專(zhuān)利名稱(chēng)：：聚核苷酸組合物及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及穩(wěn)定性提高的聚核苷酸組合物。本發(fā)明還涉及通過(guò)冷凍干燥制備聚核苷酸組合物的方法。
背景技術(shù)：
：聚核苷酸組合物在工業(yè)、制藥、醫(yī)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)和／或農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣泛用途。例如，聚核苷酸可用于制備這些領(lǐng)域內(nèi)有用的蛋白質(zhì)。而且，聚核苷酸本身是用于診斷／造影方法的體內(nèi)試劑，是用于基因治療、反義方法和疫苗應(yīng)用的試劑，或作為藥物用于治療或預(yù)防諸如遺傳缺陷、傳染病、癌癥和自身免疫病等疾病。聚核苷酸還是用于諸如生物化學(xué)研究試驗(yàn)、醫(yī)學(xué)、診斷和篩選試驗(yàn)，以及污染檢測(cè)試驗(yàn)等的體外試劑。對(duì)以上所述各用途來(lái)說(shuō)，聚核苷酸，例如質(zhì)粒DNA，必需長(zhǎng)時(shí)間地留存，而且最好是在非冷藏或非冷凍溫度下。阻礙聚核苷酸以上用途開(kāi)發(fā)的一個(gè)問(wèn)題是如果不冷凍，聚核苷酸會(huì)不穩(wěn)定。例如，聚核苷酸在溶液中，數(shù)小時(shí)后就活性降低。測(cè)定聚核苷酸穩(wěn)定性的較好方法是一定時(shí)間后聚核苷酸的超螺旋(SC)喪失?！俺菪敝妇酆塑账岬囊环N物理狀態(tài)，其中，聚核苷酸的一鏈相對(duì)于另一鏈欠旋或超旋。一定時(shí)間后超螺旋的喪失會(huì)降低聚核苷酸組合物的純度。所以，人們?yōu)榻鉀Q這一問(wèn)題和提高聚核苷酸穩(wěn)定性進(jìn)行了許多嘗試。其中之一是先干燥后沉淀的聚核苷酸制備方法。然而，這類(lèi)方法沒(méi)能獲得理想的聚核苷酸穩(wěn)定性?，F(xiàn)有技術(shù)中還包括將聚核苷酸保存在鹽溶液中的方法；然而，這些方法仍然造成超螺旋結(jié)構(gòu)的喪失。穩(wěn)定聚核苷酸的其他方法包括將聚核苷酸冷凍干燥。冷凍干燥已被用于穩(wěn)定或保存食品、血漿、活器官、蛋白質(zhì)、細(xì)菌和單細(xì)胞真核生物等完整細(xì)胞和藥物等生物活性物質(zhì)。冷凍干燥的過(guò)程包括將待冷凍干燥的材料溶于溶劑，溶劑通常是水，冷凍該溶液。通常用一定量的冷凍保護(hù)劑來(lái)穩(wěn)定聚核苷酸。將溶液冷凍后，施加真空，逐步加熱凍結(jié)材料，使溶劑由凍結(jié)狀態(tài)升華。最終得到的冷凍干燥材料通常呈餅狀，其形狀與大小與凍結(jié)時(shí)的相同，具有充分的空隙率以允許再生。80年代早期，美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心出售以冷凍保護(hù)劑乳糖穩(wěn)定的凍干DNA。1996年12月27日公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO96／41873及其相關(guān)美國(guó)專(zhuān)利No．5，811，406(1998年9月22日)公開(kāi)了通過(guò)冷凍干燥含冷凍保護(hù)劑的聚核苷酸復(fù)合物來(lái)穩(wěn)定該復(fù)合物，但未公開(kāi)冷凍干燥的方法。然而，冷凍干燥過(guò)程的參數(shù)對(duì)聚核苷酸組合物的穩(wěn)定性和溶解度具有顯著影響。冷凍干燥可能得到低溶解度的聚核苷酸，這就需要較多的溶劑進(jìn)行再生。以上文獻(xiàn)未能解決冷凍干燥的這些問(wèn)題，因此沒(méi)有提供得到穩(wěn)定性或溶解度提高的冷凍干燥組合物的方法。因此本領(lǐng)域仍未得到穩(wěn)定性增強(qiáng)、尤其適合藥用的聚核苷酸組合物，以及制備此類(lèi)穩(wěn)定的聚核苷酸組合物的方法。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供一種冷凍干燥的聚核苷酸組合物，它包含至少一種聚核苷酸和至少一種冷凍保護(hù)劑，其中聚核苷酸與冷凍保護(hù)劑之比約為0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷凍保護(hù)劑。