專利名稱：凝血和腫瘤治療的組織因子方法和組合物的制作方法
本申請是涉及1997年3月27日提交的臨時申請流水號60/042,427(代理人案卷號UTSD517PZ3)；1997年1月27日提交的臨時申請流水號60/036,205(代理人案卷號UTSD517PZ2)；和1997年1月22日提交的臨時申請流水號60/035,920(代理人案卷號UTSD517PZ1)之主題的非臨時申請，毫無疑問，上述各臨時申請的全部內容都列入本文作為參考。美國政府依據(jù)國立衛(wèi)生研究院的準予號ROI-CA59569，ROI-CA54168和POI-HL16411擁有對本發(fā)明的權利。1.發(fā)明領域本發(fā)明一般涉及血管和凝血領域，本發(fā)明更具體地包括一個奇怪的發(fā)現(xiàn)，即組織因子成分可定位于腫瘤血管系統(tǒng)并導致特異性凝血。本發(fā)明特別地提供了用經修飾的組織因子(TF)成分以及TF與其它分子的聯(lián)合影響特異性凝血和治療腫瘤的方法和組合物。2.相關技術的描述腫瘤細胞對多種化學治療劑的耐受性是臨床腫瘤學的主要問題所在，因此，盡管最近30年來，腫瘤疾病化學療法已取得很多進展，但是很多最流行的人類癌癥形式仍然不能有效地進行化學治療干預。
在任何治療方案中，必須提及一個值得注意的根本問題，即“全細胞殺傷”的概念。此概念認為為了具有有效的治療方案，不論是外科手術還是化學治療法還是兩者兼?zhèn)?，都必須對所有所謂的“克隆發(fā)生性”惡性細胞，即能無限制地生長并取代任何可被除去的腫瘤塊的細胞進行全細胞殺傷。由于最終需要開發(fā)可達到全細胞殺傷的治療劑和方案，因此，相對于其它腫瘤而言，某些類型的腫瘤更能經得起治療的考驗。例如，軟組織腫瘤(如淋巴瘤)和血液及血液形成器官的腫瘤(如白血病)一般比諸如癌之類的實體腫瘤對化學療法反應性更強。
軟組織和基于血液的腫瘤對化學療法敏感的一個原因是化學療法干預在身體上更易于接近淋巴瘤和白血病細胞。簡而言之，相對于軟組織腫瘤和基于血液的腫瘤而言，大多數(shù)化學治療劑更難到達實體腫瘤塊的所有細胞，因此，更難達到全細胞殺傷。增加化學治療劑的劑量經常會導致毒副作用，這一般會限制常規(guī)抗腫瘤劑的效力。
長期以來十分明顯的是特別需要開發(fā)新的治療實體腫瘤的策略。一個這種策略是使用“免疫毒素”，其中使用抗腫瘤細胞抗體將毒素傳遞給腫瘤細胞。然而，與上述化學治療法一樣，此方法也有某些缺點。例如，抗原陰性或抗原缺損的細胞可存活并重新集群為腫瘤或導致進一步轉移。在治療實體腫瘤時，腫瘤塊一般不允許抗體和免疫毒素大小的分子透過，因此，僅開發(fā)免疫毒素不能夠特別顯著改善癌癥治療狀況。
后來，一些研究人員開發(fā)了靶向實體腫瘤血管系統(tǒng)的方法。靶向腫瘤血管的好處在于不會導致抗性腫瘤細胞或其群體的產生。另外，向血管系統(tǒng)傳遞靶向藥劑不會存在與藥劑進入相關的問題，破壞血管應能導致抗腫瘤效應的擴大，因為很多腫瘤細胞依靠單個血管供應其氧和營養(yǎng)。血管靶向策略的例子描述于Burrows等(1992)，Burrows和Thorpe(1993)和WO93/17715。將抗細胞劑靶向傳遞給腫瘤血管系統(tǒng)提供了十分有希望的策略，然而，這些分子毒素部分的使用仍為改善血管靶向留有余地。
WO96/01653中報道了靶向破壞腫瘤血管系統(tǒng)的另一方法，其中使用針對腫瘤血管系統(tǒng)標記物的抗體將促凝劑傳遞給實體腫瘤的血管系統(tǒng)。以此方法靶向傳遞促凝劑的優(yōu)點在于不太可能因存在任何背景錯誤靶向而導致顯著的毒副作用，這種背景錯誤靶向可能是由于靶向抗體與正常組織細胞任何低水平的交叉反應性所致。用于這種定向抗腫瘤療法的抗體-促凝劑構建體被稱為“凝血配體(coaguligand)”(WO 96/01653)。
盡管將促凝劑特異性傳遞給腫瘤血管標志著驚人的進步，在多種人類疾病和障礙的治療方面應用或操縱凝血已經實踐了一段時間。例如，Morrissey和Comp建議聯(lián)合使用截短的組織因子(tTF)和因子VIIa(FVIIa)治療血液凝結受損的患者，如血友病患者(美國專利號5,374,617；5,504,064；和5,504,067)。Roy和Vehar還研制出了可中和內源性組織因子、并可在治療例如心肌梗塞時用作抗促凝劑的組織因子突變體(美國專利號5,346,991和5,589,363)。
在與組織因子(TF)相關的其它研究中，Edgington及其同事們已闡明與正常的黑素細胞相比，惡性轉移的人黑素瘤細胞表達高水平的TF，即血漿凝血蛋白酶級聯(lián)反應的主要細胞起始因子(WO94/28017；WO94/05328；美國專利5,437,864)。據(jù)報道抑制TF功能以及隨后局部蛋白酶產生的減少可導致血管系統(tǒng)中殘留的腫瘤細胞數(shù)目顯著減少，這暗示著TF表達和腫瘤細胞的轉移表型之間有著直接的聯(lián)系。Edgington及其同事們提出成功植入腫瘤細胞需要TF功能，而干預TF功能、或特異性地干預TF在細胞表面的表達對于抑制轉移是有用的，因此這些作者建議用針對組織因子的抗體治療癌癥。發(fā)明簡述與Edgington及其同事們的上述觀察結果和使用抗TF抗體治療癌癥形成鮮明對照的是，本發(fā)明人已證實，可使用截短的TF成分和TF變體本身治療實體腫瘤。部分基于本發(fā)明人驚人的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了本發(fā)明，所述發(fā)現(xiàn)為僅在全身性施用之后，截短的TF會特異性地定位于血管化腫瘤內的血管中。從以前對TF分子的詳細研究中不可能推測出在缺乏任何靶向部分時的這種定位。本文所述的TF自我定位特性與以前描述的使用TF治療諸如血友病患者內出血障礙形成對照，后一療法中TF的傳遞和作用既不定位也局限于局部應用的特定部位。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了促進動物或患者前血栓形成性(prothrombotic)血管凝血的方法，此方法一般包括給動物施用含有一種凝血缺損組織因子(TF)化合物的組合物，施用的量應能有效地優(yōu)先或特異性地促進前血栓形成性血管凝血。
除了在隨后特別地指出上限的情況外，整個申請上下文中所用的術語“一個”(或“一種”)的意思是“至少一個(種)”，“至少第一個(種)”，“一個(種)或多個(種)”或“多個(種)”所指的組分或步驟，因此，“一種凝血缺損組織因子”指的是“至少第一種凝血缺損組織因子”。本領域技術人員參照本發(fā)明的內容可知道關于任何單個藥劑量的可操作范圍和混合參數(shù)。
前血栓形成性血管可能與伴有良性生長或血管化腫瘤的多種血管源疾病中的任何一種相關。在本發(fā)明的上下文中，術語“血管化腫瘤”指的是血管化的惡性腫瘤。本發(fā)明特別有利于治療至少約為中等大小的血管化腫瘤和治療大的血管化腫瘤。
組合物一般是藥理學可接受的，優(yōu)選通過例如靜脈內注射全身性施用于動物。
本發(fā)明的方法還被描述為治療患有與前血栓形成性血管相關之疾病的動物或人患者的方法，此方法包括給動物施用至少第一種凝血組合物，所述組合物含有至少第一種凝血缺損組織因子化合物，施用的量應能有效地優(yōu)先或特異性地促進與良性或惡性疾病位點相關的前血栓形成性血管凝血。
本發(fā)明的實質也可被限定為含有至少一種生物學有效量的至少第一種凝血缺損組織因子化合物的組合物，該組合物可用于制備藥物，所述藥物可用于優(yōu)先或特異性地促進動物、特別是與良性或惡性疾病位點相關之動物的前血栓形成性血管凝血。
在本發(fā)明的方法、藥物和用途中，一個優(yōu)點在于只要將凝血組合物提供到動物的全身循環(huán)中，就會導致組織因子化合物特異性地或優(yōu)先地定位于疾病位點。
本文公開的優(yōu)選方法是用于促進患有血管化腫瘤的動物或人受試者的腫瘤血管系統(tǒng)凝血的方法，所述方法一般包括給動物施用一種或多種含有一種或多種凝血缺損組織因子化合物的組合物，施用的量應足以特異性地或優(yōu)先地促進腫瘤血管系統(tǒng)凝血。治療中等大小或大的血管化腫瘤特別有利。
這些治療方法可被描述為治療患有血管化腫瘤的動物的方法，所述方法包括給動物施用生物學有效量的至少一種凝血組合物，所述組合物含有其量足以特異性地或優(yōu)先地促進腫瘤血管系統(tǒng)凝血的至少第一種凝血缺損組織因子化合物。
進一步的描述是治療患有血管化腫瘤的動物或患者的方法，所述方法包括給動物全身性施用一種或多種組合物，所述組合物含有一種或多種凝血缺損組織因子化合物，施用的量和時間能使得有效地特異性或優(yōu)先地促進血管化腫瘤血管系統(tǒng)的凝血。
本發(fā)明的抗腫瘤效應被特別地描述于下述方法中，該方法的特征在于給患有腫瘤的動物施用含有至少一種凝血缺損組織因子化合物的組合物，施用的量應能有效促進腫瘤血管系統(tǒng)的凝血，并能特異性地或優(yōu)先地導致腫瘤中的組織壞死。
本發(fā)明的這些方面也提供了含有至少一種生物學有效量的至少第一種凝血缺損組織因子化合物的組合物，所述組合物可用于制備能優(yōu)先或特異性地促進與動物惡性血管化腫瘤相關的前血栓形成性血管凝血的藥物；因而，其中所述藥物可通過導致腫瘤血管凝血和腫瘤壞死而用于治療患有癌癥的動物。
本文中用于促進前血栓形成性血管或腫瘤血管系統(tǒng)凝血上下文，和/或用于促進足以導致如腫瘤的疾病位點中組織壞死的凝血上下文中的術語“優(yōu)先地”和“特異性地”指的是組織因子化合物或TF-第二種藥劑組合行使的功能是獲得基本上局限于疾病位點(如腫瘤區(qū)域)的凝血和/或組織壞死，而基本上不會導致正常的健康組織凝血或組織壞死。
因此，凝血缺損組織因子化合物或其聯(lián)合在疾病或腫瘤位點產生了凝血和/或組織破壞效應，而對正常健康的細胞或組織只產生很小的，或不產生凝血或組織破壞效應，因此，凝血和/或組織破壞定位于疾病或腫瘤位點，而不會大量或顯著地擴展至其它主要或重要的血管或組織。因此，在本發(fā)明的方法中，健康細胞和組織的功能基本上保持未受損的狀態(tài)。
本發(fā)明中“凝血缺損組織因子”一般是當在如適當?shù)牧字h(huán)境中檢測時，活性比全長的天然組織因子至少約低100倍的組織因子化合物。組織因子化合物仍然具有活性，優(yōu)選被描述為當在如適當?shù)牧字h(huán)境中檢測時，活性比全長的天然組織因子約低100倍至1,000,000倍的組織因子化合物。
當在如適當?shù)牧字h(huán)境中檢測時，優(yōu)選凝血受損的組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子至少約低1,000倍；更優(yōu)選所述活性比全長的天然組織因子至少約低10,000倍；最優(yōu)選所述活性比全長的天然組織因子至少約低100,000倍。
“活性至少約低100,000倍”不是最小值，當在如適當?shù)牧字h(huán)境中檢測時，組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子可以至少約低500,000倍或約1,000,000倍。
人組織因子化合物一般以用于人為佳，當然，也不排除使用其它種的TF，包括大腸桿菌TF。為了簡化制備，優(yōu)選通過重組表達制備凝血缺損組織因子化合物，但此方法不是必需的。
通過在結合至磷脂表面和/或插入磷脂膜或脂質雙層方面產生缺陷可使組織因子變成凝血缺損型，優(yōu)選的例子是“截短的組織因子”。如美國專利5,504,064中所限定(其中化合物具有不同用途)，“截短的組織因子”一般具有不同于天然組織因子的氨基酸序列，不同之處在于其中截短的組織因子蛋白上缺失了功能為將天然組織因子與磷脂膜結合的足夠的跨膜氨基酸，因此截短的組織因子蛋白不與磷脂膜結合。
截短的組織因子的具體例子是約含有天然TF序列前219個鄰接氨基酸的組織因子化合物，進一步的例子是實質上由SEQ ID NO1的氨基酸序列組成的組織因子化合物。盡管欲用于不同方法中，但美國專利5,504,067中將截短的組織因子限定為具有始于第1位結束于確定的組織因子序列大致第219位的氨基酸序列的組織因子蛋白。
也可以使用二聚體形式的凝血缺損組織因子，包括同二聚體和異二聚體組織因子。本文公開的TF二聚體的例子是基本上由SEQ IDNO3(H6-tTF219-cys-C’二聚體)，SEQ ID NO6(H6-tTF220-cys-C’二聚體)，SEQ ID NO7(H6-tTF221-cys-C’二聚體)或SEQ IDNO2(H6-N’-cys-tTF219二聚體)氨基酸序列的二聚體組成的TF二聚體。本發(fā)明的某些方面優(yōu)選使用下文詳細描述的化學綴合的二聚體，而在特定實施方案中也可以使用讀框一致地連接在一起的重組產生的二聚體。
本文使用的凝血受損組織因子化合物也可以是聚合體或多聚體形式的組織因子。
在某些實施方案中，組織因子化合物是激活因子VII的能力缺損的突變組織因子。盡管單獨使用也是有用的，但最優(yōu)選將這種突變體與生物學有效量的至少一種因子VIIa或因子VIIa激活劑的共同施用聯(lián)合使用，例如與其量足以增加動物腫瘤血管系統(tǒng)凝血和腫瘤壞死的因子VIIa一起使用。
這種突變體可以是在SEQ ID NO1約第157位至約第167位氨基酸區(qū)域中包含突變的突變體。非限制性突變體的例子是在SEQ IDNO1中，第158位Trp變成Arg；第162位Ser變成Ala；第164位Gly變成Ala；或第158位Trp變成Arg和第162位Ser變成Ala的突變體。這種突變體的確定的例子是基本上由SEQ ID NO8或SEQID NO9的氨基酸序列組成的突變體。
任何截短的、二聚體、多聚體和/或突變體凝血缺損組織因子化合物可進一步被修飾以增加TF分子的壽命、半壽期或“生物半壽期”?？蓪Χ嚯慕Y構進行多種修飾以達到這種特性的改變。
經修飾增加了其生物半壽期的TF的具體例子是與載體分子(如蛋白質載體)有效地結合、優(yōu)選共價連接的那些組織因子化合物。優(yōu)選載體為惰性載體，例如(僅僅是舉例)白蛋白或球蛋白。載體也可以是如多糖和合成聚合物的非蛋白質載體。
與抗體或其部分有效結合的TF構建體是本文優(yōu)選的生物半壽期有所提高的凝血缺損TF形式。然而，在本文提供的抗癌治療策略中所用第一藥劑的上下文中，TF與不能顯著特異性結合腫瘤細胞腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分的抗體連接，即其中組織因子化合物不與“抗腫瘤”抗體連接，所得組織因子化合物不是“靶向腫瘤的TF化合物”。
在這種TF-抗體綴合物中，組織因子化合物可與所謂“不相關特異性”的IgG分子有效結合，即所述IgG分子對腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分不具有免疫結合親和性。組織因子化合物也可與抗體Fc部分有效結合，所述部分在抗體特異性方面不具有特異性靶向功能。涉及的其它構建體是其中組織因子化合物被導入IgG分子以取代CH3區(qū)域的那些構建體。
本發(fā)明非常有效的TF療法可以有利地與一種或多種其它療法聯(lián)合。例如，諸療法中可進一步包括給動物或患者施用生物學或治療有效量的至少第二種治療化合物，如至少一種選自因子VIIa、因子VIIa激活劑和至少第一種抗癌劑的第二種治療化合物。
所述至少第一種抗癌劑可以是“化學治療劑”。本文所用術語“化學治療劑”指的是治療惡性腫瘤所用的典型化學治療劑或藥物。雖然包括免疫毒素的其它化合物也可用術語化學治療劑描述，因為它們可產生抗癌效應，但為了簡單起見，還是使用了該術語。然而，“化學治療劑”在本領域中逐漸具有不同的含義，并根據(jù)此標準含義使用該術語。因此，本發(fā)明上下文中的“化學治療劑”一般不是指免疫毒素，放射性治療劑等等，盡管它們在使用上有重疊。
表II中列出了很多化學治療劑的例子。盡管與本發(fā)明聯(lián)合使用時劑量可大大降低，但本領域技術人員易于理解化學治療劑的使用和適當劑量。本文優(yōu)選的化學治療劑是表鬼臼毒素吡喃葡糖苷。也可被稱為“化學治療劑”的新的一類藥物是誘導細胞凋亡的藥劑。包括基因、載體和反義構建體的任何一種或多種這類藥物適當時也可與本發(fā)明聯(lián)合使用。
適當?shù)目拱┧巹┻€包括特異性靶向的毒性藥劑，例如，抗癌抗體，優(yōu)選為含有可與腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分特異性結合的抗體的抗體構建體或綴合物，其中抗體與至少第一種細胞毒性劑或抗細胞藥劑、或與例如至少第一種凝血因子有效結合或綴合。
例如(僅是舉例)，靶向構建體或綴合物可以是能與下述成員特異性結合的抗體構建體或綴合物腫瘤細胞表面分子；腫瘤血管系統(tǒng)組分，如E-選擇蛋白，P-選擇蛋白，VCAM-1，ICAM-1，endoglin或整聯(lián)蛋白；吸附于或定位于血管系統(tǒng)或基質中的組分，如VEGF，F(xiàn)GF或TGFβ；其表達可在腫瘤環(huán)境中天然或人工地被誘導的組分，如E-選擇蛋白，P-選擇蛋白或MHC II類抗原。非抗體靶向的藥劑包括生長因子，如VEGF和FGF；含有三肽R-G-D并能與腫瘤血管系統(tǒng)特異性結合的肽，和其它靶向組分，如膜聯(lián)蛋白和相關配體。
抗體構建體和綴合物可有效地與至少第一種細胞毒性的或要不然為抗細胞的藥劑結合。它們也可有效地與至少第一種凝血因子結合。盡管對于毒素而言一般優(yōu)選共價鍵，但在與促凝劑結合時，使用雙特異性構建體也是有利的(如使用兩種抗體結合區(qū)域)。在這種“免疫毒素”或“凝血配體”中可使用本領域已知的任何一種或多種毒性劑或促凝劑，組織因子或組織因子衍生物也可用作凝血配體的部分，其中凝血配體是第二種“抗癌劑”。
因此，本發(fā)明另外還提供了治療患有血管化腫瘤的動物或患者的方法，所述方法一般包括給動物全身性施用一種或多種凝血缺損組織因子化合物和一種或多種抗癌劑，施用的聯(lián)合劑量應能有效使腫瘤血管系統(tǒng)凝血并特異性誘導腫瘤壞死?？拱﹦┛梢允侨绫砉砭识舅剡拎咸擒盏幕瘜W治療劑，抗體，含有可與腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分特異性結合、有效連接于細胞毒性藥劑或凝血因子的抗體的抗體構建體或綴合物。
無論抗癌劑是化學治療劑還是基于抗體的構建體，都可以由單一組合物或者兩種或多種不同的組合物給動物共同施用一種或多種抗癌劑。也可以交錯或連續(xù)施用一種或多種組織因子化合物和一種或多種抗癌劑?！斑B續(xù)施用”需要以“生物有效的時間間隔”給動物施用TF和抗癌劑。例如，可在施用抗癌劑之前的生物有效時間給動物施用組織因子化合物，或在施用組織因子化合物之前的生物有效時間給動物施用抗癌劑。當首先施用組織因子化合物時，一般在施用抗癌劑之前的足以允許組織因子化合物優(yōu)先定位于腫瘤血管系統(tǒng)內的生物有效時間給藥。
本發(fā)明還包括使用至少一種因子VIIa或因子VIIa激活劑以增加確定主要治療目的的任何一種或多種凝血缺損組織因子(TF)化合物的效力的方法，這類方法一般包括另外給動物或患者施用治療有效量的因子VIIa或因子VIIa激活劑。
在這種實施方案中，一般優(yōu)選使用因子VIIa本身，所用因子VIIa基本上由SEQ ID NO14的氨基酸序列組成。
另外，給動物施用凝血缺損的組織因子化合物的同時可施用因子VIIa或因子VIIa激活劑。照此方式，可以預先形成的組織因子-因子VIIa復合物的形式給動物或患者施用因子VIIa。在某些實施方案中，組織因子-因子VIIa復合物是等摩爾的復合物。
另外，可使用交錯或連續(xù)施用的方式給動物施用凝血缺損的組織因子化合物和因子VIIa化合物。一般優(yōu)選先施用組織因子化合物，并且優(yōu)選在施用因子VIIa化合物之前的生物有效時間給動物施用組織因子化合物。這種有效的預先施用組織因子化合物一般在施用因子VIIa化合物之前足以允許組織因子化合物優(yōu)先定位于腫瘤血管系統(tǒng)內的生物有效時間進行。
因此，本發(fā)明的這些方法還可被描述為促進患有血管化腫瘤的動物或患者的腫瘤血管系統(tǒng)凝血的方法，所述方法包括給動物或患者全身性提供凝血缺損組織因子化合物和因子VIIa或因子VIIa激活劑，施用的聯(lián)合劑量應足以優(yōu)先或特異性地促進腫瘤血管系統(tǒng)凝血。
優(yōu)選在提供因子VIIa之前的時間給受試動物提供凝血缺損組織因子化合物，其中施用因子VIIa之前的時間間隔對于組織因子化合物優(yōu)先或特異性地定位于腫瘤血管系統(tǒng)是有效的。
其它方法被描述為治療患有血管化腫瘤的動物的方法，所述方法包括給動物全身性施用凝血缺損組織因子化合物和因子VIIa，施用的聯(lián)合劑量應能有效促進腫瘤血管系統(tǒng)凝血和特異地導致腫瘤壞死。一般優(yōu)選預先施用組織因子，以使組織因子化合物優(yōu)先定位于腫瘤血管系統(tǒng)內，并形成供隨后與因子VIIa聯(lián)合的庫。
所有這種因子VIIa聯(lián)合療法可與任何凝血缺損組織因子化合物，如截短的、二聚體的和/或突變的組織因子和/或半壽期增加的組織因子一起使用。這些方法可特別用于與激活因子VIIa的能力缺損的組織因子的聯(lián)合。
本發(fā)明的聯(lián)合療法也包括使用一種或多種凝血缺損組織因子化合物、一種或多種抗癌劑和因子VIIa或因子VIIa激活劑的三重聯(lián)合。
本發(fā)明還提供了新的組合物，該組合物的形式為含有一種或多種經修飾增加了半壽期的凝血缺損組織因子化合物，其中所述修飾不是由組織因子化合物與能結合腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分的抗體的結合組成。
“增加了半壽期的組織因子化合物”包括上述所有凝血缺損組織因子化合物，如截短的、二聚體的、聚合的和/或突變的組織因子。
增加了半壽期的組織因子化合物優(yōu)選包括與載體分子有效結合，如共價結合的凝血缺損組織因子化合物。本文優(yōu)選蛋白質載體，例如白蛋白或球蛋白，但非蛋白質載體也可以。
一類增加了半壽期的凝血缺損組織因子化合物是與抗體或其部分(如IgG分子或抗體的Fc部分)有效結合的組織因子化合物。導入至IgG分子的鄰接部分，如取代CH3區(qū)域的組織因子也可以。
本發(fā)明還提供了一系列可與本發(fā)明方法結合使用的新的治療試劑盒。某些試劑盒優(yōu)選在適當?shù)娜萜髦邪辽俚谝环N凝血缺損組織因子化合物與至少第一種抗癌劑的聯(lián)合。
凝血缺損組織因子化合物可以是本文所述的一種或多種凝血缺損組織因子，如截短的、二聚體的、聚合的和/或突變的組織因子，包括激活因子VII的能力缺損的突變組織因子。若試劑盒中使用了這種因子VII激活突變體，則試劑盒中還可任選包括生物學有效量的因子VIIa。
如上所述使用術語“抗癌劑”，該術語覆蓋了化學治療劑，如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷；和基于抗體的抗癌劑，如含有可與腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分特異性結合的抗體的抗體綴合物，其中所述抗體與細胞毒性劑或凝血因子(包括組織因子或組織因子衍生物)有效結合。
本發(fā)明其它的治療試劑盒一般優(yōu)選在適當?shù)娜萜餮b置中包括激活因子VII的能力缺損的突變組織因子化合物以及因子VIIa。以前人們認為這一類型突變體的活性缺損使得它們在治療上不能用于誘導凝血，而只能作為野生型TF的拮抗劑起作用并抑制凝血。以前僅建議過將具有顯著活性的截短的組織因子與因子VIIa進行聯(lián)合，用于治療出血障礙。
因此，本發(fā)明提供了突變組織因子化合物與因子VIIa的新聯(lián)合，所述化合物相對于截短的組織因子而言，其凝血活性受損情況更加嚴重，優(yōu)選是由于激活因子VII的能力缺損。施用給動物之后，因子VIIa變成“外源性因子VIIa”。因此，這些試劑盒優(yōu)選在適當?shù)娜萜餮b置中包括生物學有效量的激活因子VIIa的能力缺損的突變組織因子化合物以及生物學有效量的至少一種因子VIIa或因子VIIa激活劑。在這種試劑盒中因子VIIa激活劑可替代因子VIIa，或者除了因子VIIa外，還可使用因子VIIa激活劑。也可加入補充試劑。
可用于這種試劑盒中的TF突變體的例子是在SEQ ID NO1中約第157位到約第167位的氨基酸區(qū)域中包括突變的突變體。所述突變體的例子是在SEQ ID NO1中，第158位Trp變成Arg；第162位Ser變成Ala；第164位Gly變成Ala；或第158位Trp變成Arg和第162位Ser變成Ala的那些突變體。這種突變體TF的其它例子是基本上由SEQ ID NO8或SEQ ID NO9的氨基酸序列組成的突變體。
本發(fā)明也提供了優(yōu)選在適當容器中包含至少第一種凝血缺損的組織因子化合物、至少第一種抗癌劑和因子VIIa或因子VIIa激活劑的聯(lián)合治療試劑盒。圖的簡述下述諸圖構成了本發(fā)明說明書的一部分，它可進一步闡明本發(fā)明的某些方面。參照一幅或多幅圖、結合本文提供的具體實施方案的詳細描述可更好地理解本發(fā)明。
圖1全長TF對血漿凝血的誘導，血液(A)顯示出與細胞膜(B)接觸。
圖2TF域結構。所示的是胞外域(A；氨基酸1-219)和細胞膜(B)部分，NH2域(10)以交叉影線表示，因子VII/VIIa結合區(qū)域(20)以影線表示，跨膜域(40)始于氨基酸220(30)并跨越細胞膜。TF的跨膜域被缺失或者已變得無功能，以產生本發(fā)明的功能性tTF。在某些tTF組合物中，NH2域也可被缺失或者變得無功能。
圖3tTF誘導的腫瘤血管系統(tǒng)凝血模型。血液(A)顯示出與腫瘤血管內皮細胞(C)的細胞膜(B)接觸。前血栓形成性腫瘤內皮細胞表面具有因子IX、X(顯示出)或TFPI/Xa加上磷脂酰絲氨酸(PS-)，它們與tTF-VII或tTF-VIIa結合，導致凝血。
圖4A和圖4B。圖4A與細胞結合的tTF誘導凝血。4℃下將A20細胞(105個細胞，100μl)與抗體(0.33μg)和tTF(0.17μg)一起保溫1小時，向細胞中加入氯化鈣(12.5mM)和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；水平軸)，垂直軸表示樣品號。樣品1包括未加入抗體或tTF(對照)，樣品2包括B21-2/10H10抗體，樣品3包括tTF，樣品4包括B21-2/OX7抗體加上tTF，樣品5包括CAMPATH-2/10H10抗體加上tTF，樣品6包括10H10F(ab’)2抗體加上tTF，樣品7包括10H10Fab’抗體加上tTF，樣品8包括B21-2F(ab’)2抗體加上tTF，樣品9包括B21-2Fab’抗體加上tTF，樣品10包括B21-2/10H10抗體加上tTF。圖4B結合的tTF分子的數(shù)目與血漿凝血時間之間的關系。4℃，在疊氮化鈉存在下將A20細胞(105個細胞，100μl)與不同濃度的B21-2/10H10加上過量的tTF保溫1小時，然后洗滌，升溫至37℃。向細胞中加入氯化鈣(12.5mM)和檸檬酸鹽化的小鼠血漿(不同于A的一批)，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)，在使用125I-tTF的平行研究中測定與細胞結合的tTF分子數(shù)目(O)(對數(shù)規(guī)模；水平軸)，數(shù)值表示為3次測量的平均值與SD。
圖5通過與細胞相關的tTF219，H6-N’-cys-tTF219和H6-tTF219-cys-C’使小鼠血漿凝血。室溫下用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。洗滌細胞，以一定的tTF濃度范圍加入兩種不同的tTF219制品[標準tTF219(O)和tTF219(▲)]，H6-N’-cys-tTF219(□)或H6-tTF219-cys-C’(●)(濃度，M；水平軸)，洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖6通過與細胞相關的H6-tTF220-cys-C’和tTF220-cys-C’使小鼠血漿凝血。室溫下用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。洗滌細胞，以一定的濃度范圍加入標準tTF219(■)，H6-tTF220-cys-C’(O)和tTF220-cys-C’(●)(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖7通過與細胞相關的H6-tTF221-cys-C’，tTF221-cys-C’和H6-tTF221-cys-C’二聚體使小鼠血漿凝血。室溫下用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。洗滌細胞，以一定的濃度范圍加入標準tTF219(O)，H6-tTF221-cys-C’(●)，tTF221-cys-C’(□)或H6-tTF221-cys-C’二聚體(▲)(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖8通過與細胞相關的H6-N’-cys-tTF219和H6-N’-cys-tTF219二聚體使小鼠血漿凝血。室溫下用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。洗滌細胞，以一定的濃度范圍加入標準tTF219(O)，H6-N’-cys-tTF219(■)和H6-N’-cys-tTF219二聚體(●)(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖9通過tTF219使大的C1300 Muγ腫瘤的血管形成血栓。給皮下攜有大的(＞1000cm3)C1300 Muγ腫瘤的Nu/Nu小鼠靜脈內注射16-20μg tTF219。24小時后，麻醉小鼠，無痛致死，取出腫瘤和器官，評價石蠟組織切片中形成血栓的血管的存在，計數(shù)腫瘤切片中血栓化血管和暢通血管的數(shù)目，垂直軸表示血栓化腫瘤血管的百分比，影線條表示注射tTF219的小鼠，空心條表示注射PBS的小鼠。
圖10通過tTF219使大的C1300腫瘤的血管形成血栓。給皮下攜有大的(＞1000mm3)C1300腫瘤的Nu/nu小鼠靜脈內注射16-20μgtTF219。24小時后，麻醉小鼠，無痛致死，取出腫瘤和器官，評價石蠟組織切片中形成血栓的血管的存在，計數(shù)腫瘤切片中血栓化血管和暢通血管的數(shù)目，垂直軸表示血栓化腫瘤血管的百分比，影線條表示注射tTF219的小鼠，空心條表示注射PBS的小鼠。
圖11通過tTF219使大的3LL腫瘤的血管形成血栓。給皮下攜有大的(＞800mm3)3LL腫瘤的C57BL/6小鼠靜脈內注射16-20μgtTF219。24小時后，麻醉小鼠，無痛致死，取出腫瘤和器官，評價石蠟組織切片中形成血栓的血管的存在，計數(shù)腫瘤切片中血栓化血管和暢通血管的數(shù)目，垂直軸表示血栓化腫瘤血管的百分比，影線條表示注射tTF219的小鼠，空心條表示注射PBS的小鼠。
圖12A和圖12B通過tTF219抑制小鼠C1300 Muγ腫瘤的生長。圖12A間隔6天，給長了0.8至1.0cm直徑C1300(Muγ)腫瘤的小鼠兩次靜脈內注射B21-2/10H10-tTF凝血配體(●)(箭頭)，對照組小鼠僅接受等劑量的tTF(□)，CAMPATH-2/10H10加上tTF(Δ)，或磷酸緩沖鹽溶液(O)。接受B21-2/OX7和tTF的小鼠與僅接受tTF的動物具有類似的腫瘤反應，僅施用B21-2/10H10不影響腫瘤生長。每組含有12至27只小鼠。點表示每組平均腫瘤體積(±SEM)，垂直軸表示平均腫瘤體積(cm3)，水平軸表示第一次治療后的天數(shù)。圖12B用16-20μg tTF219(■)或磷酸緩沖鹽溶液(O)靜脈內注射皮下攜有小(350mm3)C1300 Muγ腫瘤的Nu/nu小鼠，1周后重復治療。每天測量腫瘤，計算腫瘤體積(+一個標準偏差)。每個治療組含有8至10只小鼠。垂直軸表示平均腫瘤體積(cm3)，水平軸表示第一次治療后的天數(shù)。
圖13通過tTF219抑制小鼠H460腫瘤的生長。用16-20μgtTF219(■)或磷酸緩沖鹽溶液(O)靜脈內注射皮下攜有小(350mm3)H460腫瘤的Nu/nu小鼠，1周后重復治療。注射時間以箭頭表示，每天測量腫瘤，計算腫瘤體積(+一個標準偏差)。每個治療組含有8至10只小鼠。垂直軸表示平均腫瘤體積(cm3)，水平軸表示第一次治療后的天數(shù)。
圖14通過tTF219抑制小鼠HT29腫瘤的生長。用16μg或64μgtTF219(□)或PBS(●)靜脈內注射皮下攜有大(1200mm3)HT29腫瘤的Nu/nu小鼠。每天測量腫瘤(注射后的天數(shù)；水平軸)，計算腫瘤體積(+一個標準偏差)(腫瘤體積，mm3；垂直軸)。每個治療組含有3至4只小鼠。
圖15通過與細胞相關的IgG-H6-N’-cys-tTF219使小鼠血漿凝血。用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。室溫下以一定的濃度范圍加入IgG-H6-N’-cys-tTF219(Δ)，H6-N’-cys-tTF219(■)或tTF219(O)(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖16通過與細胞相關的IgG-H6-N’-cys-tTF219和IgG-H6-tTF219-cys-C’使小鼠血漿凝血。通過將B21-2 IgG(針對I-Ad)與H6-N’-cys-tTF219(▲)或H6-tTF219-cys-C’(■)連接制備免疫球蛋白-tTF綴合物。室溫下以一定的濃度范圍將綴合物加入A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)中，并與tTF219(●)相比較(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(秒)，垂直軸表示相對于對照的凝血時間百分比。
圖17通過顯色試驗測定與細胞相關的IgG-H6-N’-cys-tTF219和Fab’-H6-N’-cys-tTF219使因子X轉變?yōu)橐蜃覺a的情況。用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20細胞(I-Ad陽性)，室溫下以一定的濃度范圍加入IgG-H6-N’-cys-tTF219(O)或Fab’-H6-N’-cys-tTF219(Δ)，也加入B21-2/10H10+H6-N’-cys-tTF219(×)和Mac51/10H10+H6-N’-cys-tTF219(對照，■)(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和“Proplex T”(ProplexT含有因子II，VII，IX和X)。通過加入生色團釋放底物S-2765測定Xa的產生，并測定409nm下的光密度(OD409nm；垂直軸)。
圖18通過免疫球蛋白-tTF綴合物抑制小鼠內C1300 Muγ腫瘤的生長。用與OX7 Fab’/10H10 Fab雙特異性“載體”抗體復合的tTF21916-20μg(Δ)靜脈內注射皮下攜有小(300mm3)C1300 Muγ腫瘤的Nu/nu小鼠，其它小鼠僅接受tTF219(■)或稀釋劑(PBS，O)。1周后重復治療。治療的那天以箭頭表示。每天測量腫瘤，計算腫瘤體積(+一個標準偏差)。每個治療組含有7至10只小鼠。垂直軸表示平均腫瘤體積(cm3)，水平軸表示第一次治療后的天數(shù)。
圖19通過表鬼臼毒素吡喃葡糖苷增強免疫球蛋白-tTF的抗腫瘤活性。用tTF219與“載體”雙特異性抗體Mac51 Fab’/10H10 Fab的復合物(■)單次靜脈內注射皮下攜有L540人Hodgkin腫瘤的SCID小鼠，另一些小鼠在用免疫球蛋白-tTF綴合物治療的前2天，前1天和當天腹膜內接受480μg表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(▲)，又一些小鼠僅接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(O)或稀釋劑(PBS，Δ)。每天測量腫瘤，計算腫瘤體積(+一個標準偏差)。垂直軸表示平均腫瘤體積(cm3)，水平軸表示治療后的天數(shù)。
圖20因子VIIa增強血漿凝血。室溫下用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。洗滌細胞，以因子VIIa下列濃度范圍僅加入tTF219(O)或加入tTF219和因子VIIa0.1nM(■)；0.3nM(●)；0.9nM(Δ)；2.7nM(▲)；和13.5nM(+)(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖21細胞相關的tTF219(W158R)和tTF219(G164A)突變體使小鼠血漿微弱凝血。室溫下用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。洗滌細胞，以一定的濃度范圍加入tTF219(O)，tTF219(W158R)(●)或tTF219(G164A)(□)(濃度，M；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖22通過因子VIIa恢復突變體tTF219(G164A)和(W158R)的凝血誘導活性。室溫下用識別I-Ad和tTF的“捕獲”雙特異性抗體B21-2/10H10處理A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)。洗滌細胞，對細胞不處理(Δ)或用tTF219(O)；tTF219(G164A)(■)或tTF219(W158R)(●)處理；各加入一定濃度范圍的因子VIIa(濃度，nM；水平軸)。洗滌細胞，升溫至37℃。加入鈣和檸檬酸鹽化的小鼠血漿，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間(凝血時間，秒；垂直軸)。
圖23tTF219VIIa和tTF219(G164A)VIIa復合物在攜有HT29人結腸癌的小鼠中的抗腫瘤活性。從左至右的條表示鹽水(1)；tTF(2)；因子VIIa(3)；tTF+因子VIIa(4)；G164A(5)；和G164A+因子VIIa(6)。垂直軸表示所測腫瘤壞死的平均百分比。序列概述SEQ ID NO1 tTF219的氨基酸序列SEQ ID NO2 H6-N’-cys-tTF219的氨基酸序列SEQ ID NO3 H6-tTF219-cys-C’的氨基酸序列SEQ ID NO4 N’-cys-tTF219的氨基酸序列SEQ ID NO5 tTF219-cys-C’的氨基酸序列SEQ ID NO6 H6-tTF220-cys-C’的氨基酸序列SEQ ID NO7 H6-tTF221-cys-C’的氨基酸序列SEQ ID NO8 tTF219(W158R)的氨基酸序列SEQ ID NO9 tTF219(G164A)的氨基酸序列SEQ ID NO10tTF的cDNA序列SEQ ID NO11組織因子的全長基因組序列SEQ ID NO12組織因子的氨基酸序列SEQ ID NO13因子VII DNASEQ ID NO14因子VII氨基酸SEQ ID NO15tTF擴增的5’引物SEQ ID NO16tTF擴增的3’引物SEQ ID NO175’引物GlytTF互補DNA擴增引物SEQ ID NO18制備tTF和連接子DNA 5’端一半部分的5’引物SEQ ID NO19制備tTF和連接子DNA 5’端一半部分的3’引物SEQ ID NO20制備連接子DNA 3’端一半部分和tTF DNA的5’引物SEQ ID NO21制備連接子DNA 3’端一半部分和tTF DNA的3’引物SEQ ID NO22構建Cys[tTF]連接子[tTF]所用的5’引物SEQ ID NO23構建Cys[tTF]連接子[tTF]所用的3’引物SEQ ID NO24[tTF]連接子[tTF]cys所用的5’引物SEQ ID NO25[tTF]連接子[tTF]cys所用的3’引物SEQ ID NO26[tTF]G164A形成所用的引物SEQ ID NO27[tTF]W158R S162A所用的引物作為例證的實施方案的描述實體腫瘤和癌占所有人類癌癥的90％以上(Shockley等，1991)。在淋巴瘤和白血病療法中研究了單克隆抗體和免疫毒素的治療性用途(Lowder等，1987；Vitetta等，1991)，但它們在針對癌和其它實體腫瘤的臨床試驗中卻是無效的(Byers和Baldwin，1988；Abrams和Oldham，1985)。
基于抗體的療法無效的主要原因是大分子不易于轉運至實體腫瘤中(Sands，1988；Epenetos等，1986)。甚至當這些分子進入腫瘤塊時，它們也不能均勻分布，因為其中存在腫瘤細胞(Dvorak等，1991)間的緊密連接、纖維狀基質(Baxter等，1991)、間質壓力梯度(Jain，1990)和結合位點屏障(Juweid等，1992)。
開發(fā)治療實體腫瘤的新策略時，涉及靶向腫瘤血管系統(tǒng)而不是腫瘤細胞自身的方法可提供與眾不同的優(yōu)點。誘導穿過腫瘤(如通過腫瘤血管系統(tǒng)特異性血纖蛋白形成)的血流阻塞會干擾腫瘤位點的流入和流出過程，從而導致抗腫瘤效應。通過特異性暴露于促凝劑，使腫瘤相關血管中的前促凝劑-纖溶劑平衡向凝血過程偏移，可阻止血液供應給腫瘤，因此，制備了抗體-促凝劑構建體和雙特異性抗體，并已用于將促凝劑特異性傳遞至腫瘤環(huán)境中(WO96/01653)。
然而，對特異性的需要盡管不象免疫毒素那樣要求嚴格，但仍然是很重要的。為了達到特異性目的，一般認為效應分子，不論是毒素還是促凝劑，都需要與靶向分子(如對腫瘤環(huán)境具有特異性的抗體或其它配體)綴合或功能性結合。這種靶向實體可針對腫瘤細胞自身，但目前認為優(yōu)選使用針對腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質之組分的靶向分子。已鑒定出大量適當?shù)陌邢蚍肿?，所述分子在腫瘤血管系統(tǒng)和/或基質細胞上或環(huán)境中可特異性或優(yōu)先表達、定位、吸附或被誘導。
盡管腫瘤血管系統(tǒng)和基質靶向方法可以十分有效，但應認識到，實施這種靶向方法學仍需要某些知識，并需要制備適當?shù)木Y合物或同等分子復合物。例如，將促凝劑靶向腫瘤血管系統(tǒng)時，必須鑒定出適當?shù)难芸乖苽淇膳c靶抗原結合的抗體或配體，選擇適當?shù)拇倌齽?，將促凝劑與抗體或配體連接或形成兩種組分的功能性結合，使用不會導致藥劑顯著地錯誤定向的劑量實施定位方案。盡管這種方法可以簡單地和成功地實施，但人們會發(fā)現(xiàn)，開發(fā)包括較少的制備性步驟因此花費更少的方法學將是有利的。
本發(fā)明提供了不需要如抗體之類靶向分子而達到特異性血液凝血(如腫瘤特異性凝血)的新方法。通過施用含有凝血缺損組織因子的組合物可做到這一點，已發(fā)現(xiàn)盡管所述組織因子缺乏任何可識別的腫瘤靶向組分，但它可特異性地促進腫瘤血管系統(tǒng)的凝血。本發(fā)明使得可以將這種凝血缺損的TF組分作為改善了半壽期的TF綴合物單獨施用，與常規(guī)化學治療劑聯(lián)合施用，與靶向免疫毒素或凝血配體聯(lián)合施用，與因子VIIa(FVIIa)或FVIIa激活劑聯(lián)合施用或與上述任何聯(lián)合一起施用。A.組織因子組織因子(TF)是凝血酶原(血液凝血)級聯(lián)反應的主要起始受體(Davie等，1991)。TF是一種單鏈的、含263個氨基酸的膜糖蛋白(SEQ ID NO12)，其一級序列與趨化因子受體家族(Edgington等，1991)具有結構相似性。TF是一種跨膜細胞表面受體，作為因子VIIa的受體和輔因子起作用。TF與因子VIIa結合，在細胞表面形成蛋白水解活性復合物(Ruf和Edgington，1991b，1994；Ruf等，1991，1992a，1992b)。此復合物通過有限的蛋白水解快速激活絲氨酸蛋白酶酶原因子IX和X，導致凝血酶形成并最終導致凝血(圖21)。
