jié)合的測(cè)定凝血酶同洗滌過的血小板的結(jié)合的測(cè)定在無鈣的凝聚/粘附緩沖液中進(jìn)行(參照實(shí)施例3中血小板聚集的測(cè)定)。洗滌過的血小板在用前先在37℃平衡10min，然后同125I-α-凝血酶在25℃作用10min。配體濃度結(jié)合功能的測(cè)定采用固定濃度(0.1nM)的125I-α-凝血酶與漸增濃度(1-200nM)的未標(biāo)記的α-凝血素混合。向凝血酶混合物中加入血小板來啟動(dòng)結(jié)合。溫育10min后，在一層20％蔗糖中12000g離心10min(Lu等(1994)上述)，將血小板和結(jié)合的凝血酶同未結(jié)合的凝血酶分離開。
包含有GP IB結(jié)構(gòu)域的樹眼鏡蛇毒素對(duì)凝血酶與血小板結(jié)合的影響按下面的方法來評(píng)價(jià)將不同濃度的突變體同洗滌過的血小板混合，然后加入固定濃度的125I-α-凝血酶。結(jié)果分析參照以前所述的方法(Lu等(1994)上述)。
血小板聚集和分泌的測(cè)定用蟲熒光素-熒光素酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定血小板的致密顆粒(dense granules)中釋放的ATP。洗滌過的血小板以2.5×108/ml重懸在0.4ml無鈣的凝聚/粘附緩沖液中，0.4ml的等份(aliquots)測(cè)定采用lumiaggregometer(Chrono-Log Corp)。然后加入蟲熒光素-熒光素酶試劑50μl，接著按終濃度為0.26nM加入α-凝血酶。由此產(chǎn)生的ATP釋放用lumiaggregometer(Chrono-Log Corp)通過記錄熒光的變化來測(cè)定。血小板聚集的測(cè)定按實(shí)施例3所述。為了檢測(cè)包含有GP IB的突變樹眼鏡蛇毒素對(duì)ATP釋放和血小板聚集的抑制作用，在加入蟲熒光素-熒光素酶和凝血酶之前先用突變蛋白同血小板在37℃溫育5min。
凝血酶的酰胺水解活性和纖維蛋白原的凝血凝血酶的酰胺水解活性和纖維蛋白原的凝血的測(cè)定參照下述的實(shí)施例10。
實(shí)施例9-含有水蛭素的一個(gè)結(jié)構(gòu)域的修飾的樹眼鏡蛇毒素水蛭素是分離自吸血水蛭Hirudo medicinalis的一種凝血酶的強(qiáng)抑制劑，是一種僅含有65個(gè)氨基酸殘基的單個(gè)多肽鏈的蛋白(Maraganore等(1989)J Biol Chem 2648692-8698)。我們構(gòu)建了包含有來自水蛭素的氨基酸殘基Asn52-Leu64或Phe45-Gln65的修飾的樹眼鏡蛇毒素。新的構(gòu)建體包含有抗凝血酶結(jié)合和抗血小板粘附的結(jié)構(gòu)域。
質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建如實(shí)施例7所述，不同之處在于，為了在樹眼鏡蛇毒素的環(huán)II中的氨基酸殘基PRP做一個(gè)小的變化，而再構(gòu)建另外一個(gè)突變位點(diǎn)。這一小變化是用Clonetech Laboratories的TransformerTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖型瓿傻?。?shí)驗(yàn)方法的具體操作參照試劑盒說明進(jìn)行，不同的是將水蛭素結(jié)構(gòu)域移植到樹眼鏡蛇毒素的環(huán)I和環(huán)II中。修飾的分子如圖3A和3C所示，從水蛭素來的氨基酸殘基同原始的樹眼鏡蛇毒素殘基線性連接在一起。圖3D顯示了圖3C中的修飾的分子是如何推遲凝血時(shí)間以及抑制ADP或凝血酶誘導(dǎo)的血小板的凝聚。
Den-HR的表達(dá)、分離和純化基本同實(shí)施例1所述中所描述的方法。該分子的RGD功能建立參照實(shí)施例3的方法。
實(shí)施例10-樹眼鏡蛇毒素中水蛭素結(jié)構(gòu)域的作用分析α-凝血酶的酰胺水解活性測(cè)定使用產(chǎn)色底物S-2238(Chromogenix)和終濃度為0.06單位/ml的α-凝血酶來進(jìn)行。凝血酶可以使底物釋放p-硝基苯胺，反應(yīng)的速率是在微量滴定板上用自動(dòng)分光光度計(jì)(Autoreader III，Ortho Diagnostic Systems)在405nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的。Den-HR對(duì)凝血酶切割產(chǎn)色底物的抑制效果是在終濃度為nM-mM的范圍內(nèi)測(cè)定的。凝血酶和Den-HR首先預(yù)混合，然后加入底物啟動(dòng)反應(yīng)。為了評(píng)估纖維蛋白原的凝固活性，取溶有α-凝血酶(終濃度為1nM)的pH6.5的0.05M磷酸鈉溶液(BSA，終濃度為1％)200μl，在室溫溫育5min，然后加入含有0.011M檸檬酸三鈉作為抗凝劑的正常血漿。在37℃用自動(dòng)凝血計(jì)測(cè)定觀察到纖維蛋白原凝固的開始時(shí)間。突變體對(duì)α-凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白原凝固的影響的測(cè)定方法如下用在一定濃度范圍內(nèi)的突變體代替開始混合物中的HEPES緩沖液。