該組合物還含占最終冷凍干燥組合物總重約0．5-6wt％的水。本發(fā)明聚核苷酸組合物的特征在于穩(wěn)定性提高，在37℃，至少10天以上仍有至少90％保持超螺旋結(jié)構(gòu)。另一方面，本發(fā)明提供制備穩(wěn)定性提高的冷凍干燥聚核苷酸組合物的方法。該方法的步驟包括對(duì)含冷凍保護(hù)劑的聚核苷酸溶液進(jìn)行首輪干燥，所述組合物已經(jīng)冷卻直至凍結(jié)并處于真空中，首輪干燥包括用約5至30小時(shí)的時(shí)間逐步加熱聚核苷酸溶液，至-20℃至20℃，期間避免組合物液化(又稱(chēng)“復(fù)熔”)。該首輪改造減少了整個(gè)冷凍干燥過(guò)程所需的時(shí)間，使所得的冷凍干燥聚核苷酸呈基本無(wú)定形物理結(jié)構(gòu)，在約37℃經(jīng)至少10天以上仍保持90％的超螺旋。該產(chǎn)品可在需要時(shí)以水溶液再生。另一方面，本發(fā)明提供一種冷凍干燥方法，所設(shè)計(jì)的參數(shù)可提供穩(wěn)定性和溶解度提高的冷凍干燥聚核苷酸組合物。該方法的步驟包括(a)形成聚核苷酸水溶液，pH約6．2至7．8，含約0．1-5mg／ml(按聚核苷酸溶液總體積計(jì))至少一種聚核苷酸，和約0．5-10wt％(按聚核苷酸溶液總重計(jì))至少一種冷凍保護(hù)劑；(b)將聚核苷酸溶液冷卻至約-30℃至-70℃，直至凍結(jié)；(c)施加約25mTorr至250mTorr的真空；(d)第一次用約5至40小時(shí)將聚核苷酸溶液逐步加熱至約-40℃至約20℃；(e)將加熱步驟(d)后的聚核苷酸溶液在-35℃至10℃，25mTorr至250mTorr，保持大約1至10小時(shí)；(f)在25mTorr至250mTorr，用約1至20小時(shí)將保溫步驟(e)后的聚核苷酸溶液逐步加熱至約20℃至35℃；(g)回收冷凍干燥的聚核苷酸組合物，含水量占所得組合物總重約0．5-6wt％。另一方面，本發(fā)明提供了用以上方法制得的冷凍干燥組合物。另一方面，本發(fā)明提供一種液態(tài)的聚核苷酸組合物，其中包含以水再生的上述冷凍干燥組合物，其特征在于pH約為6．2-7．8。另一方面，本發(fā)明提供一種包含活性成分的藥物組合物，它是上述冷凍干燥組合物，或是上述再生的液態(tài)溶液。其中的成分與藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑或載體組合良好。另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動(dòng)物的方法，包括給予有效量的藥物組合物。所述給予可以是任意常規(guī)給藥途徑，例如口服、腸胃外、鼻內(nèi)或肺內(nèi)。以下本發(fā)明的詳細(xì)描述和優(yōu)選實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的其他內(nèi)容和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)述圖1是本發(fā)明冷凍干燥DNA組合物(◆)和相同DNA溶液(●)穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的曲線圖，采用瓊脂糖法，以％超螺旋(SC)表示。根據(jù)下文方案1中描述DNA降解的速度方程3，得到實(shí)施例1優(yōu)選冷凍干燥聚核苷酸組合物和質(zhì)粒DNA非冷凍干燥液體組合物(對(duì)照)的In(％SC)一時(shí)間曲線。用最小二乘回歸法計(jì)算曲線斜率(-kobs，測(cè)得擬一次速度常數(shù))。冷凍干燥組合物的斜線公式是y=0．001x+4．5369，速度常數(shù)(R2)=0．7988。對(duì)照的斜線公式是y=0．014x+4．5611，速度常數(shù)(R2)=0．9297。該圖顯示，優(yōu)選冷凍干燥組合物的速度常數(shù)比液體溶液的速度常數(shù)至少低10倍。