因此，TF是外源性凝血途徑的激活劑，在正常生理條件下它不與血液直接接觸(Osterud等，1986；Nemerson，1988；Broze，1992；Ruf和Edgington，1994)。然而，當血管被某些細胞因子或內毒素損害或激活時，TF會通過(亞)內皮細胞(Weiss等，1989)或通過某些血細胞(Warr等，1990)暴露于血液中，然后，TF會與正常條件下以低濃度循環(huán)于血液中的因子VIIa復合(Wildgoose等，1992)，TF/因子VIIa復合物通過將因子X激活為因子Xa而起始凝血級聯(lián)反應，該級聯(lián)反應最終導致血纖蛋白的形成(圖1)。為了發(fā)生這一系列事件，TFVIIa復合物必須與磷脂表面結合，籍此裝配含有因子IX或X的凝血起始復合物(Ruf和Edgington，1991a；Ruf等，1992c；Paborsky等，1991；Bach等，1986；Krishnaswamy等，1992；tenCate等，1993)。
只有有限數(shù)目的細胞組成型表達TF。肺和中樞神經系統(tǒng)含有高水平的TF活性，在肺支氣管粘膜和肺泡上皮細胞以及神經系統(tǒng)的膠質細胞和星形膠質細胞中發(fā)現(xiàn)了TF。據(jù)報道，心肌細胞、腎小球、以及腸、膀胱和呼吸道的某些上皮或粘膜組織中也表達TF，因此可以看出，TF一般組成型表達于身體組織和外部環(huán)境之間的組織屏障處(Drake等，1989；Ruf和Edgington，1994)。
TF也存在于器官之間的組織邊界，如肝、脾和腎的器官被膜中，TF還存在于動脈和小靜脈外膜。以此方式表達TF使得TF可行使阻斷內部出血的作用，因此，有必要指出的是血友病患者中作為出血主要位點的關節(jié)和骨骼肌中缺乏TF。
正常條件下，在血細胞或形成血管系統(tǒng)的內皮細胞表面，TF一般沒有任何顯著程度的表達，而通過感染性因子可誘導血管系統(tǒng)內的(亞)內皮細胞和單核細胞表達TF，例如，單核細胞經細胞因子和T細胞誘導可表達TF。血管系統(tǒng)中TF的表達一般會導致彌散性血管內凝血或血液凝塊或血栓形成的局部起始。在此上下文中，值得注意的是組織受損、感染或遭到其它攻擊之后必需凝血的身體所有位點都必須能得到TF，因此，所有這種組織位點應能同等地得到TF，而一般不應積存在身體的任何特定局部區(qū)域。
某些研究已描述了TF和某些類型腫瘤中致瘤性表型發(fā)展之間的聯(lián)系(Ruf和Edgington，1994)。實際上，據(jù)報道，TF水平增加是惡性黑素瘤轉移潛力的一個預示性指征(Mueller等，1992)。據(jù)推論凝血級聯(lián)反應的普遍激活會損害血管系統(tǒng)，導致腫瘤細胞或腫瘤細胞衍生的小泡進入全身循環(huán)，使得這種腫瘤細胞根植下來，導致轉移性腫瘤過量生長。
不論基本機理如何，上述研究使Edgington及其同事建議在癌癥治療中使用針對TF的抗體(WO94/05328)，因此，這些作者認為對TF具有結合親和力的抗體在癌癥治療中有治療實用性，對認為有發(fā)展為轉移性腫瘤這種危險的患者尤其有用。這一意圖導致人們對能產生可與人TF反應的單克隆抗體的雜交瘤進行開發(fā)(美國專利5,223,427)。
除了在癌癥治療中的用途外，也建議在抑制過量凝血中使用抗TF抗體，所述抗體也可用于治療敗血癥性休克和減輕炎癥反應(Morrissey等，1988；美國專利5,223,427)，或用于治療心肌梗塞，其中抗體被用作TF拮抗劑(美國專利5,589,173)。美國專利5,589,173中特別公開了聯(lián)合使用抗TF抗體和其它溶栓劑以溶解堵塞的血栓。使用這種抗體的具體方法是在其中血液要從患者體內取出的諸如心肺旁路程序的外科手術過程中抑制體外循環(huán)過程中的凝血(美國專利5,437,864)。
下文將要更完整地陳述的是(B部分)已克隆出人TF并使用了一段時間(Morrissey等，1987；Edgington等，1991；美國專利5,110,730)。在某些早期研究中，統(tǒng)統(tǒng)被鑒定為人TF的相同蛋白質可能指的是人TF重鏈蛋白或TF重鏈。該基因編碼長度為295個氨基酸的多肽前體，該前體包含具有可選擇的裂解位點的肽前導序列，現(xiàn)在已知該前體可導致形成長度為263個氨基酸的蛋白質。據(jù)報道，人TF在CHO細胞中的重組表達可導致TF產生，據(jù)稱產生的水平為已報道的重組跨膜受體在哺乳動物細胞中產生的最高表達水平之一(Rehemtulla等，1991)。
已構建出僅含有TF的細胞表面或胞外域(Stone等，1995)、而缺乏其跨膜區(qū)和胞質區(qū)的重組形式TF。這種‘截短的’TF(tTF)長度為219個氨基酸，是一種可溶性蛋白質，相對于天然跨膜TF而言，它在適當磷脂膜環(huán)境中激活因子X的活性要低約105倍(Ruf等，1991b)。這一活性差異的原因在于當與帶負電的磷脂表面結合時，TFVIIa復合物能更有效地結合并激活因子IX和X(Ruf等，1991b；Paborsky等，1991)。
盡管tTF的凝血能力顯著受損，但當tTF通過一些其它方法與磷脂或膜環(huán)境結合或功能性結合時可促進血液凝血。例如，本文闡明使用將tTF與質膜抗原結合的雙特異性抗體可恢復有用的凝血活性。這使得一個發(fā)明人研制出了通過使用靶向構建體將tTF或其變體特異性傳遞至腫瘤血管或基質而在體內特異性地使腫瘤血管凝血的方法(WO96/01653)。靜脈內施用這種“凝血配體”會導致促凝劑定位于腫瘤中，在腫瘤血管中形成血栓，并最終導致腫瘤壞死。
使用例如雙特異性靶向抗體-tTF組合物將促凝劑聰明地靶向傳遞至腫瘤血管系統(tǒng)這種方法的開發(fā)可被看成是對傳統(tǒng)免疫毒素療法的改善。實際上，這種凝血配體治療在30分鐘之內即可誘導腫瘤血管中的血栓形成，而施用免疫毒素之后大約需6小時才可達到相同效果。另外，凝血配體療法沒有顯著的副作用。盡管靶向傳遞如tTF的促凝劑驚人地有效，但仍需要制備“靶向構建體”。
已報道對TF進行了目的非常不同的其它研究，以鑒定tTF不依賴于其與靶向試劑結合的用途。在此方面，tTF最近被認為是用于治療如血友病之類障礙的候選藥物。此項工作由在這種療法中使用apo-TF的嘗試發(fā)展起來。apo-TF是TF的去脂質化制劑，根據(jù)此分子可自發(fā)和優(yōu)先地將其自身摻入或結合至損害位點所暴露的膜表面的假說，建議將它灌注到血友病患者體內。因此，推斷apo-TF可能在這種療法中有用，而不會導致顯著副作用(O’Brien等，1988；美國專利5,017,556)。
建議在慢性出血障礙中使用apo-TF療法，所述障礙的特征在于遺傳性和后天性地趨向于出血。美國專利5,017,556中描述了諸如與因子VIII，IX或XI缺損相關的障礙；或與因子V，VIII，IX，XI，XII和XIII抑制劑的獲得相關的障礙。人們承認，特征在于基本上缺乏組織因子天然脂質并在施用前基本上不具有前促凝劑活性的apo-TF的使用，得到的結果與推斷會導致毒性的預期結果相反。目前看來美國專利5,017,556中描述的結果一般代表本領域中的異?，F(xiàn)象，這些研究與本領域其他研究人員的工作有沖突。
實際上，在將根據(jù)上述的研究投入實踐的嘗試中，觀察到實驗動物中出現(xiàn)了副作用，如彌散性血管間凝血(DIC)，由此得出結論靜脈內施用apo-TF太危險以致于不能使用(Sakai和Kisiel，1990；美國專利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。
人們并不認為可溶的截短形式TF的開發(fā)能解決與TF或apo-TF相關的問題，例如，現(xiàn)已不考慮將tTF作為TF的替代物，因為當用正常血漿檢測時，tTF幾乎沒有前促凝劑活性(Paborsky等，1991；美國專利5,374,617)。
因此，在本發(fā)明之前，tTF潛在的用途僅局限于使用例如抗體靶向傳遞tTF，當與恢復充足活性必需的其它輔助分子聯(lián)合使用時，tTF可能的用途被局限于治療有限數(shù)量的障礙(美國專利5,374,617)。在某些受限的環(huán)境中，已通過將tTF的使用與凝血因子因子VIIa的施用聯(lián)合起來而利用了第二種可能性。因子VIIa和tTF的聯(lián)合使用導致恢復了足以使此聯(lián)合用于治療出血障礙(如血友病)的凝血活性。然而，與WO96/01653中討論的如tTF的促凝劑的靶向傳遞形成對照的是，tTF和因子VIIa聯(lián)合療法未包括特異性靶向的概念，因此，該療法被建議僅用于治療凝血受損的患者(美國專利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。
最易于用這種受損凝血機制表示的患者組是血友病患者，包括血友病A和血友病B患者，和針對凝血因子的抗體滴度比較高的患者。另外，已建議將tTF和因子VIIa聯(lián)合療法用于治療具有嚴重創(chuàng)傷、手術后出血或甚至硬變的患者(美國專利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。在這些療法中，通過灌注全身性施用和局部施用都被推薦使用。因此，這些療法可以被看成是用兩種凝血類型的“因子”補加至體內以克服對凝血級聯(lián)反應中這些或其它相關分子的任何天然限制，從而阻斷特定位點的出血。
Roy等人也建議使用某些組織因子突變體治療心肌梗塞，特別是預防冠狀動脈的再堵塞(美國專利5,346,991)。照此，組織因子突變體是被用作“溶栓劑”，被描述為能裂解血纖蛋白-血小板血栓以使血液重新流過受影響血管的藥物。所述TF突變體被設計為能中和內源性TF的作用，它們在心肌梗塞療法中的用途是允許早期再灌注，防止重新堵塞，因而限制組織壞死。
再造上文所述天然環(huán)境的人工方法與天然過程有關，其中組織因子被描述為可在器官之間的邊界組成型存在以使其行使起始分子的功能，從而阻止出血。然而，當然需要在不會將凝血途徑的平衡傾斜為廣泛凝血的情況下達到這種對血友病患者的出血進行限制的目的，因為廣泛凝血對這種患者是有害的，它會抑制對有問題的特定組織或器官的氧供給。因此，tTF的廣泛循環(huán)和活性是不合乎需要的，實際上從上述研究中看，也不希望這種現(xiàn)象發(fā)生。
盡管tTF以前未顯示出具有任何優(yōu)先定位于給定位點的能力，并且已知相對于天然全長的組織因子而言，tTF的凝血能力大大減小，但本發(fā)明闡明了當給患有實體腫瘤的動物全身性施用tTF時，tTF會誘導腫瘤血液供給的特異性凝血，導致腫瘤退化。因此，本發(fā)明的各個方面均基于tTF能使腫瘤血管選擇性形成血栓這一發(fā)現(xiàn)。A1.凝血缺損的TF本發(fā)明人在使用tTF作為對照的抗體-促凝劑(“凝血配體”)腫瘤靶向研究過程中驚奇地發(fā)現(xiàn)tTF特異性地定位于腫瘤內足以導致抗腫瘤效應。由此最初的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人發(fā)展了本文公開的本發(fā)明的多個方面。因此，由第一次使用的最初的tTF發(fā)展了本發(fā)明可用的組織因子化合物或構建體，這樣，目前可使用多種TF構建體，包括很多不同形式的tTF，較長但仍缺損的TF，突變體TF，經修飾或綴合而改善了其半壽期的任何截短的、變異的或突變的TF，及其所有功能等價物。然而，應理解本發(fā)明可用的各個TF構建體由“凝血缺損”這一需求統(tǒng)一。如下文詳述，在設計候選的凝血缺損TF時，有多個結構上的考慮可被使用，可使用多種測定法進一步證實候選TF確實適用于本發(fā)明的治療方面。假如使用例如分子生物學產生多種化合物的技術是本領域技術人員熟知的常規(guī)技術，并且假如本文提供了深入的結構和功能指導，普通技術人員在本發(fā)明上下文中應易于制備和使用大量不同的凝血缺損TF。
如本文中詳述，多種TF中的任一種或多種也可以與其它藥劑聯(lián)合用于實體腫瘤和與前血栓形成性血管相關的其它疾病的有利治療。除了與如外科手術和放射療法這類標準療法聯(lián)合外，本發(fā)明的凝血方法也可與施用典型的化學治療藥物，其它免疫毒素或凝血配體聯(lián)合，或可與另外的凝血因子，如因子VIIa聯(lián)合。
假定本發(fā)明的聯(lián)合療法有望得到相加的、增強的甚或協(xié)同的抗腫瘤效應，本領域技術人員也易于意識到在本發(fā)明的上下文中仍然可使用在本文所述的體外和體內試驗中具有弱于最適之特性的TF構建體。例如，候選的凝血缺損TF構建體可具有針對本文推薦范圍的較低端的凝血活性，這種分子仍證實可與化學治療劑、凝血因子或其它抗癌劑聯(lián)合使用。同樣，在使用實驗動物的細致體內研究后及以低劑量開始的臨床研究中，被認為具有足以導致副作用顧慮的高凝血活性的候選凝血缺損TF構建體仍證實是有用的。因此，提供下列有關凝血缺損TF分子的指標僅是為了舉例，本領域技術人員易于理解不與本文提供的結構和數(shù)量指標精確吻合的TF分子在本發(fā)明上下文中仍具有顯著的治療實用性。盡管確定這一事實一般經常需要在動物體內進行試驗，但這種試驗對于本領域技術人員而言是常規(guī)的，僅需要給藥和監(jiān)測。A2.對凝血缺損TF結構上的考慮本領域技術人員易于理解可用于本發(fā)明的TF分子實質上不能夠是天然的TF。這是很顯然的，因為天然TF及其密切相關的變體對促進凝血特別有效。這樣，給動物或患者施用這類分子后，會導致廣泛凝血并會致死，因此，應避免使用完整的天然TF制劑。同樣，也不能相信通過操縱其物理環(huán)境而調節(jié)TF活性的嘗試在本發(fā)明的上下文中會特別富有成效。例如，應該避免使用O’Brien及其同事的apo-TF法(1988)，因為使用該方法預期會導致DIC。
本文提供的圖2是涉及天然TF分子域的指導性模型。本發(fā)明的目的是提供實質上不與質膜結合的TF分子。通常，截短分子是得到不與膜結合的經修飾的TF的最直接方法。下文將更詳細地描述這些類型的截短構建體，然而，分子的實際截短或縮短不是產生有效TF變體的唯一機制。例如，可在分子中正?？缭侥さ腃末端區(qū)域導入突變，以防止適當?shù)哪げ迦??？赏ㄟ^插入多個其它氨基酸，或將已存在的殘基進行突變來達到這種膜驅逐，因此，在此方面可考慮的修飾是可降低分子C末端部分疏水性而使此區(qū)域的熱動力學特性不再有利于膜插入的那些修飾。
在考慮對天然TF分子進行結構上的修飾時，本領域技術人員應能意識到需要保留分子中足以使所得TF變體能行使促進至少一些凝血功能的重要部分。一項重要考慮是TF分子應基本上保留其結合因子VII或因子VIIa的能力。參照圖2，可看出VII/VIIa結合區(qū)域一般是分子的中間部位，因此，本發(fā)明建議使用的所有TF變體應基本上保留這種區(qū)域。下文將更詳細地討論此結合區(qū)域的具體位置和突變體或單獨或與其它藥劑聯(lián)合的任選使用。
然而，估計天然TF N末端區(qū)域的某些序列部分并非必需，因此，可在此區(qū)域中導入突變，或可使用缺失突變體(N末端截短)作為本文使用的候選TF分子。根據(jù)這些指導，本領域技術人員會理解下列例舉的截短的、二聚體的、多聚體的和突變的TF構建體絕非限制性的，其它很多功能等同的分子也是易于制備和使用的。A3.例舉的凝血缺損TF構建體下列例舉的包括截短的、二聚體的、多聚體的和突變形式的組織因子組分可以以獨特的多肽存在，或者也可如下文所述與如免疫球蛋白之類的惰性載體綴合。i.截短的組織因子本文中，就TF所用的術語“截短的”指的是缺乏某些氨基酸序列的特定TF構建體，因此，術語“截短的”指的是長度較短的組織因子構建體，該術語將這些化合物與膜連接或結合降低了的其它組織因子構建體區(qū)分開。因此，盡管經修飾但基本上為全長的TF可能被認為是截短的TF的功能等價物(“功能上截短的”)，但本文所用術語“截短的”的典型含義是指除去了的氨基酸序列足以影響特性改變，從而使TF分子變成膜結合缺損型。
因此，截短的TF蛋白或多肽相對于天然組織因子而言，已從分子中除去足夠數(shù)量的跨膜氨基酸序列，從而不同于天然TF。在此上下文中的“足夠數(shù)量”是原本足以使TF分子進入膜，或者介導TF蛋白與膜功能性結合的跨膜氨基酸序列的量。因此，除去這種“足夠數(shù)量的跨膜跨越序列”產生了磷脂膜結合能力缺損的截短組織因子蛋白或多肽，從而使該蛋白質實質上是可溶性的蛋白質，其不與磷脂膜顯著結合，在標準的TF試驗中基本上不能將因子VII轉變?yōu)橐蜃覸IIa，但仍保留了所謂的催化活性，包括在因子VIIa的存在下激活因子X的活性。美國專利5,504,067特別地列入本文作為參考以進一步描述這種截短的組織因子蛋白。
下文將描述特定的截短組織因子構建體的制備。優(yōu)選用于本發(fā)明的組織因子一般缺乏蛋白質的跨膜和胞質區(qū)(SEQ ID NO12的氨基酸220-263)，然而，截短的TF分子不必局限于長度為219個氨基酸的分子，因此，也可使用長度約為210至約230個氨基酸的構建體，具體地說，構建體的長度可以是約210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229或約230個氨基酸。通常，應理解這一意圖是從截短的分子上實質上缺失約23個氨基酸的跨膜區(qū)，因此，在長度長于約218至222個氨基酸的截短TF構建體中，其后的重要序列部分一般由形成天然TF分子胞質區(qū)域的約21個氨基酸組成。在這一點上，截短的TF構建體的長度可以約為231，232，233，234，235，236，237，238，239，240或241個氨基酸。
在某些優(yōu)選的實施方案中，tTF可稱為成熟組織因子蛋白的胞外域，因此，在例舉的優(yōu)選實施方案中，tTF可具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，該序列含有成熟蛋白質(SEQ ID NO12)的殘基1-219。SEQ ID NO1可由例如SEQ ID NO10編碼。當然，SEQ ID NO1僅是tTF的一個例子，如本文所公開，衍生自核酸序列SEQ ID NO11或相關序列、具有所需的對因子VII或因子VIIa高親和結合特性并具有一般性降低的前凝血輔因子活性的任何組織因子蛋白都是有用的。ii.二聚體組織因子構建體以前已表明J82膀胱癌細胞表面上的天然組織因子可以以二聚體的形式存在(Fair等，1987)。一個因子VI I或因子VIIa分子與一個組織因子分子的結合也可能便于另一個因子VII或因子VIIa與另一個組織因子的結合(Fair等，1987；Bach等，1986)。另外，組織因子顯示出與細胞因子受體家族成員的結構同源性(Edgington等，1991)，一些所述受體可二聚體化而形成活性受體(Davies和Wlodawer，1995)。因此，估計本發(fā)明截短組織因子組分的二聚體可能是有用的。
因此，可以二聚體形式制備本文所述的任何截短的、突變的或凝血缺損的組織因子構建體或其等價物以用于本發(fā)明。本領域技術人員應知道，利用分子生物學和重組表達的標準技術可制備這種TF二聚體，其中兩個編碼區(qū)被制成讀框一致的形式，并由表達載體表達。同樣，也可使用多種化學綴合技術制備TF二聚體，綴合前可對單個TF單體進行衍生化。上述所有技術都是本領域技術人員熟知的。
如有必要，可通過生物學可釋放鍵，如可選擇性裂解的連接子或氨基酸序列連接組織因子二聚體或多聚體。例如，可使用肽連接子，該連接子包括優(yōu)先定位于腫瘤環(huán)境或在該環(huán)境中具有活性的酶的裂解位點。這種肽連接子的形式例如是可被尿激酶、纖溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金屬蛋白酶(如膠原酶，明膠酶或溶基質素)裂解的肽連接子。
在某些實施方案中，組織因子二聚體可另外含有受阻的疏水性膜插入部分，以在后來促進組織因子與磷脂膜的功能性結合，但僅在某些確定的條件下才會如此。如在截短組織因子的上下文中所述，疏水性膜結合序列一般是因其疏水特性而可促進與磷脂環(huán)境結合的一段氨基酸序列。同樣，也可使用脂肪酸提供潛在的膜插入部分。這種膜插入序列可位于TF分子的N末端或C末端，或連接在分子的任何其它位點，只要這種連接不會阻礙TF構建體的功能特性即可。受阻的插入部分的含義是它能維持無功能，直至TF構建體位于腫瘤環(huán)境內，并使得可以達到疏水性附著，甚至可進一步地促進與膜的物理結合。同樣，估計在這一點上生物學可釋放鍵和可選擇性裂解的序列也特別有用，所述鍵或序列僅在定位于腫瘤環(huán)境內并暴露于特定酶或其它生物活性分子才被裂解或修飾。
例如，發(fā)明人已構建了對應于C’-cys-tTF219二聚體(SEQ IDNO3的二聚體)，C’-cys-tTF220二聚體(SEQ ID NO6的二聚體)，C’-cys-tTF221二聚體(SEQ ID NO7的二聚體)，和H6-N’-cys-tTF219二聚體(SEQ ID NO2的二聚體)的二聚體tTF。然而，現(xiàn)在應懂得上述各個序列僅是舉例，而不以任何方式限制本發(fā)明可產生和使用的二聚體結構。iii.三聚體和多聚體組織因子構建體在其它實施方案中，本發(fā)明的tTF構建體可以是多聚體或聚合體。在此上下文中，“聚合體構建體”含有3或多個本發(fā)明的組織因子構建體。“多聚體或聚合體TF構建體”是含有第一個TF分子或衍生物與至少第二個和第三個TF分子或衍生物有效結合的構建體，優(yōu)選其中所得的多聚體或聚合體構建體與野生型TF相比仍是凝血活性缺損型。在優(yōu)選實施方案中，可用于本發(fā)明的多聚體和聚合體TF構建體是截短TF分子的多聚體或聚合體，它可任選地與其它凝血缺損的TF構建體或變體聯(lián)合。多聚體可含有約3至20個這種TF分子，優(yōu)選含有約3至約15或約10個，最優(yōu)選含有約3至約10個這種TF分子。一般，本發(fā)明包括至少約3，4，5，6，7，8，9或10個左右這種TF分子的TF多聚體。必要時，多聚體或聚合體中的各個TF單位也可通過選擇性裂解的肽連接子或其它生物學可釋放的鍵連接。同樣，與上文就TF二聚體論述的一樣，使用重組操作和表達或使用標準的合成化學可很容易制備構建體。iv.因子VII激活突變體在本發(fā)明上下文中有用的其它TF構建體是激活因子VII的能力缺損的突變體。這種突變體實用的基礎在于這樣一個事實，即它們也是“凝血缺損的”。本文中將這種“因子VII激活突變體”一般確定為可結合功能性因子VII/VIIa、蛋白水解性地激活因子X、但基本上不具有蛋白水解性地激活因子VII的能力的TF突變體。因此，這種構建體是缺乏因子VII激活活性的TF突變體。
這種因子VII激活突變體促進腫瘤特異性凝血的功能是基于TF構建體定位于腫瘤血管系統(tǒng)和血漿中低水平因子VIIa的存在。施用這種因子VII激活突變體后，該突變體與本發(fā)明的任何TF構建體一樣，一般會定位于血管化腫瘤的血管系統(tǒng)內。定位前，由于其不能將因子VII轉變?yōu)橐蜃覸IIa，因此TF突變體一般不能促進任何其它身體部位的凝血，然而，定位和積累于腫瘤區(qū)域內后，突變體會遇到足夠的血漿中的因子VIIa，從而起始外源性凝血途徑，導致腫瘤特異性血栓形成。
下文將更完整地描述，最優(yōu)選使用的因子VII激活突變體是與因子VIIa的共同施用相聯(lián)合。盡管如上文所述，這種突變體本身是有用的，但如果已知因子VIIa在血漿中僅以低水平存在(約1ng/ml，而血漿中的因子VII約為500ng/ml)，則突變體一般達不到最佳活性(美國專利5,374,617；5,504,064和5,504,067)。因此，共同施用外源性因子VIIa和因子VII激活突變體非常優(yōu)于僅施用突變體。若希望這些突變體幾乎沒有副作用，則它們與因子VIIa的同時、之前或之后施用的聯(lián)合使用是本發(fā)明特別有利的方面。
可結合本發(fā)明的任一方面制備和使用多種因子VII激活突變體的任一種或多種。大量科學知識揭示TF分子上存在因子VII/VIIa的識別位點，例如，可參照Ruf和Edgington(199la)，Ruf等(1992c)和WO 94/07515和WO94/28017的論文，上述各文獻都特別地列入本文作為參考以提供有關問題的指導。因此，可認為因子VII激活區(qū)域一般位于TF分子的約氨基酸157至約氨基酸167之間。然而，估計此區(qū)域外部的殘基也與因子VII激活活性相關，因此，可以考慮在一般位于TF序列的約氨基酸106和約氨基酸209之間的任何一個或多個殘基處導入突變(WO94/07515)。關于優(yōu)選的區(qū)域，一般可以考慮突變氨基酸147，152，154，156，157，158，159，160，16l，162，163，164，165，166和/或167中的任何一個或多個。至于此區(qū)域外一般優(yōu)選的候選突變，指的是下列氨基酸取代S16，T17，S39，T30，S32，D34，V67，L104，B105，T106，R131，R136，V145，V146，F(xiàn)147，V198，N199，R200和K201，也可以考慮氨基酸A34，E34和R34(WO94/28017)。
如上所述，當指的是SEQ ID NO12時，優(yōu)選通過改變一般位于氨基酸序列內約第157位至約第167位的區(qū)域中的一個或多個氨基酸使組織因子激活因子VII的能力缺損。例舉的突變體是第158位Trp變成Arg(SEQ ID NO8)；第162位Ser變成Ala；第164位Gly變成Ala(SEQ ID NO9)的突變體；和其中第158位Trp變成Arg和第162位Ser變成Ala的雙突變體。當然這只是例舉的突變，可以預想具有改變的氨基酸組成、具有所需的結合因子VII/VIIa的特性，但不激活凝血級聯(lián)反應的任何組織因子突變體在本發(fā)明上下文中都是有用的。A4.凝血缺損的體外定量評估本發(fā)明的組織因子構建體，不論是截短的、突變的、截短并突變的、二聚體的、多聚體的、與惰性載體綴合以增加其半壽期的，還是上述情況的任何組合，它們與天然野生型組織因子相比都是凝血缺損的。本文所用術語“凝血缺損”指的是TF構建體促進凝血的能力受損，這樣它們施用于動物或人患者的全身性循環(huán)就不會導致顯著的副作用或限制的毒性。簡單地通過在實驗動物中進行試驗，即可容易地分析TF構建體以確定它是否符合該定義。然而，下面提供詳細的指導，以幫助本領域技術人員在預先鑒定和選擇適當?shù)暮蜻x凝血缺損TF構建體時，能夠有效并便宜地進行任何實驗動物研究。
在定量方面，凝血缺損的TF比全長的天然TF活性要低100倍或更多，即當在適當磷脂環(huán)境中檢測時，它們比全長的天然TF誘導血漿凝血的能力低100倍或更多。
更優(yōu)選地，在適當磷脂環(huán)境中，缺損的TF誘導血漿凝血的能力要比全長的野生型TF低1000倍或更多；甚至更優(yōu)選在這種環(huán)境中，TF誘導血漿凝血的能力要比全長的野生型TF低10,000倍或更多；最優(yōu)選在適當磷脂環(huán)境中，缺損的TF誘導血漿凝血的能力要比全長的天然TF低100,000倍或更多。應理解“100,000倍”一般對應于本發(fā)明優(yōu)選的構建體之一，即長度為219個氨基酸的截短組織因子(SEQ ID NO1)。
“誘導血漿凝血的能力低X倍或更多”這一定義的內在含義是研究對象TF仍能夠誘導血漿凝血這一概念。顯然，經修飾后完全不能誘導凝血的TF一般在本發(fā)明的上下文中是無用的。在受控的磷脂試驗中比野生型TF活性低約500,000倍的TF估計仍然可用于本發(fā)明。類似地，在適當磷脂環(huán)境中，誘導血漿凝血的能力比全長的天然TF低約500,000倍至約1,000,000倍的所有TF變體和突變體預計在某些實施方案中仍然有用。然而，一般認為活性受損1,000,000倍(106)一般大致是本發(fā)明可考慮使用的最低活性。另外，會發(fā)現(xiàn)活性為所述范圍的較低端的TF構建體在某些確定的治療方案或聯(lián)合療法中可能最具實用性。本領域普通技術人員易于確定具體選擇哪種TF變體和治療策略。
盡管各個TF成分有某些優(yōu)選的和/或最適的用途和聯(lián)合，但本發(fā)明中可使用的凝血缺損TF一般比野生型TF活性低約100倍至約1,000,000倍；更優(yōu)選低約1,000倍至約100,000倍；并可歸類為活性低至所述范圍中的任何數(shù)目，包括低約10,000倍。范圍自身也可在約1,000倍至1,000,000倍，或約10,000倍和500,000倍或等等之間變化。
在定量檢測候選凝血缺損組織因子時可使用大量體外血漿凝血活性試驗中的任一種或多種，例如，測定固有的血漿凝血活性的一種方法如下所述1)約37℃下，在塑料管中加入約50μl血漿(人或小鼠)；2)37℃下，加入溶于適當緩沖液(如無鈣磷酸鹽或HEPES緩沖鹽水，pH7.4)中一定濃度范圍的約50μl重新脂質化的全長TF(優(yōu)選商購，如American Diagnostics Inc.，Greenwich，CT)，向其它管中加入溶于相同緩沖液中一定濃度范圍的組織因子候選的截短或突變形式；3)約37℃下，加入約50μl 30mM CaCl2；4)紀錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間；和5)繪制全長TF濃度(mol/l)對凝血時間的標準曲線，繪制候選的突變體TF濃度(mol/l)對凝血時間的曲線。通過比較達到約等于凝血時間最大降低值一半的凝血時間各自需要的濃度，計算全長TF和“受試TF”之間活性的差異。在摩爾數(shù)水平上，“受試”的突變體TF誘導血漿凝血的活性應比全長TF低100倍以上。
可進行多種類型的此類試驗，這一點對本領域技術人員而言是不言而喻的。例如，可依據(jù)組織因子和候選組織因子構建體與細胞膜或磷脂表面的結合進行這些試驗，這種結合是利用抗體或其它配體達到的。在這種試驗中，當候選或受試的截短TF或TF突變體利用抗體或其它配體與細胞膜或磷脂表面結合時，其誘導血漿凝血的活性應比野生型TF低100倍以上。由于組織因子突變體不能使因子VII有效轉變?yōu)橐蜃覸IIa，因此必需在血漿中加入因子VIIa以得到此活性水平。在例舉的試驗中，可使用下列方法測定這種活性1)在大約室溫下，將處于如磷酸緩沖鹽水的緩沖液中的細胞，如A20小鼠淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)(如4×106個細胞/ml，50μl)與結合促進劑一起保溫約1小時，所述促進劑如雙特異性抗體(50μg/ml，25μl)，對A20細胞而言，該促進劑由與抗體(例如針對TF上非抑制性表位的10H10抗體)的Fab’臂連接的抗體(例如針對I-Ad的B21-2抗體)的Fab’臂組成；2)制備相同的一套試管，管中含有細胞，但不含雙特異性抗體或其它結合劑；3)室溫下有效地洗滌細胞(如洗兩次)，將細胞重新懸浮于約50μl磷酸鹽緩沖鹽水中；4)約室溫下，加入不同濃度溶于磷酸鹽緩沖鹽水中的候選TF突變體(約50μl)。雙特異性抗體或其它結合劑捕獲TF突變體，并將TF突變體帶到離細胞表面很近的地方。當需要確定因子VIIa存在下的活性時，除了加入TF突變體外，還應加入因子VIIa(1-10nM)。用磷酸鹽緩沖鹽水將每管總體積調節(jié)至約150μl。將各管置于約室溫下保溫約1小時；5)將細胞升溫至約37℃；6)約37℃下，加入氯化鈣(約50mM，50μl)和檸檬酸鹽化的小鼠或人血漿(約50μl)；7)記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間；和8)針對包被或未包被結合劑(如雙特異性抗體)的細胞，將凝血時間(秒)對TF突變體的濃度(mol/l)作圖。計算出約等于凝血時間最大降低值一半的凝血時間(通常為50-100秒)的TF突變體濃度，計算由雙特異性抗體所致的凝血活性的增強，應超過100倍。
可以想象，使用類似于上述的試驗可檢測本發(fā)明制備的候選TF組分以證實它們的功能性得到了維持，而它們促進凝血的能力受損，活性受損必需水平是至少約100倍，優(yōu)選約為1,000倍，更優(yōu)選約為10,000倍，最優(yōu)選約為100,000倍。
在期望其它藥劑最終與候選的凝血缺損TF聯(lián)合使用的實施方案中，重要的是其它因子或藥劑應包括在體外試驗中。特別相關的例子是分析因子VII激活突變體，優(yōu)選應與加入因子VIIa相結合分析該突變體，然而，因子VIIa并非可以此方法檢測的唯一添加組分。通常，其它藥劑可稱為“其它候選藥劑”。為了鑒定其它候選藥劑，或使本發(fā)明所用候選藥劑的優(yōu)選用量最優(yōu)化，應平行進行上述試驗，即先在缺乏其它候選藥劑的情況下測定或確定凝血，然后在組合物中加入候選物質，重新測定凝血時間和/或程度。與TF突變體或變體聯(lián)合起作用會導致整個凝血水平比用天然TF觀察到的約低100倍至1,000,000倍的其它候選物質也是可用于本發(fā)明上下文中的適當聯(lián)合。
本領域技術人員應理解上述每種體外試驗及其各種變化形式中的每一個都較容易建立和進行。以此方式，可檢測一系列候選TF變體以及TF與其它藥劑的聯(lián)合，選擇最理想的候選藥劑供進一步研究，特別是在動物或人試驗中進行實驗性檢測。
盡管我們相信上述試驗對本發(fā)明特別有用，但預計本文可使用的體外試驗并不局限于這類試驗，因此，可進行所需要的任何類型的凝血或前凝血試驗。例如，為了進一步詳細了解tTF和前凝血試驗，熟練技術人員可參照美國專利5,437,864；5,223,427和5,110,730和PCT公開號WO94/28017；WO94/05328和WO94/07515，所述文獻都特別地列入本文作為參考以進一步補充本發(fā)明有關試驗的內容。A5.證實性的體內研究本領域技術人員應理解，在用于人受試者之前，一般應在體內環(huán)境中檢測候選的凝血缺損組織因子突變體、變體或它們與其它藥劑的聯(lián)合。這種在動物中進行的臨床前檢測是本領域的常規(guī)技術。為了進行這種證實性試驗，所需要的只是為本技術領域所接受的患有所述疾病的動物模型，如攜有實體腫瘤的動物。在此方面，可使用任何動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、狗、黑猩猩等。在癌癥治療方面，使用小動物(如小鼠)的研究被廣泛接受用來預測在人體中的臨床效力，因此在本發(fā)明上下文中優(yōu)選這種動物模型，因為至少與其它實驗動物相比，它們更易于得到，且相對較便宜。
進行實驗動物試驗的方法是本領域技術人員熟知的，進行這種試驗所需要的只是建立等同的治療組，給一個組施用受試化合物，而在其余組中對等同的動物平行進行多種對照研究。在研究過程中監(jiān)測動物，最終處死動物以分析治療效果。
本發(fā)明最有用的特征之一是可用于治療血管化腫瘤，因此，可進行抗腫瘤研究以測定腫瘤血管系統(tǒng)內的特異性血栓形成和整體抗腫瘤效果。作為此項研究的一部分，也應監(jiān)測效果的特異性，包括其它血管和組織中的凝血情況，還應仔細監(jiān)測動物的一般健康狀況。
在實體腫瘤的治療中，預計有效的TF構建體和構建體的有效量是一般會導致血管化腫瘤內至少約10％血管表現(xiàn)出血栓形成，而非腫瘤血管無顯著血栓形成的那些構建體和用量；優(yōu)選在實體腫瘤塊內觀察到至少約20％、約30％、約40％、或約50％血管中有血栓形成，而沒有顯著的非定位的血栓形成。在治療大腫瘤時，本發(fā)明人常規(guī)觀察到了這種陽性結果。實際上，已分析的一些腫瘤中至少約60％，約70％，約80％，約85％，約90％，約95％或甚至達到并包括約99％腫瘤血管形成血栓。當然，表現(xiàn)出血栓形成的血管越多，這種療法就越優(yōu)選，只要對腫瘤相關的血管系統(tǒng)保持特異性、相對特異性或優(yōu)先的效果，并且其它組織中的凝血不會明顯到足以導致顯著傷害動物的程度即可。
誘導腫瘤血管內的血栓形成之后，周圍腫瘤組織變得壞死，因此，也可根據(jù)特異性誘導的腫瘤壞死的范圍來評估本發(fā)明構建體或其劑量的成功使用。另外，可相對于身體所有其它部位健康組織的維持來評估腫瘤內細胞死亡的范圍。根據(jù)本發(fā)明，當其施用會導致至少約10％腫瘤組織壞死(10％壞死)時，TF藥劑、聯(lián)合或最適劑量就具有治療實用性。另外，優(yōu)選在腫瘤區(qū)域內引起至少約20％，約30％，約40％或約50％壞死，而不產生顯著的不利副作用。本發(fā)明人再次觀察到了這種有利的效果。當然，優(yōu)選使用能誘導至少約60％，約70％，約80％，約85％，約90％，約95％或甚至達到并包括約99％腫瘤壞死的構建體和劑量，只要所用構建體和劑量不會在動物中導致顯著的副作用或其它不良反應即可。
本領域技術人員易于進行和適當評估上述所有測定，例如，護理專家和醫(yī)生可利用得自實驗動物的這些數(shù)據(jù)以使用于治療人的適當劑量最優(yōu)化。在患有晚期疾病的受試者中，可以允許存在某種程度的副作用。然而，可用更適度的劑量治療早期疾病患者以得到無副作用的顯著治療效果。在這種實驗動物研究中觀察到的效果應優(yōu)選在統(tǒng)計學上顯著于對照水平，并且在不同研究中可以重復。
本領域技術人員應進一步理解，在上述有效范圍的較低值端導致腫瘤特異性血栓形成和壞死的TF構建體、聯(lián)合和劑量仍可以用于本發(fā)明。例如，在期望連續(xù)施用活性藥劑的實施方案中，使用僅導致約10％血栓形成和/或壞死的最初劑量構建體仍是有用的，這特別是因為經常觀察到這種最初的減少會“引發(fā)”腫瘤在后續(xù)的再次治療中遭受進一步的破壞性攻擊。在任何情況下，即使最終不能達到高達約40％左右的腫瘤抑制(總目標)，仍應理解對血栓形成和壞死的任何誘導仍然是有用的，因為它代表著患者狀況比治療前更有改善。
正如上文就體外檢測系統(tǒng)討論的那樣，一般應理解欲一起使用的藥劑聯(lián)合應一起受檢測并最優(yōu)化。例如，本發(fā)明的因子VIIa激活突變體就屬于這種類型，一般應與同時、之前或隨后施用的外源性因子VIIa結合起來進行檢測。類似地，可與一種或多種化學治療藥物、免疫毒素、凝血配體等等聯(lián)合起來直接分析本發(fā)明的各個TF構建體?？筛鶕?jù)上述指導確定和評估這些藥劑的聯(lián)合效果。A6.生物學功能等價物如上文所討論，可用于本發(fā)明的tTF組分是促進凝血的活性比野生型TF一般低至少100倍的tTF。在其它實施方案中，tTF促進凝血的活性比野生型TF低至少1000倍，在又一些實施方案中，tTF促進凝血的活性比野生型TF低至少10,000倍或甚至100,000倍，比野生型TF活性約低106倍左右是所需的最低活性。
例舉的TF是缺乏跨膜和胞質區(qū)(氨基酸220-263)的TF，本發(fā)明的一例tTF由SEQ ID NO1給出，它含有野生型組織因子(SEQ IDNO12)的氨基酸1-219。當然這只是tTF的一個例子，其它tTF構建體也是可以的，例如，含有SEQ ID NO12的氨基酸1-220；2-219，3-219或致使該分子缺乏野生型組織因子跨膜域和/或胞質域(否則即成為功能差不多的分子)的任何其它截短形式的構建體。如上文詳述，突變體也是可以的。
使用上文提供的詳細指導，可制備其它的TF等價物。可對TF的結構作修飾和改變，仍能得到具有類似或所需特性的分子。例如，某些氨基酸可取代蛋白質結構中的其它氨基酸，而在相互作用的結合能力(例如與因子VIIa的結合)方面沒有明顯損失。由于蛋白質相互作用的能力和特性確定了蛋白質的生物學功能活性，因此可在蛋白質序列(當然也可以是更為基本的DNA序列)中進行某些氨基酸序列取代，從而得到具有類似(激動劑)特性的蛋白質。因此，預計可在TF(SEQ ID NO12)蛋白質和肽(或更為基本的DNA序列，SEQ IDN011)序列中進行多種改變，而不會使其生物學實用性或活性明顯損失。
本領域技術人員也深入領會到，生物學功能等同的蛋白質或肽這一定義的內在含義是在分子確定部分內可作的、仍導致分子具有可接受水平的等同生物活性的改變數(shù)目存在限制。因此，本文將生物學功能等同的肽定義為其中某些，不是大多數(shù)或所有氨基酸可被取代的肽。當然，根據(jù)本發(fā)明可很容易制備和使用具有不同取代的多種不同的蛋白質/肽。
氨基酸取代一般基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等等。對氨基酸側鏈取代基大小、形狀和類型的分析揭示出精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶正電的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有大體上相似的形狀。因此，根據(jù)這些考慮，本文將精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸確定為生物學功能等價物。
在進行更多的量變時，可考慮氨基酸的水療指數(shù)。根據(jù)其疏水性和帶電特性確定了各個氨基酸的水療指數(shù)(hydropathicindex)，即異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領域技術人員一般都懂得氨基酸水療指數(shù)在賦予蛋白質相互作用性生物學功能方面的重要性(Kyte和Doolittle，1982，列入本文作為參考)。已知某些氨基酸可取代具有類似水療指數(shù)或評分的其它氨基酸，而仍保留了類似的生物活性。在根據(jù)水療指數(shù)進行改變時，優(yōu)選水療指數(shù)為±2之間的氨基酸的取代，特別優(yōu)選水療指數(shù)為±1之間的氨基酸的取代，甚至更特別優(yōu)選水療指數(shù)為±0.5之間的氨基酸的取代。
因此，應理解可用氨基酸取代具有類似親水性值的另一種氨基酸，而仍得到生物學等價蛋白質。如美國專利4,554,101(列入本文作為參考)所述，已為氨基酸殘基指定了下列親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。
在根據(jù)親水性值進行改變時，優(yōu)選親水性值為±2之間的氨基酸的取代，特別優(yōu)選親水性值為±1之間的氨基酸的取代，甚至更特別優(yōu)選親水性值為±0.5之間的氨基酸的取代。B.組織因子多核苷酸B1.DNA區(qū)段編碼本發(fā)明TF的多核苷酸可編碼完整的TF蛋白，只要它是符合本文所述的詳細指導的凝血缺損型、功能性TF蛋白域，或任何TF多肽、突變體或變體即可。無論需要制備的是截短的TF，突變的TF還是截短和突變的TF，基本有用的DNA區(qū)段和基因一般是相同的。當可得到完整TF分子的人DNA時，如果想對人進行臨床治療，一般優(yōu)選使用這種人構建體。然而，也不排斥使用其它TF基因，只要所產生的蛋白質在施用于人患者時不會產生顯著的免疫反應或其它不利反應即可。美國專利5,110,730中所述的方法和組合物特別地列入本文作為參考，以進一步補充申請人涉及本文可用基因和DNA區(qū)段的內容。
多核苷酸可衍生自基因組DNA，即直接由特定生物體的基因組克隆。然而，在其它實施方案中，多核苷酸也可以是互補的DNA(cDNA)。cDNA是使用信使RNA(mRNA)為模板制備的DNA，因此，cDNA不含有任何間斷的編碼序列，通常幾乎只含有相應蛋白質的編碼區(qū)。在其它實施方案中，可合成產生多核苷酸。正如本領域技術人員所知，一般優(yōu)選在重組表達中使用cDNA構建體，只要這種構建體比較易于操作和使用即可。然而，也不排斥使用長達和包括全長序列的較長基因組克隆。
盡管本發(fā)明令人驚奇的特征是TF構建體能優(yōu)先和特異性地定位于實體腫瘤的血管系統(tǒng)中，并在其中誘導特異性的抗腫瘤效應，但預計也可使用表達TF產物的重組載體將TF蛋白和多肽傳遞至腫瘤環(huán)境。參照涉及適當構建體和方案的某些科學文獻，可很容易實踐這種針對癌癥治療的“基因療法”。例如，可以使用病毒載體，如逆轉錄病毒載體，單純皰疹病毒，HSV(美國專利5,288,641)，巨細胞病毒，腺相關病毒，AAV(美國專利5,139,941)，和/或腺病毒載體。
SEQ ID NO11中給出了TF的人基因組DNA序列，其相應的氨基酸序列示于SEQ ID NO12中。如需要表達因子VII，SEQ ID NO13和SEQ ID NO14中分別提供了其DNA和氨基酸序列。