實(shí)施例11-修飾的樹眼鏡蛇毒素，其中含有一段并可以阻斷凝血酶促血凝活性的基于凝血酶的多肽人凝血酶上的凝血調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于凝血酶B鏈的一個(gè)區(qū)域內(nèi)。如圖3B所示，將該位點(diǎn)的序列引入樹眼鏡蛇毒素中形成雙功能分子，可以阻斷凝血酶的促血凝活性，并抑制ADP/凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集。對(duì)該突變體的功能特征研究的實(shí)驗(yàn)包括按照實(shí)施例6所述的方法測(cè)定凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白原凝固時(shí)間以及按照實(shí)施例3和6所述的方法測(cè)定ADP/凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集。圖3D總結(jié)了該雙功能分子的性質(zhì)，即能夠推遲凝血酶凝固時(shí)間和抑制ADP或凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集。
在圖3C所示的分子中，因?yàn)橐氲耐庠葱蛄袑?dǎo)致了空間位阻效應(yīng)，例如當(dāng)將來自PDGF的序列引入樹眼鏡蛇毒素中時(shí)，雖產(chǎn)生了抗PDGF活性，但抗血小板活性卻喪失了，所以這種情況下就需要對(duì)環(huán)進(jìn)行修飾。將一個(gè)與樹眼鏡蛇毒素環(huán)III類似的RGD環(huán)引入樹眼鏡蛇毒素環(huán)I就消除了這種空間位阻效應(yīng)。以樹眼鏡蛇毒素支架為基礎(chǔ)構(gòu)建的分子的序列及其功能分別總結(jié)于下面的表1和圖1中。
實(shí)施例12-修飾的樹眼鏡蛇毒素的定點(diǎn)誘變上述修飾的樹眼鏡蛇毒素中的每一個(gè)都可以通過定點(diǎn)誘變方法對(duì)RGD環(huán)的周圍或其他任何部分進(jìn)行修飾。所用方法見上述Lu等(1996)中的描述。圖3B顯示了可能的RGD側(cè)翼區(qū)修飾和樹眼鏡蛇毒素活性分析結(jié)果。一些修飾可增強(qiáng)活性，而另一些修飾則使活性消失。
實(shí)施例13-修飾的樹眼鏡蛇毒素在豚鼠動(dòng)脈血栓模型中的抗血栓括性按照Carteaux J P等在Circulation 911568-1574中詳細(xì)描述的方法，利用豚鼠動(dòng)脈血栓模型可以體內(nèi)測(cè)試上述實(shí)施例中的4個(gè)修飾的樹眼鏡蛇毒素的抗血栓活性。每種修飾的樹眼鏡蛇毒素各取多種不同劑量分別靜脈灌注動(dòng)，所取劑量位于0.1mg/kg-1mg/kg范圍之內(nèi)。50-150IU/kg的肝素或安慰劑可以作為平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例14-兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中動(dòng)脈損傷后修飾的樹眼鏡蛇毒素對(duì)細(xì)胞增殖的活性利用Ragosla M等(1996)在Circulation 931194-1200中所述的兔體內(nèi)模型系統(tǒng)，可以對(duì)Den-PDGF，Den-TM，Den-GP和Den-HR進(jìn)行測(cè)試。誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化后，向兔的靜脈中灌注0.1mg-0.5mg/kg的上述修飾的樹眼鏡蛇毒素。第一組對(duì)照是向動(dòng)物動(dòng)脈內(nèi)施用單一丸劑形式的肝素(150IU/kg)。第二組對(duì)照為用生理鹽水代替修飾的樹眼鏡蛇毒素。先氣囊血管形成術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組進(jìn)行處理，然后進(jìn)行定量血管造影(quantitative angiography)，測(cè)定激活部分促凝血酶原激酶(thrombosplastin)時(shí)間(aPTT)，3H胸腺嘧啶摻入損傷動(dòng)脈血管，最后進(jìn)行管腔狹窄研究。