圖2與圖1類(lèi)似，區(qū)別在于，這是本發(fā)明的優(yōu)選冷凍干燥組合物(◆)(含質(zhì)粒DNA和2％w／w冷凍保護(hù)劑海藻糖，含水量為4％)(Lyo2T2H)和相同DNA的非冷凍干燥溶液(●，液體)的時(shí)間曲線。冷凍干燥組合物的斜線公式是y=0．003x+4．52223，R2=0．9998。對(duì)照的斜線公式是y=0．014x+4．5611，R2=0．9297。圖3是柱形圖，描述Balb／C小鼠對(duì)本發(fā)明冷凍干燥DNA組合物(含編碼gD2蛋白的單純皰疹病毒基因的質(zhì)粒)和對(duì)對(duì)照的抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。對(duì)照之一是冷凍干燥前的后文實(shí)施例3表4中的No．6聚核苷酸溶液，不含冷凍保護(hù)劑(磷酸鹽，冷凍干燥前)。另一對(duì)照是冷凍干燥的表4中No．8檸檬酸鹽緩沖液組合物，不含冷凍保護(hù)劑(檸檬酸鹽，冷凍干燥后)?！?23對(duì)照”是一份冷凍干燥前溶液，其中的DNA具有與其他組合物所用相同的質(zhì)粒骨架，但沒(méi)有g(shù)D2序列。所用的本發(fā)明冷凍干燥組合物含有冷凍干燥的表4No．1聚核苷酸溶液，以磷酸鹽緩沖液配制，以海藻糖作為冷凍保護(hù)劑(海藻糖／磷酸鹽)；冷凍干燥的表4中No．3聚核苷酸溶液，以磷酸鹽緩沖液配制，以蔗糖作為冷凍保護(hù)劑(蔗糖／磷酸鹽)；和冷凍干燥的表4中No．7聚核苷酸溶液，以檸檬酸鹽緩沖液配制，以蔗糖作為冷凍保護(hù)劑(蔗糖／檸檬酸鹽)。各種聚核苷酸組合物對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響如實(shí)施例4所述用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，表示為刺激指數(shù)(SI)。圖4柱形圖顯示以Balbl／c小鼠血清在450nm處測(cè)得的光密度(OD)表示的對(duì)圖3中本發(fā)明冷凍干燥DNA組合物和對(duì)照的體液(抗體)應(yīng)答。陰性對(duì)照與023對(duì)照相同。各種聚核苷酸組合物對(duì)體液免疫應(yīng)答的影響如實(shí)施例4所述用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明為本領(lǐng)域提供了，如本文所述，一種穩(wěn)定性提高的聚核苷酸組合物，一種溶解度提高的聚核苷酸組合物，得到穩(wěn)定化聚核苷酸組合物的冷凍干燥方法。I．本發(fā)明的聚核苷酸組合物本發(fā)明的“聚核苷酸組合物”穩(wěn)定性和溶解度高于現(xiàn)有技術(shù)的聚核苷酸混合物。較好的是，本發(fā)明的聚核苷酸組合物一般是基本為無(wú)定形結(jié)構(gòu)的粉末，只有微量晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)聚核苷酸溶液進(jìn)行本發(fā)明冷凍干燥過(guò)程而得到。A．聚核苷酸溶液“聚核苷酸溶液”在此表示冷凍干燥前的聚核苷酸水性混合物。被冷凍干燥的聚核苷酸水溶液是至少一種聚核苷酸與至少一種冷凍保護(hù)劑形成的水性混合物。較好的是，聚核苷酸溶液中聚核苷酸與冷凍保護(hù)劑之比約為0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷凍保護(hù)劑。聚核苷酸溶液還可以含非水溶劑和其他添加劑。調(diào)節(jié)聚核苷酸、冷凍保護(hù)劑、溶劑(包括水)和可選添加劑的濃度，使得足量的聚核苷酸被冷凍干燥，而且這些聚核苷酸在冷凍干燥過(guò)程中無(wú)明顯降解。1．聚核苷酸任意聚核苷酸都可用于本發(fā)明，包括修飾聚核苷酸。合適的聚核苷酸例如BDNA、ADNA、ZDNA、RNA、tRNA和mRNA。聚核苷酸還可以是任意形式的。例如，聚核苷酸可以呈環(huán)狀或線形。聚核苷酸可以含單鏈或多鏈。例如，可使用單鏈DNA或RNA，雙鏈DNA，雙鏈的DNA-RNA雜交體，或三鏈、四鏈聚核苷酸。雙鏈DNA例如染色體DNA，R因子，PCR產(chǎn)物，質(zhì)粒DNA，噬菌體，病毒RNA和DNA載體，這包括α病毒、腺病毒、牛痘病毒、逆病毒、腺伴隨病毒、正鏈和負(fù)鏈RNA病毒、皰疹病毒、類(lèi)病毒、δ病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒。較好的是，DNA包括編碼蛋白質(zhì)的編碼序列，它們最好與調(diào)控元件操作性連接，包括操縱控制和終止區(qū)的基因，以及諸如質(zhì)粒DNA的自身復(fù)制系統(tǒng)。單鏈聚核苷酸包括反義聚核苷酸，形成核酶和三鏈體的寡核苷酸。聚核苷酸可被修飾成硫酯、硫代磷酸酯和磷酸酯等。本發(fā)明藥用組合物中的單鏈聚核苷酸最好制備成聚核苷酸組合物中治療鏈的互補(bǔ)鏈或“接頭鏈”。接頭鏈可以是單獨(dú)的另一鏈，或與治療鏈共價(jià)連接，或是治療鏈的延伸部分，這樣，治療鏈回折成雙并自身雜交。或者，接頭鏈有許多臂，使它可與許多聚核苷酸鏈雜交。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述聚核苷酸是超螺旋質(zhì)粒DNA表達(dá)載體，所編碼的免疫原與在人細(xì)胞內(nèi)有效的調(diào)控元件操作性連接。部分優(yōu)選實(shí)施例中，由編碼序列編碼的免疫原是病原蛋白，例如單純皰疹病毒gD2蛋白或HIV-lgag、pol或env基因所編碼的人免疫缺陷病毒蛋白。編碼序列與諸如巨細(xì)胞病毒(CMV)中早期啟動(dòng)子等合適啟動(dòng)子，以及SV40聚腺苷酸化信號(hào)操作性連接。例如，美國(guó)專(zhuān)利5，593，972描述了可用于本發(fā)明的質(zhì)粒。聚核苷酸可包含裸露的聚核苷酸，例如質(zhì)粒DNA，同一聚核苷酸的多份拷貝，或不同的聚核苷酸，或者，可以包含與“輔助-試劑”結(jié)合的聚核苷酸，所述“輔助-試劑”例如局部麻醉劑、肽、陽(yáng)離子脂等脂類(lèi)、脂質(zhì)體或脂類(lèi)顆粒、聚賴(lài)氨酸等聚陽(yáng)離子、例如樹(shù)狀體的支鏈三維聚陽(yáng)離子、糖、兩性陽(yáng)離子、除垢劑、芐基銨類(lèi)表面活性劑，或有助于聚核苷酸向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的其他化合物。本發(fā)明所用輔助-試劑包括，例如，美國(guó)專(zhuān)利5，593，972，5，703，055，5，739，118，5，837，533和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO96／10038(1996年4月4日公開(kāi))和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO94／16737(1994年8月8日公開(kāi))中所述，等等。當(dāng)所用試劑是局部麻醉劑時(shí)，以布比卡因?yàn)榧?，其含量以聚核苷酸溶液總重的約0．1-1．0％為佳。還可參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT／US98／22841，它以芐基銨表面活性劑作為輔助試劑，給予量為0．001-0．03wt％。此外，作為本發(fā)明溶液中的聚核苷酸，聚核苷酸的堿基、糖或鍵可用已知技術(shù)進(jìn)行修飾。較好的是，聚核苷酸在溶液中的濃度為約0．1-5．0mg／ml。其他實(shí)施例中，聚核苷酸在溶液中的濃度約為1．0-3．0mg／ml。另一些實(shí)施例中，聚核苷酸在溶液中的濃度約為1．0-2．0mg／ml。2．冷凍保護(hù)劑“冷凍保護(hù)劑”指一種冷凍保護(hù)劑或多種冷凍保護(hù)劑的混合物。冷凍保護(hù)劑可以是任意能在冷凍過(guò)程中或其后穩(wěn)定聚核苷酸的化合物。常規(guī)教科書(shū)中記載了多種冷凍保護(hù)劑，例如RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy，Vol．2，第19版(1995)。實(shí)施例之一中，本發(fā)明所用冷凍保護(hù)劑是糖醇，例如多羥糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇，及它們的混合物。特別好的是聚乙二醇。另一實(shí)施例中，冷凍保護(hù)劑是糖酸，包括醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸(aldaric)及它們的混合物。