估計存在序列不同于本文所公開序列的TF天然變體，因此，本發(fā)明不局限于使用所提供的TF的多核苷酸序列，相反，還包括使用任何天然變體。本發(fā)明也包含應用上文所述的結構上和量化功能上的考慮之后精心設計的這些序列經化學合成的突變體。
另一種類型的序列變體由密碼子變異產生。由于20種正常氨基酸中的大多數(shù)具有幾個密碼子，很多不同的DNA可編碼TF。參照表I可鑒定這種變體。表I氨基酸密碼子丙氨酸 Ala A GCA GCC GCG GCU半胱氨酸Cys C UGC UGU天冬氨酸Asp D GAC GAU谷氨酸 Glu E GAA GAG苯丙氨酸Phe F UUC UUU甘氨酸 Gly G GGA GGC GGG GGU組氨酸 His H CAC CAU異亮氨酸Ile I AUA AUC AUU賴氨酸 Lys K AAA AAG亮氨酸 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸Met M AUG天冬酰胺Asn N AAC AAU脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU谷氨酰胺Gln Q CAA CAG精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU纈氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU色氨酸 Trp W UGG酪氨酸 Tyr Y UAC UAUB2.誘變位點特異性誘變是一項有用技術，可通過特異性誘變基本的DNA而用于制備各個肽，或生物學功能等同的蛋白質或肽。通過將一個或多個核苷酸序列變化導DNA，本技術還能夠很容易地用于制備和檢測體現(xiàn)了一個或多個上述考慮的序列變體。位點特異性誘變可通過使用編碼所需突變之DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足夠數(shù)目的鄰接核苷酸以提供大小和序列復雜度足以在被跨越的缺失接合處兩側形成穩(wěn)定雙鏈體的引物序列，從而產生突變體。一般優(yōu)選長度約為17至25個核苷酸的引物，其中待改變序列的接合處兩側約有5至10個殘基。
本領域技術人員熟知位點特異性誘變技術，應理解該技術一般利用既以單鏈又以雙鏈形式存在的噬菌體載體。對位點特異性誘變有用的典型載體包括如M13噬菌體的載體。這些噬菌體載體可以商購，本領域技術人員一般熟知它們的用法。雙鏈質粒也是位點特異性誘變中常規(guī)使用的，它省略了將所需基因從噬菌體轉移至質粒這一步驟。
通常，通過首先得到單鏈載體，或使雙鏈載體的兩條鏈解鏈來進行位點特異性誘變，其中載體的序列中包括編碼所需蛋白質的DNA序列。合成制備攜有所需突變序列的寡核苷酸引物，然后將此引物與單鏈DNA制品退火，使用如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段之類的DNA聚合酶處理以完成攜有突變的鏈的合成，因此，形成了異源雙鏈體，其中一條鏈編碼原始的未突變的序列，第二條鏈攜有所需的突變。然后使用這種異源雙鏈體載體轉化適當?shù)募毎绱竽c桿菌細胞，并選擇包括攜有突變序列排列之重組載體的克隆。
使用位點特異性誘變制備選定基因的序列變體不失為產生潛在有用類型變體的一種方式，但這并不意味著局限于此，因為還可通過其它途徑得到基因的序列變體。例如，可用如羥基胺之類的誘變劑處理編碼所需基因的重組載體，以得到序列變體。適當?shù)募夹g也描述于美國專利4,888,286(列入本文作為參考)中。
盡管上述方法適用于誘變，但目前一般優(yōu)選使用聚合酶鏈反應(PCRTM)，此項技術提供了快速、有效地將所需突變導入給定DNA序列中的方法。下文具體描述了如何使用PCRTM將點突變導入序列中，這可以用于改變由給定序列編碼的氨基酸。此方法經改動也適于將限制性酶位點導入DNA分子。
在此方法中，可將合成的寡核苷酸設計成能在擴增區(qū)段的一個末端摻入點突變。PCRTM之后，通過用Klenow片段處理使擴增片段成為平端，然后連接平端片段并亞克隆至載體中以便于序列分析。
為了制備需要誘變的模板DNA，可使用預突變區(qū)域側翼的限制性位點將DNA亞克隆至高拷貝數(shù)的載體，如pUC19中，然后使用質粒微量制備法制備模板DNA。使用自動合成儀合成適當?shù)墓押塑账嵋?，該引物基于母序列，但含有所需的點突變，其5’末端側翼是限制性酶位點。一般要求引物與模板DNA有15個堿基左右是同源的?？赏ㄟ^變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化引物，但用于PCRTM中時，并不絕對需要這么做。然后，應使寡核苷酸的5’末端磷酸化。
應使用含有所需點突變的寡核苷酸引物，通過PCRTM擴增模板DNA。擴增緩沖液中的MgCl2濃度一般約為15mM，一般應按下述進行約20-25輪PCRTM循環(huán)95℃變性35秒；50℃雜交2分鐘；72℃延伸2分鐘。PCRTM一般包括于72℃，最后一次延伸循環(huán)約10分鐘。最后的延伸步驟之后，應在反應混合物中加入約5個單位的Klenow片段，于約30℃再保溫15分鐘。需要有Klenow片段的外切核酸酶活性，以使末端成為平端并適于平端克隆。
一般通過非變性的瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分析所得的反應混合物，以證實擴增已產生預定的產物。通過除去大多數(shù)礦物油，用氯仿抽提以除去殘留的油，用經緩沖的苯酚抽提，然后用100％乙醇沉淀濃縮來處理反應混合物。接著，用在寡核苷酸所用側翼序列處能夠切割的限制性酶消化約一半的擴增片段，在低融點瓊脂糖凝膠上純化經消化的片段。
為了亞克隆片段和檢查點突變，可通過平端連接將兩種擴增片段亞克隆至經適當消化的載體中。然后用于轉化大腸桿菌，隨后使用微量制備法從中制備質粒DNA，通過DNA測序分析質粒DNA中的擴增部分以證實產生了正確的點突變，這一點是至關重要的，因為Taq DNA聚合酶也可將額外的突變導入DNA片段中。
使用連續(xù)的PCRTM步驟也可實現(xiàn)點突變的導入。在此方案中，使包含突變的兩種片段互相退火，并通過相互引發(fā)的合成而延伸。然后通過第二個PCRTM步驟擴增此片段，從而避免上述方案中需要的平端連接。在此方法中，如上所述進行模板DNA的制備、寡核苷酸引物的產生和第一次PCRTM擴增。然而，在此方法中，選定的寡核苷酸與模板DNA應有約15至20個堿基的一段序列是同源的，它們互相之間也必須重疊約10個堿基或更多個堿基。
在第二次PCRTM擴增中，可使用各個擴增片段和各個側翼序列引物，并使用上述條件進行約20至25輪PCRTM循環(huán)?？墒褂蒙鲜霾襟E再次亞克隆片段并檢查點突變是否正確。
在使用上述任一方法時，一般優(yōu)選通過擴增盡可能小的片段來導入突變。當然，也應仔細考慮如寡核苷酸的解鏈溫度這樣的參數(shù)，該參數(shù)一般受寡核苷酸的GC含量和長度的影響。本領域技術人員熟知這些方法的實施及其最優(yōu)化(必要時)，有關內容進一步描述于多種出版物中，如分子生物學最新方法，1995(列入本文作為參考)。
B3.表達構建體和蛋白質的產生貫穿本申請的術語“表達構建體”包括含有可編碼基因產物的核酸的任何類型基因構建體，其內部分或全部核酸編碼序列能被轉錄。轉錄物一般被翻譯成蛋白質，因此，表達優(yōu)選包括TF基因的轉錄和TF mRNA翻譯成TF蛋白質產物。
目前，蛋白質生產領域的技術人員經常使用的技術是得到所謂“重組”形式的蛋白質，在重組細胞中表達該蛋白質和從所述細胞中得到蛋白質。此技術基于從DNA文庫中“克隆”編碼蛋白質的DNA分子，即得到不同于DNA其它部分的特定DNA分子。通過例如克隆cDNA分子，或克隆基因組類DNA分子可做到這一點。諸如此類的技術適于產生本發(fā)明的特定TF組分。下文和美國專利5,298,599(列入本文作為參考)中進一步詳細討論了重組的融合蛋白，以進一步闡明融合蛋白的生產和使用。
為了表達TF，一旦得到適當?shù)?必要時為全長的)克隆，不論該克隆是基于cDNA還是基于基因組，都可開始制備重組生產TF所用的表達系統(tǒng)?？赏ㄟ^重組表達領域的技術人員普遍熟知的技術進行DNA區(qū)段的改造，以在原核或真核系統(tǒng)中表達。相信實際上任何表達系統(tǒng)都可用于表達這些蛋白質。
如Rehemtulla等人(1991)所述，可在真核表達系統(tǒng)，如CHO細胞中成功表達這種蛋白質，然而，可以想象如大腸桿菌pQE-60之類的細菌表達系統(tǒng)對大規(guī)模制備和隨后純化蛋白質或肽特別有用。可在細菌系統(tǒng)中表達編碼TF的cDNA，其中編碼的蛋白質被表達成與β-半乳糖苷酶、遍在蛋白、Schistosoma japonicum谷胱甘肽S-轉移酶等的融合蛋白。人們相信，在易于使用和所得物質的量方面，細菌表達優(yōu)于真核表達。美國專利5,298,599和5,346,991的技術也列入本文作為參考以進一步補充本文公開的可溶性組織因子的生產方法，其中美國專利5,346,99l特別地摻入以進一步補充有關組織因子突變體和變體的產生和生產方面的內容。
為了使構建體能夠表達TF轉錄物，編碼TF多核苷酸的多核苷酸應處于啟動子的轉錄控制之下。“啟動子”指的是可被宿主細胞的合成機制、或導入的合成機制識別的DNA序列，其對于啟動基因的特異性轉錄是必需的。短語“處于轉錄控制之下”指的是啟動子相對于多核苷酸而言處于正確的位置以控制RNA聚合酶起始和多核苷酸的表達。本文所用術語啟動子指的是在RNA聚合酶II的起始位點周圍成簇的一組轉錄控制組件。
有關微生物表達，美國專利5,583,013；5,221,619；4,785,420；4,704,362；和4,366,246被列入本文作為參考，以在本申請公開內容中進一步補充在重組宿主細胞中表達基因的有關內容。
B4.純化組織因子和相關組分一旦肽已被表達，可使用本領域技術人員熟知的蛋白質純化技術分離和純化之。如下文所述，這種組分可單獨使用或與抗體，化學治療劑和作為治療劑的效應物配體聯(lián)合使用以治療腫瘤。本發(fā)明例舉的肽示于SEQ ID NO1-SEQ ID NO9，當然，應理解這只是舉例，這些序列的任何突變、改變或天然變體都可以用于本發(fā)明。
本領域技術人員熟知蛋白質純化技術，這些技術包括細胞環(huán)境的分級分離以將所需蛋白質與混合物的其它組分分開。特別適于制備純肽的分析方法是離子交換層析，排阻層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦等等。特別有效的純化肽的方法是快速蛋白質液相層析或甚至是HPLC。
本領域技術人員熟知適用于蛋白質純化的多種其它技術，這些技術包括例如用硫酸銨、PEG、抗體等或通過熱變性沉淀，接著離心；進行層析，如離子交換層析，凝膠過濾層析，反相層析，羥基磷灰石層析和親和層析；等電聚焦；凝膠電泳；和這些和其它技術的聯(lián)合。正如本領域技術人員一般知道的那樣，相信進行多種純化步驟的次序可以改變，或某些步驟可省略，而仍可成為制備基本上純化了的蛋白質或肽的合適方法。
如本文詳述，純化經表達的TF構建體以用于本發(fā)明的一般優(yōu)選的技術包括產生含有親和純化標記物的TF分子，和使用親和分離基質以得到與大多數(shù)或所有污染類分開的TF構建體。本領域技術人員熟知很多這種融合蛋白標記物，并且這種表達和分離方案易于實施。使用釋放的蛋白質或多肽之前，也可以使用裂解原始親和標記物的技術，通過在親和標記物和所需蛋白質之間插入對蛋白酶敏感的連接子即可實施這項技術。這種方法學實際上可用于本發(fā)明的各個方面，美國專利5,298,599也在此方面作出說明。然而，已知很多這種標記物不會損害已表達蛋白質行使其生物學功能的能力，本發(fā)明使用TF構建體之前不必要除去標記物。C.藥物組合物和試劑盒本發(fā)明的藥物組合物一般含有溶解于或分散于藥理學可接受載體或含水介質中的有效量的tTF。
短語“制藥學或藥理學上可接受的”指的是當施用于動物或人(適當時)時，不會產生有害的、變應性的或其它不良反應的分子實體和組合物。本文所用的“制藥學上可接受的載體”包括任何和所有溶劑，分散介質，包被劑，抗細菌和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑等等。本領域技術人員熟知這類介質和試劑對藥物活性物質的應用。在此范圍內，除了活性成分與任何常規(guī)介質或試劑不相容，否則，預計它們能用于治療組合物中。補加的活性成分也可摻入組合物中。
C1.非腸道制劑本發(fā)明的tTF經常被配制成供非腸道給藥，如配制成供靜脈內、肌內、皮下注射或其它這種途徑，包括直接滴注至腫瘤或疾病位點。本領域技術人員參照本發(fā)明所公開的內容應知道含有靶向腫瘤的促凝劑作為活性成分的含水組合物的制備。這種組合物一般被制成可注射的液體溶液或懸浮液；也可以制備成適用于在注射前通過加入液體而制成溶液或懸浮液的固體形式；制品也可被乳化。
可在與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適當混合的水中制備活性化合物作為游離堿或藥理學可接受鹽的溶液。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備分散劑。在普通儲存和使用條件下，這些制品中含有防腐劑以防止微生物的生長。
適于注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液；包含麻油，花生油或含水丙二醇的制劑；和用于新鮮制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。所有情況下都必須是無菌形式，并且液體的流動程度必須是易于注射的。在制備和儲存條件下制劑必須很穩(wěn)定，必須能夠防止微生物、如細菌和真菌的污染作用。
tTF組合物可配制成中性或鹽形式的組合物，制藥學上可接受的鹽包括酸加成的鹽(與蛋白質游離的氨基基團形成)，以及與如鹽酸或磷酸之類的無機酸，或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有機酸形成的鹽。與游離羧基基團形成的鹽也可衍生自如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵等無機堿，和如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸，普魯卡因等有機堿。
載體也可以是含有例如水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇和液體聚乙二醇等)，其適當?shù)幕旌衔锖褪卟擞偷娜軇┗蚍稚⒔橘|。通過使用包被，如用卵磷脂包被，在分散劑的情況下通過維持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑可保持適當?shù)牧鲃有?。通過多種抗細菌和抗真菌劑，如對羥基苯甲酸酯類，氯代丁醇，苯酚，山梨酸，乙基汞硫代水楊酸鈉等可抑制微生物作用。在很多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠，可延長注射組合物的吸收。
通過將于適當溶劑的所需量活性化合物與所需的多種上述其它成分混合，接著過濾滅菌，即可制備無菌的注射溶液。一般通過將多種無菌的活性成分摻入含有基本分散介質和所需的上述其它成分的無菌載體中來制備分散劑。至于制備無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干技術，由此從先前經無菌過濾的溶液得到活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
通過配制，可以與劑量配制相容的方式，以治療有效的量施用溶液。可以多種劑量形式容易地施用制劑，如上述注射溶液類型，但也可使用藥物釋放膠囊等。
本發(fā)明的合適藥物組合物一般包括與可接受的藥物稀釋劑或賦形劑(如無菌水溶液)混合以達到使用所需終濃度范圍的一定量的凝血缺損TF。制備技術一般是本領域眾所周知的，例如可參照Remington藥物科學，第16版，Mack出版公司，1980(列入本文作為參考)。應理解內毒素污染應該控制到最低程度，達到安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白質。另外，給人施用時，制品應該符合FDA局生物制品標準所需的無菌、熱原性、全面安全性和純度標準。
使用如本文所述研究中所示的動物模型易于確定治療有效劑量。經常使用攜有實體腫瘤的實驗動物使適當?shù)闹委焺┝孔顑?yōu)化，然后才轉用至臨床環(huán)境。已知這種模型在預測有效的抗癌策略方面非?？煽?。例如，如實施例中所用的攜有實體腫瘤的小鼠被廣泛用于臨床前試驗中。發(fā)明人已使用被本領域所接受的這種小鼠模型來確定抗腫瘤效果好、毒性最低的tTF工作范圍。
除了將化合物制成非腸道給藥、如靜脈內或肌內注射的形式外，其它制藥學上可接受的形式也是可以的，如片劑或其它供口服給藥的固體，緩釋膠囊，脂質體形式等。也可根據(jù)治療的疾病使用其它藥物制劑，例如，局部制劑適于治療如皮炎和銀屑病之類的病理學疾??；眼制劑適于糖尿病性視網(wǎng)膜病。
如本文詳述，預計對凝血缺損TF構建體進行加工使其具有較長的體內半壽期會帶來一些好處。這些技術包括但不限于加工或修飾TF分子自身，和使TF構建體與惰性載體(如包括免疫球蛋白和Fc部分的多種蛋白質或非蛋白質組分)綴合。本文將這類組分稱為具有較長半壽期的TF構建體。應理解較長半壽期并不與“緩釋”所用的藥物組合物同樣久遠。設計緩釋制劑的目的一般是想在較長的一段時間內維持恒定的藥物水平。增加如本發(fā)明TF構建體之類藥物的半壽期的目的是想通過給藥達到較高的血漿水平，這種水平可維持較長時間，但一般根據(jù)構建體的藥物動力學發(fā)生衰減。盡管TF構建體及其聯(lián)合的緩釋制劑在本發(fā)明中不是優(yōu)選的，但本發(fā)明并不以任何方式排斥使用它們。
C2.治療試劑盒本發(fā)明也提供了含有本文所述tTF構建體的治療試劑盒。這種試劑盒一般在適當?shù)娜萜髦泻斜景l(fā)明至少一種凝血缺損TF構建體的藥理學可接受制劑，該試劑盒也可含有其它制藥學上可接受的制劑，如含有下述的制劑靶向tTF構建體的成分；其它的凝血因子，尤其是因子VIIa；用于例如抗原誘導的雙特異性抗體，T細胞，或其它功能性成分；用于抗原抑制的成分，如環(huán)孢菌素(必要時)；獨特的抗腫瘤位點抗體或免疫毒素；和一系列化學治療藥物中的任何一種或多種。
試劑盒可具有單個容器，其中含有tTF，含或不含任何其它成分，或者，試劑盒也可具有多個不同的容器，各含所需的試劑。含有制備雙特異性凝血配體或免疫毒素所必需的分離成分的試劑盒也是可以的。本發(fā)明的某些優(yōu)選試劑盒包括激活因子VII之能力受損的凝血缺損TF構建體，所述構建體被包裝在試劑盒中以與外源性因子VIIa的共同施用聯(lián)合使用。在這種試劑盒中，TF突變體和因子VIIa可以預先復合，它們或者是等摩爾量聯(lián)合，或者其中一個成分比另一成分過量；或者在施用于患者之前，將試劑盒中的TF和因子VIIa組分各自分開保存于不同的容器中。其它優(yōu)選的試劑盒包括任何凝血缺損TF與“典型的”化學治療劑的聯(lián)合。這是總體上適用于制備所有這類TF試劑盒和試劑盒組合的各項考慮的例子。
當試劑盒的組分在一種或多種液體溶液中被提供時，該液體溶液是水溶液，特別優(yōu)選是無菌水溶液。然而，試劑盒中的組分也可以干粉末的形式供給。當各試劑或組分以干粉末的形式提供時，可通過加入適當?shù)娜軇┦狗勰┲厝?。可以預想也可以在另一個容器中提供溶劑。
試劑盒的容器一般包括至少一只小管，試管，燒瓶，瓶，注射器或其它容器，其中注入、優(yōu)選適當?shù)氐确肿⑷雝TF和任何其它所需試劑。當包括其它組分時，試劑盒一般含有第二只小管或其它容器，其中注入所述組分，使得能施用分開設計的劑量。試劑盒也可包含第二個/第三個容器以在其中裝入無菌的藥理學可接受緩沖液或其它稀釋劑。
試劑盒也可含有可用來將tTF施用于動物或患者的容器，如一個或多個針頭或注射器，或甚至是滴眼管、取液器或其它諸如此類的裝置，由此可將制劑注射至動物體內或施用于身體的患病部位。本發(fā)明的試劑盒一般也可包括含有小管等和其它組件以供出售的密封容器，例如其中裝入所需小管和其它裝置的注射或吹氣造型的塑料容器。D.治療D1.前血栓形成性血管本發(fā)明提供的組合物和方法可廣泛用于治療具有作為疾病成分的“前血栓形成性血管”的任何疾病，如良性或惡性腫瘤。這種血管系統(tǒng)相關疾病最特別地包括實體惡性腫瘤，以及良性腫瘤，如BPH。然而，也不排除治療糖尿病性視網(wǎng)膜病，血管再狹窄，動靜脈畸形(AVM)，腦膜瘤，血管瘤，新血管性青光眼和銀屑病；以及血管纖維瘤，關節(jié)炎，動脈粥樣硬化斑，角膜移植新血管形成，血友病性關節(jié)，肥大型疤痕，osler-weber綜合征，生膿肉芽腫，晶狀體后纖維組織形成，硬皮病，沙眼，血管粘連，滑膜炎，皮炎，甚至是子宮內膜異位。
本發(fā)明基于TF構建體或TF與其它試劑的聯(lián)合使用，其中TF構建體或其聯(lián)合具有足夠的凝血酶原活性以干擾特異的疾病相關血管(如血管化腫瘤之血管)中的前凝血環(huán)境，導致血栓形成。正常組織內的血管環(huán)境是溶纖性的，而腫瘤血管是前凝血性的，即更傾向于導致血栓形成。腫瘤血管中的前凝血變化部分是由內皮細胞激活細胞因子IL-1和TNFα的局部釋放引起的。大多數(shù)腫瘤細胞和激活的巨噬細胞可分泌IL-1，浸潤至腫瘤的宿主細胞(包括激活的淋巴細胞，巨噬細胞，NK細胞和LAK細胞)可分泌TNFα。
IL-1和TNFα誘導血管內皮細胞發(fā)生多種變化，包括上調組織因子，下調纖溶酶原激活物和上調纖溶酶原激活物的抑制劑，PAI-1(Nawroth和Stern，1986；Nawroth等，1988)。衍生自腫瘤的因子(Murray等，1991；Ogawa等，1990)，也許是VEGF使這些作用進一步放大。這些和其它變化的總結果是內皮細胞變得更能支持血栓形成，更不能溶解血纖蛋白，更傾向于導致血栓形成。
因此，鑒于上述科學現(xiàn)象，發(fā)明人預計，當施用凝血缺損TF時，它們具有足夠的殘留凝血酶原活性，能將實際上一般是前血栓形成性的血管中的凝血級聯(lián)反應平衡朝血栓形成傾斜(圖3)。盡管為了實施本發(fā)明不必要機械地理解科學推理，但應理解上述解釋是一個機理，本發(fā)明可能通過此機理得到實現(xiàn)。此機理較少地基于TF在血管化腫瘤之血管內的特異性定位(這一點與其它血管相反)，但仍令人驚奇的是，TF的等量生物分布(如果實際上發(fā)生的話)居然會導致疾病位點內(如實體腫瘤內)不均等的凝血效果。假定腫瘤的固有特性一般是維持血管網(wǎng)絡并繼續(xù)血管形成進程，顯然，腫瘤相關血管不可能會更傾向于導致血栓形成以致于它們自發(fā)地或容易支持凝血，因為這種凝血必然會導致腫瘤細胞的氧和營養(yǎng)供給受到阻斷，并會導致腫瘤自我解體。這顯然是不會發(fā)生的。
易于理解的是不論對在疾病相關血管中誘導特異性凝血的機理如何理解，本發(fā)明在治療如血管化腫瘤的疾病方面具有顯著的實用性，然而，發(fā)明人進一步推理出構成TF構建體可能存在的令人驚奇的作用之基礎的另一種機理，即相對于身體其它組織或位點而言，TF優(yōu)先選擇性地結合某些血管內皮細胞(圖3)。因此，注射后，tTF應選擇性地結合腫瘤血管內皮細胞，這可以使它與液體表面接觸，并促進腫瘤血管內凝血起始復合物的裝配。可能由于腫瘤血管的前血栓形成特性，使因子VIIa，IXa，Xa，組織因子途徑抑制劑(TFPI)或其它可與TF相互作用的分子的局部濃度有所增加，因此促進了定位。
使用本發(fā)明的方法，通過標記tTF，將它注射至攜有腫瘤的小鼠體內，測定它是否確實定位于腫瘤血管中，即可檢測tTF的定位。盡管在科學上有興趣，但假定不論構成此現(xiàn)象之基礎的精確作用機理如何，施用凝血缺損的TF構建體都可有利地導致特異性的抗腫瘤效果，則本發(fā)明實施中就沒必要進行這種研究。
凝血缺損TF分子促進前血栓形成性血管凝血的本發(fā)明的用途不同于以前就TF構建體(如與因子VIIa聯(lián)合的tTF)推薦的用途。tTF和因子VIIa曾被建議聯(lián)合用于治療出血障礙，如血友病(美國專利5,374,617；5,504,064；和5,504,067)。美國專利5,346,991和5,589,363中也描述了在治療心肌梗塞時使用K165A和K166A TF突變體抑制凝血，并提供了生產這些TF突變體的重組DNA序列和載體。
應直接意識到前一方法學的目標與本發(fā)明所針對的前血栓形成性血管截然相反?！扒把ㄐ纬尚浴毖芴幱诟鼉A向于凝血的動力學狀態(tài)，但其中凝血不會發(fā)生于自然環(huán)境中。這種血管例如是血管化腫瘤內分類為前血栓形成性的，但腫瘤內維持了足夠的血液供應以支持腫瘤的維持和過度生長。與之形成對照的是，具有出血障礙的個體內的靶位點支持凝血的能力本質上顯著缺損。主要用于血友病患者的tTF和因子VIIa聯(lián)合方法學也被建議用于控制術后出血或者其中外來攻擊使必需的凝血過程失效的嚴重外傷。這又不類似于本發(fā)明的意圖。
相信本發(fā)明最重要的用途是治療血管化惡性腫瘤。然而，除了上述多種疾病和障礙外，本發(fā)明也包括用于其它良性生長的療法。良性生長的具體例子是良性前列腺增生(BPH)，根據(jù)下文所述的特定劑量和治療方案可治療該疾病。BPH的治療也可與本領域最近實踐的其它治療聯(lián)合，例如，當然也包括將免疫毒素靶向定位于BPH內的標記物，如PSA。
D2.癌癥和治療最優(yōu)選將本發(fā)明的tTF定位和特異性凝血開發(fā)用于tTF治療癌癥和腫瘤的治療用途。這些應用中可只使用tTF或與化學治療劑和/或免疫毒素或凝血配體聯(lián)合使用tTF。本發(fā)明提供的組合物和方法可廣泛用于治療具有血管成分的任何惡性腫瘤。典型的血管化腫瘤是需要血管成分提供氧和營養(yǎng)的實體腫瘤，尤其是癌。使用本發(fā)明可治療的實體腫瘤的例子包括但不限于肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胃癌，胰腺癌，喉癌，食道癌，睪丸癌，肝癌，腮腺癌，膽道癌，結腸癌，直腸癌，宮頸癌，子宮癌，子宮內膜癌，腎臟癌，膀胱癌，前列腺癌，甲狀腺癌，鱗狀細胞癌，腺癌，小細胞癌，黑素瘤，神經蝕質瘤，成神經細胞瘤等。
預期本發(fā)明也可用于治療患有實體腫瘤的任何患者，然而，由于本發(fā)明可特別成功地用于治療中等大小或大的實體腫瘤，因此，用本文提供的方法和組合物進行治療，可能會使這類患者得到更顯著的好處。一般說來，本發(fā)明可用于治療約0.3-0.5cm和更大的腫瘤，但本發(fā)明較好的應用是治療大于0.5cm的腫瘤。根據(jù)在可接受的動物模型中進行的研究，相信約1.0或約1.2cm的腫瘤代表本發(fā)明TF構建體能最有效進攻的實體腫瘤大小。因此，攜有大小約為1.0至約2.0cm之腫瘤的患者是本發(fā)明TF療法中的優(yōu)選治療組患者，但也可治療大到并包括在人體中發(fā)現(xiàn)的最大腫瘤的腫瘤。
盡管本發(fā)明一般并不打算用作防治性或預防性治療，但本發(fā)明的應用當然也不局限于治療患有中等大小或大腫瘤的患者。有很多推論構成本發(fā)明廣度方面的基礎。例如，中等大小或更大的初期腫瘤患者也可能具有多個被認為是小的或甚至處于轉移性腫瘤根植較早期的其它轉移性腫瘤。如果本發(fā)明的TF構建體和聯(lián)合廣泛施用于患者的全身循環(huán)中，則它們自然對次生的、較小的和轉移性的腫瘤也具有效果，盡管這并不是治療的主要意圖。另外，甚至在腫瘤塊作為一個整體是單個小腫瘤的情況下，使用本發(fā)明的療法也會產生某些有利的抗腫瘤效果。
上文有關使用本發(fā)明的最適患者的指導旨在說明某些患者分布圖可能有助于選擇本發(fā)明可治療的患者，或使用其它抗癌治療策略可更好地治療的患者。不過，某類患者中存在更優(yōu)選或更有效的療法這一事實不會以任何方式否定本發(fā)明治療患有血管化腫瘤的所有患者這一基本用途。進一步的考慮是，本發(fā)明的TF療法所提供的對腫瘤的最初攻擊的任何可測和即時效果可能較小，但可使腫瘤易接受更進一步的治療，從而使后續(xù)治療能夠達到整體的協(xié)同效應甚或導致全面緩和或治愈。
不能相信任何特定類型的腫瘤要排除在使用本發(fā)明的療法之外。由于該療法的意圖是使腫瘤血管系統(tǒng)凝血，又因為所有實體腫瘤中的血管系統(tǒng)基本上或完全相同，因此應理解本發(fā)明的方法學可廣泛或全面地用于治療所有實體腫瘤，而不論腫瘤細胞自身的特定表型或基因型如何。然而，腫瘤細胞的類型可能與本發(fā)明和第二種治療劑，特別是抗腫瘤細胞免疫毒素和/或凝血配體的聯(lián)合使用相關。
本領域技術人員應理解某些類型的腫瘤更適于使用本發(fā)明誘導血栓形成和壞死。在實驗動物中觀察到這一現(xiàn)象，這在人治療中也可能發(fā)生，例如，已知HT29模型腫瘤系統(tǒng)相對較難凝血；而C1300腫瘤模型一般更加適于誘導血栓形成和隨后的壞死。在實驗動物體內進行臨床前研究和對治療任何特定患者或患者組的劑量進行最優(yōu)化時都要考慮到這些因素。
如上文涉及體內定量研究的討論中所述，有實際的目標可用作進行臨床治療之前的臨床前試驗的指標，然而，相對于全面的實用性而言，這更是一件花費少的事，并且是選擇最有利的化合物和劑量的一種機制。有關它們的基本實用性，可導致任何持續(xù)可測的血栓形成和抗腫瘤效應的任何構建體或其聯(lián)合仍可確定為有用的發(fā)明。應可在約10％至約40-50％的腫瘤血管和腫瘤組織中觀察到血栓形成和壞死效應，可觀察到的這種效應可高達約50％至約99％。也應理解，甚至在TF構建體及其聯(lián)合的抗腫瘤效應接近上述范圍的最低值的情況下，相對于針對特定腫瘤目標的所有其它已知療法而言，此療法可能仍同樣有效或甚至更有效。不幸的是，臨床醫(yī)生顯然知道某些中期或晚期腫瘤不能得到有效治療，但仍不能否定本發(fā)明療法的實用性，特別是當該療法與普遍建議的其它策略一樣有效時更是如此。
設計凝血缺損TF構建體及其聯(lián)合的適當劑量時，由本文所述的動物研究可很容易推斷出臨床施用所需的適當劑量。為了達到這一轉換，應考慮每單位重量的實驗動物施用的藥劑量，還應考慮實驗動物和人患者之間的身體表面積差異。所有這種計算對本領域技術人員而言是眾所周知和常規(guī)的。例如，若每只小鼠(總體重約為20g)采取的成功劑量為16μg，采用上文所述的計算，即可得出可用于人患者的相當劑量約為2mg。因此，使用此資料，發(fā)明人估計可用于人施用的凝血缺損TF的有用劑量為每個患者約0.2毫克至200毫克TF構建體。除了所提及的范圍外，應理解，根據(jù)上文提供的參數(shù)和詳細指導，本發(fā)明也包含對活性或最適范圍作進一步改變。
因此，估計劑量一般約為0.2mg至180毫克；約0.5至160毫克；約1至150毫克；約5至125毫克；約10至100毫克；約15至80毫克；約20至65毫克；約30至50毫克；約40mg；或使用上述任一例舉的劑量或特定范圍內的任何中間值的任何特定范圍。盡管本發(fā)明優(yōu)選1mg，2mg，3mg，4mg和約5mg左右的劑量，但應理解，較低的劑量更適于與其它藥劑聯(lián)合，并且也可耐受高劑量，尤其是用于本發(fā)明的TF藥劑自身無細胞毒性時，而即使存在某些不利的副作用，也不會必然導致不能被正常的穩(wěn)態(tài)機制抵制的凝血，相信這可以使對健康組織顯著毒性的機會變小。
本發(fā)明治療方案的意圖一般是產生最大的抗腫瘤效應，同時將劑量保持在與不可接受的毒性相關的水平之下。除了改變劑量本身以外，也可以改變施用方案以使治療策略最優(yōu)化。本發(fā)明優(yōu)選的治療策略是在約7天的期間內，服用約0.2mg至200mg TF構建體或其聯(lián)合約3次。例如，可在約第1天，第3或4天和第6或7天給藥。至于施用特定劑量自身，優(yōu)選給患者全身性提供制藥學上可接受的組合物。一般優(yōu)選靜脈內注射，最優(yōu)選的方法是在約1或2小時左右的時間內進行連續(xù)灌注。盡管在使用本發(fā)明治療前不需要確定這種參數(shù)，但應說明的是，本文所述的各項研究中，在注射約30分鐘內，即在實體腫瘤的血管中特異地觀察到至少一些血栓形成，并且腫瘤細胞自身在約3至4小時內開始死亡。一般在下面的約24小時內可觀察到廣泛的腫瘤壞死，其中可觀察到高達90％及以上的壞死。E.聯(lián)合療法本發(fā)明的方法可與一般用于治療患者表現(xiàn)出的特定疾病或障礙的任何其它方法聯(lián)合。例如，在治療實體腫瘤方面，本發(fā)明的方法可與常規(guī)方法，如外科手術，放射性療法等聯(lián)合使用。只要特定的治療方法自身不是有害的，或與TF療法的效力相抵消，即可與本發(fā)明聯(lián)合應用。當一種或多種藥劑與TF療法聯(lián)合使用時，聯(lián)合的結果不需要是獨立進行各個治療時所觀察到的效果的加成，盡管這顯然是合乎需要的，也不特殊要求聯(lián)合治療表現(xiàn)出協(xié)同效應，盡管這當然是可能的和有利的。
至于外科手術，任何外科手術干預都可以與本發(fā)明聯(lián)合實踐。在放射性療法方面，涉及可在腫瘤細胞內局部誘導DNA損害的任何機制，如γ-照射，X射線，UV照射，微波，甚至電子發(fā)射等。也包括將放射性同位素直接運送至腫瘤細胞中，這可以與靶向抗體或其它靶向方式聯(lián)合使用。已證實細胞因子療法是聯(lián)合治療方案的有效成員。多種細胞因子可用于這種聯(lián)合方法中，細胞因子的例子包括IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，TGF-β，GM-CSF，M-CSF，G-CSF，TNFα，TNFβ，LAF，TCGF，BCGF，TRF，BAF，BDG，MP，LIF，OSM，TMF，PDGF，IFN-α，IFN-β，IFNγ。根據(jù)與如患者狀況和細胞因子相對毒性之類臨床指征一致的標準方案施用細胞因子。
E1.化學治療聯(lián)合和治療在某些實施方案中，本發(fā)明顯示，當與化學治療劑聯(lián)合施用時，tTF的抗腫瘤活性有所增強。藥物增強tTF的抗腫瘤活性的機理尚未被精確確定，但本發(fā)明人相信，藥物可殺死增殖中的腫瘤細胞，產生會導致吞噬細胞浸潤腫瘤的壞死區(qū)域。由浸潤細胞釋放的IL-1，TNFα和其它細胞因子再激活腫瘤血管內皮，使其更能支持由一般為較弱凝血酶原的tTF所致的凝血，因此，藥物增強了tTF的血栓形成作用。
TF和抗癌藥物作用增強的另一種可能性是tTF誘導了腫瘤血管內形成血栓，從而將藥物捕獲在腫瘤內。盡管從身體其它部位清除了藥物，但它仍存在于腫瘤內，因此，腫瘤細胞暴露于更高濃度的藥物中達更長時間。將藥物捕獲于腫瘤內也可降低藥物的劑量，使治療更為安全有效。
不論獲得增強的腫瘤破壞的機理如何，本發(fā)明的聯(lián)合治療方面對有效治療疾病具有明顯的實用性。為了將本發(fā)明與施用化學治療劑聯(lián)合使用，可以能在動物體內有效導致聯(lián)合抗腫瘤作用的方式，簡單地給動物施用凝血缺損的TF構建體與化學治療劑的聯(lián)合。因此，應以有效的量和能有效導致它們聯(lián)合存在于腫瘤血管系統(tǒng)內和在腫瘤環(huán)境中聯(lián)合作用的時間提供這些藥劑。為了達到這一目的，可以單個組合物或作為使用不同施用途徑的兩種不同組合物給動物共同施用TF和化學治療劑。
或者，可以在化學治療劑治療之前或之后間隔數(shù)分鐘至數(shù)周進行TF治療。在分開給動物施用化學治療因子和TF的實施方案中，一般應確保每次給藥之間間隔時間并不太長，以使化學治療劑和TF組合物仍能對腫瘤產生有利的聯(lián)合效應。在這種情況下，預計腫瘤與兩種藥劑將在約5分鐘至約1周內互相接觸，更優(yōu)選在約12至72小時內互相接觸，最優(yōu)選延遲時間僅為約12至48小時。在一些情況下，各次給藥間隔時間為幾天(2，3，4，5，6或7)或甚至幾周(1，2，3，4，5，6，7或8)時可能需要顯著延長治療的時間。也可以想見需要施用不止一次TF或化學治療劑。為了使腫瘤退化，以能有效抑制腫瘤生長的聯(lián)合劑量傳遞兩種藥劑，而不用管施用的次數(shù)如何。
多種化學治療劑可用于本文公開的聯(lián)合治療方法，僅作為例子的化學治療劑包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)，阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，喜樹堿，放線菌素D，絲裂霉素C，順鉑(CDDP)和甚至是過氧化氫。在某些實施方案中，已顯示出當與本發(fā)明的tTF組合物聯(lián)合施用時，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的使用可有效地使腫瘤變小。
本領域技術人員應理解，化學治療劑的適當劑量一般就是單獨施用或與其它化學治療劑聯(lián)合施用化學治療劑的臨床療法中已使用的大致劑量。例如，可使用如順鉑之類藥劑和其它DNA烷基化藥劑。順鉑被廣泛用于治療癌癥，其臨床應用所用的有效劑量為每3周給藥20mg/m2達5天，共3個療程。順鉑不能被口服吸收，因此必須經由靜脈內、皮下、腫瘤內或腹膜內注射來傳遞。
其它有用的藥劑包括干擾DNA復制、有絲分裂和染色體分離的化合物，這種化學治療化合物包括阿霉素，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，異搏定，鬼臼毒素等。廣泛用于治療腫瘤的臨床背景時，對于阿霉素而言，以25-75mg/m2的劑量范圍，每隔21天通過大劑量靜脈內注射給藥，對表鬼臼毒素吡喃葡糖苷而言，以35-50mg/m2的劑量靜脈內給藥或以雙倍于靜脈內劑量的劑量口服。
也可使用破壞多核苷酸前體的合成和精確性的藥劑。特別有用的是已經過深入檢測并易于得到的藥劑。例如，致瘤性組織優(yōu)先使用如5-氟尿嘧啶(5FU)之類藥劑，使得此藥劑對靶向致瘤性細胞特別有用。盡管5-FU毒性很大，但它可適用于寬范圍的載體，包括局部使用，然而，一般使用劑量范圍是3至15mg/kg/天的靜脈內給藥。
表II列出了可用于聯(lián)合療法的化學治療劑的例子，其中所列的各個藥劑僅是例子而不會以任何方式限制藥劑的范圍。熟練技術人員可參照“Remington藥物科學”第15版，第33章，特別是p624-652。根據(jù)治療對象的病情必需對劑量作一些改變。在任何情況下，負責給藥的人會確定各個受試者的適當劑量。另外，為了給人施用，制品必需符合FDA生物制品標準所需的無菌、熱原性、全面安全性和純度標準。
表II用于致瘤性疾病的化學治療劑
表II-續(xù)<
<p>表II-續(xù)
E2.免疫毒素和凝血配體的聯(lián)合和療法本發(fā)明的任一種或多種凝血缺損的TF構建體可與免疫毒素(IT)和/或凝血配體聯(lián)合使用，所述免疫毒素和/或凝血配體的靶向部分(如抗體或配體)針對的是腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質相對特異的標記物。同上文討論的化學治療劑一樣，聯(lián)合使用凝血缺損的TF構建體和靶向毒性劑(IT)或促凝劑(凝血配體)會產生針對腫瘤環(huán)境中不同目標的不同藥劑。這應該導致累加的、明顯大于累加的或甚至協(xié)同的效果。
有關例舉的免疫毒素和凝血配體的制備和使用，下列專利申請的內容被特定地列入本文作為參考以進一步補充本發(fā)明的教導美國流水號07/846,349；08/295,868；08/205,330；08/350,212；08/273,567和08/482,369。
與本發(fā)明的tTF構建體聯(lián)合使用的第二種藥劑的至少一個結合區(qū)域是能將毒素或促凝劑傳遞至腫瘤區(qū)域(即能定位于腫瘤位點內)的組分。由于促凝劑分布的稍廣泛并不與嚴重的副作用相關，因此，相對于免疫毒素而言，對凝血配體靶向成分的要求較不嚴格。靶向藥劑可以針對腫瘤細胞組分；腫瘤血管系統(tǒng)組分；與腫瘤細胞結合、或一般性相關聯(lián)的組分；與腫瘤血管系統(tǒng)結合、或一般性相關聯(lián)的組分；腫瘤胞外基質或基質的組分或者與基質結合的組分；甚至可以針對腫瘤血管系統(tǒng)內發(fā)現(xiàn)的細胞類型。
對于凝血配體，非常嚴格靶向的負擔(如使用免疫毒素時所要求的)有所減輕，因此，達到特異性靶向意味著相對于非腫瘤位點的血管系統(tǒng)而言，腫瘤血管系統(tǒng)內的凝血有所促進。因此，對于靶向劑的生物分布特性而言，凝血配體的特異性靶向是功能性術語而不是純粹的物理術語，有用的靶可能不是全部局限于腫瘤，給藥后，在身體的其它位點仍可發(fā)現(xiàn)能有效促進腫瘤特異性凝血的靶向配體。
i.腫瘤細胞靶使用具有能與腫瘤細胞相對特異之標記物結合的區(qū)域的配體或雙特異性配體可靶向構成腫瘤的惡性細胞。毒素會殺死腫瘤細胞，由于與腫瘤細胞的結合會使相關的促凝劑定位于腫瘤，因此可達到特異性凝血的目的。
已記載過很多所謂的“腫瘤抗原”，其中的任一個都可用作本發(fā)明聯(lián)合方面的靶。下文列出了大量實體腫瘤相關抗原的例子，本領域技術人員熟知針對這種抗原的抗體的制備和使用，例舉的抗體包括得自婦科腫瘤位點OC 125；OC 133；OMI；Mo v1；Mo v2；3C2；4C7；ID3；DU-PAN-2；F 36/22；4F7/7A10；OV-TL3；B72.3；DF3；2C8/2F7；MF 116；Mov18；CEA 11-H5；CA 19-9(1116NS 19-9)；H17-E2；791T/36；NDOG2；H317；4D5，3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，SB8；HMFG2；3.14.A3；乳腺腫瘤位點DF3；NCRC-11；3C6F9；MBE6；CLNH5；MAC 40/43；EMA；HMFG1 HFMG2；3.15.C3；M3，M8，M24；M18；67-D-11；D547Sp，D75P3，H222；Anti-EGF；LR-3；TA1；H59；10-3D-2；HmAB1，2；MBR 1，2，3；24.17.1；24.17.2(3E1.2)；F36/22.M7/105；C11，G3，H7；B6.2；B1.1；Cam 17.1；SM3；SM4；C-Mul(566)；4D5 3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，5B8；OC 125；MO v2；DU-PAN-2；4F7/7A10；DF3；B72.3；cccccCEA 11；H17-E2；3.14.A3；FO23C5；結腸直腸腫瘤位點B72.3；(17-1A)1083-17-1A；CO17-1A；ZCE-025；AB2；HT-29-15；250-30.6；44X14；A7；GA73.3；791T/36；28A32；28.19.8；X MMCO-791；DU-PAN-2；ID3；CEA 11-H5；2C8/2F7；CA-19-9(1116NS 19-9)；PR5C5；PR4D2；PR4D1；黑素瘤位點4.1；8.2 M17；96.5；118.1，133.2，(113.2)；L1，L10，R10(R19)；I12；K5；6.1；R24；5.1；225.28S；465.12S；9.2.27；F11；376.96S；465.12S；15.75；15.95；Me1-14；Me1-12；Me3-TB7；225.28SD；763.24TS；705F6；436910；M148；胃腸腫瘤ID3；DU-PAN-2；OV-TL3；B72.3；CEA 11-H5；3.14.A3；CCOLI；CA-19-9(1116NS 19-9)and CA50；OC125；肺腫瘤4D5 3H4，7C2，6E9，2C4，7F3，2H11，3E8，5B8，7D3，SB8；MO v2；B72.3；DU-PAN-2；CEA 11-H5；MUC 8-22；MUC 2-63；MUC 2-39；MUC 7-39；和各種各樣的腫瘤PAb 240；PAb 246；PAb 1801；ERIC.1；M148；FMH25；6.1；CA1；3F8；4F7/7A10；2C8/2F7；CEA 11-H5.