實(shí)施例15-用體外豬模型對(duì)修飾的樹眼鏡蛇毒素的溶栓活性進(jìn)行測(cè)試該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)可以采用Mruk J S等(1995)Circulation 93792-799中的模型體系。向患有阻塞性血栓的豬靜脈內(nèi)注射0.1mg-1mg/kg實(shí)施例12中提到的樹眼鏡蛇毒素?？山o對(duì)照動(dòng)物施用一定劑量的肝素和水蛭素(100IU/kg的丸劑，然后以20IU/kg灌注)。只使用生理鹽水的動(dòng)物也用作對(duì)照。
權(quán)利要求
1.一種雜合多肽，它包括第一個(gè)氨基酸序列和一段另外的氨基酸序列，所述的第一個(gè)氨基酸序列包含RGD基序并能賦予樹眼鏡蛇毒素活性，所述的另外的氨基酸序列能賦予除樹眼鏡蛇毒素活性以外的其他活性。
2.一種具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的雜合多肽，它包括一個(gè)樹眼鏡蛇毒素的支架和一個(gè)非樹眼鏡蛇毒素的另外的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，包括至少兩個(gè)所述的另外的氨基酸序列，任選地所述的另外的氨基酸序列是相同的。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列包括兩個(gè)或多個(gè)被至少一個(gè)樹眼鏡蛇毒素的氨基酸殘基隔開的氨基酸序列部分。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列選自血小板衍生生長(zhǎng)因子(PGDF)、糖蛋白IBα、水蛭素、凝血調(diào)節(jié)蛋白、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管緊張肽II、因子VIII以及von Willebrand因子。
6.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的多肽，包括如圖3A、3B或3C所示的氨基酸序列。
7.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被摻入樹眼鏡蛇毒素的支架的(a)環(huán)I和/或環(huán)II；(b)環(huán)I和/或環(huán)III；(c)環(huán)II和/或環(huán)III；或者(d)環(huán)I、環(huán)II和環(huán)III。
8.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被摻入環(huán)I或者環(huán)II中。
9.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的多肽，其中含RGD的環(huán)通過插入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而被修飾，優(yōu)選地樹眼鏡蛇毒素的環(huán)III中能被修飾的氨基酸的數(shù)目最多8個(gè)，最少1個(gè)。
10.如權(quán)利要求9所述的多肽，其中所述的RGD環(huán)具有如表1所示的氨基酸序列。
11.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的多肽，其中所述的環(huán)I和/或環(huán)II經(jīng)以下的手段修飾插入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選14-36個(gè)氨基酸殘基。
12.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的多肽，其中所述的另外的氨基酸序列被插入到樹眼鏡蛇毒素支架的氨基酸殘基間，該殘基選自2-16、21-36、21-31、28-32、9-13、21-33位中的一個(gè)或多個(gè)或第50位殘基之后的樹眼鏡蛇毒素支架末端。
13.一種編碼如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的多肽的核酸分子。
14.如權(quán)利要求13所述的核酸，可操縱地連接到一個(gè)啟動(dòng)子上，并且可任選連接到一段編碼異源蛋白或肽的核酸序列上，從而編碼一個(gè)融合產(chǎn)物。
15.如權(quán)利要求14所述的核酸，其中所述的啟動(dòng)子是IPTG誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，任選地所述的異源蛋白或肽是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。
16.一種含有如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的核酸的質(zhì)粒。
17.含有如權(quán)利要求13所述的核酸的質(zhì)粒pGEX-3X。