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑還可以是糖。合適的糖是含有2個(gè)以上羥基的醛或酮。這些糖可以是環(huán)狀或線形，例如醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸，或它們的混合物。糖也可以是單糖、二糖或多糖，例如二糖或多糖。合適的糖例如甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖或神經(jīng)氨酸，或它們的衍生物。合適的多糖例如阿拉伯聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如土木香粉)、左聚糖、巖藻依聚糖、交叉菜聚糖、半乳糖卡諾糖(galactocarolose)、果膠、果膠酸、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、膠淀粉、纖維素、葡聚糖、石臍素、幾丁質(zhì)、瓊脂躺、角蛋白、軟骨素、皮膚素、透明質(zhì)酸、海藻酸、花黃素或淀粉。特別有用的糖是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖，和它們的混合物。蔗糖是特別有用的冷凍保護(hù)劑。較好的是，本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑是糖或“糖”醇，可能是多元醇。多元醇化合物即含有一個(gè)以上羥基的化合物。較好的是線形的多元醇化合物。合適的多元醇化合物例如乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇；甘油；或季戊四醇；或它們的混合物。部分優(yōu)選實(shí)施例中的冷凍保護(hù)劑是蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇。其他優(yōu)選實(shí)施例中，冷凍保護(hù)劑是蔗糖。根據(jù)需要，以上任意冷凍保護(hù)劑都可以與至少一種其他冷凍保護(hù)劑混合存在。冷凍保護(hù)劑或冷凍保護(hù)劑混合物在聚核苷酸溶液中的濃度以約0．5-10wt％為佳。部分實(shí)施例中，冷凍保護(hù)劑在溶液中的濃度約為1．0-8．0wt％。另一些實(shí)施例中，冷凍保護(hù)劑在溶液中的濃度約為1．0-5．0wt％。3．聚核苷酸溶液中的可選添加劑聚核苷酸溶液最好以水為基礎(chǔ)。然而，如果需要，也可以在溶液中加入一種或多種與水、聚核苷酸和冷凍保護(hù)劑相容的溶劑。例如，可向溶液中加入乙二醇、丙二醇或甘油等可溶于水的醇。最好用緩沖液來(lái)制備聚核苷酸溶液，這樣，冷凍干燥聚核苷酸組合物再生后即可達(dá)到等滲。聚核苷酸溶液的pH以約6．2-7．8為佳。實(shí)施例之一中，聚核苷酸溶液的pH約為6．2-7．4。另一些實(shí)施例中，本發(fā)明聚核苷酸溶液的pH為6．2-6．9。這一范圍的pH有助于避免聚核苷酸在本發(fā)明冷凍干燥過(guò)程中降解。所以，可用的緩沖液包括任意能夠在冷凍干燥過(guò)程中維持上述pH范圍的化合物。優(yōu)選的緩沖液包括磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液，濃度通常為5-60mM。較好的是，緩沖液占聚核苷酸溶液總重的約0．1-1．2wt％。其他可選添加劑，例如促進(jìn)劑(如前文所述)、表面活性劑或鹽，或它們的混合物也可加入聚核苷酸溶液中?？杉欲}調(diào)節(jié)聚核苷酸溶液的等滲性。例如，可用氯化鈉等鹽。較好的是，鹽的用量是聚核苷酸溶液總重的約0．1-1．0wt％?？傊@些可選添加劑宜占聚核苷酸溶液總重的約0．1-3wt％。然后，對(duì)混合以上組分制備而成的聚核苷酸溶液進(jìn)行本發(fā)明的冷凍干燥過(guò)程，得到本發(fā)明的冷凍干燥聚核苷酸組合物。B．冷凍干燥組合物由上述聚核苷酸溶液制備而成的本發(fā)明冷凍干燥組合包含(a)至少一種聚核苷酸；(b)至少一種冷凍保護(hù)劑，其中，聚核苷酸與冷凍保護(hù)劑之比約為0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷凍保護(hù)劑；(c)占聚核苷酸組合物總重約0．