確定可靶向的腫瘤的另一種方法是根據(jù)腫瘤細胞自身的特性，而不是描述由細胞表達的抗原的生物化學特性。因此，熟練技術人員可參照ATCC目錄列舉一些公眾可得到的(得自ATCC目錄)人類腫瘤細胞系，細胞系例有J82；RT4；ScaBER；T24；TCCSUP；5637；SK-N-MC；SK-N-SH；SW 1088；SW 1783；U-87 MG；U-118 MG；U-138 MG；U-373 MG；Y79；BT-20；BT-474；MCF7；MDA-MB-134-VI；MDA-MD-157；MDA-MB-175-VII；MDA-MB-361；SK-BR-3；C-33A；HT-3；ME-180；MS751；SiHa；JEG-3；Caco-2；HT-29；SK-CO-1；HuTu 80；A-253；FaDu；A-498；A-704；Caki-1；Caki-2；SK-NEP-1；SW 839；SK-HEP-1A-427；Calu-1；Calu-3；Calu-6；SK-LU-1；SK-MES-1；SW 900；EB1；EB2；P3HR-1；HT-144；Malme-3M；RPMI-7951；SK-MEL-1；SK-MEL-2；SK-MEL-3；SK-MEL-5；SK-MEL-24；SK-MEL-28；SK-MEL-31；Caov-3；Caov-4；SK-OV-3；SW 626；Capan-1；Capan-2；DU 145；A-204；Saos-2；SK-ES-1；SK-LMS-1；SW 684；SW 872；SW 982；SW 1353；U-2 OS；Malme-3；KATO III；Cate-1B；Tera-1；Tera-2；SW579；AN3 CA；HEC-1-A；HEC-1-B；SK-UT-1；SK-UT-1B；SW 954；SW 962；NCI-H69；NCI-H128；BT-483；BT-549；DU4475；HBL-100；Hs 578Bst；Hs 578T；MDA-MB-330；MDA-MB-415；MDA-MB-435S；MDA-MB-436；MDA-MB-453；MDA-MB-468；T-47D；Hs 766T；Hs 746T；Hs 695T；Hs 683；Hs 294T；Hs 602；JAR；Hs 445；Hs 700T；H4；Hs 696；Hs 913T；Hs729；FHs 738Lu；FHs 173We；FHs 738B1；NIH0VCAR-3；Hs 67；RD-ES；ChaGo K-1；WERI-Rb-1；NCI-H446；NCI-H209；NCI-H146；NCI-H441；NCI-H82；H9；NCI-H460；NCI-H596；NCI-H676B；NCI-H345；NCI-H820；NCI-H520；NCI-H661；NCI-H510A；D283 Med；Daoy；D341 Med；AML-193和MV4-11.
可查閱以后任一年的ATCC目錄以鑒定其它適當?shù)募毎怠Ｈ绻枰囟ǖ募毎愋?，此特定領域的技術人員也應知道得到這種細胞的方法，和/或其可立即得到的來源。因此，科技文獻分析可很容易揭示出針對需要靶向的任何腫瘤細胞類型可作的適當細胞選擇。
(a)抗腫瘤細胞抗體識別腫瘤抗原靶的直接方法是使用對特定抗原具有結合親和力的抗體。已知有大量針對實體腫瘤抗原的抗體，上文列出了某些有用的抗腫瘤抗體。然而，本領域技術人員顯然明白上述某些抗體可能不具有適當?shù)纳锘瘜W特性，或沒有足夠的腫瘤特異性，因而不具有治療用途，例如可識別胞質抗原的MUC8-22。這一類抗體一般僅用于研究性的實施方案，如模型系統(tǒng)或篩選試驗中。
一般說來，可用于本發(fā)明這些方面的抗體優(yōu)選識別細胞表面易接近的抗原和由腫瘤細胞優(yōu)先或特異性表達的抗原。這種抗體也優(yōu)選表現(xiàn)出高親和性特性，如表現(xiàn)出Kd＜200nM，優(yōu)選＜100nM，而與維持生命的正常組織(如選自心臟，腎臟，腦，肝臟，骨髓，結腸，乳房，前列腺，甲狀腺，膽囊，肺，腎上腺，肌肉，神經纖維，胰腺，皮膚或人體中其它維持生命的器官或組織中的一種或多種組織)沒有顯著的反應性。從低反應性的觀點看來，對本發(fā)明最重要的“維持生命”的組織包括心臟，腎臟，中樞和外周神經系統(tǒng)組織和肝臟。本文所用術語“顯著反應性”指的是當抗體或抗體片段在適于免疫組織化學反應的條件下應用于特定組織時，不會引發(fā)染色或僅引發(fā)微弱的染色，其中在大多為陰性細胞的區(qū)域內分散僅少數(shù)幾個陽性細胞。
用于本發(fā)明的特別令人滿意的抗體是對實體腫瘤具有高選擇性的抗體，例如，與在很多乳腺癌、肺癌和結腸直腸癌表面選擇性發(fā)現(xiàn)的TAG72和HER-2原癌基因蛋白結合的抗體(Thor等，1986；Colcher等，1987；Shepard等，1991)；MOv18和OV-TL3以及可與乳粘蛋白核心蛋白和人乳脂球蛋白結合的抗體(Miotti等，1985；Burchell等，1983)；可與高Mr黑素瘤抗原結合的抗體9.2.27(Reisfeld等，1982)。其它有用的抗體是針對在幾乎所有卵巢癌中均均勻表達的葉酸結合蛋白的抗體；針對在鱗狀細胞癌和大多數(shù)神經蝕質瘤中過量表達的erb家族癌基因的抗體；和已知是不斷進行的臨床前和臨床評價對象的其它抗體。
在本領域常規(guī)實施的臨床前試驗之后，相信抗體B3，KSI/4，CC49，260F9，XMMCO-791，D612和SM3特別適用于臨床實施方案。B3(美國專利5,242,813；Brinkmann等，1991)的ATCC登記號是HB10573；KS1/4可按美國專利4,975,369所述制備；D612(美國專利5,183,756)的ATCC登記號是HB9796。
確定腫瘤相關靶的另一種方法是根據(jù)腫瘤細胞的特性，而不是描述由細胞表達的抗原的生物化學特性。因此，發(fā)明人預計優(yōu)先與腫瘤細胞結合的任何抗體都可用作免疫毒素或凝血配體的靶向成分。優(yōu)先結合腫瘤細胞的基礎仍是抗體對腫瘤細胞表現(xiàn)出高親和性，而與上文所述的維持生命的正常細胞或組織不具有顯著的反應性。
本發(fā)明還提供了幾種制備可用于本文所述靶向凝血法的抗體的方法。為了產生腫瘤細胞特異性的抗體，可用含有腫瘤細胞抗原的組合物免疫動物，并如下文詳述，選擇具有適當特異性的所得抗體。免疫組合物可含有上述任何抗原的純化的、或部分純化的制品；富含上述任何抗原的組合物，如膜制品；上述任何細胞；或包括上述任何細胞類型的細胞混合物或群體。
當然，不論抗體的來源如何，在實施本發(fā)明以治療人時，以首先確保臨床靶向的腫瘤會表達最終選定的抗原為佳。利用非常簡單直接的試驗，包括對腫瘤組織樣品(例如外科活檢樣品)進行抗原檢測，或檢測循環(huán)排出的抗原可做到這一點。在如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)之類免疫學篩選試驗中可很容易進行上述檢測，所述試驗中，為了確定對腫瘤的反應性，檢測了得自雜交瘤“庫”的抗體的結合親和性。然后，選擇顯示出適當腫瘤選擇性和親和性的抗體以制備本發(fā)明的雙特異性抗體。
由于眾所周知的交叉反應性現(xiàn)象，預計有用的抗體除了可由最初抗原得自人細胞的免疫方案產生外，還可由其中最初使用的抗原得自動物(如小鼠或靈長類動物)的免疫方案產生。當使用來源于人的抗原時，抗原可得自人腫瘤細胞系，或可通過特定的所研究患者的生物樣品來制備抗原。實際上，產生為患者腫瘤“量身定做”的抗體的方法是已知的(Stevenson等，1990)，預計能用于本發(fā)明。
(b)其它腫瘤細胞靶和結合配體除了使用抗體外，還可使用其它配體，通過與腫瘤細胞抗原結合，而將促凝劑導向腫瘤位點。對于身為過量表達的受體(雌激素受體，EGF受體)或突變受體的腫瘤抗原，相應的配體可用作靶向劑。
與內皮細胞受體配體類似，可能有可特異性地或優(yōu)先地與腫瘤細胞結合的成分存在。例如，假如腫瘤抗原是一種過量表達的受體，則腫瘤細胞在體內可能被特異性配體包被。這樣的話，配體似乎能被針對該配體的抗體或受體自身一種形式靶向。這些類型的靶向劑的具體例子是針對TIE-1或TIE-2配體的抗體，針對血小板因子4的抗體，及白細胞粘附結合蛋白。
ii.其它疾病靶在其它實施方案中，可使用TF與IT或凝血配體的聯(lián)合，所述IT或凝血配體能與特異性地或優(yōu)先地在疾病位點而不是腫瘤位點表達的靶分子結合。
與其它患病細胞相關的靶分子的例子包括例如；與銀屑病相關的白細胞粘附分子；與增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病相關的FGF；與多種疾病的活化內皮細胞相關的血小板因子4；和與血管增殖性疾病相關的VEGF。相信在疾病位點特異性誘導凝血，和任選通過靶向毒素傳遞，可使患有任一種上述疾病的動物或患者獲得好處。
已知具有共同的血管依賴性病理學的疾病(如Klagsburn和Folkman(1990)所述)也可按本文所述治療。特別是可以使用靶向血管內皮細胞的配體或靶向基質的配體使疾病位點凝血。目前特別包括BPH，糖尿病性視網(wǎng)膜病，血管再狹窄，血管粘連，AVM，腦膜瘤，血管瘤，血管再生性青光眼，類風濕性關節(jié)炎和銀屑病的治療。
iii.疾病相關的血管系統(tǒng)細胞靶血管系統(tǒng)的細胞可作為本發(fā)明所用的靶。在這些情況下，免疫毒素或凝血配體的至少一個結合區(qū)域能結合由疾病相關的血管系統(tǒng)內皮細胞優(yōu)先表達的可接近標記物。由于血管內皮細胞接近疾病區(qū)域和局部異常生理過程的產物，使得血管標記物的開發(fā)利用成為可能。例如，腫瘤血管內皮細胞暴露于腫瘤細胞和腫瘤衍生的產物，所述產物可改變內皮細胞的表型。
已知腫瘤細胞可合成衍生自腫瘤的產物，如淋巴因子，單核因子，集落刺激因子，生長因子和血管生成因子，它們對附近的血管內皮細胞起作用(Kandel等，1991；Folkman，1985a，1985b)，還可產生細胞因子(Burrows等，1991；Ruco等，1990；Borden等，1990)。腫瘤產物與內皮細胞結合，并選擇性地誘導某些分子的表達。使用本發(fā)明某些方面送遞腫瘤內皮細胞特異性毒素和/或促凝劑可靶向的就是這些被誘導的分子。腫瘤中的血管內皮細胞以比各種正常組織中的血管內皮細胞大30倍的速率增殖(Denekamp等，1982)，這表明與增殖相關的決定簇也可用作腫瘤血管內皮細胞的標記物。
在本發(fā)明的某些實施方案中，免疫毒素或凝血配體的靶向成分是對腫瘤血管系統(tǒng)具有相對高水平的特異性的成分。這些靶向成分可限定為與腫瘤內皮細胞上表達、但在正常內皮細胞的表面很少或不表達的分子可結合的成分。通過本領域技術人員熟知的組織切片免疫染色標準方法可評估這種特異性。在凝血配體方面，一般建議可使用本發(fā)明雙特異性配體或抗體靶向的分子是在腫瘤血管系統(tǒng)上的表達水平比正常內皮細胞中高的那些分子。
(a)疾病血管內皮細胞標記物已知在疾病位點或環(huán)境中的血管內皮細胞表面優(yōu)先表達的分子在本文被稱為“天然的疾病相關性血管內皮細胞標記物”。使用此術語簡單地指在與增加的或不適當?shù)难苌苫騼绕ぜ毎鲋诚嚓P的疾病中表達的內皮細胞成分。一個具體例子是對腫瘤衍生的因子反應而原位表達的腫瘤內皮細胞成分。這些成分也被稱為“天然誘導的腫瘤內皮細胞標記物”。
VEGF/VPF(血管內皮細胞生長因子/血管通透因子)和FGF(成纖維細胞生長因子)家族的成分在腫瘤血管系統(tǒng)內或上密集，因此，相應的受體為進攻腫瘤血管系統(tǒng)提供了潛在的靶，例如已知嚙齒類動物和人中，VEGF受體在腫瘤內皮細胞上被上調，與正常組織中的內皮細胞正好相反(Thieme等，1995)，這可能是氧不足(腫瘤微環(huán)境的特征)的后果(Leith等，1992)。FGF受體在暴露于低氧的內皮細胞上也被上調3倍，因此相信它在腫瘤中也會被上調(Bicknell和Harris等，1992)。
內皮細胞上的TGF β(轉化生長因子β)受體(endoglin)在分裂中的細胞上被上調，這提供了另一個靶。本發(fā)明人之一發(fā)現(xiàn)，endoglin在培養(yǎng)著的被激活的和分裂中的HUVEC上被上調，在人組織的新血管形成位點(包括寬范圍的實體腫瘤和胎盤)的內皮細胞上高水平表達。與之形成對照的是，包括腫瘤發(fā)生前損害在內的大多數(shù)非惡性成年組織的內皮細胞含有很少的或不含endoglin。重要的是，相信endoglin的表達與乳腺的瘤形成進程相關聯(lián)，良性的纖維腺瘤和早期的癌會結合低水平的TEC-4和TEC-11抗體，而晚期的管內癌和侵入性癌會結合高水平的這些抗體即可證明這一點。
其它天然的疾病相關性血管內皮細胞標記物包括TIE，VCAM-1，P-選擇蛋白，E-選擇蛋白(ELAM-1)，αvβ3整聯(lián)蛋白，多效蛋白(pleiotropin)和內皮唾液酸蛋白，可使用本發(fā)明靶向其中的任一個。
(b)細胞因子可誘導的血管內皮細胞標記物由于經常導致身體局部功能異常的疾病過程的特征，處理疾病位點而同時使其它組織相對不受影響的方法是可行的。對于作為獨特的實體在動物體內存在的惡性和良性腫瘤而言尤為如此。例如，可處理腫瘤環(huán)境以產生特異于腫瘤血管內皮細胞的其它標記物。這些方法一般模擬實體腫瘤中天然進行的過程，還包括局部產生信號傳遞劑，如生長因子或細胞因子，它們可誘導某些分子在附近的血管內皮細胞表面特異性表達。
本文將可被人工誘導而在疾病或腫瘤環(huán)境的血管內皮細胞表面表達的分子組稱為“可誘導的內皮細胞標記物”，或具體地稱為“可誘導的腫瘤內皮細胞標記物”。此術語可用于指經人工誘導，即通過人為操作導致被誘導的標記物，而不是作為動物疾病或腫瘤發(fā)展過程的一部分被誘導的標記物。盡管“天然標記物”也可以被例如腫瘤衍生物所誘導，但為了簡化，本申請選擇上文所定義的術語“可誘導的標記物”。
因此，盡管對于實踐本發(fā)明并非必需，但對疾病相關性血管系統(tǒng)表面的血管內皮細胞抗原靶進行選擇性誘導的技術是可行的，如果需要的話，可將此技術用于本發(fā)明。這些技術包括操縱抗原表達或細胞表面呈遞，以使靶抗原在疾病相關性血管系統(tǒng)的表面表達或可得到，而在正常內皮細胞的表面不表達，或不可接近或得到而進行結合，或至少是降低到較低的程度。
腫瘤內皮細胞標記物可被腫瘤衍生的細胞因子(Burrows等，1991；Ruco等，1990)和血管生成因子(Mignatti等，1991)誘導。在腫瘤內皮細胞中可被特異性地誘導、然后使用本發(fā)明提供的雙特異性凝血配體可靶向的細胞表面標記物的例子包括表III中所列的那些(Bevilacqua等，1987；Dustin等，1986；Osborn等，1989；Collins等，1984)。
表III中還列出了推測標記物的誘導機制；誘導性或“中間體細胞因子”，如IL-1和IFN-γ；和其靶向會導致細胞因子釋放的白細胞細胞類型和相關細胞因子激活分子。誘導特異性標記物時，一般需要雙特異的“細胞因子誘導性”或“抗原誘導性”抗體。此抗體可選擇性地誘導適當細胞因子釋放于腫瘤地點，因此選擇性地誘導血管內皮細胞表達所需的靶抗原。雙特異性抗體與腫瘤塊細胞和產生細胞因子的白細胞交聯(lián)，從而激活白細胞以釋放細胞因子。
上述雙特異性抗體的制備和使用部分依據(jù)下列事實即識別CD3，CD14，CD16和CD28的交聯(lián)抗體以前已顯示出可通過與第二種抗原交聯(lián)而選擇性地引發(fā)細胞因子產生(Qian等，1991)。在本發(fā)明的上下文中，由于只有成功地與腫瘤細胞交聯(lián)的白細胞方可被激活以釋放細胞因子，因此，細胞因子的釋放僅局限于腫瘤部位。所需標記物，如E-選擇蛋白的表達也類似地局限于腫瘤血管系統(tǒng)的內皮細胞。
表III有可能被誘導的血管靶
<p>表III(續(xù))
<p>重要的是，應指出在表III所列的可誘導的標記物中，E-選擇蛋白和MHC II類抗原，如HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ(Collins等，1984)，是用于臨床實施方案的最優(yōu)選的靶。表III中的其它粘附分子似乎在正常組織，一般在淋巴器官內和內皮細胞上有不同程度的表達，使得它們的靶向僅在動物模型中或它們在正常組織中的表達可被抑制而沒有顯著副作用的情況下才可能合適。E-選擇蛋白或MHCII類抗原的靶向是優(yōu)選的，因為在腫瘤相關內皮細胞中可最直接地選擇性促進這些抗原的表達。
E-選擇蛋白對正常內皮細胞表面不表達的抗原進行靶向是誘導方法最簡單的形式。E-選擇蛋白是不在正常內皮細胞血管系統(tǒng)或其它人細胞類型中表達的粘附分子(Cotran等，1986)，但可通過如IL-1，TNF，淋巴毒素和細菌內毒素之類細胞因子的作用而在內皮細胞表面被誘導(Bevilacqua等，1987)。E-選擇蛋白不能被IFN-γ誘導(Wu等，1990)，因此，通過選擇性傳遞這種細胞因子，或通過使用可導致這種細胞因子在腫瘤環(huán)境中選擇性釋放的組合物，可在腫瘤內皮細胞中選擇性誘導E-選擇蛋白的表達。
雙特異性抗體是能導致一種或多種上述或其它適當?shù)募毎蜃釉谀[瘤位點、而不是身體其它位點選擇性釋放的組合物的一個例子。本文將這種雙特異性抗體稱為“誘導抗原的抗體”，當然，它們不同于具有靶向和凝血成分的本發(fā)明的任何雙特異性抗體。誘導抗原的抗體被設計成可將細胞因子效應細胞(如單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞，T細胞和/或NK細胞或肥大細胞)與被靶向的實體腫瘤塊的腫瘤細胞交聯(lián)，然后，這種交聯(lián)會引起細胞因子釋放，其釋放局限于交聯(lián)位點，即腫瘤內。
有效的誘導抗原的抗體一方面識別選定的腫瘤細胞表面抗原，另一方面識別選定白細胞細胞類型表面的選定“激活細胞因子”的抗原。術語“激活細胞因子”的抗原被用于指白細胞表面多種已知分子中的任一種，當它結合效應分子，如抗體或其片段或者天然因子或其合成類似物時，可促進白細胞釋放細胞因子，所述效應分子是可溶性因子或另一細胞上的膜結合的反受體。激活細胞因子的分子的例子包括可激活IL-1和TNFα釋放的CD14(LPS受體)和IgE的FcR；和可分別激活IFNγ和TNFβ釋放的CD16，CD2或CD3或CD28。
一旦被導入攜有腫瘤的動物的血流中，這種誘導抗原的雙特異性抗體會結合腫瘤內的腫瘤細胞，將腫瘤細胞與浸潤腫瘤的效應細胞(如單核細胞/巨噬細胞)交聯(lián)，然后引起細胞因子在腫瘤內選擇性釋放。然而，重要的是，沒有腫瘤和白細胞的交聯(lián)，誘導抗原的抗體就不會引起細胞因子的釋放，因此，在摘除腫瘤的身體部位不會釋放細胞因子，被細胞因子誘導的分子(如E-選擇蛋白)的表達僅在腫瘤內皮細胞內出現(xiàn)。
已知有大量有用的“激活細胞因子”的抗原，當它們與適當?shù)碾p特異性抗體交聯(lián)時會導致交聯(lián)的白細胞釋放細胞因子。用于此目的的普遍優(yōu)選靶是發(fā)現(xiàn)于單核細胞和巨噬細胞表面的CD14。當CD14被交聯(lián)時，會刺激單核細胞/巨噬細胞釋放IL-1(Schutt等，1988；Chen等，1990)，可能還釋放其它的細胞因子，它們反過來會刺激E-選擇蛋白在附近的血管系統(tǒng)中出現(xiàn)。與E-選擇蛋白誘導和靶向相關的其它可能的交聯(lián)靶包括肥大細胞上發(fā)現(xiàn)的IgE的FcR；NK細胞上發(fā)現(xiàn)的IgG的FcR(CD16)；以及T細胞表面發(fā)現(xiàn)的CD2，CD3或CD28。其中，一般優(yōu)選CD14靶向，因為與其它白細胞細胞類型相反，實體腫瘤中單核細胞/巨噬細胞浸潤相對有優(yōu)勢。
在一例誘導實施方案中，用雙特異性(Fab’-Fab’)抗CD14/抗腫瘤抗體(如針對高Mr黑素瘤抗原OV-TL3的抗-CEA，9.2.27抗體或針對卵巢相關抗原的MOv18抗體)注射攜有實體腫瘤的動物?？贵w由于其結合腫瘤的活性而定位于腫瘤中，然后通過交聯(lián)它們的CD14抗原而激活腫瘤中的單核細胞和巨噬細胞(Schutt等，1988；Chen等，1990)。被激活的單核細胞/巨噬細胞具有殺腫瘤活性(Palleroni等，1991)，并釋放可快速地在腫瘤血管內皮細胞上誘導E-選擇蛋白抗原的IL-1和TNF(Bevilacqua等，1987；Pober等，1991)。
MHC II類抗原可用于本發(fā)明的第二組優(yōu)選的可誘導標記物是MHC II類抗原(Collins等，1984)，包括HLA-DR，HLA-DP和HLA-DQ。II類抗原在多個物種(包括人在內)的大多數(shù)正常組織中的血管內皮細胞上表達。體外研究(Collins等，1984；Daar等，1984；O’Connell等，1990)和體內研究(Groenewegen等，1985)表明，血管內皮細胞表達II類抗原需要IFN-γ的持續(xù)存在，IFN-γ由TH1細胞產生，較低程度上由NK細胞和CD8+T細胞產生。
MHC II類抗原不是血管內皮細胞所獨有的，它也在B細胞、激活的T細胞、單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞和某些上皮細胞上組成型表達，這一點在小鼠(Hammerling，1976)和人(Daar等，1984)中得到驗證。由于MHC II類抗原在“正?！眱绕ぜ毎系谋磉_，因此它們的靶向不象E-選擇蛋白那樣十分簡單。然而，通過聯(lián)合使用能有效抑制II類分子在正常組織中表達的免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素A(CsA)，即有可能進行MHC II類抗原的誘導和靶向(Groenewegen等，1985)。CsA是通過防止激活T細胞和NK細胞(Groenewegen等，1985；DeFranco，1991)、由此將IFN-γ的基礎水平降低至維持II類分子在內皮細胞上表達所需的水平之下而起作用的。
有多種與CsA相關的其它環(huán)孢菌素，包括環(huán)孢菌素A，B，C，D，G等等，它們也具有免疫抑制作用，可能會顯示出抑制II類表達的能力?？赡芫哂蓄愃谱饔玫钠渌噭┌‵K506和納巴霉素。
因此，MHC II類抗原誘導和靶向實施方案的實踐需要用一定劑量的CsA或能有效抑制II類表達的其它II類免疫抑制劑預處理攜有腫瘤的動物。當使用CsA時，劑量一般約為10至30mg/kg體重。一旦II類抗原在正常組織中被抑制，即可同樣通過使用雙特異性抗體而在腫瘤內皮細胞中選擇性誘導II類抗原。
在這種情況下，誘導抗原的雙特異性抗體應對腫瘤細胞標記物和能誘導IFN-γ產生的效應細胞之表面存在的激活抗原具有特異性。這種效應細胞一般是輔助性T細胞(TH)或天然殺傷(NK)細胞。在這些實施方案中，T細胞或NK細胞(如果使用CD16的話)必需存在于腫瘤中以產生細胞因子中間體，因為II類抗原的表達可使用IFN-γ達到，而用其它細胞因子不能達到。因此，為了實踐本發(fā)明的這一方面，理想的是選擇CD2，CD3，CD28，或最優(yōu)選選擇CD28作為激活細胞因子的抗原，以通過誘導抗原的雙特異性抗體進行靶向。
應在腫瘤中被激活的T細胞是那些與血管系統(tǒng)相鄰的T細胞，因為細胞最容易到達這一區(qū)域，而且雙特異性抗體也最密集。被激活的T細胞應還分泌可在相鄰腫瘤血管系統(tǒng)上誘導II類抗原的IFN-γ。
本發(fā)明優(yōu)選使用雙特異性(Fab’-Fab’)抗體，該抗體的一個臂針對的是腫瘤抗原，另一個臂針對的是CD28。此抗體交聯(lián)腫瘤內T細胞上的CD28抗原，當它與第二信號(通過例如一般由腫瘤細胞分泌的IL-1提供(Burrows等，1991；Ruco等，1990))聯(lián)合時，顯示出可通過不依賴于CA2+的非CsA抑制性途徑激活T細胞(Hess等，1991；June等，1987；Bjorndahl等，1989)。
本領域技術人員熟知如何制備針對多種激活細胞因子之分子的抗體，例如，目前，幾個實驗室已描述了能誘導白細胞產生細胞因子的抗CD14和抗CD28單克隆抗體的制備和使用(分別參見Schutt等，1988；Chen等，1990和June等，1990)的綜述。另外，通過其它機制和其它激活抗原刺激白細胞釋放細胞因子的單克隆抗體的制備也是已知的(Clark等，1986；Geppert等，1990)。
在其它實施方案中，發(fā)明人預計可用其它方法抑制II類分子的表達，并在腫瘤部位選擇性地引發(fā)II類分子表達。避免同時使用CsA和雙特異性激活抗體的此方法利用了下述事實，即通過使用抗CD4抗體，可抑制T細胞產生IFN-γ，從而有效抑制II類分子的表達(Street等，1989)。使用此實施方案，通過施用抗CD4抗體可抑制IFN-γ產生，導致II類分子的表達全面地被抑制。然后使用例如僅在腫瘤內可被激活的腫瘤特異性T細胞，可僅在腫瘤位點誘導II類分子。
在這種治療模式中，一般用能有效抑制IFN-γ產生、從而抑制II類分子表達的一定劑量抗CD4預處理動物或人患者。預計有效劑量是例如約4至10mg/kg體重左右。II類分子的表達被抑制之后，即制備能產生IFN-γ的T細胞克隆(如Th1或細胞毒性T淋巴細胞，CTL)并將該克隆導入血流中，所述克隆對腫瘤細胞表面表達的抗原有特異性。這些T細胞因其識別抗原的能力而定位于腫瘤塊上，并通過這種識別釋放IFN-γ。以此方式，細胞因子的釋放同樣局限于腫瘤中，因此使II類分子的表達限制在腫瘤血管系統(tǒng)中。
可產生IFN-γ的T細胞克隆可得自外周血(Mazzocchi等，1990)，然而，優(yōu)選的來源是得自腫瘤塊內(Fox等，1990)。本發(fā)明優(yōu)選的制備這種T細胞克隆的方法是從患者體內摘出部分腫瘤塊；分離細胞，必要時可使用膠原酶消化；使用密度梯度離心，然后通過例如用特異性抗體和補體處理除去其它白細胞亞型，以富集浸潤腫瘤的白細胞；然后在體外擴展浸潤腫瘤的白細胞以得到產生IFN-γ的克隆。此克隆必需與患者免疫學相容，因此患者應能很好地耐受此克隆。
建議通過每14天確定各個克隆的細胞因子分泌模式而從擴展的白細胞中進一步選擇高產IFN-γ的T細胞克隆，這樣做特別有利。為此，對靜息克隆進行促分裂性或抗原性刺激約24小時，并使用例如特異性夾心ELISA技術(Cherwinski等，1989)檢測其培養(yǎng)物上清液中IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5和IL-10的存在。選擇分泌高水平IL-2和IFN-γ(TH1克隆的特征性細胞因子分泌模式)的克隆，使用增殖試驗進一步證實腫瘤特異性。
另外，優(yōu)選將抗CD4 Fab用作抗CD4抗體，因為它在注射后24小時內會從體內消除，因而不會導致對隨后施用的識別腫瘤的T細胞克隆的抑制。本領域技術人員一般已知具有腫瘤特異性的T細胞克隆的制備，例如可由浸潤實體黑素瘤腫瘤的淋巴細胞產生和鑒定T細胞克隆(Maeda等，1991)。
在使用任一種MHC II類抑制-誘導方法時，靜脈內注射的抗II類抗體不會到達除肝臟和脾臟以外的正常器官中的上皮細胞或單核細胞/巨噬細胞，這一事實可能會帶來其它的好處。這可能是因為大多數(shù)正常器官中的血管內皮細胞比較緊密，不象在肝臟和脾臟中的那樣有孔，因此抗體必須擴散經過基底膜以到達II類陽性細胞。同樣，例如交聯(lián)后可產生的任何B細胞消除不可能造成嚴重的問題，因為這些細胞是由II類陰性祖細胞補充的(Lowe等，1986)，甚至B細胞殺傷(如B淋巴瘤患者中會出現(xiàn))也不會導致明顯的傷害(Vitetta等，1991)。
總的說來，盡管本發(fā)明的腫瘤凝血組合物和抗體非常簡單，不需要在操作過程中誘導抗原，但預計也可將本發(fā)明與誘導抗原的雙特異性抗體聯(lián)合使用，這種抗體一般在本發(fā)明的雙特異性凝血配體之前施用。
一般說來，更具有“免疫原性”的腫瘤應更適于涉及例如通過抗CD28/抗腫瘤雙特異性抗體交聯(lián)腫瘤中T細胞的MHC II類方法，因為這些腫瘤更可能被T細胞浸潤，這是該方法有效的先決條件。免疫原性的實體腫瘤的例子包括腎癌，黑素瘤，少數(shù)乳腺癌和結腸癌，可能還有胰腺癌，胃癌，肝癌，肺癌和膠質細胞腫瘤。這些腫瘤之所以被稱為“免疫原性的”是因為有證據(jù)表明它們可在宿主中引發(fā)免疫應答，已發(fā)現(xiàn)它們經得起細胞免疫療法(Yamaue等，1990)。對黑素瘤和大腸癌而言，此時最優(yōu)選使用的抗體是B72.3(抗TAG-72)和PRSC5/PR4C2(抗Lewis a)或9.2.27(抗高Mr黑素瘤抗原)。
對所有來源的大多數(shù)實體腫瘤而言，利用巨噬細胞/單核細胞中間體的抗CD14方法更加適合，這是因為大多數(shù)腫瘤中富含巨噬細胞。富含巨噬細胞的腫瘤的例子包括大多數(shù)乳腺癌，結腸癌和肺癌。此時優(yōu)選使用的抗腫瘤抗體的例子是抗HER-2，B72.3，SM-3，HMFG-2和SWA11(Smith等，1989)。
(c)促凝劑可誘導的標記物促凝劑也可起誘導某些標記物的作用，所述促凝劑如凝血酶，因子IX/IXa，因子X/Xa，纖溶酶和金屬蛋白酶，如間質膠原酶，溶基質素和明膠酶。特別是凝血酶可誘導E-選擇蛋白，P-選擇蛋白，PDGF和ICAM-1(Sugama等，1992；Shankar等，1994)。
因此，為了進行誘導，可利用抗促凝劑/抗腫瘤雙特異性抗體。該抗體可通過其腫瘤結合活性而定位于腫瘤中，然后，雙特異性抗體可將促凝劑(如凝血酶)集中于腫瘤中，導致在腫瘤血管內皮細胞上誘導E-選擇蛋白和P-選擇蛋白(Sugama等，1991；Shankar等，1994)。
或者，截短的組織因子對腫瘤細胞或內皮細胞的靶向會誘導凝血酶沉積在腫瘤內。由于凝血酶被沉積，E-選擇蛋白和P-選擇蛋白將在腫瘤血管內皮細胞上被誘導。
(d)針對血管內皮細胞標記物的抗體識別不論是在天然環(huán)境中被誘導還是通過人工方法誘導的疾病相關血管系統(tǒng)靶的簡單方法是使用對特定細胞表面受體，分子或抗原具有結合親合性的抗體。這些抗體包括針對已知存在于例如腫瘤血管內皮細胞上的所有細胞表面成分的抗體，針對對腫瘤衍生的因子反應而被誘導或過量表達的成分的抗體，針對人工操作之后被誘導的成分的抗體。
抗vWF識別抗原VIII R Ag，對其存在的腫瘤類型100％染色，對腫瘤內血管100％染色，在正常血管中呈現(xiàn)強染色模式。FB5識別抗原內皮唾液酸蛋白，對其存在的腫瘤類型50％染色，對腫瘤內血管10-30％染色，并在淋巴器官的正常血管中呈現(xiàn)染色模式。TP3識別抗原80KDa骨肉瘤相關抗原蛋白，對其存在的腫瘤類型50％染色，對腫瘤內血管10-30％染色，并在小血管的正常血管中呈現(xiàn)強染色模式。BC-1識別抗原纖連蛋白同種型，對其存在的腫瘤類型60％染色，對腫瘤內血管10-30％染色，但未在正常血管中呈現(xiàn)染色模式。TV-1識別抗原纖連蛋白，對其存在的腫瘤類型100％染色，對腫瘤內血管100％染色，并在所有正常血管中呈現(xiàn)強染色模式。LM 609識別αvβe玻連蛋白受體，對其存在的腫瘤類型85％染色，對腫瘤內血管70-80％染色，并在正常血管中呈現(xiàn)中度染色模式。TEC-11識別endoglin，對其存在的腫瘤類型100％染色，對腫瘤內血管100％染色，在大多數(shù)正常血管中呈現(xiàn)弱染色模式。TEC110識別抗原VEGF，對其存在的腫瘤類型100％染色，對腫瘤內血管100％染色，在大多數(shù)正常血管中呈現(xiàn)弱染色模式。
在抗EC mAb對人腫瘤的比較研究中，發(fā)現(xiàn)TEC110、TV-1和TEC11在胃腸，腮腺，乳腺，卵巢，子宮，肺和何杰金氏類型的腫瘤中呈陽性，而FB-5在胃腸和肺腫瘤中具有微弱的染色，在所列其它腫瘤中呈陰性。TP-3在胃腸腫瘤中呈陽性，而在腮腺腫瘤類型、卵巢腫瘤和何杰金氏類型的腫瘤中較少呈陽性。BC-1在胃腸腫瘤以及生殖和呼吸道腫瘤中呈陽性，IM609在胃腸、卵巢、子宮、肺和何杰金氏腫瘤以及生殖和呼吸道腫瘤中呈陽性。
可用于本發(fā)明的兩種其它抗體是Rettig等(1992)和Wang等(1993)所描述的針對在人腫瘤血管系統(tǒng)中表達、而在大多數(shù)正常組織中不表達、未知功能的不相關抗原的抗體。
本發(fā)明也可使用Kim等(1993)所述的抗體，這是因為此抗體可在體內抑制血管生成和抑制腫瘤生長。
也可使用以前未顯示出特異于人腫瘤的抗體。例如，Venkateswaran等(1992)描述了抗FGF MAb的制備，Xu等(1992)開發(fā)和鑒定了針對FGF受體(flg)同種型的16個同種型和區(qū)域特異性多克隆和單克隆抗體系列。Massoglia等(1987)也報道了針對FGF受體的MAb。
(e)產生針對疾病血管系統(tǒng)的抗體除了利用已知的抗體，如上文所述的抗體和科學文獻中已知和公開的那些抗體外，還可使用下文詳述的標準免疫方法產生新的抗體。為了產生針對已知的疾病相關性血管標記物抗原的抗體，可用含有該抗原的免疫原性組合物免疫動物。所述組合物可以是膜制品，其中包括或富含抗原；分離自細胞或膜的相對純化形式的抗原；使用例如天然抗原提取物或得自重組宿主細胞的重組形式抗原，通過多種純化步驟得到的高度純化形式的抗原。
本發(fā)明也提供了產生針對疾病相關性血管系統(tǒng)內皮細胞上所存在抗原的抗體的其它方法，此方法甚至在不知道抗原的生物化學特性的情況下也是適用的。通過產生針對腫瘤血管系統(tǒng)內皮細胞的抗體可舉例說明這些方法。以此方式產生抗體的第一種方法使用得自動物或人患者腫瘤位點的血管內皮細胞制品，只需簡單地用這種細胞的制品免疫實驗動物并收集所產生的抗體。此方法最有用的形式是當隨后選擇特異性抗體時，使用常規(guī)的雜交瘤技術和針對腫瘤血管內皮細胞進行篩選即可做到。
上述方法的一個發(fā)展是體外模擬腫瘤血管系統(tǒng)現(xiàn)象、并且不需要細胞純化的情形。使用此方法時，在細胞培養(yǎng)中而非動物體內使內皮細胞接觸腫瘤衍生的產物，所述產物例如可得自腫瘤條件培養(yǎng)基。此方法一般包括用腫瘤條件培養(yǎng)基刺激內皮細胞，并利用受刺激的內皮細胞作為免疫原以制備抗體集合物。同樣需使用例如常規(guī)的單克隆抗體技術，或如由分離自經免疫動物脾臟的RNA制備的組合免疫球蛋白噬菌粒文庫之類的其它技術選擇特異性抗體。應選擇相對于正常成人組織而言。更優(yōu)先識別腫瘤刺激的血管內皮細胞并與腫瘤相關的內皮細胞更強烈反應的特異性抗體。
(f)抗endoglin抗體本發(fā)明人之一已制備和分離了對腫瘤血管內皮細胞具有相對特異性的抗體。使用上述方法(美國流水號08/457,229和08/457,031，都列入本文作為參考)得到了被稱為腫瘤內皮細胞抗體4和腫瘤內皮細胞抗體11(TEC4和TEC11)的MAb。TEC4和TEC11可識別的抗原最終被確定為分子endoglin。endoglin上由TEC4和TEC11識別的表位存在于被刺激的HUVE細胞的細胞表面上，未受刺激的細胞表面上僅有極少數(shù)存在(或免疫學上可接近)。以前已針對endoglin產生了MAb，然而，通過FACS或間接免疫熒光術分析與HUVEC或TCM-激活的HUVEC細胞表面決定簇的反應性，結果表明由TEC4和TEC11識別的表位不同于以前稱為44G4的抗體的表位(Gougos和Letarte，1988)。
(g)使用血管內皮細胞結合配體已知可與內皮細胞表面分子(如生長因子受體)結合或相互作用的生物學配體也可用作靶向成分。
在此意義上可用作靶的生長因子或配體包括VEGF/VPF，F(xiàn)GF，TGFβ，結合TIE的配體，腫瘤相關的纖連蛋白同種型，分散因子，肝細胞生長因子(HGF)，血小板因子4(PF4)，PDGF和TIMP。
特別優(yōu)選的靶是VEGF/VPF，F(xiàn)GF家族的蛋白質和TGFβ。Abraham等(1986)克隆了FGF，因此可得到重組蛋白形式的FGF。如Ferrara等(1991)所報道，已克隆了具有121，165，189和206個氨基酸的4種VEGF。
(h)結合配體的靶向抗體或特異性靶向配體也可針對與疾病位點(如腫瘤)的血管內皮細胞表面結合的任何成分。這種成分的例子是可與內皮細胞上已存在的特異性細胞表面受體結合，或可與這種細胞上由于對腫瘤環(huán)境作出反應而誘導或過量表達的受體結合的腫瘤衍生的配體和抗原，如生長因子。腫瘤血管系統(tǒng)相關靶也被稱為腫瘤衍生的內皮細胞結合因子。
成功的疾病靶向所需的特異性水平可以達到，部分因為局部內皮細胞可被誘導表達或顯露出在正常內皮細胞上不存在或低量表達或隱藏的受體。至于腫瘤，還會導致進一步的特異性，因為腫瘤中的內皮細胞會捕獲腫瘤衍生的因子，將它們結合至細胞表面，降低了其它組織可得到的配體量。由于分布在血液和組織流體庫中而進一步稀釋了因子或配體聯(lián)合，結合這一點，預計正常組織中的內皮細胞可結合的這種因子相對很少，因此，在操作上，細胞表面的結合配體或因子能用作腫瘤內皮細胞標記物。
除了由腫瘤細胞自身產生外，腫瘤內皮細胞結合因子也可源自已浸潤腫瘤的其它細胞類型，如巨噬細胞和肥大細胞，或可由在腫瘤內被激活的血小板產生。
可用作腫瘤血管系統(tǒng)相關性靶向劑的其它生長因子或配體包括EGF，F(xiàn)GF，VEGF，TGFβ，HGF(NaKamura，1991)，angiotropin，TGF-α，TNF-α，PD-ECGF和TIE結合配體(Bicknell和Harris，1992)。本發(fā)明優(yōu)選的靶向劑是VEGF/VPF，F(xiàn)GF家族蛋白質，轉化生長因子-β(TGF-β)；TGF-α；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；angiotropin；血小板衍生的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)；TIE結合配體；多效蛋白(pleiotropin)。另外，本發(fā)明的某些方面也可以使用特異性靶向腫瘤血管系統(tǒng)的非抗體靶向成分，如膜聯(lián)蛋白和含有三肽序列R-G-D的肽(Pasqualini等，1997)。
本發(fā)明的另一方面是使用特異于僅在配體-受體復合物中存在的表位的靶向抗體，或得自該抗體的結合區(qū)域，各個(游離)配體和未結合形式的受體上不存在所述表位。這些抗體識別和結合獨特的構象，所述構象是當配體(如生長因子)與其受體(如生長因子受體)結合形成特異性結合的復合物時產生的。這種表位不存在于非復合形式的配體或受體上。
發(fā)明人預計可結合這些抗體的配體-受體復合物存在于腫瘤相關內皮細胞上的量比非腫瘤相關內皮細胞上的量顯著要高。因此，這種抗體可用作靶向劑，并可進一步增強本發(fā)明雙特異性促凝劑的特異性。
(i)受體構建體內皮細胞表面受體的可溶性結合域也可用作本發(fā)明的靶向配體，這一概念一般基于眾所周知的夾心結合現(xiàn)象，這一現(xiàn)象已被多種體外和體內結合方案采用?；旧希捎趦绕ぜ毎磉_特異性受體，因此細胞結合和吸附相應的配體，然后配體可用于結合被導入系統(tǒng)中的其它受體構建體。
在上述章節(jié)中已鑒定了有用的內皮細胞受體范圍，其中特別優(yōu)選的靶是VEGF/VPF，F(xiàn)GF，TGFβ，TIE-1和TIE-2?？刹僮鬟@些受體中的每一個以形成可用作靶向配體的可溶性結合域。
iv.疾病相關的基質細胞靶(a)胞外基質靶Birembaut等(1985)描述了基底膜標記物在腫瘤病理學中的用途。這些研究表明在腫瘤病理學中，基底膜(BM)標記物，IV型膠原，層粘連蛋白(LM)，硫酸乙酰肝素粘蛋白(HSP)和纖連蛋白(FN)的分布被破壞。Burtin等(1983)也描述了人轉移性淋巴結中基底膜和結締組織抗原的變化。
本發(fā)明可使用的優(yōu)選靶是RIBS。據(jù)Ugarova等(1993)報道構象變化出現(xiàn)于血纖蛋白原中，是由血纖蛋白原與血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa的相互作用引起的。血纖蛋白原與激活的血小板上膜糖蛋白GPIIb-IIIa的結合會導致血小板聚集，這種相互作用導致血纖蛋白原的構象發(fā)生變化，受體誘導的結合位點(RIBS)的表達就可以證明這一點，這種結合位點是由結合形式而非游離形式的配體表達的表位。
Ugarova等(1993)已定位了兩個RIBS表位，一個序列位于γ112-119，它由MAb 9F9識別；第二個是位于Aα 95-98的RGDF序列，它由mAb 155B16識別。通過將血纖蛋白原吸附至塑料表面，并用纖溶酶消化該分子也可暴露這些表位。表位的蛋白酶解暴露與裂解Aα鏈的羧基末端以形成片段X2一致。血纖蛋白原內Aα95-98位RGDF序列的不可接近性表明此序列不參與該分子與GPIIb-IIIa的最初結合。
血纖蛋白原與其受體的結合改變了Aα鏈羧基末端方向的構象，暴露出位于該分子D和E區(qū)域之間的卷曲螺旋頸圈區(qū)段的序列，產生RIBS表位。實踐中，建議將RIBS序列用作凝血配體靶向的表位，因此，使用Mab 9F9和155B16是有利的，使用Zamarron等(1991)所述的抗體也可能是有利的。
(b)其它的細胞靶用于本發(fā)明的聯(lián)合的其它優(yōu)點在于通過將它們靶向疾病區(qū)域內發(fā)現(xiàn)的細胞類型，可使用它們將促凝劑導入疾病相關的血管系統(tǒng)。
血小板通過粘附至受傷的血管壁并在受傷位點積累而參與止血和凝血。盡管血管受傷位點處的血小板沉積在生理條件下負責初步止血，但它在病理條件下會導致血管堵塞，結果導致缺血性組織損傷和血栓栓塞。
血小板與其環(huán)境的相互作用及其互相之間的相互作用代表了在細胞表面上起始的復雜過程，因此，表面膜提供了包括血管壁和血漿成分的外部介質與血小板內部之間的反應界面。
使用本發(fā)明可靶向p-155，p-155是激活的血小板上表達的多聚體血小板蛋白(Hayward等，1991)。血小板通過經受復雜的生物化學和形態(tài)學的變化而對大量刺激物作出反應，這些變化涉及包括粘附、聚集和凝血在內的生理學進程。血小板激活產生了可由單克隆抗體識別的膜變化。單克隆抗體JS-1(Hayward等，1991)是可用作凝血配體部分的這樣一種抗體。
配體誘導的結合位點(LIBS)是僅在配體的結合導致受體改變形狀、介導隨后的生物學事件之后，而出現(xiàn)于細胞表面受體上的位點。可將它們看作RIBS的對應物，它們也是本發(fā)明優(yōu)選使用的靶。
Frelinger等(1990；1991)已研制出了13種抗LIBS抗體，根據(jù)本發(fā)明，其中任何一種都可用于將促凝劑傳遞至疾病或腫瘤位點。也可使用Dewerchin等(1991)所述的鼠單克隆抗血小板抗體MA-TSPI-1(針對人血小板反應蛋白)和MA-PMI-2，MA-PMI-1和MA-LIBS-1(針對人血小板糖蛋白IIb/IIIa上的LIBS)，也可使用Heynen等(1994)所述的RUU2.41和LIBS-1；Tomiyama等(1992)所述的OP-G2；和Ab-15。
也可以使用很多其它的靶，如平滑肌細胞、周細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和浸潤性淋巴細胞和白細胞上的抗原。