18.一種用如權(quán)利要求16或17中所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌。
20.一種包含如權(quán)利要求18或19中所述的宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。
21.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所定義的多肽的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求18或19所述的宿主細(xì)胞以表達(dá)所述的多肽，從培養(yǎng)物中抽提該多肽，并純化。
22.一種生產(chǎn)一種多功能抗凝劑的方法，包括a)構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體，它包括編碼樹眼鏡蛇毒素支架的核酸序列，可操縱地與一個(gè)啟動(dòng)子相連，且任選與編碼異源蛋白質(zhì)的核酸相連以便與其共表達(dá)；b)通過插入、缺失或者取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基，對(duì)編碼樹眼鏡蛇毒素支架的載體的核酸序列中除結(jié)合血小板RGD基序之外的至少一個(gè)部分進(jìn)行修飾，從而在表達(dá)時(shí)，樹眼鏡蛇毒素的支架中包括一個(gè)具有除樹眼鏡蛇毒素活性之外的活性的另外的氨基酸序列；c)用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使該宿主細(xì)胞表達(dá)修飾的樹眼鏡蛇毒素核酸序列。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟d)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中抽提修飾的樹眼鏡蛇毒素，e)從細(xì)胞培養(yǎng)物抽提物中純化修飾的樹眼鏡蛇毒素，可任選包括以下步驟從共表達(dá)的異源蛋白中切割出樹眼鏡蛇毒素。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的異源蛋白是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，純化過程包括GST親和層析，接著從GST中裂解出修飾的樹眼鏡蛇毒素。
25.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的或者是利用權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)所述的方法得到的多肽。
26.一種藥用組合物，其中包括一種治療上有效量的如權(quán)利要求1-12或25中任一項(xiàng)所述的多肽。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其進(jìn)一步包括藥物學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
28.如權(quán)利要求1-12或5中任一項(xiàng)所述的多肽，用作藥物。
29.如權(quán)利要求1-12或25中任一項(xiàng)所述的多肽用于制備治療或預(yù)防血栓相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
30.如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中所述的疾病是以下疾病中的一種或多種血栓癥、心肌梗死、視網(wǎng)膜新血管形成、內(nèi)皮損傷、異常調(diào)控凋亡、異常細(xì)胞遷移、白細(xì)胞募集、免疫系統(tǒng)激活、組織纖維化和腫瘤發(fā)生。
全文摘要
通過重組DNA技術(shù)特別是“環(huán)移植”技術(shù)修飾一種多肽神經(jīng)毒素類似物－樹眼鏡蛇毒素,從而提供一種修飾的多肽。所述的修飾的多肽構(gòu)建成保持樹眼鏡蛇毒素活性例如對(duì)纖維蛋白酶原的血小板粘附作用,另外還具有一或多種非樹眼鏡蛇毒素天然活性的生物學(xué)或生物化學(xué)活性,例如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)活性或水蛭素活性。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1251133SQ9880349
公開日2000年4月19日 申請(qǐng)日期1998年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月20日
發(fā)明者陸新杰, 邁克爾·菲巴爾·斯庫利, 維賈伊·維爾·卡卡爾, 卡爾萬特·辛格·奧蒂 申請(qǐng)人:特里根有限公司