5-6wt％的水。在部分實(shí)施例中，以上冷凍干燥聚核苷酸組合物含約6％或以下的水。部分實(shí)施例中，聚核苷酸組合產(chǎn)物含約5％或以下的水。另一些實(shí)施例中，冷凍干燥組合物含約2-3wt％水。本發(fā)明聚核苷酸組合物的特征在于其穩(wěn)定性比現(xiàn)有技術(shù)中的聚核苷酸組合物高。超螺旋百分比反映了聚核苷酸的純度。因此，以一定時(shí)間后保留的純度確定聚核苷酸的穩(wěn)定性。“穩(wěn)定性提高或增強(qiáng)”表示在37℃至少10天以上，聚核苷酸至少保留90％的超螺旋。部分實(shí)施例中，本發(fā)明聚核苷酸，最好是DNA，在37℃至少20天以上仍保留至少90％的超螺旋。更好的是，部分實(shí)施例中，本發(fā)明的聚核苷酸在37℃至少30天以上仍保留至少90％的超螺旋。除穩(wěn)定性之外，本發(fā)明聚核苷酸組合物的溶解度也比現(xiàn)有技術(shù)聚核苷酸組合物提高?！叭芙舛忍岣摺北硎颈景l(fā)明聚核苷酸組合物25℃(即室溫)時(shí)在水中的溶解度至少為1mg／ml。較好的是，本發(fā)明聚核苷酸組合物25℃時(shí)在水中的溶解度至少為2mg／ml。另一些優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明聚核苷酸組合物25℃時(shí)在水中的溶解度至少為10mg／ml。甚至可能達(dá)到高達(dá)約20mg／ml的溶解度。較好的是，通過(guò)以本發(fā)明方法冷凍干燥聚核苷酸溶液得以提高本發(fā)明聚核苷酸組合物的穩(wěn)定性和溶解度。本發(fā)明冷凍干燥聚核苷酸組合物的特征還在于基本上呈無(wú)定形物理結(jié)構(gòu)。部分實(shí)施例中，含聚核苷酸的組合物主要是無(wú)定形的，但也含微量或少量晶體，例如晶格結(jié)構(gòu)。C．藥物組合物可將冷凍干燥的聚核苷酸組合物配制成各種形式，以便保存，或在體外或體內(nèi)使用。本發(fā)明聚核苷酸組合物尤其適合的體內(nèi)用途包括用質(zhì)粒DNA進(jìn)行的免疫接種和基因治療，例如美國(guó)專(zhuān)利5，593，972，5，703，055，5，676，954，5，580，859，5，589，466，5，739，118和5，837，533，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO96／41873(1996年12月27日公開(kāi))和國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO94／16737(1994年8月8日公開(kāi))中所述。本發(fā)明冷凍干燥的聚核苷酸組合物可配制成各種無(wú)水或液體形式。如果需要，可對(duì)本發(fā)明的無(wú)水冷凍干燥聚核苷酸組合物進(jìn)行研磨、粉碎或過(guò)篩，用已知技術(shù)制成粉末。例如，可用造粒機(jī)、噴射磨、破塊機(jī)或切碎機(jī)將冷凍干燥的聚核苷酸組合物轉(zhuǎn)變成粉末。較好的是，聚核苷酸組合物的平均粒徑小于約100μm。如果組合物要用做肺給予的藥物，則粒徑需小于等于10μm。部分優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的聚核苷酸組合物制備成粉劑、片劑、膠囊、腸溶片劑或膠囊、或栓劑等形式給予哺乳動(dòng)物。另一實(shí)施例中，可通過(guò)冷凍干燥組合物以水再生制備液體聚核苷酸組合物，和／或制成液體組合物。再生組合物的pH以約6．2-7．8之間為佳，這和前文就原初聚核苷酸溶液所述相同。上述無(wú)水組合物或液體溶液適合用做藥物組合物。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施例是藥物組合物，其中包含上述冷凍干燥的組合物或再生的液體組合物作為活性成分，混合以藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑或載體。根據(jù)藥物組合物的用途，賦形劑或載體需適合諸如口服、腸胃外、鼻內(nèi)和肺內(nèi)等給藥途徑?？