v.毒素對某些應用而言，可預想第二種治療劑是與抗體或生長因子結合的藥劑，尤其是具有殺死內皮細胞或抑制其生長或細胞分裂這種能力的細胞毒性劑或抗細胞劑。通常，本發(fā)明的第二方面包括可與靶向劑(優(yōu)選抗體)綴合、并能以活性形式傳遞至被靶向的內皮細胞或基質的任何藥劑的使用。例舉的抗細胞劑包括化學治療劑，放射性同位素以及細胞毒素。有關化學治療劑，發(fā)明人建議特別優(yōu)選使用的藥劑如激素，如類固醇；抗代謝物，如阿糖胞苷，氟尿嘧啶，氨甲碟呤或氨基碟呤；anthracycline；絲裂霉素C；長春花生物堿；秋水仙胺；表鬼臼毒素吡喃葡糖苷；光輝霉素；或抗腫瘤烷化劑，如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。其它實施方案包括如細胞因子、生長因子、細菌內毒素或細菌內毒素的脂質A部分之類的藥劑。在任何情況下，建議必要時，可使用已知的綴合技術將上述藥劑成功地與靶向劑(優(yōu)選與抗體)綴合，以使它們按需要靶向、內在化、釋放或呈遞至被靶向的內皮細胞位點處的血液成分(例見Ghose等，1983和Ghose等，1987)。
在某些優(yōu)選的實施方案中，免疫毒素一般包括衍生自植物、真菌或細菌的毒素，如A鏈毒素、核糖體滅活蛋白、α-八疊球菌、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、白喉毒素或假單胞菌外毒素，需指出這只是一些例子。免疫毒素領域的技術人員熟知毒素-抗體構建體的使用以及免疫毒素與抗體的結合。其中特別優(yōu)選與抗體結合的毒素是去糖基化的蓖麻毒蛋白A鏈。去糖基化的蓖麻毒蛋白A鏈被優(yōu)選的原因在于其具有十分強的效力，較長的半壽期，并且在臨床級別和規(guī)模上制備它也便宜易行。
(a)制備靶向劑-毒素綴合物盡管免疫毒素的制備一般是本領域已知的(例見美國專利4,340,535和歐洲專利44167，都列入本文作為參考)，本發(fā)明人仍意識到通過在制備免疫毒素和純化該毒素以供隨后臨床施用的過程中使用某些優(yōu)選的技術可獲得某些好處。例如，盡管基于IgG的免疫毒素與其Fab’配對物相比一般表現(xiàn)出更好的結合能力和更慢的血液清除速率，但基于Fab’片段的免疫毒素與基于IgG的免疫毒素相比一般表現(xiàn)出更好的組織穿透能力。
另外，盡管已知多種類型的含有二硫鍵的連接子可成功地用于將毒素部分與靶向劑綴合，但基于不同的藥理學特征和能力，某些連接子一般優(yōu)于其它連接子。例如，優(yōu)選含有空間上“受阻”的二硫鍵的連接子，因為這種連接子在體內更加穩(wěn)定，可防止毒素部分在結合至作用位點之前就被釋放下來。另外，盡管通過使用大量毒素部分中的任一種可實現(xiàn)本發(fā)明的某些好處，但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用蓖麻毒蛋白A鏈，甚至更優(yōu)選使用去糖基化的A鏈，將會帶來特別的好處。
已知多種細胞毒性劑可與抗內皮細胞抗體綴合，例子包括來自植物、真菌或甚至細菌的多種有用毒素，例如包括多種A鏈毒素，特別是蓖麻毒蛋白A鏈，如皂草素或gelonin的核糖體滅活蛋白，α-八疊球菌，曲霉菌素，局限曲菌素，如胎盤核糖核酸酶的核糖核酸酶，血管生成素(angiogenic)，白喉毒素和假單胞菌外毒素，所述的僅是一些例子。本發(fā)明最優(yōu)選的毒素部分是已被處理以修飾或除去糖殘基的毒素A鏈，即所謂的去糖基化A鏈。發(fā)明人通過使用目前可從Inland Laboratories，Austin，TX商購的去糖基化蓖麻毒蛋白A鏈(dgA)取得了最大的成功。
然而，從藥理學的觀點看，需要利用仍可提供適當生物反應的最小的分子，因此，可能會希望利用能提供足夠抗細胞反應的較小A鏈肽。為此，其他人已發(fā)現(xiàn)，通過利用Nagarase(Sigma)除去30個N-末端氨基酸可使蓖麻毒蛋白A鏈被“截短”，但仍保留足夠的毒素活性。建議必要時可在本發(fā)明的綴合物中使用這種截短的A鏈。
或者，可能會發(fā)現(xiàn)對毒素A鏈部分應用重組DNA技術會為本發(fā)明提供其它顯著的優(yōu)點。參照其他人的文獻(O’Hare等，1987；Lamb等，1985；Halling等，1985)，已能夠克隆和表達有生物學活性的蓖麻毒蛋白A鏈，這樣，目前已有可能鑒定和制備仍表現(xiàn)出適當毒素活性的較小肽或變異肽。另外，蓖麻毒蛋白A鏈目前已被克隆，這一事實使得可利用定點誘變，通過定點誘變可容易地制備和篩選A鏈衍生的肽，并得到其它有用的部分以用于本發(fā)明。
綴合物的毒素A鏈區(qū)域與靶向劑區(qū)域的交聯(lián)是本發(fā)明的一個重要方面。在某些情況下，需要利用具有二硫鍵功能的交聯(lián)劑以使綴合物具有生物活性，這么做的原因尚不清楚，但可能是由于需要在靶向劑將毒素“傳遞至”被靶向的細胞時某些毒素部分能夠容易地從靶向劑上釋放下來。交聯(lián)劑的類型，以及如何進行交聯(lián)將會改變所得綴合物的藥物動力學。歸根結底，在希望毒素可以釋放的情況下，人們期望的綴合物是在除了預定作用位點以外的所有身體部位中的條件下能夠保持完整，而在所述作用位點處具有良好的“釋放”特性。因此，具體交聯(lián)方案，特別包括所用的具體交聯(lián)劑和被交聯(lián)的結構具有一定的意義。
取決于用作融合蛋白一部分的特定毒素化合物，可能會需要提供與靶向劑和毒素化合物可操縱地結合的肽間隔區(qū)，所述間隔區(qū)能折疊成以二硫鍵鍵合的環(huán)結構，然后，環(huán)內的蛋白酶裂解會產生異二聚體多肽，其中靶向劑和毒素化合物僅通過單個二硫鍵連接。例見Lord等(1992)，這種毒素的一個例子是蓖麻毒蛋白A鏈毒素。
當利用其它一些毒素化合物時，可提供不能被裂解的肽間隔區(qū)，以可操作地連接融合蛋白的靶向劑和毒素化合物?？膳c不能被裂解的肽間隔區(qū)結合使用的毒素是自身可通過蛋白水解切割而轉變?yōu)榧毎拘缘亩蜴I鍵合形式(例見Ogata等，1990)，這種毒素化合物的例子是假單胞菌外毒素化合物。
本文可使用的核酸包含編碼所需靶向劑的核酸序列和編碼所需毒素的核酸序列。這種編碼靶向劑和編碼毒素的核酸序列連接的方式能使得核酸的翻譯可產生本發(fā)明的靶向劑/毒素化合物。
(b)其它藥劑與靶向劑的結合預計本發(fā)明其它IT方面的大多數(shù)治療應用包括將毒素部分靶向腫瘤內皮細胞或基質，這是因為與其它潛在的藥劑相比，大多數(shù)毒素提供細胞殺傷效應的能力更強。然而，也存在某些情況，例如當靶抗原通過與靶向劑/毒素化合物(如免疫毒素)有效致毒相一致的途徑不能內在化時，就需要靶向化學治療劑，如抗腫瘤藥物，其它細胞因子，抗代謝物，烷化劑，激素等。這些藥劑優(yōu)于與非靶向劑綴合的對應物的優(yōu)點在于靶向劑(如抗體)提供了額外的選擇性。有關所述藥劑的例子，有類固醇，阿糖胞苷，氨甲蝶呤，氨基蝶呤，anthracyclines，絲裂霉素C，長春花生物堿，秋水仙胺，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷，光輝霉素等。當然，所列出的僅是一些例子，因為使藥劑與靶向劑(如抗體)結合從而特異性傳遞至組織的技術已完善建立(例見Ghose和Blair，1987)。
目前，已成功地將多種化學治療劑和其它藥劑與抗體綴合在一起，并顯示出起到藥物的作用(例見Vaickus等，1991)。已研究的抗腫瘤劑包括例如阿霉素，柔紅霉素，氨甲蝶呤，長春花堿和多種其它藥劑(Dillman等，1988；Pietersz等，1988)。另外，已描述了其它藥劑的結合，所述藥劑如新制癌素(Kimura等，1983)，大分子霉素(Manabe等，1984)，三亞胺醌(Ghose，1982)和α-鵝膏毒環(huán)肽(Davis和Preston，1981)。
vi.凝血配體本發(fā)明任選使用的第二種靶向劑也可包括能促進凝血的靶向成分，這種“促進靶向凝血的藥劑”或“凝血配體”包括能與一種或多種凝血因子可操作結合的上述任何靶向劑。靶向劑可與能直接或間接刺激凝血的因子直接連接，或者靶向劑可連接第二個結合區(qū)域，所述區(qū)域可結合并釋放能直接或間接刺激凝血的凝血因子。
(a)凝血因子如本文詳述，例舉的凝血因子是本發(fā)明的tTF，二聚體、多聚體和突變體分子類型。
本發(fā)明可使用多種如下文所述的其它凝血因子。當凝血因子與第一種結合或靶向劑共價連接時，使用不同于其功能性凝血位點的位點來連接分子。在下文各章節(jié)中也描述了不同于凝血因子的活性位點或功能性區(qū)域的適當連接區(qū)域。
凝血因子本發(fā)明中也可使用凝血酶，因子V/Va和衍生物，因子VIII/VIIIa和衍生物，因子IX/IXa和衍生物，因子X/Xa和衍生物，因子XI/XIa和衍生物，因子XII/XIIa和衍生物，因子XIII/XIIIa和衍生物，因子X激活物和因子V激活物。
蛇毒促凝劑Williams和Esnouf于1962年證明Russell蝰蛇毒含有促凝劑蛋白，Kisiel(1979)分離出可激活因子V的蛇毒糖蛋白；Di Scipio等(1977)證明得自蛇毒的蛋白酶可激活人因子X。因子X激活物是可用于本發(fā)明的成分。
特異于Russell蝰蛇毒中存在的因子X激活物的單克隆抗體也已經產生(例如Pukrittayakamee等，1983的MP1)，可使用該單克隆抗體將藥劑傳遞至體內特定的靶位點。
前列腺素和合成的酶血栓烷A2是通過血小板微粒體中的環(huán)加氧酶和血栓烷合成酶的相繼作用而由內過氧化物形成的。血小板易于產生血栓烷A2，血栓烷A2利用其引起血小板聚集的能力而成為有效的血管收縮劑(Whittle等，1981)。
血栓烷A2及其活性類似物都可以用于本發(fā)明。Bhagwat等(1985)描述了產生血栓烷A2的合成方案。本文特別包括使用Ohuchida等(1981)描述的血栓烷A2類似物(尤其是化合物2)。
血栓烷合成酶和能合成可激活血小板的前列腺素的其它酶也可用作本發(fā)明上下文中的“促凝劑”。Shen和Tai(1986)描述了血栓烷合成酶的單克隆抗體，以及該合成酶的免疫親和純化；Wang等(1991)報道了人血栓烷合成酶的cDNA。
纖溶抑制劑α2-抗纖溶酶或α2-纖溶酶抑制劑是人血漿中天然存在的蛋白酶抑制劑，能有效抑制由纖溶酶原激活物誘導的血纖蛋白塊的裂解(Moroi和Aoki，1976)。α2-抗纖溶酶是特別有效的抑制劑，可以用于本發(fā)明。
首選按Moroi和Aoki(1976)所述純化α2-抗纖溶酶，也可使用其它純化方案，如使用纖溶酶原-Sepharose上的親和層析，DEAE-Sephadex上的離子交換層析和伴刀豆球蛋白A-Sepharose上的層析；或使用Sepharose柱上的親和層析，所述柱上攜有經彈性蛋白酶消化的纖溶酶原制劑，該制劑在纖溶酶A鏈上含有三個N-末端三聯(lián)環(huán)結構(LBSI)，接著進行凝膠過濾(Wiman和Collen，1977；Wiman，1980)。
由于α2-抗纖溶酶的cDNA序列是可以得到的(Tone等，1977)，因此，產生α2-抗纖溶酶的優(yōu)選方法是通過重組表達。
針對α2-抗纖溶酶的單克隆抗體也是可以得到的，該抗體可用于本發(fā)明的雙特異性結合配體實施方案中。例如，Hattey等(1987)描述了兩種針對α2-抗纖溶酶的MAb，即MPW2AP和MPW3AP。據(jù)報道這兩種抗體與天然α2-抗纖溶酶的反應同樣良好，因此它們都可用來將外源性的α2-抗纖溶酶傳遞至靶位點，或積累內源性α2-抗纖溶酶并將其集中于靶向區(qū)域內。也可使用由Mimuro及其同事描述的其它抗體，如JTPI-2。
(b)結合凝血因子的藥劑可與本發(fā)明的TF一起使用的另一組靶向凝血配體中的靶向區(qū)域不直接與凝血因子連接，但與可結合凝血因子的第二個結合區(qū)域連接。
當利用第二個結合區(qū)域結合和傳遞凝血因子時，選擇的結合區(qū)域應使其識別凝血因子上不會顯著損害其誘導凝血之能力的位點。適于以此方式結合的凝血因子區(qū)域一般與上文所述的適于共價連接靶向區(qū)域的區(qū)域相同。
然而，由于此類雙特異性配體有望在將凝血因子傳遞至腫瘤位點或區(qū)域后將其釋放出來，因此，凝血因子上適于結合第二種結合劑或抗體的區(qū)域更具靈活性。
可以此方式使用的適當?shù)牡诙Y合區(qū)域一般是對凝血因子具有結合特異性的抗體的抗原結合位點，所述抗體包括抗體的功能性部分，如scFv，F(xiàn)v，F(xiàn)ab’，F(xiàn)ab和F(ab’)2片段。
含有針對組織因子、凝血酶、前激肽釋放酶、因子V/Va、因子VIII/VIIIa、因子IX/IXa、因子X/Xa、因子XI/XIa、因子XII/XIIa、因子XIII/XIIIa、Russell蝰蛇毒、血栓烷A2或α2-抗纖溶酶的抗體或其片段的雙特異性結合配體是本發(fā)明此方面的示范實施方案。
(c)TF前藥例舉的tTF前藥具有下列結構tTF1-219(X)n1(Y)n2Z配體，其中tTF1-219表示TF減去胞質域和跨膜域；X表示疏水性的跨膜域，長度為n1個氨基酸(AA)(n＝1-20個AA)；Y表示親水性的蛋白酶識別序列，長度為n2個氨基酸(足夠的AA以確保適當?shù)牡鞍酌缸R別)；Z表示二硫鍵、硫酯鍵或其它連接基團，如(Cys)1-2；配體表示可識別腫瘤細胞、腫瘤EC、結締組織(基質)或基底層標記物的抗體或其它靶向部分。
可靜脈內注射tTF前藥以使其定位于疾病位點(如腫瘤)。一旦定位于患病組織內，則內源性蛋白酶(如金屬蛋白酶，凝血酶，因子Xa，因子VIIa，因子IXa，纖溶酶)會從前藥上裂解下親水性的蛋白酶識別序列，使疏水性的跨膜序列插入局部細胞膜。一旦尾部插入膜內，tTF即會重新獲得其誘導凝血的特性，導致患病組織在血管系統(tǒng)內形成凝血塊。
(d)雙特異性抗體一般而言，本領域技術人員熟知雙特異性抗體的制備，例見Glennie等(1987)。雙特異性抗體已被臨床用于例如治療癌癥患者(Bauer等，1991)。制備雙特異性抗體的一種方法包括分開制備對靶向的腫瘤細胞抗原和促凝劑(或其它所需靶，如激活性抗原)具有特異性的抗體。
雙特異性抗體也已被特別地開發(fā)用作免疫治療劑。如前文中有關抗原誘導的部分中所提及，已開發(fā)了某些這種抗體，以使淋巴細胞和腫瘤抗原交聯(lián)(Nelson，1991；Segal等，1992)。例子包括嵌合分子，該分子可結合T細胞(如在CD3上)和腫瘤抗原，并通過在靶細胞附近物理交聯(lián)TCR/CD3復合物而引發(fā)淋巴細胞激活(Staerz等，1985；Perez等，1985；1986a；1986b；Ting等，1988)。
實際上，據(jù)報道，癌癥、淋巴瘤、白血病和黑素瘤的腫瘤細胞對雙特異性抗體介導的T細胞殺傷敏感(Nelson，1991；Segal等，1992；deLeij等，1991)。這些類型的雙特異性抗體已被用于幾個I期臨床試驗以針對多種多樣腫瘤目標?？砂次墨I所述施用雙特異性交聯(lián)抗體，所述文獻如deLeij等(1991)；Clark等(1991)；Rivoltini等(1992)；Bolhuis等(1992)和Nitta等(1990)。
盡管本領域已知多種制備雙特異性抗體的方法，但Glennie等(1987)的方法包括制備兩種選定抗體的消化性F(ab’γ)2片段，接著對各個片段進行還原以得到分離的Fab’γSH片段。然后，用如鄰苯二馬來酰亞胺的交聯(lián)試劑使欲偶聯(lián)的兩個配對物之一上的SH基團烷基化，從而在一個配對物上提供游離的馬來酰亞胺基團。然后可通過硫酯鍵將此配對物與另一個配對物綴合，得到所需的F(ab’γ)2異綴合物。
因其制備容易，產量高和再現(xiàn)性好，Glennie等(1987)的方法經常是制備雙特異性抗體的優(yōu)選方法，然而，也可以使用很多其它方法，這些方法是發(fā)明人可以預想到的。例如，已知的其它一些技術中用SPDP或蛋白質A進行交聯(lián)，或制備三特異性構建體(Titus等，1987；Tutt等，1991)。
產生雙特異性抗體的另一種方法是通過融合兩種雜交瘤以形成四倍體瘤(quadroma)(Flavell等，1991，1992；Pimm等，1992；French等，1991；Embleton等，1991)。本文所用術語“四倍體瘤”描述的是兩種B細胞雜交瘤的生產性融合體。使用目前的標準技術，將兩種產生抗體的雜交瘤融合在一起，得到子代細胞，然后選擇出維持兩套克隆型免疫球蛋白基因之表達的那些細胞。
產生四倍體瘤的優(yōu)選方法包括選擇出至少一種親代雜交瘤的酶缺損突變體，然后，將第一種突變的雜交瘤細胞系與已被致死性暴露于如碘乙酰胺以防其持續(xù)存活的第二種雜交瘤的細胞融合。通過細胞融合，通過從被致死性處理過的雜交瘤處獲得補償酶缺損的基因，從而挽救第一種雜交瘤，而通過與第一種雜交瘤的融合也挽救了第二種雜交瘤。優(yōu)選(但并非要求)相同同種型、但屬于不同亞類的免疫球蛋白融合。如果用其它試驗分離優(yōu)選的四倍體瘤，則可使用混合亞類的抗體。
更詳細地說，培育和篩選四倍體瘤的一個方法包括得到分泌第一種選定MAb的雜交瘤細胞系，并使其缺損必需的代謝酶，即次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)。為了得到該雜交瘤的缺損突變體，在濃度漸增的8-氮鳥嘌呤(1×10-7M至1×10-5M)的存在下培養(yǎng)細胞。通過有限稀釋亞克隆突變體，并測試其對次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)的敏感性。培養(yǎng)基可由例如添加了10％FCS，2mM L-谷氨酰胺和1mM青霉素-鏈霉素的DMEM組成。
通過標準的細胞融合技術(Galfre等，1981)，或通過使用Clark等(1988)所述的方案，利用產生第二種所需MAb的互補雜交瘤細胞系來產生四倍體瘤。簡單地說，將4.5×107個HAT敏感型的第一種細胞與2.8×107個HAT抗性的第二種細胞混合，所述第二種細胞已于融合前，在冰上用致死劑量的不可逆生化抑制劑碘乙酰胺(5mM于磷酸鹽緩沖鹽水中)預處理30分鐘。使用聚乙二醇(PEG)誘導細胞融合，將細胞平鋪在96孔微量培養(yǎng)板上，使用含有HAT的培養(yǎng)基選擇四倍體瘤。使用例如固相同種型特異性ELISA和同種型特異性免疫熒光染色鑒定含有雙特異性抗體的培養(yǎng)物。
在一個鑒定雙特異性抗體的鑒定實施方案中，微量培養(yǎng)板(Falcon，Becton Dickinson Labware)的孔被一種試劑包被，所述試劑可與親代雜交瘤抗體中的一種特異性相互作用，但缺乏與兩種抗體的交叉反應性。洗滌培養(yǎng)板，封閉，并向各個孔中加入需檢測的上清液(SN)。室溫下將培養(yǎng)板保溫2小時，棄上清液，洗滌板，室溫下加入經稀釋的堿性磷酸酶-抗抗體綴合物達2小時。洗滌板，在各個孔中加入磷酸酶底物，如對硝基苯基磷酸鹽(Sigma，St.Louis)。保溫培養(yǎng)板，在各個孔中加入3N NaOH以終止反應，使用ELISA讀數(shù)器測定OD410的值。
在另一個鑒定實施方案中，使用經聚-L-賴氨酸預處理的微量培養(yǎng)板將靶細胞之一結合至各個孔中，然后使用例如1％的戊二醛固定細胞，檢測雙特異性抗體結合完整細胞的能力。另外，本發(fā)明中也可結合使用FACS，免疫熒光染色，獨特型特異性抗體，抗原結合競爭試驗和抗體鑒定領域公知的其它方法來鑒定優(yōu)選的四倍體瘤。
分離四倍體瘤之后，從其它細胞產物中純化出雙特異性抗體，通過免疫球蛋白純化領域技術人員公知的多種蛋白質分離方法可實現(xiàn)純化目的。制備和鑒定抗體的方法是本領域眾所周知的(例見抗體實驗室手冊，1988)。
例如，可以將得自選定四倍體瘤的上清液穿過蛋白質A或蛋白質G Sepharose柱以結合IgG(取決于其類型)。然后用例如pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液洗脫結合的抗體，對等滲的緩沖液透析含有BsAb的洗脫級分。或者，也可將洗脫物穿過抗免疫球蛋白-Sepharose柱，然后用3.5M氯化鎂洗脫BsAb。然后可通過例如如上所述的同種型特異性ELISA和靶細胞的免疫熒光染色試驗檢測以此方式純化的BsAb的結合活性。
也可通過SDS-PAGE電泳，接著用銀或考馬斯藍染色，從而鑒定和分離經純化的BsAb和親代抗體。當親代抗體之一的分子量比另一種更高時即有可能如此，其中BsAb帶遷移至兩種親代抗體的中間。樣品的還原證實了其中存在兩種不同表觀分子量的重鏈。
另外，目前一般可以使用重組技術制備抗體，也可制備編碼具有所需雙特異性之抗體的重組抗體基因(Van Duk等，1989)。因此，選擇出具有最優(yōu)選結合特性的單克隆抗體之后，可通過例如噬菌體表達文庫的免疫學篩選分離出這些抗體的相應基因(Oi和Morrison，1986；Winter和Milstein，1991)，然后，通過Fab編碼域的重排，可很容易得到適當?shù)那逗蠘嫿w。
vii.聯(lián)合治療與免疫毒素或凝血配體聯(lián)合的組織因子組合物可用于多種人類癌癥和甚至其它障礙(如良性前列腺增生和類風濕性關節(jié)炎)的臨床治療中，在所述癌癥和障礙中中期或較長期地阻斷血流將是有利的。
本申請所公開的組織因子組合物與免疫毒素和凝血配體的聯(lián)合被認為是抗腫瘤療法中特別有用的工具。由本文所提供的包括動物研究的數(shù)據(jù)，以及淋巴瘤治療相關領域的知識(Glennie等，1988)，可直接得出T-細胞靶向(Nolan和Kennedy，1990)和藥物靶向(Paulus，1985)的適當劑量和治療方案。
本發(fā)明建議在治療癌癥時，與上述組織因子構建體一起使用的免疫毒素和凝血配體當經由IV途徑以每周約1次的頻率施用時，其有效劑量約為0.1mg/kg至2mg/kg，優(yōu)選約為0.8mg/kg至1.2mg/kg。根據(jù)被治療的受試者的病情必需對劑量作一些改動。在任何情況下，負責給藥的人員會確定各個受試者的適當劑量。這種最優(yōu)化和調整可在本領域中常規(guī)進行，并不需要額外的實驗。
當然，在廣泛使用前需進行進一步的動物研究和臨床試驗。本領域技術人員參照本發(fā)明會知道進行臨床試驗的多個要素，包括患者療法和監(jiān)測。提供的下列資料可作為建立這種試驗的一般性指南。
預計選定用于聯(lián)合研究的患者對至少一個常規(guī)療程沒有反應，并且，通過體格檢查、實驗室技術或放射顯影方法測定出該患者具有可見的可測疾病。當鼠單克隆抗體部分被用于免疫毒素或凝血配體時，患者應對小鼠免疫球蛋白沒有變態(tài)反應史。在開始該研究之前至少2周應停止任何化學療法。
至于與免疫毒素或凝血配體一起施用組織因子構建體，人們認為使用存在于中樞靜脈內的具有三聯(lián)腔門的導管較有利。應使用例如0.22μ的濾膜過濾治療混合物，并用例如鹽水適當稀釋至終體積為100ml。使用前，也應以類似方法過濾檢測樣品，過濾之前和之后通過測定A280評估樣品濃度。預計回收率應為87至99％，然后可根據(jù)蛋白質的損失進行調整。
這些組織因子和IT或凝血配體的聯(lián)合可在約4至24小時的期間內施用，且每個患者以2至7天的間隔接受2至4次輸注。也可以在7天的期間內以穩(wěn)定的輸注速率施用。輸注的劑量水平應取決于是否觀察到任何毒性。因此，如果任何單次輸注之后，或穩(wěn)定速率輸注的特定時間點達到II級毒性，應終止進一步的給藥或停止穩(wěn)定速率輸注直至毒性改善為止。應將劑量逐漸增加的組織因子與免疫毒素或凝血配體施用于患者組直至任一組中約60％的患者顯示出不可接受的III級或IV級毒性。為此值2/3的劑量可確定為安全劑量。
當然，治療之前和治療后每隔不超過1個月應進行體格檢查、腫瘤測量和實驗室檢測。實驗室檢測應包括全血計數(shù)，血清肌酸酐，肌酸激酶，電解質，脲，氮，SGOT，膽紅素，白蛋白和總血清蛋白。應通過放射免疫測定法評價治療后不超過60天取的血清樣品中完整組織因子、免疫毒素和/或凝血配體或其組分和針對其任何部分的抗體的存在。使用任何標準測定法，例如ELISA或RIA，對血清進行免疫學分析，可評價治療劑的藥物動力學和清除情況。
為了評價抗腫瘤反應，應在最后一次輸注后48小時至1周內和第30天檢查患者。當存在可觸知的疾病時，應在治療過程中的每一天，治療完成后的1周內，和第30天測定所有腫瘤塊的兩個正交直徑。為了測量不可觸知的疾病，應在48小時至1周內和第30天，遍及胸、腹和骨盆以1cm為間隔進行系列CT掃描。也應使用疾病位點活檢標本或適當時使用血液或流體樣品，在組織學上和/或通過流式細胞術評價組織樣品。
可通過能接受的測量確定臨床反應。例如，治療后1個月所有可測腫瘤消失可被確定為完全反應。而治療后1個月所有可評估的腫瘤結的正交直徑乘積的總和降低50％或以上，并且無腫瘤位點顯示出增大，即可被確定為部分反應。類似地，治療后1個月所有可測病變的正交直徑乘積減少50％或以上，并且一個或多個位點有惡化即可被確定為混合反應。F.半壽期延長的TF本文闡明，通過將tTF與延緩tTF從體內清除出去的載體分子(如免疫球蛋白)綴合，可增強tTF的抗腫瘤活性。例如，tTF與免疫球蛋白的連接可通過延長tTF的體內半壽期，使tTF保留時間更長并有更長時間誘導腫瘤血管中的血栓形成，從而增強抗腫瘤活性。半壽期的延長或者是由于tTF大小的增加超過腎小球過濾限度造成的；或者是由于綴合物在腎臟內被積極地再吸收(這是免疫球蛋白Fc片段的一個特性)造成的(Spiegelberg和Weigle，1965)。也可能是免疫球蛋白組分改變了tTF的構象，使其變得更具有活性或更穩(wěn)定。除免疫球蛋白以外，其它載體分子也可產生類似的效果，因此也包含在本發(fā)明中。
F1.修飾假定對通過tTF與免疫球蛋白的連接觀察到的半壽期延長第一種解釋只是所致大小的增加導致血漿半壽期延長，則發(fā)明人預計在本發(fā)明中可有利地使用能增加TF構建體大小的其它修飾，只要延長性修飾基本上不使經修飾的TF構建體恢復膜結合功能即可。只要無這種可能性(這可很容易檢測)，實際上任何一般性的惰性的生物學可接受的分子均可與TF構建體綴合，以制備體內半壽期有所增加的經修飾TF。
也可以修飾TF自身結構以使其變得更加穩(wěn)定，或可能的話降低其在體內的分解代謝速率。這種修飾的一個機制是使用d-氨基酸替代TF分子中的1-氨基酸。本領域技術人員應理解，導入這種修飾之后需要精確地檢測所得分子，以確保其仍保留所需的生物學特性。其它的穩(wěn)定化修飾包括在N末端或C末端或兩端加上穩(wěn)定化的部分，這一般用于延長生物分子的半壽期。例如，可以通過酰化或氨基化來修飾TF構建體的末端?？蓪⒍喾N此類修飾一起使用，TF分子的部分也可以被模擬肽的化學結構替代，所述結構可維持生物學功能，并仍能改善分子的穩(wěn)定性。
F2.綴合物i.蛋白質可用于將所需蛋白質與載體蛋白綴合的技術被廣泛用于科學界。一般應理解，在制備這種TF綴合物以用于本發(fā)明時，被選定作為載體分子的蛋白質應具有某些確定的特性。例如，它當然必須是生物學相容的，施用于患者后不會導致任何顯著的不良作用。另外，一般需要載體蛋白相對比較惰性，并且是非免疫原性的，這兩個特性會維持TF功能，并且使所得構建體不會被腎臟排出。例舉的蛋白質是白蛋白和球蛋白。
ii.非蛋白質同上述蛋白質綴合物一樣，本發(fā)明的TF分子也可與非蛋白質因子綴合以改善其在體內的半壽期。對這種綴合物中所用非蛋白質分子的選擇對本領域技術人員而言也是容易實現(xiàn)的。例如，可以使用包括多糖和PEG在內的多種天然或合成聚合物中的任何一種或多種。
在制備綴合物的過程中，不論是蛋白質與否，應注意滿足的條件是被導入的綴合物基本上不會使經修飾的TF分子與質膜再次結合，導致增加了凝血能力、并在施用后產生有害副作用的分子產生。作為一般性的原則，我們相信這些實施方案中應盡量避免疏水性的加合物或綴合物。
iii.免疫綴合物當使用抗體與本發(fā)明的tTF組分綴合時，對抗體的選擇一般取決于TF-抗體綴合物的用途。例如，當除了僅使用TF分子外，還使用TF免疫綴合物時，就應考慮腫瘤的類型，例如是否優(yōu)先靶向腫瘤細胞，或者是否更優(yōu)先靶向腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質。當TF免疫綴合物自身是主要的治療劑時，免疫綴合物在任何意義上都不是“被靶向的免疫綴合物”。在這些方面，TF分子與抗體或其部分的綴合可簡單地進行，以產生與原始TF分子相比其半壽期和/或生物可利用性有所改善的構建體。在任何情況下，通過特定類型抗體的應用可獲得一些好處，例如，與其Fab’對應物相比，基于IgG的抗體有望表現(xiàn)出更好的結合能力和更慢的血液清除速率，而基于Fab’片段的組分一般表現(xiàn)出更好的組織穿透能力。
(a)單克隆抗體制備和鑒定抗體的方法是本領域眾所周知的(例見抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室，1988)。
產生單克隆抗體(MAb)的方法一般沿著與制備多克隆抗體相同的途徑開始。簡單地說，多克隆抗體是這樣制備的用本發(fā)明的免疫原性組合物免疫動物，之前是否需要經過免疫耐受得取決于所用的抗原組成和方案(如耐受正常的細胞群體，然后用腫瘤細胞群體免疫)，再從經免疫的動物中收集抗血清。多種動物可用于制備抗血清，用于產生抗抗血清的典型動物是兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或山羊。由于兔的血量相對較多，所以優(yōu)選利用兔產生多克隆抗體。
正如本領域技術人員眾所周知的，給定組合物的免疫原性各不相同，因此，經常必須強化宿主的免疫系統(tǒng)，通過將肽或多肽免疫原與載體偶聯(lián)可以實現(xiàn)此目的。例舉和優(yōu)選的載體是匙孔血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。也可將其它白蛋白用作載體，如卵白蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白。將多肽與載體蛋白綴合的方法是本領域技術人員眾所周知的，包括用戊二醛，間-馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)，碳二亞胺和雙重氮化聯(lián)苯胺(bis-biazotized benzidine)。
本領域還熟知，使用免疫應答的非特異性刺激物(已知為佐劑)可增強特定免疫原組合物的免疫原性。例舉的和優(yōu)選的佐劑包括完全弗式佐劑(含有被殺死的結核桿菌的免疫應答非特異性刺激物)，不完全弗式佐劑和氫氧化鋁佐劑。
產生多克隆抗體中所用免疫原組合物的量隨免疫原的特性以及免疫所用動物的不同而不同?？墒褂枚喾N途徑施用免疫原(皮下，肌內，真皮內，靜脈內和腹膜內)?？赏ㄟ^在免疫后的多個時間點取經免疫動物的血樣監(jiān)測多克隆抗體的產生，也可以進行第二次加強免疫注射。重復加強免疫和滴度測定的過程直至獲得適當?shù)牡味?。當達到所需的滴度水平時，可對經免疫動物進行取血，分離血清并儲存，和/或可使用該動物產生Mab。
通過使用眾所周知的技術，如美國專利4,196,265(列入本文作為參考)中例舉的技術可很容易制備MAb。所述技術一般包括用選定的免疫原組合物(如純化的或部分純化的腫瘤細胞或血管內皮細胞蛋白，多肽，肽或完整細胞組分)免疫合適的動物。以能有效刺激產生抗體之細胞的方式施用免疫組合物。如小鼠和大鼠的嚙齒類動物是優(yōu)選的動物，然而，也可以使用兔、綿羊、青蛙的細胞。使用大鼠可能有些好處(Goding，1986，p60-61)，但優(yōu)選使用小鼠，最優(yōu)選BALB/c小鼠，因為它是最常規(guī)使用的，一般有較高的穩(wěn)定融合百分比。
免疫后，選擇具有產生抗體之潛力的體細胞，具體為B淋巴細胞(B細胞)，以用于產生MAb。這些細胞可得自活檢的脾臟、扁桃體或淋巴結，或得自外周血樣品。優(yōu)選脾細胞和外周血細胞，因為前者富含產生抗體的細胞，所述細胞處于分裂著的漿母細胞期，優(yōu)選后者則是因為外周血易于得到。經常需免疫一組動物，取出具有最高抗體滴度的動物脾臟，用注射器勻漿脾臟以得到脾淋巴細胞。經免疫小鼠的脾臟一般約含有5×107至2×108個淋巴細胞。
然后，將得自經免疫動物的可產生抗體的B淋巴細胞與無限增殖的骨髓瘤細胞融合，所述骨髓瘤細胞來源的種類一般與經免疫動物的種類相同。適用于產生雜交瘤的融合方案中的骨髓瘤細胞系優(yōu)選是不產生抗體的，具有高融合效力，存在酶缺損，使其不能在某些選擇性培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基僅支持所需融合細胞(雜交瘤)生長。
可使用大量骨髓瘤細胞中的任一種，這一點是本領域眾所周知的(Goding，p65-66，1986；Campbell，p75-83，1984)。例如，當免疫動物是小鼠時，可使用P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，F(xiàn)O，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XXO Bul；對大鼠而言，可使用R210.RCY3，Y3-Ag1.2.3，IR983F，4B210或上述小鼠細胞系中的任一種；至于人細胞融合，可使用U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6。
產生抗體的脾或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的雜合體的產生方法一般包括在可促進細胞膜融合的試劑(化學或電學的)的存在下，以4∶1的比例將體細胞與骨髓瘤細胞混合，但所述比例可以在20∶1至1∶1之間變化。Kohler和Milstein(1975；1976)已描述了使用仙臺病毒的融合方法，Gefter等(1977)描述了使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的融合方法。電誘導的融合方法也是適用的(Goding，p71-74，1986)。
融合操作通常以約1×10-6至1×10-8的低頻率產生存活的雜合體，然而，這不是問題所在，因為通過在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，存活的融合雜合體與親代未融合的細胞(尤其是正常情況下可持續(xù)地無限分裂的未融合骨髓瘤細胞)能區(qū)分開。選擇性培養(yǎng)基一般是在組織培養(yǎng)基中含有可阻斷核苷酸從頭合成的試劑。例舉的和優(yōu)選的試劑是氨基蝶呤，氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤能阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅能阻斷嘌呤的合成。當使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤時，要在培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸的來源(HAT培養(yǎng)基)。當使用重氮絲氨酸時，則在培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤。
優(yōu)選的選擇性培養(yǎng)基是HAT。只有能進行核苷酸補救途徑的細胞才能在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤細胞中補救途徑的關鍵酶，如次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)具有缺陷，因而它們不能存活。B細胞可進行此途徑，但它們在培養(yǎng)中的壽命有限，一般在約2周內死亡。因此，僅有的能在選擇性培養(yǎng)基中存活的細胞是由骨髓瘤和B細胞形成的雜合體。
這種培養(yǎng)提供了雜交瘤群體，從中可選擇出特定的雜交瘤。一般通過在微滴定板中進行單克隆稀釋而培養(yǎng)細胞，接著檢測各個克隆上清液(2至3周后)中的目的反應性，從而選擇雜交瘤。檢測試驗應該比較靈敏、簡單和快速，如放射性免疫測定法，酶免疫測定法，細胞毒性測定法，噬斑測定法，點免疫結合測定法等。
然后，可連續(xù)稀釋選定的雜交瘤并克隆成能產生抗體的各個細胞系，再無限增殖各克隆以提供MAb?？山泝煞N基本方法利用細胞系產生MAb。其中之一是將雜交瘤的樣品注射至(經常為腹腔內)組織相容性動物，該動物類型與提供體細胞和骨髓瘤細胞以供最初融合所用的動物類型相同。被注射的動物長出分泌特定單克隆抗體的腫瘤，該抗體由融合的細胞雜合體產生。然后可抽出動物的體液，如血清或腹水液，以得到高濃度的MAb。另一種方法是在體外培養(yǎng)單個細胞系，其中MAb一般會分泌至培養(yǎng)基中，從中可很容易得到高濃度的MAb。必要時，可使用過濾、離心和多種層析方法(如HPLC或親和層析)，對由這兩種方法之一產生的MAb進一步純化。
發(fā)明人預計也可使用分子克隆方法產生單克隆抗體。為此，可由分離自免疫動物脾臟的RNA制備組合免疫球蛋白噬菌粒文庫，通過使用表達抗原的細胞和對照細胞(如正常與腫瘤細胞)進行淘選來選擇表達適當抗體的噬菌粒。此方法相對于常規(guī)雜交瘤技術的優(yōu)點在于一輪中可產生和篩選多約104倍的抗體，通過H和L鏈的組合產生了新的特異性，這進一步增加了發(fā)現(xiàn)適當抗體的機會。
當本發(fā)明使用MAb時，它們可來源于人，鼠，猴，大鼠，倉鼠，雞或甚至兔。本發(fā)明包括使用人抗體，來源于小鼠、大鼠或其它種、攜有人恒定和/或可變區(qū)域的“人源化”或嵌合抗體，和其它重組抗體及其片段。當然，由于其易于制備和易于獲得試劑，因此一般優(yōu)選鼠單克隆抗體。
(b)功能性抗體結合區(qū)Fab通過用非特異性的巰基蛋白酶，即木瓜蛋白酶蛋白水解整個免疫球蛋白，可得到Fab片段。必須首先用半胱氨酸、2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇還原其活性位點中的巰基基團以激活木瓜蛋白酶。應通過用EDTA(2mM)螯合除去酶儲液中的重金屬，以確保最大的酶活性。一般以1∶100的重量比將酶和底物混合在一起。保溫后，可以用碘乙酰胺使巰基不可逆地烷基化或簡單地通過透析而終止反應。應通過SDS-PAGE監(jiān)測消化的完成情況，并通過蛋白質A-Sepharose或離子交換層析將多種組分分開。
F(ab’)2由兔和人源的IgG制備F(ab’)2片段的常規(guī)步驟是用胃蛋白酶有限水解(方法7.3.2)，條件是37℃，醋酸鹽緩沖液(pH4.5)中的抗體過量100倍(w/w)，這樣抗體在重鏈之間二硫鍵的C末端一側被切割。小鼠IgG的消化速率隨亞類的不同而不同，難以得到高產量的不含一些未消化或完全降解的IgG的活性F(ab’)2片段。更具體地說，IgG2b對完全降解高度敏感。其它亞類需要不同的保溫條件以得到最佳結果。
用胃蛋白酶消化大鼠IgG需要的條件包括在0.1M醋酸鹽緩沖液，pH4.5中透析，然后與1％w/w胃蛋白酶一起保溫4小時；如果首先于4℃對0.1M甲酸鹽緩沖液，pH2.8透析16小時，接著對醋酸鹽緩沖液進行透析，則可改善IgG1和IgG2a的消化。IgG2b于37℃在含葡萄球菌V8蛋白酶(3％w/w)的0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.8)中保溫4小時會得到更一致的結果。
iv.第二代TF免疫綴合物發(fā)明人預計，本文所述有利研究中所用的tTF-免疫球蛋白構建體中的免疫球蛋白Fc部分可能實際上是導致體內半壽期增加的抗體分子相關部分?？梢院侠淼丶俣?，與Fc區(qū)域的綴合可導致TF-Fc綴合物在腎臟內的積極再吸收，使綴合物回復至全身性循環(huán)。籍此，可將本發(fā)明的任何凝血缺損的TF構建體或變體與Fc區(qū)域綴合以增加所得綴合物的體內半壽期。
可以使用多種方法產生純度足以使其與TF構建體綴合的Fc區(qū)域，例如，化學裂解抗體以提供確定的區(qū)域或部分是眾所周知的，也易于實施，也可以使用重組技術制備大量Fc區(qū)域，或者，實際上在制備表達所需融合蛋白的重組載體之后可制備整個TF-Fc綴合物。
也可以對免疫球蛋白共有的結構進行進一步的操作以提供半壽期有所增加的第二代TF構建體。例如，可以考慮用截短的組織因子或其變體取代IgG分子的CH3區(qū)域。一般說來，產生這種雜合體分子的最有效機制是使用分子克隆技術和重組表達。所有這些技術一般都是本領域技術人員眾所周知的，下文將更詳細地描述這些技術。
F3.連接方式可以任何可操作的方式使上述組分與組織因子組分連接，以使各個區(qū)域行使其預定的功能，而對組織因子的功能沒有顯著的損害。因此，連接組分應能延長構建體的半壽期，組織因子應能促進血液凝結。
i.生物化學交聯(lián)劑上述任一組分與組織因子組分連接所利用的技術一般與為制備免疫毒素而開發(fā)的技術相同。一般的指導思想認為適用于免疫毒素的任何生化交聯(lián)劑也可以用于本發(fā)明，也可考慮使用其它連接劑。
可使用交聯(lián)劑來形成將兩個不同分子(如穩(wěn)定劑和促凝劑)的功能性基團連接到一起的分子橋。為了逐步連接兩個不同的蛋白質，可使用不會形成不需要的同聚物的異雙功能交聯(lián)劑。
表IV異-雙功能交聯(lián)劑
例舉的異雙功能交聯(lián)劑含有兩個反應基團一個與伯胺基團反應(如N-羥基琥珀酰亞胺)，另一個與巰基反應(如吡啶基二硫化物，馬來酰亞胺，鹵素等)。通過伯胺反應基團，交聯(lián)劑可與一種蛋白質(如選定抗體或片段)的賴氨酸殘基反應，而通過巰基反應基團，已與第一種蛋白質連接的交聯(lián)劑可與另一種蛋白質(如促凝劑)的半胱氨酸殘基(游離的巰基)反應。
因此，可以看出，優(yōu)選的組織因子組分一般具有，或被衍生化而具有可用于交聯(lián)的官能團。不應認為這種需求是局限性的，因為多種基團可以此方式使用。例如，伯胺或仲胺基團，酰肼或肼基團，羧基醇，磷酸，或烷基化基團都可用于結合或交聯(lián)。有關連接技術的綜述，可參見Ghose和Blair(1987)。
交聯(lián)劑兩個反應基團之間的間隔區(qū)臂可具有不同的長度和化學組成。較長的間隔區(qū)臂可使綴合物組分具有較好的靈活性，而橋中的一些特定組分(如苯基)可使反應基團仍具有額外的穩(wěn)定性，或使化學連接對多方面作用的耐受性有所增加(如使二硫鍵對還原劑有耐受性)。也可以使用肽間隔區(qū)，如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala。
優(yōu)選使用在血液中具有合理穩(wěn)定性的交聯(lián)劑。已知含有二硫鍵的多種類型連接子可成功地用于綴合靶向劑和促凝劑。經證實，含有空間受阻的二硫鍵的連接子在體內的穩(wěn)定性更強，可防止組織因子在結合至作用位點之前釋放出來，因此，這些連接子是一組優(yōu)選的連接劑。
免疫毒素中可用的最優(yōu)選交聯(lián)劑之一是SMPT，它是含有二硫鍵的雙功能交聯(lián)劑，所述二硫鍵在空間上受相鄰苯環(huán)和甲基的阻礙。人們相信二硫鍵在空間上受阻可以起到保護二硫鍵免受組織和血液中可能存在的硫醇鹽陰離子(如谷胱甘肽)的進攻的作用，從而有助于防止綴合物在將結合的藥劑傳遞至腫瘤位點之前發(fā)生脫偶聯(lián)。預計也可以在本發(fā)明雙特異性凝血配體中使用SMPT試劑。
SMPT交聯(lián)試劑與很多其它已知的交聯(lián)試劑一樣，具有交聯(lián)諸如半胱氨酸的SH或伯胺(如賴氨酸的ε氨基)之類官能團的能力。另一類可能的交聯(lián)劑包括含有可裂解的二硫鍵的異雙功能光反應性疊氮基苯，如磺基琥珀酰亞胺基-2-(對疊氮基-水楊酰胺基)乙基-1，3’-二硫丙酸。N-羥基-琥珀酰亞胺基基團與伯氨基反應，疊氮基苯(通過光解)與任何氨基酸殘基非選擇性地反應。
除了受阻的交聯(lián)劑外，本發(fā)明中也可以使用不受阻的交聯(lián)劑。其它不含有或不產生受保護的二硫鍵的有用交聯(lián)劑包括SATA，SPDP和2-亞氨基硫雜戊環(huán)(2-iminothiolane)(Wawrzynczak和Thorpe，1987)，這類交聯(lián)劑的使用是本領域所熟知的。
一旦綴合后，一般應純化tTF以將綴合物與未綴合的靶向劑或促凝劑以及其它污染物分開。可使用大量純化技術來提供純度足夠高的綴合物以使它們在臨床上有用。一般最常用基于大小分離的純化方法，如凝膠過濾，凝膠滲透或高效液相層析。也可以使用其它層析技術，如Blue-Sepharose分離法。
ii.重組融合蛋白本發(fā)明的tTF組分也可以是通過分子生物學技術制備的融合蛋白，使用重組DNA技術達到此目的目前是本領域技術人員的標準操作，這些方法包括例如體外重組DNA技術，合成技術和體內重組/基因重組。另外，可使用自動合成儀進行DNA和RNA的合成(例見Sambrook等，1989；和Ausubel等，1989所述的技術)。
這種融合蛋白的制備一般要求制備第一和第二DNA編碼區(qū)，并讀框一致地將所述區(qū)域功能性連接在一起，以制備編碼所需融合蛋白的單一編碼區(qū)。在本發(fā)明中，tTF或TF突變體DNA序列一般與編碼惰性蛋白質載體，免疫球蛋白，F(xiàn)c區(qū)域等的DNA序列讀框一致地連接。融合蛋白的TF部分或惰性部分被制成N末端區(qū)域還是C末端區(qū)域一般并不特別相關。至于第二代TF免疫球蛋白分子，可將TF編碼序列進一步插入免疫球蛋白的編碼區(qū)內，以使TF序列在功能上破壞免疫球蛋白序列，被編碼的蛋白質可被認為是“三合體(tribrid)”。
一旦得到了所需的編碼區(qū)，即可制備表達載體。表達載體在插入的DNA區(qū)域上游含有一個或多個啟動子，其功能是促進DNA轉錄，因此促進所編碼的重組蛋白質的表達。這就是“重組表達”的含義，在說明書別處已經討論過。
F4.檢測至于本發(fā)明的其它方面，一旦為了提供體內半壽期有所增加的構建體而制成了候選的TF構建體，一般應檢測該構建體以確保所得化合物所需特性。用于測定這種功能變化的多種試驗是常規(guī)的，本領域技術人員可很容易實施。
在僅為了增加其大小而設計的TF構建體中，對增加大小的證實完全是常規(guī)技術。例如，可簡單地使用被設計成依據(jù)大小分離生物組分的任何方法學來分離候選組分，可分析分離的產物以確定已產生了大小有所增加的TF構建體。例如，可以用分離凝膠和分離柱，如凝膠過濾柱。分離綴合和未綴合組分的混合物過程中使用凝膠過濾柱在本發(fā)明的其它方面(例如產生相對高水平綴合物、免疫毒素或凝血配體時)也是有用的。
由于本發(fā)明的此類綴合物的目的是提供體內半壽期有所增加的凝血缺的TF分子，因此一般應檢測候選的TF修飾變體或綴合物以證實此特性的存在。這種測定法也是常規(guī)技術。第一種簡單的測定法是在體外試驗中確定候選的經修飾或綴合的TF的半壽期。這種測定法一般包括混合血清中的候選分子，并測定該分子相對于凝血缺損組織因子的原始樣品而言，是否以相對完整的形式保留較長一段時間?？稍俅螐幕旌衔镏腥〕龅确衷嚇硬y定其大小，并優(yōu)選測定其生物學功能。
生物學半壽期或“清除”的體內試驗也是易于進行的。在這些系統(tǒng)中，一般優(yōu)選用可檢測的標記物標記受試的候選TF構建體，施用于動物之后跟蹤標記物的存在，優(yōu)選施用的途徑是最終治療策略欲采用的途徑。作為此方法的一部分，應取體液樣品，尤其是血清和/或尿樣，并分析樣品中與TF構建體結合的標記物的存在，這可以指出構建體在體內自然環(huán)境中的壽命。
因此，本文所述治療方法中可使用一種或多種半壽期有所增加的TF分子或其聯(lián)合。建議給藥劑量一般為每位患者約0.2mg至200mg，與上述的原始TF構建體一樣。然而，由于這些TF分子已被修飾，有效劑量甚至可以更低，如約0.1mg左右。當以施用藥物的次數(shù)使用半壽期增加的TF時，更可能改變的是治療方案而不是給藥的劑量。例如，當建議在治療期間第1，3和7天使用原始TF構建體時，對于具有更長半壽期的相應改良TF而言，則只需在第1和7天給藥。在任何情況下，本領域技術人員都可以很容易地確定有關給藥劑量和次數(shù)的所有這種最優(yōu)化。G.TF和因子VIIa聯(lián)合本發(fā)明人進一步闡明，在因子VIIa的存在下，與A20細胞結合的tTF誘導凝血的活性顯著增強。與早期研究相同的是，這些體外結果也可以同樣出現(xiàn)于體內環(huán)境中。本文提供的研究闡明通過共同施用因子VIIa，多種凝血缺損TF構建體的抗腫瘤活性都有所增強。甚至使用眾所周知難以凝血的HT29腫瘤實驗動物模型，共同施用凝血缺損TF構建體和外源因子VIIa都會導致腫瘤組織發(fā)生相當多的壞死。
此數(shù)據(jù)可被解釋為tTF可結合因子VII，但不能有效地介導其被Xa和相鄰的因子VIIa分子激活為因子VIIa。提供預先形成的(外源性)因子VIIa來源可克服此阻礙，使得凝血更加有效。凝血缺損TF和因子VIIa聯(lián)合治療的成功一般基于TF構建體在腫瘤血管系統(tǒng)內令人驚奇的定位。缺乏這種令人驚奇的定位和特異性的功能作用，共同施用因子VIIa在腫瘤治療中就沒有意義，甚至可能會是有害的，因為它可能會在多種健康組織中促進不期望的血栓形成。以非靶向的方式聯(lián)合使用tTF和因子VIIa以前被建議用于治療血友病患者和具有其它出血障礙的患者，所述患者的凝血級聯(lián)反應具有基本的損傷。在本發(fā)明中，凝血級聯(lián)反應一般是完全起作用的，治療性干預將此活性集中于身體確定的區(qū)域內。
因此，本發(fā)明的另一目的是通過結合使用TF和另外施用的因子VIIa來增加本發(fā)明任一TF構建體的抗腫瘤效應。由于tTF可結合腫瘤血管內皮細胞，因此，可以用tTF注射攜有腫瘤的動物，等一段時間以使過量的tTF被清除，然后注射因子VIIa以放大tTF在腫瘤血管內的血栓形成作用。以此方式，可以看出tTF或其它凝血缺損TF構建體能在腫瘤內形成儲備庫，使得隨后施用因子VIIa能夠增加和維持抗腫瘤效應。
本發(fā)明其它的觀察結果是因子VII激活突變體tTF(G164A)和tTF(W158R)的血栓形成活性被因子VIIa大大地修復。這些突變位于tTF中對于因子VII轉變?yōu)橐蜃覸IIa至關重要的一個區(qū)域內。至于tTF自身，本文的研究表明，在凝血復合物形成時增加預先形成的因子VIIa可克服此障礙。本發(fā)明利用這些和上述觀察結果以提供癌癥的體內療法。
實際上，本文提供的研究證實，共同施用TF的因子VII激活突變體和預先形成的因子VIIa會對腫瘤產生大量壞死性損害，甚至對本發(fā)明療法不是最適應的小腫瘤模型也是如此。本發(fā)明的此方面特別令人驚奇，因為以前人們不相信這種突變體除了可能競爭性抑制TF而可能用于抑制或降低凝血這樣的治療價值外，還會在任何具體實施中有治療價值。除了這種假設外，只是科學興趣激發(fā)了人們制備這種突變體，它們可在某些體外研究中用作對照。只有本發(fā)明人的研究使得這種突變體在臨床上有用，它們或者可用于靶向傳遞(WO96/01653)，或者可用于本發(fā)明甚至更令人驚奇的聯(lián)合應用中。
在特定的實施方案中，本發(fā)明的此應用首先包括給攜有腫瘤的動物注射tTF(G164A)，tTF(W158R)或其等價物。然后使tTF突變體定位于腫瘤血管，多余的被清除，接著注射因子VIIa，這可以使定位的tTF突變體表現(xiàn)血栓形成活性。這一策略的優(yōu)點是使用非常安全。tTF突變體實際是無毒的，因子VIIa自身也一樣。因此，先施用tTF突變體再施用因子VIIa對宿主是無害的，但能有效地誘導腫瘤血管中的血栓形成。
G1.因子VIIa可按Fair(1983)，美國專利5,374,617，5,504,064和5,504,067(都列入本文作為參考)所述制備因子VII。Hagen等(1986)報道了人因子VII cDNA序列的編碼區(qū)，其中第1至60位的氨基酸序列對應于分泌前會被細胞除去的前-原/前導序列。成熟的因子VII多肽鏈由氨基酸61至466組成。通過裂解精氨酸212和異亮氨酸213之間的單個肽鍵可將因子VII轉變?yōu)槠浠钚孕问揭蜃覸IIa。
通過將純化的蛋白質與固定于Affi-GelTM15珠(Bio-Rad)上的因子Xa一起保溫，可在體外將因子VII轉變?yōu)橐蜃覸IIa。通過對已還原的樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳可監(jiān)測轉變。在50mMEDTA的存在下，用終濃度為0.2mM的顯色底物N-甲氧羰基-D-環(huán)己基甘氨酰-甘氨酰-精氨酰對硝基苯胺醋酸酯(SpectrozymeTM因子Xa，American Diagnostica，Greenwich，CT)可檢測因子VIIa制品中的游離因子Xa。
重組的因子VIIa也可購自Novo Biolabs(Danbury，CT)。
G2.治療本發(fā)明中因子VIIa的用途不局限于其顯著改善本文所述因子VII激活突變體實用性的能力。同樣預計因子VIIa可與凝血缺損組織因子分子聯(lián)合使用，所述分子同首次使用的截短tTF具有相同活性。在這種治療實施方案中，TF構建體的劑量一般是每位患者約0.2mg至200mg，參照此信息可最佳地確定因子VIIa的適當劑量。
例如，可能需要形成其中TF構建體和因子VIIa比例為1∶1的預復合物，并將預復合的組分施用于動物。如果必需這么做，一般應將足以使等摩爾復合物形成的一定量的TF和一定量的因子VIIa混合。為了達到此目的，優(yōu)選使用2-3倍摩爾過量的因子VIIa，以確保各個TF分子被充分復合。然后可使用任何適當?shù)募夹g，如凝膠過濾，簡單地將未復合的TF和因子VIIa與復合的混合物分開。形成TFVIIa復合物之后，可以每位患者約0.2mg至200mg的劑量給需要治療的患者簡單地施用該復合物。
如上所述，一般優(yōu)選提前給患者施用凝血缺損TF構建體，使得TF有足夠的時間特異性地定位于腫瘤內。預施用之后，可設計適當?shù)囊蜃覸IIa劑量，該劑量應足以與定位于腫瘤血管系統(tǒng)內的TF協(xié)調和復合。同樣，也可設計因子VIIa的劑量以使腫瘤環(huán)境中形成1∶1摩爾比例的TF和因子VIIa。由于這兩種分子的分子量差異，一般建議加入約為TF毫克量2倍的因子VIIa毫克量。
然而，上述分析只是為了舉例，一般可導致凝血改善的任何劑量的因子VIIa顯然都具有臨床重要性。在此方面，應注意的是本文所提供的研究實際上使用與因子VIIa相比為16∶1過量的TF，這一般是約為32倍摩爾過量的TF構建體，然而，在腫瘤中特異地觀察到顯著的凝血和壞死。因此，因子VIIa的有效劑量范圍顯然十分寬，例如，可考慮給患者施用劑量為每位患者約0.01mg至約500mg的因子VIIa。
上述各個分析同樣適用于經突變損害了其激活因子VII之能力的組織因子構建體的使用。假定上述推測是基于結合的比例，相信不必聯(lián)合使用特別增加水平的因子VIIa和所述激活突變體。然而，假定相信施用因子VIIa自身不是特別有害，則使用增加劑量的因子VIIa的效力當然是明顯的。
盡管相信上文提供的詳細指導足以使本領域技術人員明白如何實踐本發(fā)明的這些方面，但也應參考其它定量分析以輔助TF和因子VIIa施用劑量的最優(yōu)化。例如，可參照美國專利5,374,617；5,504,064；和5,504,067，所述專利描述了因子VIIa的治療活性劑量范圍和血漿水平。
據(jù)Morrissey和Comp報道在出血障礙中，當全身性施用時，施用凝血缺損組織因子的有效劑量應能在血漿中達到100ng/ml至50μg/ml的有效水平，或優(yōu)選為1μg/ml至10μg/ml的水平或為60至600μg/kg體重；或當局部施用時，可達到10μg/ml至50μg/ml的有效水平，或10μg/ml至50μg/ml的優(yōu)選水平(美國專利5,504,064)。
當局部施用時，施用因子VIIa的劑量應能在血漿中有效產生20ng/ml至10μg/ml(1.2至600μg/kg)的有效水平，或優(yōu)選為40ng/ml至700μg/ml(2.4至240μg/kg)的水平，或1μg因子VIIa/ml至10μg因子VIIa/ml的水平。
通常，可施用凝血缺損組織因子和因子VII激活物以產生達10μg凝血缺損組織因子/ml血漿和40ng-700μg因子VIIa/ml血漿的水平。盡管這些研究是在出血障礙中進行的，但它們也與本發(fā)明內容相關，因為水平必須是有效的，但需經適當監(jiān)測以避免因凝血缺損組織因子和激活的因子VIIa水平提高導致全身毒性，因此，因子VII激活物的施用劑量應能在血漿中有效達到如上文所定義的因子VIIa有效水平。
G3.因子VII激活物如美國專利5,504,064(列入本文作為參考)所述，也可施用內源性因子VII激活物以替代因子VIIa自身。如上述專利中所述，施用凝血缺損組織因子之前、之時或優(yōu)選稍后立即在體內形成因子VIIa。在這種實施方案中，通過聯(lián)合注入因子VIIa激活物、如因子Xa(FXa)與磷脂(PCPS)，可將內源性的因子VII轉變?yōu)橐蜃覸IIa。
因子VII的體內激活物包括因子Xa/PCPS，因子IXa/PCPS，凝血酶，因子XIIa，和得自Oxyuranus scutellatus毒液的因子VII激活物與PCPS的聯(lián)合。這些激活物已顯示出可在體外將因子VII激活為因子VIIa。也可直接測定Xa/PCPS在體內將因子VII激活為因子VIIa的激活作用。通常，以1至10μg/ml載體的劑量施用因子VII激活物(美國專利5,504,064)。
可以多種形式提供磷脂，如磷脂酰膽堿/磷脂酰絲氨酸載體(PCPS)。PCPS載體的制備和施用Xa/PCPS的方法描述于Giles等(1988)(列入本文作為參考)。也可用其它磷脂制品替代PCPS，只要它們可加速因子VII被因子Xa激活即可?？砂聪挛乃霰O(jiān)測效力，因此確定最佳組成和劑量的測定。
據(jù)報道，可提高黑猩猩體內因子VIIa水平的Xa/PCPS高度有效的劑量為每kg體重26pmol因子Xa+40pmol PCPS。此劑量使內源性因子VIIa的水平增加18倍(達146ng/ml)。對狗使用較小的劑量觀察到勉強可測的效果，其中每kg體重注入12pmol因子Xa+19pmolPCPS使內源性因子VIIa水平增加了3倍。因此，每kg體重至少12pmol因子Xa的因子Xa劑量應該有用，優(yōu)選每kg體重26pmol因子Xa。類似地，每kg體重至少19pmol PCPS的PCPS劑量應是有用的，優(yōu)選每kg體重40pmol PCPS(美國專利5,504,064)。
靜脈內施用之后，通過在大劑量注入激活物之后的不同時間(2，5，10，20，30，60，90和120分鐘)取出檸檬酸鹽化的血樣，由血樣制備不含血小板的血漿，即可監(jiān)測任何可注入的因子VII激活物的效力。然后通過進行基于凝血缺損組織因子的因子VIIa凝血試驗，可測定檸檬酸鹽化的血漿樣品中內源性因子VIIa的量。內源性因子VIIa的所需水平與共同注入純化的因子VII和凝血缺損組織因子時所提到的血漿因子VIIa目標水平應該相同。因此，無需過多實驗即可在體內檢測其它因子VII激活物產生因子VIIa的情況，并且，使用基于凝血缺損組織因子的血漿樣品因子VIIa試驗，可調整劑量使其產生所需水平的因子VIIa。然后可將適當劑量的因子VII激活物(產生所需水平的內源性因子VIIa)與推薦用量的凝血缺損組織因子聯(lián)合使用。
可安排給藥時間以使因子VIIa水平長時間提高，優(yōu)選一直給藥至獲得所需的抗腫瘤效應，然后按需要重復施用以控制出血。據(jù)報道，因子VIIa的體內半壽期約為2小時，但半壽期隨治療方式和各個患者的不同而不同，因此，應該用基于凝血缺損組織因子的凝血試驗測定給定治療方式中血漿內因子VIIa的半壽期。H.實施例下列實施例可闡明本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。本領域技術人員應理解，下列實施例公開的技術代表的是由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實踐過程中能較好地起作用的技術，因此可認為所述技術構成了本發(fā)明實踐的優(yōu)選模式。然而，本領域技術人員參照本發(fā)明公開的內容應理解可在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，對所公開的具體實施方案作很多修改，仍可得到類似或相似的結果。實施例I合成截短的組織因子本文中的tTF指的是成熟組織因子蛋白的胞外域(成熟蛋白質的氨基酸1-219；SEQ ID NO1)，SEQ ID NO1由例如SEQ ID NO10編碼。A.H6[tTF]H6Ala Met Ala[tTF]。按下述制備tTF的互補DNA(cDNA)使用J-82細胞(人膀胱癌)的RNA克隆tTF。使用GlassMaxTMRNA微量分離試劑(Gibco BRL)分離總RNA，使用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer)將RNA逆轉錄為cDNA，使用含有下列兩個引物的相同試劑盒擴增tTF cDNA5’引物5′GTC ATG CCA TGG CCT CAG GCA CTA CAA(SEQ ID NO15)3’引物5′TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO16)下劃線的序列編碼tTF的N末端，5’引物中的其余序列是NcoI限制性位點，可使tTF克隆至表達載體中。3’引物的序列是可將tTF克隆至表達載體的HindIII位點。按廠商的建議進行PCR擴增，簡單地說，使用75μM dNTP；0.6μM引物，1.5mM MgCl2，95℃30”，55℃30”和72℃30”，共進行30輪循環(huán)。
使用表達載體H6pQE-60(Qiagen)將tTF表達成以非天然狀態(tài)存在于大腸桿菌包涵體中的融合蛋白。使用大腸桿菌表達載體H6pQE-60表達tTF(Lee等，1994)。將經PCR擴增的tTF cDNA插入NcoI和HindIII位點之間，H6pQE-60具有嵌入的(His)6編碼序列，以使表達的蛋白質在N末端具有(His)6序列，這樣可在Ni-NTA柱上純化。另外，融合蛋白具有凝血酶裂解位點和TF的殘基1-219。
為了純化tTF，將含有tTF的H6pQE-60 DNA轉化至大腸桿菌TG-1細胞中，將細胞培養(yǎng)至OD600＝0.5，加入IPTG使之濃度為30μM以誘導tTF產生。于30℃振蕩18小時之后收集細胞，在6M Gu-HCl中使細胞沉淀物變性，將裂解物上樣于Ni-NTA柱(Qiagen)。用6M尿素洗滌結合的tTF，室溫下用梯度為6M-1M的尿素將tTF重新折疊16小時。用洗滌緩沖液(0.05 NaH2PO4，0.3M NaCl，10％甘油)洗滌柱，再用0.2M溶于洗滌緩沖液中的咪唑(imidozole)洗脫tTF。濃縮洗脫下來的tTF，并上樣于G-75柱，收集tTF單體。B.tTFGly[tTF]。按與上一部分所述相同的方法制備GlytTF互補DNA(cDNA)，不同之處在于在PCR中用下列引物替代5’引物5’引物5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG CTT CTG GCA CTACAA ATA CT(SEQ ID NO17)下劃線的序列編碼tTF的N末端，其余序列編碼NcoI限制性位點和凝血酶裂解位點。
H6pQE-60表達載體和蛋白質純化方法與上文相同，不同之處在于用凝血酶處理最終的蛋白質產物以除去H6肽。在500份tTF中加入1份凝血酶(Sigma)(w/w)，室溫下裂解18小時可達到此目的。通過使混合物穿過Benzamidine Sepharose 6B凝血酶親和柱(Pharmacia)，從tTF中除去凝血酶。所得tTF被稱為tTF219，它由TF殘基1-219加上N末端的一個額外甘氨酸組成。當通過SDS-PAGE分析時，它作為分子量為26KDa的單一帶遷移，通過Edman降解進一步證實了N末端的序列。該蛋白質具有SEQ ID NO1所示的序列。C.半胱氨酸修飾的tTF通過利用在成熟tTF N’末端前面編碼一個Cys的5’引物進行PCR以突變tTF219，可制備(His)6-N’-cys’tTF219-tTF，下文簡稱為H6-N’-cys-tTF219。類似地，使用在tTF氨基酸219之后編碼一個Cys的3’引物制備H6-tTF219-cys-C’。它們的表達和純化與tTF219相同，不同之處在于重折疊之后使用Ellman試劑(5’5’-二硫代-雙-2-硝基苯甲酸)將N’或C’末端的Cys轉變?yōu)榉€(wěn)定激活的二硫基。兩種產物具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的序列。通過凝血酶裂解除去(His)6標記物并將蛋白質轉變?yōu)榫哂蠸EQ ID NO4和SEQ ID NO5所示序列的N’-cys-tTF219和tTF219-cys-C’。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定出產物純度＞95％。
使用編碼tTF氨基酸219之后的Ile-Cys和Ile-Phe-Cys的3’引物進行PCR以突變tTF219，可制備H6-tTF220-cys-C’和H6-tTF221-cys-C’。表達、重折疊和純化操作與H6-tTF219-cys-C’相同，這兩種蛋白質具有SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示的序列。實施例II合成組織因子二聚體本發(fā)明人推論組織因子二聚體在起始凝血方面可能會比單體更加有效，J82膀胱癌細胞表面上的天然組織因子可能是以二聚體的形式存在(Fair等，1987)。一個因子VII或因子VIIa分子與一個組織因子分子的結合可能也有助于另一個因子VII或因子VIIa與另一個組織因子的結合(Fair等，1987；Bach等，1986)。另外，組織因子顯示出與細胞因子受體家族成員具有結構同源性(Edgington等，1991)，其中一些成員可二聚體化而形成活性受體(Davies和Wlodawer，1995)，因此，本發(fā)明人按下述合成了TF二聚體。盡管下文中在化學綴合方面描述了二聚體的合成，但發(fā)明人預計也可使用重組和其它方法來產生本發(fā)明二聚體。A.[tTF]連接子[tTF]制備具有Gly[tTF](Gly)4Ser(Gly)4Ser(Gly)4Ser[tTF]結構的Gly[tTF]連接子[tTF]。
按下述，分別PCR擴增兩個DNA片段，連接片段并插入載體中PCR1制備tTF和連接子DNA的5’那半部分。PCR中的引物序列如下5’引物5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCACTA CAA ATA CT(SEQ ID NO18)3’引物5′CGC GGA TCC ACC GCC ACC AGA TCC ACC GCC TCC TTC TCTGAA TTC CCC TTT CT(SEQ ID NO19)Gly[tTF]DNA被用作DNA模板，其它PCR條件如tTF章節(jié)所述。
PCR2制備連接子DNA的3’那半部分和tTF DNA。PCR中的引物序列如下5’引物5′CGC GGA TCC GGC GGT GGA GGC TCT TCA GGC ACT ACA AATACT GT(SEQ ID NO20)3’引物5′TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO21)
tTF DNA被用作PCR的模板。用NcoI和BamH消化PCR1的產物，用HindIII和BamHI消化PCR2的產物。將經消化的PCR1和PCR2 DNA與經NcoI和HindIII消化的H6pQE60 DNA連接。
至于載體構建體和蛋白質的純化，其方法與Gly[tTF]章節(jié)中所述的相同。B.Cys[tTF]連接子[tTF]構建具有SerGlyCys[tTF2-219](Gly)4Ser(Gly)4Ser(Gly)4Ser[tTF]結構的Cys[tTF]連接子[tTF]。使用下列引物通過PCR制備DNA5’引物5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCACTA CAA ATA CT(SEQ ID NO22)3’引物5′TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ ID NO23)[tTF]連接子[tTF]DNA被用作模板，其余的PCR條件如tTF章節(jié)所述。至于載體構建體和蛋白質的純化，其方法與H6C[tTF]純化中所述的完全相同。C.[tTF]連接子[tTF]cys制備具有蛋白質結構[tTF](Gly)4Ser(Gly)4Ser (Gly)4Ser[tTF]Cys的[tTF]連接子[tTF]cys二聚體。使用下列引物通過PCR制備DNA5’引物5′GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCA CTA CAAATA CT(SEQ ID NO24)3’引物5 ′TGA CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T(SEQ IDNO25).連接子[tTF]DNA被用作模板，其余的PCR條件如tTF章節(jié)所述。按與[tTF]cys純化一節(jié)中所述相同的方法進行載體構建體和蛋白質的純化。D.化學綴合的二聚體已用Ellman試劑處理，使游離的Cys轉變?yōu)楸患せ畹亩蚧腫tTF]Cys單體被一半摩爾當量的二硫蘇糖醇還原，這可以在一半分子中產生游離的Cys殘基?；瘜W綴合單體以形成[tTF]Cys-Cys[tTF]二聚體，通過于室溫下，在被保護的[tTF]Cys中加入等摩爾量的DTT達1小時以使[tTF]Cys C末端的半胱氨酸去保護并暴露即可以做到這一點。在DTT/[tTF]Cys混合物中加入等摩爾量被保護的[tTF]Cys，室溫下持續(xù)保溫18小時。在G-75凝膠過濾柱上純化二聚體。類似地制備H6-tTF220-cys-C’，H6-tTF221-cys-C’和H6-N’-cys-tTF219的二聚體。使用相同的方法化學綴合Cys[tTF]單體以形成二聚體。實施例III合成組織因子突變體描述了3種tTF突變體，所述突變體缺乏將與tTF結合的因子VII轉變?yōu)橐蜃覸IIa的能力。血漿中的因子VIIa比因子VII少300倍(Morrissey等，1993)，因此，循環(huán)中的tTF突變體起始凝血的能力較差，因此表現(xiàn)出很低的毒性。然而，正如本文令人驚奇的闡明，一旦tTF突變體定位于腫瘤位點，即可注入因子VIIa以與tTF所結合的因子VII交換。已突變蛋白質具有SEQ ID NO8和SEQ IDNO9所示的序列，在因子VIIa的存在下是有活性的。A.[tTF]G164A“[tTF]G164A”具有突變蛋白質的結構，其中tTF219的氨基酸164(Gly)被Ala取代。Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒(Stratagene)被用于產生該突變體。DNA模板是Gly[tTF]DNA，誘變引物的序列如下5′CAA GTT CAG CCA AGA AAAC(SEQ ID NO26)G164A突變體由SEQ ID NO9表示，在Gly[tTF]的純化過程中使用上述的載體構建體和蛋白質純化方法。B.[tTF]W158RtTF219的氨基酸158位的色氨酸被突變?yōu)榫彼?，該突變是用編碼此變化的引物經PCRTM完成的。表達、重折疊和純化操作與tTF219的相同。該已突變蛋白質具有SEQ ID NO8的序列。C.[tTF]W158R S162A[tTF]W158R S162A是一種雙重突變體，其中tTF219的氨基酸158(Trp)被精氨酸取代，氨基酸162(Ser)被丙氨酸取代。使用就[tTF]G164A和[tTF]W158R所述相同的誘變方法，誘變引物是5′ACA CTT TAT TAT CGG AAA TCT TCA GCT TCA GGA AAG(SEQ ID NO27)上述載體構建體和蛋白質純化的方法與Gly[tTF]的純化方法相同。實施例IV制備tTF雙特異性抗體加合物并合成組織因子綴合物A.制備tTF雙特異性抗體加合物構建雙特異性抗體，它具有特異于tTF上非抑制性表位的10H10抗體的一個Fab’臂，以及與該臂連接的具有不相關特異性的抗體(OX7，Mac51，CAMPATH-2)的一個Fab’臂。當與tTF混合時，雙特異性抗體即經由10H10臂結合tTF，形成非共價的加合物。根據(jù)略加改動的Brennan等(1985；列入本文作為參考)的方法合成雙特異性抗體。
簡單地說，通過用胃蛋白酶(A型；EC3.4.23.1)消化，由IgG抗體得到F(ab’)2片段，再通過在Sephadex G100上層析將該片段純化至均質。20℃下，在含有1mM EDTA(PBSE緩沖液)和9mM NaAsO2的0.1M磷酸鈉緩沖液，pH6.8中，用5mM 2-巰基乙醇將F(ab’)2片段還原16小時。加入Ellman試劑(ER)使其終濃度為25mM，20℃3小時后，在處于PBSE中的Sephadex G25柱上將Ellman衍生化的Fab’片段(Fab’-ER)與未反應的ER分開。
為了形成雙特異性抗體，在Amicon超濾杯中將衍生自一種抗體的Fab’-ER濃縮至約2.5mg/ml，用10mM 2-巰基乙醇在20℃下還原1小時。將所得Fab’-SH穿過處于PBSE中的Sephadex G25柱以進行過濾，并與制備自第二抗體的1∶1摩爾過量的Fab’-ER混合。通過超濾將混合物濃縮至約3mg/ml，20℃下攪拌16小時。在處于PBS中的Sephadex G100柱上分級分離反應產物，將含有雙特異性抗體(110KDa)的級分濃縮至1mg/ml，4℃下，儲存于0.02％疊氮鈉中。
為了形成tTF雙特異性抗體加合物，將雙特異性抗體與等摩爾量的tTF或其衍生物在4℃下混合1小時。在凝膠過濾柱上洗脫分子量約為130KDa的加合物，它相當于一分子tTF與一分子雙特異性抗體連接。1.制備IgG-H6-N’-cys-tTF219和IgG-H6-tTF219-cys-C’
在26mg溶于經N2沖洗過的磷酸鹽緩沖液中、濃度為10mg/ml的IgG中加入溶于0.1ml干DMF中的250μg SMPT(Pharmacia)。室溫下攪拌30分鐘之后，將溶液上樣于用相同緩沖液平衡過的Sephadex G25(F)柱(1.6cm直徑×30cm)。將衍生化的IgG至收集10-12ml，通過超濾(Amicon，YM2膜)濃縮至約3.5ml。通過于室溫下，0.2mM DTT的存在下保溫以還原H6-N’-cys-tTF219或H6-tTF219-cys-C’(15mg)，直至所有Ellman試劑均釋放出來(即412nm下的OD達到最大值)，然后上樣于用N2沖洗過的緩沖液平衡過的Sephadex G25(F)柱(1.6cm直徑×30cm)中。
在衍生化的IgG溶液中直接加入Cys-tTF(約15ml)，通過超濾將混合物濃縮為約5ml，室溫下保溫18小時，然后通過在SephacrylS200上進行凝膠過濾層析來分離，收集含有分子量175,000-200,000之物質的峰。此組分由與一個或兩個tTF分子連接的一個IgG分子組成。此綴合物具有下列結構
2.制備Fab’-H6-N’-cys-tTF219用10mM巰基乙胺還原IgG的F(ab’)2片段，從而產生Fab’片段。通過在Sephadex G25上進行凝膠過濾將所得的Fab’片段與還原劑分開。以20μM的濃度混合等摩爾量新鮮還原的Fab’片段和經Ellman修飾的H6-N’-cys-tTF219，偶聯(lián)反應發(fā)生后，412nm處的光吸收會增加，這是因為綴合引起釋放了3-羧化-4-硝基硫代苯酚鹽(3-carboxylato-4-nitrothiophenolate)陰離子。綴合物具有下列結構Fab’-SS-tTFB.合成組織因子綴合物1.化學衍生化和抗體綴合通過經由二硫鍵連接化學衍生化的抗體與化學衍生化的tTF，合成抗體tTF綴合物。
將抗體與5倍摩爾過量的琥珀酰亞胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)在室溫下反應1小時，以形成衍生化抗體，其中每個抗體分子平均有2個吡啶基二硫基，通過凝膠滲透層析純化衍生化的抗體。
將與抗體相比為2.5倍摩爾過量的tTF與45倍摩爾過量的2-亞氨基硫戊雜環(huán)(2IT)在室溫下反應1小時，產生每個tTF分子平均具有1.5個巰基基團的tTF。也通過凝膠滲透層析純化衍生化的tTF，并立即與衍生化的抗體混合。
使混合物于室溫下反應72小時，然后上樣于Sephacryl S-300柱中，以將抗體-tTF綴合物與游離的tTF和釋放的吡啶-2-硫酮分開。通過在抗tTF柱上進行親和層析將綴合物與游離的抗體分開。如SDS-PAGE所評估，最終綴合物產物中占優(yōu)勢的分子類型是單一取代的抗體-tTF綴合物(Mr約為176,000)，只有較少量的多取代綴合物(Mr≥約202,000)。2.半胱氨酸修飾的tTF與衍生化抗體的綴合經由二硫鍵直接偶聯(lián)半胱氨酸修飾的tTF與化學衍生化的抗體，合成抗體-C[TF]和[tTF]C綴合物。
將抗體與12倍摩爾過量的2IT于室溫下反應1小時，產生每個抗體分子平均具有1.5個巰基的衍生化抗體。通過凝膠滲透層析純化衍生化的抗體，并立即與2倍摩爾過量的經半胱氨酸修飾的tTF混合。使混合物于室溫下反應24小時，然后如上所述通過凝膠滲透和親和層析純化綴合物。
如SDS-PAGE所評估，最終綴合物中占優(yōu)勢的分子類型是單一取代的綴合物(Mr約為176,000)，只有較少量的多取代綴合物(Mr≥約202,000)。3.半胱氨酸修飾的tTF與Fab’片段的綴合制備抗體Fab’-C[tTF]和[tTF]C綴合物。這種綴合物在體內更加有效，因為因其有限的內化能力使得它們在細胞表面維持的時間比二價綴合物更長。將Fab’片段與2倍摩爾過量的經半胱氨酸修飾的tTF混合24小時，然后如上所述通過凝膠滲透和親和層析純化綴合物。實施例V組織因子使腫瘤血管形成梗塞A.方法1.體外凝血試驗利用此試驗來證明，tTF、其多種衍生物和突變體、以及免疫球蛋白-tTF綴合物一旦定位于細胞表面，即獲得凝血誘導活性。將A20淋巴瘤細胞(I-Ad陽性)(2×106個細胞/ml，50μl)與一種雙特異性抗體(50μg/ml，25μl)在室溫下保溫1小時，所述雙特異性抗體由針對I-Ad的B21-2抗體的Fab’臂與針對tTF上非抑制性表位的10H10抗體的Fab’臂相連接組成。室溫下洗滌細胞，加入不同濃度的tTF、其衍生物或突變體、或免疫球蛋白-tTF綴合物，于室溫下達1小時。該雙特異性抗體捕獲tTF或與免疫球蛋白相連的tTF，使其緊挨細胞表面，在此處進行凝血。
室溫下再次洗滌細胞，重新懸浮于75μl PBS中，升溫至37℃。加入鈣(12.5mM)和檸檬酸鹽化的小鼠或人血漿(30μl)，記錄第一條血纖蛋白鏈形成的時間。將凝血時間對tTF濃度作圖，將曲線與使用標準tTF219制品制得的標準曲線比較。
在一些研究中，將多種濃度的重組人因子VIIa與tTF219及其突變體加在一起，以測定因子VIIa的存在是否增強了凝血速率。2.因子Xa產生試驗除體外凝血試驗外，此試驗也是有用的，或可替代體外凝血試驗，用于闡明tTF和免疫球蛋白-tTF綴合物一旦定位于細胞表面，即可獲得凝血誘導活性。此試驗利用因子Xa的生色底物(S-2765)來測定因子X至Xa的轉變。
將A20細胞(2×107個細胞)懸浮于10ml含有0.2％w/v疊氮鈉的培養(yǎng)基中。在2.5ml細胞懸浮液中加入6.8μgB21-2/10H10“捕獲”雙特異性抗體，于室溫下達50分鐘。洗滌細胞，將細胞重新懸浮于2.5ml含有0.2％w/v疊氮鈉的培養(yǎng)基中。以不同的濃度將100μl溶解于相同培養(yǎng)基中的tTF和免疫球蛋白-tTF綴合物加入96孔微滴定板的孔中，然后向孔中加入100μl細胞/雙特異性抗體懸浮液，室溫下將板保溫50分鐘。
將板離心，棄上清液，將細胞沉淀物重新懸浮于250μl洗滌緩沖液(150mM NaCl；50mM Tris-HCl，pH8；0.2％w/v牛血清白蛋白)中。再次洗滌細胞，將細胞重新懸浮于100μl稀釋了12.5倍的Proplex T(Baxter，Inc.)中，該Proplex中含有于稀釋緩沖液(添加了12.5mM氯化鈣的洗滌緩沖液)中的因子II，VII，IX和X。將平板于37℃保溫30分鐘，在每孔中加入于洗滌緩沖液中的終止溶液(12.5mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA))。離心平板，在得自每孔的100μl上清液中加入11μl S-2765(N-α-芐基氧羰基-D-Arg-L-Gly-L-Arg-?；鶎ο趸桨范渎然?，Chromogenix AB，Sweden)。測定各溶液在409nm處的光密度，將結果與使用標準tTF219制得的標準曲線比較。3.體內腫瘤血栓形成使用此模型來闡明tTF和免疫球蛋白-tTF綴合物可在體內誘導腫瘤血管形成血栓和導致腫瘤血管發(fā)生梗塞。
腫瘤檢測系統(tǒng)有四種類型i)在C57BL/6小鼠皮下生長的3LL小鼠肺癌；ii)在BALB/c nu/nu小鼠皮下生長的C1300小鼠成神經細胞瘤；iii)在BALB/c nu/nu小鼠皮下生長的HT29人結腸癌；和iv)在BALB/c nu/nu小鼠皮下生長的C1300 Muγ小鼠成神經細胞瘤。C1300 Muγ腫瘤是衍生自C1300腫瘤的、可分泌γ干擾素的轉染體(Watanabe等，1989)。
另外，按下述使用和修飾C1300(Muγ)腫瘤模型(Burrows等，1992；列入本文作為參考)(i)使用抗體B21-2靶向I-Ad；(ii)使用在BALB/c nu/nu小鼠體內持續(xù)生長的C1300(Muγ)腫瘤細胞，C1300(Muγ)12腫瘤細胞的一個亞系；和(iii)小鼠的飲用水中不加四環(huán)素以防止腸細菌誘導胃腸上皮細胞上的I-Ad。與免疫毒素不同，凝血配體和組織因子構建體不會損害表達I-Ad的腸上皮細胞。4.腫瘤的建立為了建立腫瘤，將106至1.5×107個腫瘤細胞皮下注射至小鼠的右前肋，當腫瘤生長至不同大小時，將小鼠隨機劃分為不同的研究組。然后給小鼠靜脈內注射0.5mg/kg tTF，或與IgG、Fab’或雙特異性抗體連接的tTF。其它小鼠僅接受等量的IgG，F(xiàn)ab’或雙特異性抗體。在約45秒的時間內，緩慢注射至一尾靜脈中，通常接著注射200μl鹽水。
一些研究中研究了施用癌癥化學治療藥物對tTF使腫瘤血管形成血栓之作用的影響。給皮下攜有直徑為1.0cm的HT29人結腸腫瘤的小鼠腹膜內注射阿霉素(1mg/kg/天)，喜樹堿(1mg/kg/天)，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(20mg/kg/天)，或γ干擾素(2×105個單位/kg/天)2天，然后注射tTF，注射tTF的當天再次注射上述藥物。
注射了tTF或免疫球蛋白-tTF綴合物24小時之后，用metophane麻醉小鼠，通過用肝素化的鹽水灌流除去小鼠的血。切下腫瘤和正常組織，立即用3％(v/v)福爾馬林固定。切出石蠟切片，用蘇木精和伊紅染色。計數(shù)含有紅細胞、具有開腔的血管和含有血栓的血管。切出石蠟切片，用蘇木精和伊紅染色或用MartiusScarlet Blue(MSB)三色染色以檢測血纖蛋白。5.抗腫瘤效應使用被接受的動物模型測定施用tTF或免疫球蛋白-tTF綴合物是否可抑制小鼠體內實體腫瘤的生長。腫瘤檢測系統(tǒng)是i)在SCID小鼠體內生長的L540人Hodgkin氏病腫瘤；ii)在nu/nu小鼠體內生長的C1300 Muγ(分泌干擾素)成神經細胞瘤；iii)在nu/nu小鼠體內生長的H460人非小細胞肺癌。為了建立實體腫瘤，將1.5×107個腫瘤細胞皮下注射至SCID或BALB/c nu/nu小鼠(Charles RiverLabs.，Wilmingham，MA)的右前肋。當腫瘤生長至不同直徑時，將小鼠隨機劃分為不同的實驗組，每組含4至9只小鼠。
然后給小鼠靜脈內注射0.5mg/kg tTF，或與雙特異性抗體連接的tTF。其它小鼠僅接受等量的雙特異性抗體。耗時約45秒以上注射至一尾靜脈中，接著注射200μl鹽水。6天后重復注入。以規(guī)則的間隔測定正交的腫瘤直徑，計算腫瘤體積。B.結果1.通過tTF和突變體體外凝血為了將tTF靶向腫瘤血管內皮細胞上的I-Ad，發(fā)明人制備了一種雙特異性抗體，該抗體具有特異于I-Ad的B21-2抗體的Fab’臂，此臂與特異于tTF C組件上非抑制性表位的10H10抗體的Fab’臂相連接。此雙特異性抗體B21-2/10H10在體外介導tTF以抗原特異性的方式結合A20小鼠B淋巴瘤細胞上的I-Ad。當向已通過B21-2/10H10與tTF結合的A20細胞中加入小鼠血漿時，血漿快速凝血。在經抗體處理的細胞中加入血漿36秒后即可看到血纖蛋白鏈，而在未經處理的細胞中加入血漿164秒后才可看見血纖蛋白鏈(圖4A)。僅當tTF與細胞結合時，才可觀察到這一增強的凝血現(xiàn)象對于僅與tTF保溫的細胞而言，未觀察到對凝血時間的影響，對于與同二聚體F(ab’)2、Fab’片段或tTF加上僅具有tTF與A20細胞結合所需兩種特異性之一的雙特異性抗體保溫的細胞而言，結果也是如此。
按實施例I制備的tTF219與得自Thomas Edgington博士(TheScripps Research Institute，La Jolla，CA)的“標準”tTF219制品，在經由B21-2/10H10雙特異性抗體與A20淋巴瘤細胞結合之后，它們誘導小鼠或人血漿凝血的能力相同(圖5)。當實施例I中的tTF219制品和“標準”的tTF都以3×10-9M的濃度應用于細胞時，小鼠血漿在50秒內凝血，因此，按本文所述制備的tTF219似乎正確地進行了重新折疊并具有完整的活性。
與細胞結合的tTF分子數(shù)目的對數(shù)和細胞使血漿凝血的速率之間存在線性關系(圖4B)。在僅存在細胞的情況下，血漿在190秒內凝血，而在每個細胞結合300,000個tTF分子的情況下，凝血時間為40秒。甚至在每個細胞僅結合有20,000個分子的情況下，凝血時間(140秒)也快于未經處理的細胞。這些體外研究表明，通過抗體介導的與細胞表面II類抗原的結合，使得接近于細胞表面，這樣可增強tTF的血栓形成效力。
一旦經由雙特異性抗體與A20細胞結合，H6-N’-cys-tTF219和H6-tTF219-cys-C’誘導血漿凝血的活性與tTF相同。當以3×10-9M的濃度使用H6-N’-cys-tTF219和H6-tTF219-cys-C’時(與tTF濃度相同)，血漿在50秒內凝血(圖5)。因此，突變tTF而在N’或C’末端導入(His)6序列和Cys殘基不會降低其誘導凝血的活性。
一旦經由雙特異性抗體B21-2/10H10定位于A20細胞的表面上，H6-tTF220-cys-C’，tTF220-cys-C’，H6-tTF221-cys-C’和tTF221-cys-C’在誘導血漿凝血方面與tTF219活性相同。所有樣品均為5×10-10M，血漿在50秒內凝血(圖6和圖7)。2.通過tTF二聚體在體外凝血一旦經由雙特異性抗體B21-2/10H10定位于A20細胞的表面上，H6-N’-cys-tTF219二聚體在誘導血漿凝血方面與tTF219本身活性相同。濃度為1-2×10-10M的兩種樣品在50秒內誘導凝血(圖8)。與之形成對照的是，H6-tTF221-cys-C’二聚體比H6-tTF221-cys-C’單體或tTF219本身的活性低4倍。濃度為4×10-9M的H6-tTF221-cys-C’二聚體在50秒內誘導血漿凝血，而只需使用濃度為1×10-9M的相應單體即可產生相同的凝血效果。3.體內腫瘤血栓形成進行組織學研究，以確定靜脈內施用B21-2/10H10-tTF凝血配體是否可誘導皮下攜有直徑為0.8至1.0cm的C1300(Muγ)成神經細胞瘤的小鼠的腫瘤血管系統(tǒng)選擇性地形成血栓(圖9)。在30分鐘內，所有穿過腫瘤的血管皆形成血栓，含有堵塞的血小板聚集物，聚集的紅細胞和血纖蛋白。此時，腫瘤細胞在組織學上無法與未經處理的小鼠的腫瘤細胞區(qū)分開。
然而，4小時后，有腫瘤細胞受損的跡象。大多數(shù)腫瘤細胞已彼此分開，并具有固縮核，腫瘤間質通常含有紅細胞。24小時過后，腫瘤顯示出高度壞死，72小時過后，腫瘤整個中心區(qū)凝聚成無定形的碎片。這些研究表明，B21-2/10H10-tTF凝血配體對腫瘤血管的顯著堵塞作用是通過與腫瘤血管內皮細胞上的II類抗原結合所介導的。
奇怪的是，觀察到在較晚的時間，在腫瘤血管中具有可覺察的tTF非特異性血栓形成作用在24小時前用tTF或與對照雙特異性抗體OX7/10H10混合的tTF注射的小鼠的腫瘤中，在30分鐘內腫瘤開始呈現(xiàn)變黑、受損的外觀，到24小時時，這種外觀逐漸變得更加明顯。組織學研究揭示，注射tTF21924小時之后，實際上腫瘤所有區(qū)域中的所有血管都形成血栓(圖9)。血管中含有血小板聚集物、聚集的紅細胞和血纖蛋白。大多數(shù)腫瘤細胞已彼此分開，并產生固縮核，腫瘤的很多區(qū)域都已壞死，這些現(xiàn)象在腫瘤核心最為顯著，在腫瘤間質中普遍可觀察到紅細胞。
可能腫瘤血管系統(tǒng)存在的凝血酶原活性(Zacharski等，1993)使得這些血管對甚至由未靶向的tTF引起的血栓形成更加敏感?；蛘?，可能是由衍生自腫瘤的IFNγ誘導了增強的前促凝劑變化。
當給攜有大C1300腫瘤(＞1000mm3)的小鼠施用tTF219時，可得到類似的結果。另外，在注射24小時后，實際上所有血管都形成血栓(圖10)，因此，所觀察到的對C1300 Muγ腫瘤的作用與腫瘤細胞分泌γ干擾素無關。
在攜有大(＞800mm3)3LL腫瘤的C57BL/6小鼠中進行進一步的研究。又觀察到腫瘤血管中的血栓形成，但在某種程度上沒有用C1300和C1300Muγ腫瘤觀察到的顯著。平均62％的3LL腫瘤血管形成血栓(圖11)。
施用tTF219很大程度上未能顯著影響小(＜500mm3)C1300和C1300Muγ腫瘤中的血管，因此，隨著腫瘤的生長，它們對tTF219引起的血栓形成更加敏感。這可能是因為由腫瘤細胞或浸潤腫瘤的宿主細胞釋放的細胞因子激活了腫瘤血管內皮細胞，誘導血管中前促凝劑變化所致。
凝血配體治療能被很好地耐受，小鼠未減重并保持正常的外觀和活性水平。當治療劑量為0.6mg/kg B21-2/10H10加上0.5mg/kgtTF時，40只小鼠中，僅在2只中觀察到毒性(尾靜脈的血栓形成)，重要的是應指出，攜有腫瘤的小鼠在施用凝血配體或游離的tTF之后30分鐘或24小時，其肝臟，腎臟，肺，腸，心臟，腦，腎上腺，胰腺或脾臟的石蠟切片中均看不見血栓、組織學或形態(tài)學的異常。另外，在經治療的動物中未觀察到毒性的跡象(行為變化，體征，體重變化)。4.抗腫瘤作用發(fā)明人接著研究了靜脈內施用B21-2/10H10-tTF凝血配體是否可抑制小鼠大腫瘤(直徑為0.8-1.0cm)的生長。3個獨立研究的綜合結果表明，接受B21-2/10H10-tTF凝血配體的小鼠腫瘤完全萎縮達4個月或更長時間。這些抗腫瘤效應顯著大于所有其它治療組(圖12A)。
奇怪的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)B21-2/10H10-tTF凝血配體的抗腫瘤效應部分歸功于tTF的非靶向作用。接受tTF或與對照雙特異性抗體(CAMPATH II/10H10或B21-2/OX7)混合的tTF的小鼠內，腫瘤明顯比僅接受抗體或鹽水的小鼠內腫瘤生長得更慢(圖12A；圖12B)。
給攜有小(300mm3)C1300Muγ腫瘤的小鼠靜脈內注射16-20μgtTF219，1周后重復治療。用tTF219第一次治療對腫瘤生長有微弱的抑制作用，這與在上述小腫瘤中觀察到的無顯著的血栓形成是一致的(圖12B)。第二次治療對腫瘤生長具有明顯更大的，統(tǒng)計學上顯著(p＜0.01)的作用，這可能是因為腫瘤的大小有所增加。用tTF219第二次治療1周后，腫瘤大小為僅接受稀釋劑的小鼠腫瘤的60％。第二次注射更加有效可能是因為上文觀察到的tTF219對大腫瘤內血管有更強的血栓形成作用。
在攜有H460人肺癌的小鼠中觀察到了類似的抗腫瘤作用(圖13)。當腫瘤較小(250mm3)時第一次用tTF219進行治療，此時對生長速率沒什么影響。當腫瘤較大(900mm3)時第二次用tTF219進行治療，導致腫瘤在再次生長之前萎縮至550mm3。
在攜有HT29人結腸癌的小鼠中也觀察到抗腫瘤作用(圖14)。給兩肋攜有大(1200mm3)腫瘤的Nu/nu小鼠靜脈內注射tTF219或PBS(對照)，每天監(jiān)測腫瘤的生長，共監(jiān)測10天。用tTF219治療的小鼠腫瘤在治療后約7天內不再持續(xù)生長，而用PBS治療的小鼠腫瘤持續(xù)不受抑制地生長。
在接受B21-2/10H10-tTF凝血配體治療之后未顯示出完全腫瘤萎縮的動物中，由腫瘤周邊細胞存活的微小邊緣長成腫瘤。對這些腫瘤的免疫組化檢查揭示出腫瘤侵襲邊緣的血管內皮細胞缺乏可測的II類抗原，這與能允許局部腫瘤細胞存活的凝血配體不能使這些血管形成血栓是一致的，因此，共同施用對腫瘤細胞自身起作用的藥物可能會改善效力，這一點已被另一種抗血管療法所證實(Burrows和Thorpe，1992；Burrows和Thorpe，1993；Burrows和Thorpe，1994；美國流水號07/846,349；08/205,330；08/295,868；和08/350,212)。
發(fā)明人以前闡明當施用于攜有大C1300Muγ腫瘤的小鼠時，針對腫瘤細胞自身的強細胞毒性的蓖麻毒蛋白A鏈免疫毒素實際上不具有抗腫瘤活性(Burrows和Thorpe，1993；美國流水號07/846,349；08/205,330；08/295,868；和08/350,212)。缺乏活性的原因可能是免疫毒素不能靠近大腫瘤塊的腫瘤細胞，因此證實了凝血配體療法具有相當?shù)男ЯΑ?br>
使用凝血配體的研究證實了腫瘤血管系統(tǒng)中凝血級聯(lián)反應選擇性起始的治療效力(美國流水號08/273,567；08/482,369；08/485,482；08/487,427；08/479,733；08/472,631；08/479,727和08/481,904)。因此，通過將凝血酶原靶向腫瘤內皮細胞標記物而誘導腫瘤梗塞是有效的抗癌策略，甚至可導致原發(fā)性實體腫瘤和血管化轉移的根除。
靶向研究最初的令人驚奇的成果是成功地使用了tTF或tTF與不相關特異性之抗體的免疫綴合物。盡管僅接受tTF的小鼠不具有完全的腫瘤萎縮，顯然，tTF令人驚奇的抗腫瘤活性使得它和功能相關的TF衍生物可用于治療實體腫瘤。本文所述這種組分的好處很多，包括使用這種TF沒有副作用。另外，本領域技術人員熟知產生本發(fā)明提供的tTF型組分的方法。這種組分可單獨用于治療實體腫瘤，也可與其它抗癌劑聯(lián)合治療實體腫瘤。實施例VI通過免疫球蛋白-TF綴合物使小鼠血漿凝血當借助于雙特異性抗體B21-2/10H10定位于A20細胞表面時，IgG-H6-N’-cys-tTF219具有誘導小鼠血漿凝血的活性。當以5×10-9M的濃度施用tTF時，50秒內可誘導凝血，這與使用1×10-9M非綴合的tTF219和H6-N’-cys-tTF219的結果相當(圖15)。因此，相對于未綴合的H6-N’-cys-tTF219或tTF219自身而言，IgG-H6-N’-cys-tTF219的凝血誘導活性降低了5倍。
IgG的綴合使活性稍有降低可能是因為IgG-H6-N’-cys-tTF219的IgG部分阻礙了B21-2/10H10雙特異性抗體接近tTF部分(即相對于檢測方法而言是人為的降低)。這可能不是因為IgG-H6-N’-cys-tTF219的IgG部分干擾了凝血起始復合物的形成，因為在早期的工作中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)類似構建體B21-2 IgG-H6-N’-cys-tTF219中的tTF部分與經由B21-2/10H10而與A20細胞上的I-Ad抗原結合的tTF活性一樣(圖16)。類似地，B21-2 IgG-H6-tTF219-cys-C’與N’連接的綴合物誘導凝血的活性相同(圖16)。
檢測IgG-H6-N’-cys-tTF219和Fab’-H6-N’-cys-tTF219一旦借助于雙特異性抗體B21-2/10H10而定位于A20淋巴瘤細胞表面上時，在因子II，VII和IX的存在下將因子X轉變?yōu)閄a的能力。Fab’-tTF構建體在誘導Xa形成方面與H6-N’-cys-tTF219自身活性相同。IgG-tTF構建體比H6-N’-cys-tTF219自身的活性稍低(2倍)(圖17)。實施例VII通過免疫球蛋白-TF綴合物抑制C1300 Muγ腫瘤的生長用tTF219或tTF219與不針對腫瘤環(huán)境組分的雙特異性抗體OX7Fab’/10H10 Fab’的復合物治療皮下攜有小(300mm3)C1300Muγ腫瘤的小鼠，6天后重復治療(圖18)。雙特異性抗體被簡單設計為可將tTF219的分子量由25KDa增加至135 KDa，以延長其循環(huán)半壽期，但并非旨在賦予tTF靶向的功能。
用免疫球蛋白-tTF綴合物治療的小鼠體內的腫瘤比僅接受tTF219的小鼠體內的腫瘤生長得更加緩慢。第一次注射后14天，腫瘤大小是僅接受稀釋劑的對照的55％。在僅接受tTF219的小鼠中，腫瘤大小是僅接受稀釋劑的對照的75％(圖18)。實施例VIII通過表鬼臼毒素吡喃葡糖苷增強免疫球蛋白-tTF綴合物的抗腫瘤活性用tTF219與雙特異性抗體的復合物和常規(guī)的抗癌藥物表鬼臼毒素吡喃葡糖苷一起治療攜有L540人Hodgkin疾病腫瘤的小鼠。表鬼臼毒素吡喃葡糖苷大大增強了免疫球蛋白-tTF綴合物的作用。僅在這一腫瘤模型中，僅接受抗體-tTF復合物的小鼠相對于僅接受稀釋劑的小鼠腫瘤而言未顯示出腫瘤生長的降低(圖19)。
與之形成對照的是，接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和免疫球蛋白-tTF綴合物的小鼠內腫瘤大小萎縮，17天內未重新開始生長。在研究結束時(第20天)，接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和免疫球蛋白-tTF的小鼠內腫瘤大小平均為900mm3，相比之下，用稀釋劑治療的小鼠為2300mm3，僅用免疫球蛋白-tTF治療的小鼠為2000mm3。在僅接受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的小鼠中，第14天腫瘤平均為1400mm3(圖19)。這些結果表明，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷可使腫瘤血管傾向于由tTF或免疫球蛋白-tTF綴合物形成血栓。不論機制如何，結果清楚地顯示了tTF或TF綴合物與典型化學治療劑的有利聯(lián)合。實施例IX通過VIIa增強血漿凝血游離的因子VIIa的存在大大增強了與細胞結合的tTF219誘導小鼠或人血漿凝血的能力(圖20)。缺乏因子VIIa時，用B21-2/10H10雙特異性抗體和10-10M tTF219處理的A20細胞在60秒內使血漿凝血，而當存在13.5nM因子VIIa時，它使血漿在20秒內凝血(圖20)。這表明在因子VIIa的存在下，tTF誘導凝血的效力約增加了100倍。甚至在只有0.1nM因子VIIa的存在下，也可觀察到tTF誘導凝血的效力約增加了2至5倍。
這一發(fā)現(xiàn)導致了本發(fā)明的一些方面，即將因子VIIa與tTF或其衍生物一起、或者與免疫球蛋白-tTF綴合物一起共同施用，以增強體內腫瘤血管的血栓形成。實施例X通過TF因子VII激活突變體減少小鼠血漿的凝血據(jù)報道，tTF219W158和G164的突變可顯著降低TF誘導重新鈣化的血漿發(fā)生凝血的能力(Ruf等，1992；Martin等，1995)。TF的殘基157-167對于加速因子VII激活為因子VIIa似乎是至關重要的，但對于因子VII與TF的結合似乎并不重要。發(fā)明人將W158突變?yōu)镽，G164突變?yōu)锳，并測定突變體一旦通過雙特異性抗體B21-2/10H10定位于A20細胞的表面上時是否即獲得使血漿凝血的能力。我們發(fā)現(xiàn)突變體誘導血漿凝血的效力比tTF219低30至50倍(圖21)。實施例XI通過因子VIIa恢復因子VII激活突變體的凝血能力突變的tTF219(G164A)是很弱的tTF219凝血突變體(Ruf等，1992)。突變存在于據(jù)認為對因子VII轉變?yōu)橐蜃覸IIa至關重要的TF區(qū)域(氨基酸157-167)，因此，推斷在被雙特異性抗體和tTF219(G164A)包被的細胞中加入因子VIIa會誘導血漿凝血。在因子VIIa的存在下，先被B21-2/10H10包被，接著被tTF219(G164A)包被的A20細胞誘導血漿凝血的能力增強(圖22)，這一事實可支持上述觀點。相對于加入相同濃度的tTF219和因子VIIa而言，加入濃度為1nM或更高的因子VIIa時凝血時間僅稍微更慢一些。
突變的tTF219(W158R)與tTF219(G164A)的結果相似。相對于加入相同濃度的tTF219和因子VIIa而言，在先被B21-2/10H10包被、接著被tTF219包被的A20細胞中加入濃度為1nM或更高的因子VIIa時，凝血時間僅稍微變慢一些。
這些結果支持本發(fā)明某些方面的內容，即當將tTF219(G164A)或tTF219(W158R)與因子VIIa共同施用于攜有腫瘤的動物時，會誘導腫瘤血管形成血栓。預想此方法比較有利，因為分開施用tTF219(G164A)，tTF219(W158R)或因子VIIa實際上對小鼠無毒性，相同結果可合理地推及至人。共同施用突變體tTF和因子VIIa有望不會導致毒性，而仍可導致腫瘤血管發(fā)生有效的血栓形成。因此，一起施用突變體tTF和因子VIIa預計會導致比施用tTF219加因子VIIa有所改善的治療指標。實施例XII激活突變體和因子VIIa有所增強的抗腫瘤活性為了進行這些研究，發(fā)明人選擇了HT29(人結腸癌)異種移植腫瘤模型。給BALB/c nu/nu小鼠皮下注射HT29細胞(107個細胞/小鼠)。監(jiān)測腫瘤大小，當腫瘤大小為0.5至1.0cm3時處理動物。給動物靜脈內注射下列物質之一tTF219(16μg)，tTF219(16μg)+因子VIIa(1μg)，tTF219(G164A)(64μg)，tTF219(G164A)(64μg)+因子VIIa(1μg)，僅因子VIIa(1μg)，或鹽水。
處理24小時之后處死動物，用鹽水和肝素灌注，并放血。收集腫瘤和器官，用福爾馬林固定，制備組織切片。定量測定腫瘤切片上壞死的平均面積，并將此面積計算為切片上腫瘤總面積的百分比。
在這些小HT29腫瘤中，對用鹽水、因子VIIa、tTF219或tTF219(G164A)治療的動物腫瘤切片的分析顯示出有一些壞死(圖23)。tTF誘導的腫瘤壞死是最顯著的，但在這種情況下，它不象使用不同腫瘤模型和/或大腫瘤的早期研究結果那樣令人震驚。用tTF219+因子VIIa或tTF219(G164A)+因子VIIa治療過的動物的腫瘤切片分析顯示出有相當程度的壞死(分別為12.5％和17.7％；圖23)，新形成血栓的血管和壞死的面積之間有密切的關系。因此，因子VIIa和TF、甚至體外凝血活性有特別缺損的TF構建體的聯(lián)合使用是本發(fā)明特別有利的方面。由于HT29腫瘤模型一般難以形成血栓，且這些腫瘤較小，因此，這些結果在其它體系和人中可能甚至會更加令人驚奇。
參照本發(fā)明的內容，無需過多的實驗即可制備和實施本文公開和要求的所有組合物和/或方法。盡管以優(yōu)選實施方案的方式描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對本領域技術人員顯而易見的是，在不違背本發(fā)明概念、精神和范圍的情況下，可對本文所述的組合物和/或方法和方法的步驟或各步驟的順序作一些改動。更具體地，在化學和生理上都相關的某些藥劑顯然可替代本文所述的藥劑，而能獲得相同或相似的結果。對本領域技術人員而言顯而易見的所有這種相似的替代和修飾都包括在所附權利要求書確定的本發(fā)明精神、范圍和概念內。參考文獻具體地將下列參考文獻列入本文作為參考，它們在某種程度上可提供操作上的例子或其它細節(jié)以補充本文所述的內容。AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988.Abraham et al.，Science，233545-548，1986.Abrams and Oldham，Monoclonal Antibody Therapy of Human Cancer，F(xiàn)oon and Morgan(Eds.)，Martinus Nijhoff Publishing，Boston，pp.103-120，1985.Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.，1989.Bach et al.，Biochemistry，25，4007-4020，1986.Bauer，et al.，Vox Sang，61156-157，1991.Baxter，et al.，Micro. Res.，41(1)5-23，1991.Bevilacqua，et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，849238-9242，1987.Bhagwat et al.，Nature，316511-513，1985.Bicknell and Harris，Seminars in Cancer Biology，3399-407，1992.Birembaut et al.，J.Pathology，145283-296，1985.Bjorndahl et al.，Eur. J. Immunol.，19881-887，1989.Bolhuis et al.，J.Immunol.，1491840-1846，1992.Borden et al.，Cancer，65800-814，1990.Brennan et al.，Science，22981-83，1985.Brinkmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，88(19)8616-8620，1991.Broze，Seminars in Hematol.，29159-169，1992.Burchell et al.，J.Immunol.，131(1)508-513，1983.Burrows et al.，Cancer Res.，525965-5962，1992.Burrows et al.，Cancer Res.，514768-4775，1991.Burrows and Thorpe，Proc.Natl. Acad. Sci.，USA，908996-9000，1993.Burtin et al.，Cancer，31719-726，1983.Byers and Baldwin Immunol.，65329-335，1988.Campbell，InMonoclonal Antibody Technology.Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Vol.13，Burden and Von Knippenberg(Eds.)，Elseview，Amsterdam.
pp.75-83，1984.Chen et al.，J. Immunol.，1458-12，1990.Cherwinski et al.，J.Exp.Med.，1661229-1244，1989.Clark et al.，Biochem.Biophys.ACTA，867244-251，1986.Clark et al.，Int.J.Cancer，215-17，1988.Clark et al.，Cancer Res.，51944-948，1991.Colcher et al.，Cancer Res.，471185 and 4218，1987.Collins et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8l4917-4921，1984.Cotran et al.，J.Exp.Med.，164661-666，1986.Daar et al.，Transplantation，38(3)293-298，1984.Davie et al.，Biochem.，3010363-10310，1991.Davies and Wlodawer，F(xiàn)ASEB J.，950-56，1995.Davis and Preston，Analytical Biochemistry，116(2)402-407，1981.DeFranco，Nature，352754-755，1991.deLeij et al.，Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity，Romet-Lemonne et al.，p.
249，1991.Denekamp et al.，Brit.J.Cancer，461711-720，1982.Dewerchin et al.，Blood，78(4)1005-1018，1991.Di Scipio et al.，Biochemistry，165253-5260，1977.Dillman et al.，Antibody Immunocon. Radiopharm.，165-77，1988.Drake et al.，J.Cell Biol.，109389-95，1989.Dustin et al.，J.Immunol.，137245-254，1986.Dvorak et al.，J.Exp. Med.，1741275-1278，1991.Edgington et al.，Thrombosis and Haemostatis，66(1)67-79，1991.Embleton et al.，Br.J.Cancer，63(5)670-674，1991.Epenetos et al.，Cancer Res.，463183-3191，1986.Fair，Blood，62784-791，1983.Fair et al.，J.Biol. Chem.，262，11692-11698，1987.Ferrara，J.Cell. Biochem.，47211-218，1991.Flavell et al.，Br. J.Cancer，64(2)274-280，1991.Flavell et al.，Br.J.Cancer，65545-551，1992.Folkman，Adv.Cancer Res.，43175-230，1985aFolkman，InImportant Advances in Oncology，Part I，DeVita et al.，(Eds.)，J B Lippincott，Philadelphia，pp.42-62，1985b.Fox et al.，J.Biol.Resp.，9499-511，1990.Frelinger III，et al.，J.Biol. Chem.，265(11)6346-6352，1990.Frelinger III，et al.，J.Biol. Chem.，266(26)17106-17111，1991.French et al.，Cancer Res.，512358-2361，1991.Galfre et al.，Methods Enzymol.，731-46，1981.Gefter et al.，Somatic Cell Genet.，3231-236，1977.Geppert et al.，Immunological Reviews，1175-66，1990.Ghose and Blair，CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，3262-359，1987.Ghose，CRC Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems，3262-359，1982.Ghose et al.，Meth. Enzymology，93280-333，1983.Ghose et al.，CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，3262-359，1987.Giles et al.，Brit.J.Haematol.，69491-497，1988.Glennie et al.，J.Immunol.，1392367-2375，1987.Glennie et al.，1988Goding，InMonoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，2d Ed.，Academic Press，Orlando，F(xiàn)l.，pp.60-61，65-66，71-74，1986.Gougos and Letarte，J.Immunol.，1411925-1933，1988.Groenewegen et al.，Nature，316361-363，1985.Hagen，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，832412-2416，1986.Halling et al.，Nucl.Acids Res.，138019-8033，1985.Hammerling，Transplant Rev.，3064-82，1976.Hattey et al.，Thrombosis Research，45(5)485-495，1987.Hayward et al.，Biological Chemistry，266(11)7114-7120，1991.Hess et al.，Transplantation，61232-1240，1991.Heynen et al.，J.Clin.Invest.，941098-1112，1994.Jain，Cancer Meta.Rev.，9(3)253-266，1990.June et al.，Mol.Cell Biol.，124472-4481，1987.June et al.，Immunology Today，11(6)211-216，1990.Juwcid et al.，Cancer Res.，525144-5153，1992.Kandel et al.，Cell.661095-1104，1991.Kim et al.，Nature，362841-844，1993.Kimura et al.，Immunogenetics，11373-381，1983.Kisiel，J.Biol. Chem.，254(23)12230-12234，1979.Klagsburn and Folkman，Angiogenesis Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.95，Sporn and Roberts，Springer-Verlag，Berlin，pp.549-586，1990.Kohler and Milstein，Nature，256495-497，1975.Kohler and Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519，1976.Krishnaswamy et al.，J. Biol.Chem.，26726110-26120，1992.Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.，157(1)105-132，1982.Lamb et al.，Eur.J.Biochem.，148265-270，1985.Lee et al.，Methods in Enzymology，237146-164，1994.Leith et al.，British J.Cancer，66(2)345-348，1992.Lord et al.，InGenetically Engineered Toxins，F(xiàn)rank(Ed.)，M.Dekker Publ.，p.183，1992.Lowder et al.，Blood，69199-210，1987.Lowe et al.，Immunol.Lett.，12263-269，1986.Maeda et al.，J. Invest.Derm.，97183-189，1991.Manabe et al.，J. Lab.Clin.Med.，104(3)445-454，1984.Martin，F(xiàn)ASEB J.，9852-859，1995.Massoglia et al.，J.Cell Phys.，132531-537，1987.Mazzocchi et al.，Cancer Immunol.Immuother.，3213-21，1990.Mignatti et al.，J.Cell.Biol.，1131193-1201，1991.Miotti et al.，Cancer Res.，65826，1985.Moroi and Aoki，J.Biol.Chem.，251(19)5956-5965，1976.Morrissey et al.，Cell，50129-135，1987.Morrissey et al.，Thrombosis Research，52247-261，1988.Morrissey et al.，Blood，81734-744，1993.Mueller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8911832-11836，1992.Murray，Clauss，Thurston，Stem，Int.J.Radiat.Biol.，60273-277，1991.Nakamura，Prog.Growth Factor Res.，367-86，1991.Nawroth，Handley，Matsueda，de Waal，Gerlach，Blohm，Stem，J.Exp.Med.，168637-648，1988.Nawroth and Stern，J.Exp.Med.，163740-745，1986.Nelson，Cancer Cells，3(5)p163-72，1991.Nemerson，Blood，71(1)1-8，1988.Nitta et al.，Lancet，335368-371，1990.Nolan and Kennedy，1990O’Brien et al.，J.Clin.Invest.，82206-211，1988.O’Connell et al.，J.Immunol.，144(2)521-525，1990.O’Hare et al.，F(xiàn)EBS Lett.，210731，1987.Ogata，J.Biol.Chem.，25620678-20685，1990.Ogawa，Shreeniwas，Brett，Clauss，F(xiàn)urie，Stem，Brit.J.Haematol.，75517-524，1990.Ohuchida et al.，J.Am.Chem.Soc.，103(15)4597-4599，1981.Oi and Morrison，Mt.Sinai J.Med.，53(3)175-180，1986.Osborn et al.，Cell，591203-1211，1989.Osterud et al.，Thrombosis Res.，42323-329，1986.Paborsky et al.，J. Biol.Chem.，266(32)21911-21916，1991.Palleroni et al.，Int.J.Cancer，49296-302，1991.Pasqualini et al.，Nat. Biotechnol.15542-546，1997.Paulus，1985Perez et al.，Nature，316354-356，1985.Perez et al.，J.Immunol.，1372069-2072，1986a.Perez et al.，J.Exp.Med.，163166-178，1986b.Pieterez et al.，Antibody Immunoconj.Radiopharm.，179-103，35，1988.Pimm et al.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，118367-370，1992.Pober et al.，J.Exp.Med.，1571339-1353，1991.Pukrittayakamee et al.，Mol.Biol.Med.，1123-135，1983.Qian et al.，Cancer Res.，1403250，1991.Rehemtulla et al.，Thrombosis and Haemostatis.65(5)521-527，1991.Reisfeld et al.，Melanoma Antigens and Antibodies，p.317，1982.Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th Ed.，Mack Publishing Company，1980.Rettig et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，8910832-10836，1992.Rivoltini et al.，3rd Int.Conf.Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity，1992.Ruco et al.，Am.J.Pathol.，137(5)1163-1171，1990.Ruf and Edgington，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，888430-8434，1991a.Ruf and Edgington，Thrombosis and Haemostasis，66(5)529-533，40，1991b.Ruf，et al.，J.Biol.Chem.，266，pg.2158，1991.Ruf and Edgington，F(xiàn)ASEB J.，8385-390，1994.Ruf et al.，J.Biol.Chem.，26722206-22210，1992a.Ruf et al.，J.Biol.Chem.，2676375-6381，1992b.Ruf et al.，J.Biol.Chem.，267(31)22206-22210，1992c.Sakai and Kisiel，Thrombosis Res.，60213-222，1990.Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989.Sands，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals，1213-226，1988.Schutt et al.，Immunol.Lett.，19321-328，1988.Shen and Tai，J.Biol.Chem.，261(25)11585-11591，1986.Segal et al.，Int.J.Cancer Suppl.，7 p36-8，1992Shankar et al.，J.Biol.Chem.，269(19)13936-13941，1994.Shepard et al.，J.Clin.Immunol.，11117-127，1991.Shockley et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，617367-382，1991.Smith et al.，Br.J.Cancer，59(2)p174-8，1989.Spiegelberg and Weigle，J.Exp.Med.，121323-338，1965.Staerz et al.，Nature，314(6012)628-631，1985.Stevenson et al.，Chem.Immunol.，48126-166，1990.Stone，et al.，Biochem J.，310605，1995.Street et al.，Cell.Immunol.，12075-81，1989.Sugama et al.，Jpn.J.Pharmacol.，552，pp.287-290，1991.Sugama et al.，J.Cell.Biol.，119(4)935-944，1992.ten Cate et al.，J.Clin.Invest.，921207-1212，1993.Thieme et al.，Diabetes，44(1)98-103，1995.Thor et al，Cancer Res.，463118，1986.Ting et al.，J.Immunol.，141741-748，1988.Titus et al.，J.Immunol.，1384018-4022，1987.Tomiyama et al.，Blood.，79(9)2303-2312，1992.Tone 1977Tutt et al.，Eur.J.Immunol.，211351-1358，1991.U.S. Patent 4,196,265U.S. Patent 4,554,101U.S. Patent 4,975,369U.S. Patent 5,017,556U.S. Patent 5,110,730U.S. Patent 5,139,941U.S. Patent 5,183,756U.S. Patent 5,223,427U.S. Patent 5,242,813U.S. Patent 5,288,641U.S. Patent 5,346,991U.S. Patent 5,374,617U.S. Patent 5,437,864U.S. Patent 5,504,064U.S. Patent 5,504,067U.S. Patent 5,589,173U.S. Patent 5,589,363Ugarova et al.，J.Biol.Chem.，268(28)21080-21087，1993.Vaickus et al.，Cancer Invest.，9195-209，1991.Van Duk et al.，Int.J.Cancer，43344-349，1989.Venkateswaran et al.，Hybridoma，11(6)729-739，1992.Vitetta et al.，Cancer Res.，154052-4058，1991.Wang et al.，Biochem.and Biophys.Res.Comm.，177(1)286-291，1991.Wang et al.，Int.J.Cancer，54363-370，1993.Warr et al.，Blood，751481-1489，1990.Watanbe et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869456-9460，1989.Wawrzynczak and Thorpe InImmunoconjugatesAntibody Conjugates in Radioimaging andTherapy of Cancer，Vogel(ed.)，New York，Oxford University Press，pp.28-55，1987.Weiss et al.，Blood，73968-975，1989.Whittle et al.，Nature，292472-474，1981.Wildgoose et al.，Blood，8025-28，1992.Williams and Esnouf，Biochem.J，8452-62，1962.Wiman and Collen，Eur.J.Biochem.，7819-26，1977.Wiman，Biochem.J.，191229-232，1980.Winter and Milstein，Nature，349293-299，1991.WO 94/05328，PCT ApplicationWO 94/07515，PCT ApplicationWO 94/28017，PCT ApplicationWO 96/01653，PCT ApplicationWu et al.，Int.J.Pharm.，12235-239，1990.Xu et al.，J.Biol.Chem.，267(25)17792-17803，1992.Yamaue et al.，Biotherapy，2247-259，1990.Zamarron et al.，J.Biol.Chem.，266(24)16193-16199，1991.
序列表1)一般資料(i)申請人(A)姓名Board of Regents，The University of TexasSystem(B)街道201 West 7th Street(C)城市Austin(D)州Texas(E)國家美國(F)郵政編碼78701(ii)發(fā)明題目凝血和腫瘤治療的組織因子方法和組合物(iii)序列數(shù)27(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)目前的申請資料(A)申請?zhí)栁粗?vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/042,427(B)申請日27-MAR-1997(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/036,205(B)申請日27-JAN-1997(vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 60/035,920(B)申請日22-JAN-1997(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度620個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Thr His Arg Ala1 5 10 15Ser Asn Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Thr Tyr20 25 30Arg Ala Ser Asn Leu Glu Thr His Arg Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ser35 40 45Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Asn Pro His GLu Leu Tyr Ser Thr His50 55 60Arg Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Thr Arg Pro Gly Leu Pro Arg Leu65 70 75 80Tyr ser Pro Arg Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu Asn Val Ala Leu85 90 95Thr Tyr Arg Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Ile Leu Glu Ser100 105 110Glu Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Ser115 120 125Pro Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser130 135 140Pro His Glu Thr Tyr Arg Thr His Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Thr145 150 155 160His Arg Gly Leu Cys Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Thr His Arg Ala165 170 175Ser Pro Gly Leu Ile Leu Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro180 185 190Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Thr His Arg Thr Tyr Arg Leu195 200 205Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala Leu Pro His Glu Ser Glu Arg210 215 220Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Val Ala225 230 235 240Leu Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala245 250 255Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Pro Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu260 265 270Ala Ser Asn Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu Pro His Glu Thr His Arg275 280 285Pro Arg Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Thr His Arg Ala Ser Asn Leu290 295 300Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Pro Arg Thr His Arg Ile Leu Glu Gly305 310 315 320Leu Asn Ser Glu Arg Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu325 330 335Gly Leu Tyr Thr His Arg Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Ser Asn Val340 345 350Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu Ala Ser Pro Gly Leu Ala355 360 365Arg Gly Thr His Arg Leu Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Ala Arg Gly370 375 380Ala Ser Asn Ala Ser Asn Thr His Arg Pro His Glu Leu Glu Ser Glu385 390 395 400Arg Leu Glu Ala Arg Gly Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Gly405 410 415Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Leu Glu Ile Leu Glu Thr Tyr Arg420 425 430Thr His Arg Leu Glu Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Thr Arg Pro Leu Tyr435 440 445Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr450 455 460Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr465 470 475 480His Arg Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Ser Asn Gly Leu Pro His Glu485 490 495Leu Glu Ile Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Ser Pro Leu Tyr500 505 510Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Pro515 520 525His Glu Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Leu Ala Val Ala530 535 540Leu Ile Leu Glu Pro Arg Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Val545 550 555 560Ala Leu Ala Ser Asn Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Thr His565 570 575Arg Ala Ser Pro Ser Glu Arg Pro Arg Val Ala Leu Gly Leu Cys Tyr580 585 590Ser Met Glu Thr Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Leu Tyr Ser Gly595 600 605Leu Tyr Gly Leu Pro His Glu Ala Arg Gly Gly Leu610 615 620(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度234個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Cys1 5 10 15Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr20 25 30Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val35 40 45Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys50 55 60Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys65 70 75 80Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly85 90 95Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser100 105 110Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile115 120 125Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp130 135 140Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp145 150 155 160Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser165 170 175Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile180 l85 190Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile195 200 205Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys210 215 220Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu225 230(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度234個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO3His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly1 5 10 15Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn20 25 30Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr35 40 45Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe50 55 60Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp65 70 75 80Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn85 90 95Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro100 105 110Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln115 120 125Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu130 135 140Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val145 150 155 160Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser165 170 175Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp180 185 190Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro195 200 205Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met210 215 220Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Cys225 230(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度220個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO4Ser Cys Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys1 5 10 15Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn20 25 30Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser35 40 45Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile50 55 60Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro65 70 75 80Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu85 90 95Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro100 105 110Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val115 120 125Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu130 135 140Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys145 150 155 160Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe165 170 175Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala180 185 190Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val195 200 205Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu210 215 220(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度220個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO5Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Iys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Cys210 215 220(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度235個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO6His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly1 5 10 15Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn20 25 30Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr35 40 45Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe50 55 60Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp65 70 75 80Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn85 90 95Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro100 105 110Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln115 120 125Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu130 135 140Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val145 150 155 160Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser165 170 175Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp180 l85 190Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro195 200 205Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met210 215 220Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Cys225 230 235(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度236個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO7His His His His His His Ala Met Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly1 5 10 15Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn20 25 30Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr35 40 45Thr Val Gln Ile Ser Tnr Lys Ser Gly Asp lrp Lys Ser Lys Cys Phe50 55 60Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp65 70 75 80Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn85 90 95Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro100 105 110Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln115 120 125Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu130 135 140Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val145 150 155 160Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser165 170 175Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp180 185 190Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro195 200 205Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met210 215 220Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Cys225 230 235(2)SEQ ID N08的資料(i)序列特征(A)長度219個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO8Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Arg Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu210 215(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度219個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO9Ser Gly Thr Thr Asn Thr val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Ala Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu210 215(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征
(A)長度657個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO10TCAGGCACTA CAAATACTGT GGCAGCATAT AATTTAACTT GGAAATCAAC TAATTTCAAG 60ACAATTTTGG AGTGGGAACC CAAACCCGTC AATCAAGTCT ACACTGTTCA AATAAGCACT120AAGTCAGGAG ATTGGAAAAG CAAATGCTTT TACACAACAG ACACAGAGTG TGACCTCACC180GACGAGATTG TGAAGGATGT GAAGCAGACG TACTTGGCAC GGGTCTTCTC CTACCCGGCA240GGGAATGTGG AGAGCACCGG TTCTGCTGGG GAGCCTCTGT ATGAGAACTC CCCAGAGTTC300ACACCTTACC TGGAGACAAA CCTCGGACAG CCAACAATTC AGAGTTTTGA ACAGGTGGGA360ACAAAAGTGA ATGTGACCGT AGAAGATGAA CGGACTTTAG TCAGAAGGAA CAACACTTTC420CTAAGCCTCC GGGATGTTTT TGGCAAGGAC TTAATTTATA CACTTTATTA TTGGAAATCT480TCAAGTTCAG GAAAGAAAAC AGCCAAAACA AACACTAATG AGTTTTTGAT TGATGTGGAT540AAAGGAGAAA ACTACTGTTT CAGTGTTCAA GCAGTGATTC CCTCCCGAAC AGTTAACCGG600AAGAGTACAG ACAGCCCGGT AGAGTGTATG GGCCAGGAGA AAGGGGAATT CAGAGAA 657(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度13865個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO11GAATTCTCCC AGAGGCAAAC TGCCAGATGT GAGGCTGCTC TTCCTCAGTC ACTATCTCTG 60GTCGTACCGG GCGATGCCTG AGCCAACTGA CCCTCAGACC TGTGAGCCGA GCCGGTCACA120CCGTGGCTGA CACCGGCATT CCCACCGCCT TTCTCCTGTG CGACCCGCTA AGGGCCCCGC180GAGGTGGGCA GGCCAAGTAT TCTTGACCTT CGTGGGGTAG AAGAAGCCAC CGTGGCTGGG240AGAGGGCCCT GCTCACAGCC ACACGTTTAC TTCGCTGCAG GTCCCGAGCT TCTGCCCCAG300GTGGGCAAAG CATCCGGGAA ATGCCCTCCG CTGCCCGAGG GGAGCCCAGA GCCCGTGCTT360TCTATTAAAT GTTGTAAATG CCGCCTCTCC CACTTTATCA CCAAATGGAA GGGAAGAATT420CTTCCAAGGC GCCCTCCCTT TCCTGCCATA GACCTGCAAC CCACCTAAGC TGCACGTCGG480AGTCGCGGGC CTGGGTGAAT CCGGGGGCCT TGGGGGACCC GGGCAACTAG ACCCGCCTGC 540GTCCTCCAGG GCAGCTCCGC GCTCGGTGGC GCGGTTGAAT CACTGGGGTG AGTCATCCCT 600TGCAGGGTCC CGGAGTTTCC TACCGGGAGG AGGCGGGGCA GGGGTGTGGA CTCGCCGGGG 660GCCGCCCACC GCGACGGCAA GTGACCCGGG CCGGGGGCGG GGAGTCGGGA GGAGCGGCGG 720GGGCGGGCGC CGGGGGCGGG CAGAGGCGCG GGAGAGCGCG CCGCCGGCCC TTTATAGCGC 780GCGGGGCACC GGCTCCCCAA GACTGCGAGC TCCCCGCACC CCCTCGCACT CCCTCTGGCC 840GGCCCAGGGC GCCTTCAGCC CAACCTCCCC AGCCCCACGG GCGCCACGGA ACCCGCTCGA 900TCTCGCCGCC AACTGGTAGA CATGGAGACC CCTGCCTGGC CCCGGGTCCC GCGCCCCGAG 960ACCGCCGTCG CTCGGACGCT CCTGCTCGGC TGGGTCTTCG CCCAGGTGGC CGGCGCTTCA 1020GGTGAGTGGC ACCAGCCCCT GGAAGCCCGG GGCGCGCCAC ACGCAGGAGG GAGGCGACAG 1080TCCTGGCTGG CAGCGGGCTC GCCCTGGTTC CCCGGGGCGC CCATGTTGTC CCCCGCGCCT 1140ACGGGACTCG GCTGCGCTCA CCCAGCCCGG CTTGAATGAA CCGAGTCCGT CGGGCGCCGG 1200CGGGAGTTGC AGGGAGGGAG TTGGCGCCCC AGACCCCGCT GCCCCTTCCG CTGGAGAGTT 1260TTGCTCGGGG TGTCCGAGTA ATTGGACTGT TGTTGCATAA GCGGACTTTT AGCTCCCGCT 1320TTAACTCTGG GGAAAGGGCT TCCCAGTGAG TTGCGACCTT CAATATGATA GGACTTGTGC 1380CTGCGTCTGC ACGTGTTGGC GTGCAGAGGT TTGGATATTA TCTTTCATTA TATGTGCATC 1440TTCCCTTAAT AAAGAGCGTC CCTGGTCTTT TCCTGGCCAT CTTTGTTCTA GGTTTGGGTA 1500GAGGCAATCC AAAAGGGCTG GATTGCTGCT TAGATTGGAG CAGGTACAAC GTTGTGCATG 1560CCCCGTATTT CTACGAGGTG TTCGGGACGG CGTAGAGACT GGGACCTGCT GCGTACTGGC 1620AAAGCAGACC TTCATAAGAA ATAATCCTGA TCCAATACAG CCGACGGTGT GACAGGCCAC 1680ACGTCCCCGT GGGTCTCTGT GGAAGTTTCA GTGTAGCGAC ATTTCAGATA AAAGTGGAAA 1740AAGTGAAGTT TGGCTTTTTT CATTTGTATG CAGTCCTAAC TCTTGTCACA CGTGTGGGAT 1800TTATCTTTTT CCATAACTTA CTGAAAACCC TTCCTGGCGG GCTGAACCTG ACTCTTCCTG 1860AGCTGAGTCC TGGACTGGCA CACTGATGGC TCTGGGCTCT TCCCGGTCAA GTTATAACAA 1920GGCTTTGCCC ATGAATAATT TCAAACGAAA ATGTCAAGAT CCTTGCCGGT GTCCTGGGAT 1980TACAAGGTGA ATCTTGTCAT GAAGAAATTC TAGGTCTAGA AAAAATTTGA AGATTCTTTT 2040TCTCTTGATA ATTCACTAAT GAAGCTTTTG TGGTTGAAAA ATAAAAAGTG AGGTTTATGG 2100TGATGTCAGG TGGGAAGGTG TTTTATACAT CAATACATTC GAGTGCTCTG AAGTGCATGT 2160AATAATAGCT GTTTCTCTGT TGTTTAAAGG CACTACAAAT ACTGTGGCAG CATATAATTT 2220AACTTGGAAA TCAACTAATT TCAAGACAAT TTTGGAGTGG GAACCCAAAC CCGTCAATCA 2280AGTCTACACT GTTCAAATAA GGTAAGCTGG GTACAGAAAA AGAAAATTAA GGTCTTTGAT 2340GTTTCTACTG TCCTATGCTG AACAAGAATG TCTTTAAAGC TGATTACTGG ATGAAATTAT 2400TTAACAGATG ACGAAGAAGA AGGGATTCTT GGCAATTCGC TGGCCGGTGT CATACTCTAT 2460TAGGCCTGCA ACATTTCCAG ACCTTAAACT GATAGAACAT TTTAATTGTT TTAATTGTTT 2520TTGGAAATGA TGGGAGAGTT CCTAAGTGGA GTATAAACTG TGGAGAGATG AACCATCTTG 2580AGTAGGCACT GAAGTGTGCT TTGGGTCATG ATAGATTAAT TAATCTCATC TAAACATTGA 2640TGTCTTTTTC CGTTGCTGTC TAGACTGTGA ACAATGTCTA ACACCTTAGG GAAGAGGTGG 2700GGAGGAATCC CAATGTATAC ATTGCCCTTA AGCAGTGTTT GATTCATTCA TCTTTGGACT 2760CCATGAATCG AAATCTGGTA GAATACATGA TCTTAGTGGA GGAGGCCAAA TGCGTGACTC 2820ACTGAGCCTG GCAGAGCAGA AATACTCTGC TGTCTGCACC CTCTGGGTCT GGTGTGGCTC 2880TGCTTCTTGG TGCTTCAACT CTGACTGGCA GCTGTCCCCA GGAGGCGATA ATTCAGCATG 2940TTCAATCTAA AGGTTATGAC TTCCTTGATG GTTTTCACCA TATTCTTGGC AAGTTTTTGG 3000TTTTTGAAAT GTTCTAGGAG GCTTGGTAGA GATCTTATGA AATAGAGAAT AGCTGCTGTG 3060GAAATTATTT TAATGCTAAT TACATAAAAG TACAAAAGTA GCACTAGCTA AAACAAAAGG 3120TATTTTGCTG TTCTGTTTTG TTTTAGCTTG TGCCAGGCCT TTTACAGCAT TAGGAATGCA 3180ACTTCTAGAT AACGATGCAT CTTTTAAGTG AATGTTCTTG TTTTTCAAAA TGAACTTCAT 3240GACAGTAGTT GCCAAACCAG CAAGGAGAAC TTGCATGCAT ACGTGCATGC ATGTGTGGAT 3300ATGTATGGGG GTGGGGGGAG AGAAAGATGA AGGAATTTCA TAACATGAAA TAATGATTAC 3360AGTTCTGGTC AAACTTGTCA ATTCAGATTT CACCAATTGA GAATTAGTAA GTAATTTCTC 3420TGATACAGGC CTGAAGTTTA CCTTAGTAAA CACTTTACTT CCATATGGTA AAAATTAGAT 3480TTTGGGAGGA ATGCTTACCT CCTAAATATA TTCAATCTAA TATTTGAGGA CACATGGGAA 3540TATATTTATG ATTCATCTGC TTTTTAAACA TAAGCCTTTG TTAACTGTAA GTTCTTGAAC 3600TTTATAAGGC TGCTGTTATT TAAATGAGCA CAGCTCCTGA TCTGCAAACA GCAGAGCGCA 3660GGGCTACAGC TTGGGGGATG CCAGCCGACT CAGGGTGGTC CTGTGGACTG AACAATCTCT 3720TGCTGCTGTA CTGGAGGGCC TGGGAGCTTT TCCATCAGCC TCGGCCTGAG GTGTGCACTC 3780TTCTCCTGCC CACCCCAGGA ATAAATGAGA TTCCTGGTTA AAAAGGACCA GAGCAGTCAT 3840TTTACAGTTG AGGAAACTGT TGCTCTGAGA AGTGAGGGAT TTATTCATGA CTACACTGAT 3900GGTGAGTGCC CATGTCAGGT CTGGAACCAA AGTCTACCCA GTATCCACAC ACCACCATCC 3960CTCAGGTGGC TCTGCCACAG TCTGATGGGA GGCTCCAAAG CGGGAGGAAG AAGGAAAGTC 4020TTGCCCACTG CATCTCCTCA GTTGGCCTTC CTCTCTGCCT GTTTTCCCTC CCTACAGTTA 4080GCATCTTAAG CAGCTGCCTC TCTTCCCTCC CGACTGCTCT CACTACTGCA GCCTGGCTCC 4140AGCCGCAGGA CACTACTGCT GTGCAGAAGC CCCTACTTGG AACTCCAACT GCATTTTTCA 4200CCTTTGCTAA CAGTTTTCAG TGGTGGTTGG GAAATGTTAT TGGCTTAAGC CTTAGCACAA 4260ACCGTCACCG GTGATATTCA TTCCATGGAA ATGTTCTGAA TTCTAAAGCT GAATTTACAA 4320AGCTTCTGGA AAACAACCTG CAACCAAATT AGTGACTGAA TTTTTTAGTT AACTCAAAAT 4380TCCAAATCAG AGGGTTTTGC AATGCCTGGA GGAACCTTGG AGGCTTTTAA AGTGTTAATG 4440CTATTAATGG CATTCAGAGG GATTTTCTAC AGAATTGTCC CTTCATTACC TGTTTATACA 4500GTTTTACTAC TTACCAGGGT ACTGTATAAA TCCTTGTGCT AAATTTTGCT ATAGAGTATG 4560TGGTCCCTGC TGTGAGCTGG GAGGAACCAA ATACTGTATC TCTATGTTAC ATAGAAAGCC 4620CTAGGAGACT TTCTCCTGTT ATCTGAACAA CTATTTGCTG TACTGATAAA AAGGAAACAG 4680CATAGTCTCA TTCACTTTTT GAAATGGAAA TGATAAAATA AAACACATTT TGGTCATTCG 4740GGAACAAAAT ACCCTCTCTA CTTTTATCAC ATAAAATTAA ATAAATAGAA ACCAAATAT 4800TTCAGTATCA ATCTTAGTTT GTGCACTTTA GGATAAAGAA TGTGTTTACC CAAATCCTTT 4860TGGCCTGGTT ACTTAGTTCA GATTTTGAAA GAAAATATAT TTGTGGCTTT TATGTGTGAA 4920TTTAGACAAT GGAATCCATG TGGTGCCTCG TTTTCCCTGA GATTATGTAT TAATTCAACC 4980TGTAAATGCA AACCATCTAA TAGTCAGCGA GACCCTATAG CCCTGCTGCT TAATGGGGGC 5040ACACAAGGGC ATGCAGCCCT CGTACCAGGC AGACTGTGTT CATATTAACA GCATCGTGGA 5100GAAACTCATG CTGGGGGACA GGGGAGGGAG ATGTAAATGC TCAGCAGGGA GATCTGGAGA 5160TTCCTGGAGC AGGTGGAGTT GGGACCTGGC CTTGAACGAT GGGTCTGGCT CTGGCAGTCA 5220GTAATGCCAA AGGGAAGAGC AGCATAACTG TCACTTTCCA TGGGACAGAA GTGTGTGAAT 5280CAAGTTGCAG TGACGCTTCA CCTATTTATT ATTTTGGTCA TTTAGAAGAA TTTCATTGTC 5340AGTAGAAGTC CTTTAAATCA TTTCCCCTTC AGTGACGTCT CACAAAAAAA AGATCTGTCT 5400TTAGCTTTTT AGTCTCAGAC TTTATTAGAC AGATACTACC TGTACTCTTA TTCTGTAATC 5460TTTGTTGGGA TGGATTCACA TCTTGCAAAG GAAGGGAGGC ATGTAGTATA ATGGGGCAAA 5520CAGACCCAGC TCTGCCACTC GTTAGATATG TGACCTTCTG CAAGTTGCTT AGTGCCTGTG 5580AGCTTCAGTG TCCTCATGGA TAAGAAAGAT CCAACACCTT CTTGGAAGGA TTATATCAAA 5640TGAAGTAACA TGAGTAAAGG GTCCAGCAGA ATACCTGGCA TATAGTGGAG TCAATGAATG 5700ATTAATAATA TTATTAATAG TGGTCATGAG AGATATATGT ATAACATGTT ATTATGTAGA 5760CTCACTATAT AGACTCTATT CTACATAGAA TATAGAACAT TATATAACAA ACAACTATAA 5820TAAGTAGACT ATAGTAAACA ACCTCACTTT GTCTCAGTTG CCTCATCTTG ATGGAAAACT 5880GCTCTTTCTC TCCTGTTACC CTGACAGAGA GCGTCTACAT TCTAAAAGAA AGATATTTAA 5940CAAAATGGTT GAGTACAGAT CCAAGAGTCA AATAGCTGTC TGGTTCAAAG TCCAGCTGTG 6000TGATTTTGAG CTAGTCACCC AATCTCACTT TGTCTCAGTA GCCTTATTTG TAAAAACAAG 6060GCAAATTACA GAGCCATCCC CTGGGTTGCT ATGAGGACTC AAACATGCAT CCCAAGTGCT 6120CGGTGTTGCT AGGTATGATG GCTCACACCT GTACATTCAG CACTTTGGGA GGCCGAAGCA 6180GAAGGATCAG CCTGGGCAAC ATAGCAGGAC CCCATCTCTA CAAAACAATG TTTAAAAAAA 6240AGCAAAGTGC TCAGCACAGT GACTGCATCA TTAGGATTGA TTGTAGGGCT CCTGATGTTA 6300GCACAGAACA CCACAGCCAG GAAGCAGTCT ATCTTGTTGG GTGCAAATTG TAACATTCCA 6360TTTATGTTTC TTCCTTCTTT TCTTTCTTTA GCACTAAGTC AGGAGATTGG AAAAGCAAAT 6420GCTTTTACAC AACAGACACA GAGTGTGACC TCACCGACGA GATTGTGAAG GATGTGAAGC 6480AGACGTACTT GGCACGGGTC TTCTCCTACC CGGCAGGGAA TGTGGAGAGC ACCGGTTCTG 6540CTGGGGAGCC TCTGTATGAG AACTCCCCAG AGTTCACACC TTACCTGGAG AGTAAGTGGC 6600TTGGGCTGTA ATACCGTTCA TTCTTGTTAG AAACGTCTGA ACATTCTCGT GATCTTGTGC 6660CTTTAGGGGC TACAAAATTA AAAATATTTA TTCTTTTTTT CTCAGAAACT GGTATGTATC 6720ACAGCCCTCT TCACACATTC CAGATGTGGT AGGAGGTTCA CAGAATGTGA ACTTTTGGAG 6780CTGATGACAG TGTCATCAAG TAACTTTCTC CCCCAGTCTG TCCCCAGACC CTGTTACTGT 6840CCTCAGTAAG CGGCTGAATG TGTGTTGGGA GAGGGCGGGC CAGGGAAGCG GGTAGGGATA 6900GGAAATCCAC CAAGGCCGGG GTTTTAGCTT TTCCCTATAT ATATATCATG TATCCTGATT 6960TTTCTGTCCC GTTATCACAC TAAAAATCCC AGTTGAGGAT TTTTCCCAAA CGGTCATAAA 7020TCAATGAGGA AAGTCCATGG TTTCCCTCTG AGCCCATAAT TAGCCTAATT ATGCTGACCT 7080TTTCTAATCA GTTGGCCATG ATTTGAGTTC CGTGATGTGC CAGCACCTGC CCAGCCATCT 7140GCCTGTCACC CTCGTTCTGG TTTTGGAAAG GTGGAATACT TTCCTCCTCA GCCTTTGCCC 7200CTGTAAGCTG GCCCTAGGAG CCAGTAAAAG AATGAAGAGA ATTCCTGTCA AGTAGGAGAT 7260TTATTCTTTT GCCGCAACTG TGGCTCTGAG CTAGGCAATT TAGATAAATG CATGTAGCAC 7320ATTGAGTAGA GTGAAATTAG CTTCTCTTGT AAGGCCAGCT GGTTAGAATG AAGGTGTTGT 7380GTGAGTGTTA GGCCCAGCGA GAGAGAACAG TTTCTCAAGG TAGGAATGGT GAAAAGAAGG 7440GGTGGACGGA CAACCAACCA ACCATCCTCC TCTGGTATCT ACTTTGAGGG TTGAAATAGG 7500GGGCCTGACC CCAGGTGAAT GTGGCTGCCT TCCCAGAGCC CCCATTTGCA AGACCCTCCA 7560GACCCCCAGG TGCTTCTGCT TGTGTCTTTT GTGGCACCAG GCAAGAATGT AGCAGCGTCA 7620GCAGCCCCTC TGGTGACTGT GGCATGGTTG ACATTCATTT CCCCCCTAAT TAATGGCATC 7680CTCATGATTC TCTTTTATAT TAATAGTTCT TGAGTTTTTT TGTAAGCTAC TTCAAATCCT 7740TTGTTGGTGC AAGATAGAAG ATATTTTATG TGTTTGTTTT GCATGTGCAC ACACATATTT 7800GGCCTGTGAA TTGATGTTTG TTTTCCTGTC ATTTAACCAA AGCACATGAG ATAATTGAGC 7860CATTGCAGAG ACCCCGTGGT TAAATCCGGC TTCTCGAGGT ACCAAGGACA TTTCCTGGGC 7920TTTCTCACAG CCCTACATAT TTTTGAACCT AAAATATCGT AGTTTATGCT ACCACCCTGT 7980TCAGTATAGT AGCCACTAGC CACATGTGGC TGTTGACCAC TTGAAATATG GCTAATGCTC 8040TAAGTATAAA GTACACACTG GAATTTAAGA AGTGTAGAAT ATCTCAAAAC TTTTTTATAT 8100TGATTACACA TTAAAATGAT TATATTCCAG ATATATGCAG TTGACTCAAG CAATGCATGG 8160CTGAGAGGCA CCGACTCCCT GTGCAGTTGA AAATCCGAGT ATAACTTGAC TCCCCAAAAA 8220CTTAACTACT AATAGCCTAC CTATCGGTTG ACTGTTGACT GCAGCCTTAC CAATAAGATA 8280AACAGTCAAT TAACACACAT TTTTCATGTT GCGTGTATTA TATACTGTAT TCTTACAATA 8340AAGTAAGCTA GAGGAAAGAA AATGTTATTA AGAAAATTAT AAGGAAAAGA GGCTGGGCAT 8400GGTGGCTCGT GCCTGTAATC TCAGAACTTT GGGATGCTAA GGCGGGTGGA TCACTTGAGG 8460TCAGGAGTTC AAGACCAGCC TGGCCAACAT GGTGAAACCC CATCTCTACT AAAAATACAA 8520AAATTAGCCA GGCGTGGTTG TGGGTGCCTG TAATCCCAGC TACTTGGGAG GCTGAGGCAG 8580GAGAATCACT TCGACCCAGG TGGAGGAGGT TGCAGTGAAC TGAGATTGCG CCACTGCACT 8640CCGGCCTGGG TGACAGAGCG AGACTCTGTC TAAAAAAGAA AGGGAAAGAA AGAAAAAAAA 8700GAAAAGAAAA GAAAAGAAAG AAGGAAGGAA GAGAAAGAAT TATAAGGAAG AGAAAATATA 8760TTTACTATTG ATAAAGTGGA AGTGGATCAT CATAAAGGTG TTCATCCTCG TCATCTTCAT 8820GTTGAGTAGG CTGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAAGAGCAGG GGCCACGGCA GGAGAAAAGA 8880TGGAGGAAGT AGGAGGCGGC ACACTTGGTG TAACTTTTAT TTAAAAAAAT TTGCATACAA 8940GTGGATCCAC AGAGTTCAAA CCCATGTTGT TCAGGGGTCA ACTGTCTTTG GTTAAATAAA 9000ATATATTATT AAAATTAATT TCACCTGTTC CTTTTTACTT TTTCTAATGT GACTACTAGA 9060AAACTTAAAA TGACATCTGA GGCTCCATTG TCTTCCCCTT GGGCCAGCAC TACCACAGAA 9120ACATGTTTTA TATGAGAGAT AATTAAGTTG TCAATTGTGA TAACAAAACA GGATTTGACT 9240TTGTACAGAA TTCTTTGGTT CCAACCAAGC TCATTTCCTT TGTTTCAGCA AACCTCGGAC 9300AGCCAACAAT TCAGAGTTTT GAACAGGTGG GAACAAAAGT GAATGTGACC GTAGAAGATG 9360AACGGACTTT AGTCAGAAGG AACAACACTT TCCTAAGCCT CCGGGATGTT TTTGGCAAGG 9420ACTTAATTTA TACACTTTAT TATTGGAAAT CTTCAAGTTC AGGAAAGGTG AGCATTTTTT 9480AATTTGTTTT TATGACCTGT TTTAAATTGT GAATACTTGG TTTTACAACC CATTTCTTCC 9540CCAATTCAAA AATAGCAGAA CAGAGTTGTT GAGAAGGTGA TGGAGTAGAA GGGGGAGCGC 9600GCACTGTGGG GAGGGGTGGA CAACAGGCCT GGTCCTACCT GTGACTCTGC ACTACCCTGT 9660GACTCTGGCA GGGCCCCCTC GGAGACCCAG GTTCCTCAGC CAACCGGCTG GATCAGGTCA 9720TCTCTAAAGG TCCCGCCACG CTCACATTTC TCCCTCTATT GAGGATCCCA GGCACAAAAT 9780TTGTTTTTGG TTCAATGCAT AATACTCCCT TCCTTTTTCT TTTACTGCAG ATATCTTCTA 9840AAGGGGCTCA ATAGGGTTCA ATATGCCTAA ATTGGATCTT CTCAGTCTTG GAAAAGGCAT 9900TTTTAGCAGT GATCAAGGGA AACTGATTAG CGAAGTCACT TCTAATCCTT CACGTGTCAG 9960CTGTGTTCTT GTAGGCTTTG CTTAGAACCT AGGTTTTTAC TTCCACAGTG ACTTAATAAA10020GGGGAAAGAA TTGACTCAGA GCCCAGATGA ATTAAGAACT CTATCTTTTT ACAGAAAACA10080GCCAAAACAA ACACTAATGA GTTTTTGATT GATGTGGATA AAGGAGAAAA CTACTGTTTC10140AGTGTTCAAG CAGTGATTCC CTCCCGAACA GTTAACCGGA AGAGTACAGA CAGCCCGGTA10200GAGTGTATGG GCCAGGAGAA AGGGGAATTC AGAGGTGAGT GGCTCTGCCA GCCATTTGCC10260TGGGGGTATG GGTGCTGTGG GTGACTTCTG GAGGAGTAGC TCCACCCTCA GGGCTGGGAT10320ATACTTCCTT GGTTAAATAT TCAGGAAAAC AAACTGCCTG GAGGTTTTTT GTTGTTATTT10380GTTTGTTTTG GTTTTGATTT TGCTTTGGTA CAAAAAAGAT TTTGGACATT TAGAAATGTT10440TCTGTGTTGA TTGTGCCCTT GTATTAGCAG GTGTTTTCTT GAGCACCTGT CATGTGCTAA10500GCCCTCTGCT GAGCACTGGA TACACAAACT GTGTTTAGGA TTTAGCAACA AGTCACAGAT10560TTCCCTGGGC ATTTTTTCAT GCTTAAATTC TAATTCTGGG GGTGGCTTCT GGACCAGCTG10620CAACAGGACA CAGTAGACAT TCGTGAGTAC CCACTGTGGG CTGTTGCCAC AGAGGCTGTA10680GAGTCTAACC CATCAAGGGA AGGGATTGAG TATATCAAAT ATACCCACAT GCATGCATGT10740GTGTATATGG CGGACACGTG TGTGTACATG CATGTGCATA TGTTGGGAGC TCAGGCCCAT10800TGTGCGAGGA ACAGTCCCTA ACCGGAAGTG CTGTGGGCCT TCAGACTCTT GCAGGAAGCT10860AGAAAAGAGT CAGGGGATAT AAACGATGGC TTACGCTGGG TGTGGTGGCT CACGCCTGTA10980GTCCCTGCAC TTTGGGAGGC CCAGACAGGC AAATCACTTG AGGTCAGGAG TTTGGGACCA11040GCCTGGCCAA CATGGTAAAA GCCCATCTCT ACTCAAAATA CAAAAAGTAG CTGGGTGTGG11100TTGCACGTGT CTGTAGTCCC AGCTACTCAG GAGGTTGAGG CAGGAGAATT GCTTGAACCT11160GGGAGGCGGA GGCTGAAGTG AGCTGAGATT GGACCACTGT ACTCCAGCCT GGGTGACAGA11220GCGAGATTCC ATCTCAAAAA AAAAAAAAAG AAACAACGAA AAAAGAAATG ATGGCTTAGC11280TCCATGTGAA GATGATATTT GAACATTTTA AAACACTTTA AATAAACTGT TCTCTCCTGT11340TTATTGCCAC TGACAGGAGA GGTTTCTCTT TACCTCTGGT CCTGCACCCC TCTGAGCCAT11400CCTACCCACA GCCTTCAGTC ATTGTCCTAA AGCCTAGCTC TAATTCCACT GCCTCTCCTT11460TTGTGCACAC ACACTTCTCT GCTTCCCTGG CCGTTCTCTA TCTTGGAGAG GCATTTCAAA11520CGCCACTTCC ACCAGAAGGC CTTGCTACTG CACCAACTAG TTACTATCTC TTCTTCACCC11580AAATCCTGGT AGCACTTTGG ATCTCCCACT TGCACTTAGG GTTCACCTTC CGTTATAATC11640ATTGCCATCA ATCTCAGCAT CGTTTTAGGC ACTTCTTTCC AGCCATTGTT CTTACCTCCA11700ACTACATATC TTTTCTGGAC TGTGCATTAT TCAGTTTATT AAATGCCCAT TAAATGTGTT11760TAGCCATTGT CAATTACTCT GAAACGTTCA GGTTTTGACA AATTCTTTCC TAATGTAAGT11820GTGGTGGAAA GAGTGAAAGA AAGTCAAATT GCACAAAAAT AGGATGGTGT AATTTGGGGT11880TATGCCGTCA ATTTTGTCCA CTGATAAATG GGATTTGAGC TCTCCAAGTT GACTAGATGC11940CCTTTATTTT TCAGAAATAT TCTACATCAT TGGAGCTGTG GTATTTGTGG TCATCATCCT12000TGTCATCATC CTGGCTATAT CTCTACACAA GTGTAGAAAG GCAGGAGTGG GGCAGAGCTG12060GAAGGAGAAC TCCCCACTGA ATGTTTCATA AAGGAAGCAC TGTTGGAGCT ACTGCAAATG12120CTATATTGCA CTGTGACCGA GAACTTTTAA GAGGATAGAA TACATGGAAA CGCAAATGAG12180TATTTCGGAG CATGAAGACC CTGGAGTTCA AAAAACTCTT GATATGACCT GTTATTACCA12240TTAGCATTCT GGTTTTGACA TCAGCATTAG TCACTTTGAA ATGTAACGAA TGGTACTACA12300ACCAATTCCA AGTTTTAATT TTTAACACCA TGGCACCTTT TGCACATAAC ATGCTTTAGA12360TTATATATTC CGCACTCAAG GAGTAACCAG GTCGTCCAAG CAAAAACAAA TGGGAAAATG12420TCTTAAAAAA TCCTGGGTGG ACTTTTGAAA AGCTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGAGAC12480GGAGTCTTGC TCTGTTGCCC AGGCTGGAGT GCAGTAGCAC GATCTCGGCT CACTGCACCC12540TCCGTCTCTC GGGTTCAAGC AATTGTCTGC CTCAGCCTCC CGAGTAGCTG GGATTACAGG12600TTGGCCAGGC TGGTCTTGAA TTCCTGACCT CAGGTGATCC ACCCACCTTG GCCTCCCAAA 12720GTGCTAGTAT TATGGGCGTG AACCACCATG CCCAGCCGAA AAGCTTTTGA GGGGCTGACT 12780TCAATCCATG TAGGAAAGTA AAATGGAAGG AAATTGGGTG CATTTCTAGG ACTTTTCTAA 12840CATATGTCTA TAATATAGTG TTTAGGTTCT TTTTTTTTTC AGGAATACAT TTGGAAATTC 12900AAAACAATTG GCAAACTTTG TATTAATGTG TTAAGTGCAG GAGACATTGG TATTCTGGGC 12960ACCTTCCTAA TATGCTTTAC AATCTGCACT TTAACTGACT TAAGTGGCAT TAAACATTTG 13020AGAGCTAACT ATATTTTTAT AAGACTACTA TACAAACTAC AGAGTTTATG ATTTAAGGTA 13080CTTAAAGCTT CTATGGTTGA CATTGTATAT ATAATTTTTT AAAAAGGTTT TCTATATGGG 13140GATTTTCTAT TTATGTAGGT AATATTGTTC TATTTGTATA TATTGAGATA ATTTATTTAA 13200TATACTTTAA ATAAAGGTGA CTGGGAATTG TTACTGTTGT ACTTATTCTA TCTTCCATTT 13260ATTATTTATG TACAATTTGG TGTTTGTATT AGCTCTACTA CAGTAAATGA CTGTAAAATT 13320GTCAGTGGCT TACAACAACG TATCTTTTTC GCTTATAATA CATTTTGGTG ACTGTAGGCT 13380GACTGCACTT CTTCTCAATG TTTTCTCATT CTAGGATGCA AACCAATGGA GAAGCCCCTA 13440ATTAGATCAG GGCAGAGGGA AAAACAAAAA ACTGGTAGAA ACCGGCAACC ACAGCTTCAA 13500GCTTTAAGCC CATCTCCTAC ACTTCTGCTC TGTACGTGCC CATTGTCACT TCTGTTCACA 13560TGCTACTGTC CCAAGCAAGT GACCAAGCCT GACAATACTT TGTCTACTGG AGTCACTGCA 13620AGGCACATGA CGGGGCAGGG ATGTCGTCTT ACAGGGAAGA GAAAAGATAA TGCTCTCTAC 13680TGCAGACTTG GAGAGATTTC TTCCCATTGG CAGTAGTTTG ACTAATTGGA GATGAGAAAA 13740AAAGAAACAT TCTTGGGATG ATTGTATTGA AACAAAATTA GGTAAAAGGA CAATATAGGA 13800TAGGGAGAGA TATAAGTGGA ATGAGATCTC TAGAGTCCAT TAAAAGCAAG CTAGATTGAG 13860AGCTC 13865(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度263個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO12Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser1 5 10 15Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln20 25 30Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys35 40 45Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val50 55 60Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala65 70 75 80Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn85 90 95Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr100 105 110Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu115 120 125Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg130 135 140Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu165 170 175Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val180 185 190Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu195 200 205Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile210 215 220Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile225 230 235 240Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu245 250 255Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser260(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度1440個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO13TCAACAGGCA GGGGCAGCAC TGCAGAGATT TCATCATGGT CTCCCAGGCC CTCAGGCTCC60TCTGCCTTCT GCTTGGGCTT CAGGGCTGCC TGGCTGCAGG CGGGGTCGCT AAGGCCTCAG 120GAGGAGAAAC ACGGGACATG CCGTGGAAGC CGGGGCCTCA CAGAGTCTTC GTAACCCAGG 180AGGAAGCCCA CGGCGTCCTG CACCGGCGCC GGCGCGCCAA CGCGTTCCTG GAGGAGCTGC 240GGCCGGGCTC CCTGGAGAGG GAGTGCAAGG AGGAGCAGTG CTCCTTCGAG GAGGCCCGGG 300AGATCTTCAA GGACGCGGAG AGGACGAAGC TGTTCTGGAT TTCTTACAGT GATGGGGACC 360AGTGTGCCTC AAGTCCATGC CAGAATGGGG GCTCCTGCAA GGACCAGCTC CAGTCCTATA 420TCTGCTTCTG CCTCCCTGCC TTCGAGGGCC GGAACTGTGA GACGCACAAG GATGACCAGC 480TGATCTGTGT GAACGAGAAC GGCGGCTGTG AGCAGTACTG CAGTGACCAC ACGGGCACCA 540AGCGCTCCTG TCGGTGCCAC GAGGGGTACT CTCTGCTGGC AGACGGGGTG TCCTGCACAC 600CCACAGTTGA ATATCCATGT GGAAAAATAC CTATTCTAGA AAAAAGAAAT GCCAGCAAAC 660CCCAAGGCCG AATTGTGGGG GGCAAGGTGT GCCCCAAAGG GGAGTGTCCA TGGCAGGTCC 720TGTTGTTGGT GAATGGAGCT CAGTTGTGTG GGGGGACCCT GATCAACACC ATCTGGGTGG 780TCTCCGCGGC CCACTGTTTC GACAAAATCA AGAACTGGAG GAACCTGATC GCGGTGCTGG 840GCGAGCACGA CCTCAGCGAG CACGACGGGG ATGAGCAGAG CCGGCGGGTG GCGCAGGTCA 900TCATCCCCAG CACGTACGTC CCGGGCACCA CCAACCACGA CATCGCGCTG CTCCGCCTGC 960ACCAGCCCGT GGTCCTCACT GACCATGTGG TGCCCCTCTG CCTGCCCGAA CGGACGTTCT 1020CTGAGAGGAC GCTGGCCTTC GTGCGCTTCT CATTGGTCAG CGGCTGGGGC CAGCTGCTGG 1080ACCGTGGCGC CACGGCCCTG GAGCTCATGG TGCTCAACGT GCCCCGGCTG ATGACCCAGG 1140ACTGCCTGCA GCAGTCACGG AAGGTGGGAG ACTCCCCAAA TATCACGGAG TACATGTTCT 1200GTGCCGGCTA CTCGGATGGC AGCAAGGACT CCTGCAAGGG GGACAGTGGA GGCCCACATG 1260CCACCCACTA CCGGGGCACG TGGTACCTGA CGGGCATCGT CAGCTGGGGC CAGGGCTGCG 1320CAACCGTGGG CCACTTTGGG GTGTACACCA GGGTCTCCCA GTACATCGAG TGGCTGCAAA 1380AGCTCATGCG CTCAGAGCCA CGCCCAGGAG TCCTCCTGCG AGCCCCATTT CCCTAGCCCA 1440(2)SEQ ID N014的資料(i)序列特征(A)長度466個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln1 5 10 15Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr20 25 30Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln35 40 45Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe50 55 60Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu65 70 75 80Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile phe Lys Asp Ala Glu Arg85 90 95Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser100 105 110Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr115 120 125Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His130 135 140Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln145 150 155 160Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu165 170 175Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu180 185 190Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys195 200 205Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys210 215 220Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly225 230 235 240Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp245 250 255Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp260 265 270Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val275 280 285Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala290 295 300Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro305 310 315 320Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val325 330 335Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala340 345 350Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln355 360 365Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr370 375 380Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys385 390 395 400Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp405 410 415Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly420 425 430His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln435 440 445Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro450 455 460Phe Pro465(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO15GTCATGCCAT GGCCTCAGGC ACTACAA 27(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO16TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T31(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO17GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGCTT CTGGCACTAC AAATACT 47(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO18GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT50(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度53個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO19CGCGGATCCA CCGCCACCAG ATCCACCGCC TCCTTCTCTG AATTCCCCTT TCT53(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO20CGCGGATCCG GCGGTGGAGG CTCTTCAGGC ACTACAAATA CTGT 44(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO21TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T31(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO22GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT50(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO23TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T31(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO24GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCACTACAAA TACT 44(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO25TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCT TTCT 34(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO26CAAGTTCAGC CAAGAAAAC 19(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO27ACACTTTATT ATCGGAAATC TTCAGCTTCA GGAAAG 3
權利要求
1.組合物，該組合物中含有生物學有效量的至少第一種經修飾增加了生物半壽期的凝血缺損組織因子化合物；其中所述修飾不是由組織因子化合物與能結合腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質之組分的抗體或其抗原結合區(qū)域的連接組成。
2.權利要求1的組合物，可用于促進動物前血栓形成性血管優(yōu)先凝血所用的藥物中。
3.含有生物學有效量的至少第一種凝血缺損組織因子化合物的組合物，可用于促進動物內前血栓形成性血管優(yōu)先凝血所用的藥物中。
4.權利要求3的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是經修飾增加了生物半壽期的凝血缺損組織因子化合物；其中所述修飾并不是將組織因子化合物與可結合腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分的抗體或其抗原結合區(qū)域進行連接。
5.權利要求1，2或4中任一項的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物已通過與載體分子有效連接被修飾而增加了生物半壽期。
6.權利要求5的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物與非蛋白質載體分子有效連接。
7.權利要求5的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物與蛋白質載體分子有效連接。
8.權利要求7的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物與白蛋白或球蛋白載體分子有效連接。
9.權利要求7的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物與不特異性結合腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分的抗體或其部分有效連接。
10.權利要求9的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物與不結合腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質組分的IgG抗體有效連接。
11.權利要求9的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物與抗體的Fc部分有效連接。
12.權利要求9的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物被有效地插入IgG分子中以替代CH3域。
13.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子低至少約100倍。
14.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子低約100倍至1,000,000倍。
15.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子低至少約1000倍。
16.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子低至少約10,000倍。
17.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子低至少約100,000倍。
18.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子低至少約500,000倍。
19.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物的活性比全長的天然組織因子低至少約1,000,000倍。
20.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是激活因子VII的能力缺損的突變組織因子化合物。
21.權利要求20的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是在SEQ ID NO1的約第157至167位的氨基酸區(qū)域中包括至少一個突變的突變組織因子化合物。
22.權利要求21的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是其中第158位Trp變成Arg；第162位Ser變成Ala；第164位Gly變成Ala；或第158位Trp變成Arg且第162位Ser變成Ala的突變組織因子化合物。
23.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是結合至磷脂表面的能力缺損的組織因子化合物。
24.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是截短的組織因子化合物。
25.權利要求24的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是約為219個氨基酸長的截短組織因子化合物。
26.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物至少是二聚體的組織因子化合物。
27.權利要求26的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是同二聚體或異二聚體的組織因子化合物。
28.權利要求26的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是聚合體形式的組織因子化合物。
29.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是(a)基本上由SEQ ID N08或SEQ ID NO9的氨基酸序列組成的突變的組織因子化合物；或(b)基本上由SEQ ID NO1的氨基酸序列組成的截短組織因子化合物。
30.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是人組織因子化合物。
31.上述任一權利要求的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物是通過重組表達制備的組織因子化合物。
32.上述任一權利要求的組合物，其中所述組合物含有至少第二種不同類型的凝血缺損組織因子化合物。
33.上述任一權利要求的組合物，其中所述組合物與生物學有效量的至少一種因子VIIa或因子VIIa的激活物聯(lián)合。
34.權利要求33的組合物，其中所述組合物與因子VIIa聯(lián)合。
35.權利要求34的組合物，其中所述因子VIIa基本上由SEQ IDNO18的氨基酸序列組成。
36.權利要求33的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物和所述因子VIIa或因子VIIa的激活物被配制成單一組合物。
37.權利要求36的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物與因子VIIa以預先形成的組織因子-因子VIIa復合物的形式聯(lián)合。
38.權利要求33的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物和所述因子VIIa或因子VIIa的激活物被配制在不同組合物中。
39.上述任一權利要求的組合物，其中所述組合物與治療有效量的至少第一種抗癌劑聯(lián)合。
40.權利要求39的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是化學治療劑。
41.權利要求40的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是表II所列的化學治療劑。
42.權利要求41的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是表鬼臼毒素吡喃葡糖苷。
43.權利要求39的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是含有能與腫瘤細胞、腫瘤血管系統(tǒng)或腫瘤基質之組分特異性結合的抗體或抗原結合區(qū)域的抗體構建體，所述抗體與細胞毒性劑或凝血因子有效連接。
44.權利要求43的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是能特異性結合腫瘤血管系統(tǒng)組分的抗體構建體。
45.權利要求43的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是能特異性結合腫瘤基質組分的抗體構建體。
46.權利要求43的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是含有細胞毒性劑的抗體構建體。
47.權利要求43的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是含有凝血因子的抗體構建體。
48.權利要求47的組合物，其中所述至少第一種抗癌劑是含有組織因子或組織因子衍生物的抗體構建體。
49.權利要求39至48中任一項的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物和所述至少第一種抗癌劑被配制在單一組合物中。
50.權利要求39至48中任一項的組合物，其中所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物和所述至少第一種抗癌劑被配制成不同的組合物。
51.權利要求39至50中任一項的組合物，其中所述組合物含有至少第二種不同類型的抗癌劑。
52.權利要求2至38中任一項的組合物，其中所述藥物可用于促進動物中與良性生長相關的前血栓形成性血管優(yōu)先凝血。
53.權利要求2至51中任一項的組合物，其中所述藥物可用于促進動物中與血管化的惡性腫瘤相關的前血栓形成性血管優(yōu)先凝血。
54.權利要求53的組合物，其中所述藥物可用于促進動物中與中等大小或大的血管化惡性腫瘤相關的前血栓形成性血管優(yōu)先凝血。
55.權利要求2至54中任一項的組合物，其中所述藥物被配制成供所述動物全身性施用。
56.權利要求2至55中任一項的組合物，其中所述藥物被配制成供所述動物靜脈內注射。
57.權利要求2至56中任一項的組合物，其中所述藥物旨在供人受試者施用。
58.根據(jù)上述權利要求中任一項的組合物在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于促進動物中與血管化惡性腫瘤相關的前血栓形成性血管優(yōu)先凝血并可導致腫瘤壞死。
59.根據(jù)權利要求2至38中任一項的組合物在制備藥物中的用途，其中所述藥物可用于促進動物前血栓形成性血管優(yōu)先凝血。
60.在適當容器中包含下述的一種治療試劑盒(a)激活因子VII的能力有缺損的至少第一種突變組織因子化合物與至少一種因子VIIa或因子VIIa激活物的生物學有效聯(lián)合；或(b)至少第一種凝血缺損組織因子化合物與至少第一種抗癌劑的生物學有效聯(lián)合。
61.權利要求60的試劑盒，所述試劑盒含有激活因子VII的能力有缺損的至少第一種突變組織因子化合物與至少一種因子VIIa或因子VIIa激活物的生物學有效聯(lián)合。
62.權利要求60的試劑盒，所述試劑盒含有至少第一種凝血缺損組織因子化合物與至少第一種抗癌劑的生物學有效聯(lián)合。
63.權利要求60的試劑盒，所述試劑盒含有至少第一種凝血缺損組織因子化合物、至少第一種抗癌劑和至少一種因子VIIa或因子VIIa激活物的生物學有效聯(lián)合。
64.治療具有血管化腫瘤的動物的方法，所述方法包括給所述動物全身性施用生物學有效量的至少第一種組合物，該組合物中含有至少第一種凝血缺損組織因子化合物，所述化合物的量能有效促進腫瘤血管系統(tǒng)中的特異性凝血并導致腫瘤壞死。
65.權利要求64的方法，另外包括給所述動物施用生物學有效量的至少第二種治療化合物，所述化合物選自因子VIIa、因子VIIa激活物和抗癌劑。
66.權利要求65的方法，其中先給所述動物施用所述至少第一種凝血缺損組織因子化合物，然后在能使得有效定位于所述腫瘤血管系統(tǒng)的時間施用所述至少第二種治療化合物。
全文摘要
本發(fā)明包含令人驚奇的發(fā)現(xiàn),即組織因子(TF)組分及其變體經全身性施用后可特異性地定位于血管化腫瘤內的血管中。因此,本發(fā)明提供了可用于產生特異性凝血和用于腫瘤治療的方法和組合物,所述組合物中含有凝血缺損組織因子。本發(fā)明的TF組分和方法可作為具有改善的半壽期的TF綴合物單獨使用,或與其它藥劑,如常規(guī)的化學治療藥物、靶向的免疫毒素、靶向的凝血配體聯(lián)合使用,和/或與因子Ⅶa(FⅦa)或FⅦa激活物聯(lián)合使用。
文檔編號A61P7/02GK1251532SQ98803433
公開日2000年4月26日 申請日期1998年1月20日 優(yōu)先權日1997年1月22日
發(fā)明者P·E·索普, S·W·金, B·高 申請人:德克薩斯州立大學董事會