蓪⒗鋬龈稍锏木酆塑账峤M合物作為起始材料，與其他藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑一起制成粉末、液體或懸浮劑型，包括鼻內(nèi)或肺內(nèi)使用的那些劑型。參見(jiàn)，例如，RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy，Vol．2，第19版(1995)，第95章汽霧劑。采用以上活性成分的一優(yōu)選實(shí)施例是腸溶包衣片劑。優(yōu)選實(shí)施例之一中，聚核苷酸組合物是腸溶包衣膠囊形式的口服疫苗。其中的聚核苷酸是質(zhì)粒DNA。較好的是，硬明膠膠囊(例如WarnerLambertParke-Davis下屬的Capsugel制造的那些)中含約1mgDNA。聚核苷酸組合物中可加有滑石粉、硬脂酸鎂等流動(dòng)潤(rùn)滑劑。類(lèi)似的，還可加有纖維素等蓬松劑。明膠膠囊以腸溶包衣材料，例如EUDRAGIT，進(jìn)行腸溶包裹。根據(jù)另一些實(shí)施例，本發(fā)明的聚核苷酸組合物可用來(lái)形成以汽霧劑形式用于向肺遞送的粉末。例如，可制備傳遞基因以治療肺病的聚核苷酸組合物。此外，例如，所含DAN編碼囊纖維跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物的本發(fā)明聚核苷酸組合物可用于治療囊性纖維化。D．使用方法因此，本發(fā)明另一實(shí)施例提供了一種治療哺乳動(dòng)物的方法，包括給予受治者有效量的上述藥物組合物。根據(jù)組合物的給藥目的，所述治療方法包括通過(guò)所需途徑給予組合物，所述途徑包括口服、腸胃外、鼻內(nèi)和肺內(nèi)。例如，可將聚核苷酸組合物配制成規(guī)定等滲性的液體，通過(guò)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給予。聚核苷酸組合物也可以通過(guò)鼻內(nèi)或肺內(nèi)給予(吸服)粉末來(lái)使用。聚核苷酸組合物還可以栓劑的形式用于陰道、直腸和口等人體腔隙。使用上述組合物的方法包括基因治療，例如治療囊性纖維化。II．本發(fā)明的冷凍干燥為了生產(chǎn)本發(fā)明冷凍干燥的聚核苷酸組合物和藥物產(chǎn)品，對(duì)以上制備的聚核苷酸溶液進(jìn)行冷凍干燥，其中的步驟受到精確控制，冷凍干燥的結(jié)果提高了所得冷凍干燥聚核苷酸組合物的穩(wěn)定性和溶解度。用于冷凍干燥的可以是任意能夠在真空下逐步冷卻和逐步加熱聚核苷酸溶液的裝置。“保持”在此表示在一段時(shí)間內(nèi)保持給定的溫度和／或真空度。“漸變”在此表示在一段時(shí)間改變溫度和／或真空條件。在冷凍干燥過(guò)程中，有些是保持步驟，有些是漸變步驟。本發(fā)明冷凍干燥過(guò)程詳細(xì)描述如下聚核苷酸水溶液的pH約為6．2-7．8，含約0．1-5mg／ml(根據(jù)聚核苷酸溶液總體積)至少一種聚核苷酸，約0．5-10wt％(根據(jù)聚核苷酸溶液總重)至少一種冷凍保護(hù)劑，通過(guò)第一次冷卻固化或冷凍。實(shí)施例之一中，將溶液冷卻至-30℃至-70℃。另一實(shí)施例中，將溶液冷卻至-40℃至-60℃。另一些實(shí)施例中，將溶液冷卻至-40至-50℃。這一冷卻步驟以逐步緩慢進(jìn)行為佳，或者進(jìn)行約1-5小時(shí)，更好的是1-3小時(shí)。部分實(shí)施例中，溶液冷卻時(shí)間約為1-2小時(shí)。部分實(shí)施例中，溶液冷卻時(shí)間約為2-3小時(shí)。較好的是，在要求的時(shí)間內(nèi)以線性速度冷卻溶液。雖然以逐步冷卻為佳，但也可以進(jìn)行在冷凍干燥過(guò)程中不顯著降解聚核苷酸的快速(10分鐘以內(nèi))冷卻。當(dāng)?shù)竭_(dá)所需的冷凍溫度時(shí)，立即抽真空，將壓力降至約25-250mTorr。部分實(shí)施例中，真空使壓力降至約50-100mTorr?？蓪⒔M合物在此溫度和壓力下保持約30分鐘至5小時(shí)，以1小時(shí)以上為佳。在一特別好的實(shí)施例中，真空是如下施加的迅速降壓至300-200mTorr，然后逐步降壓至約150mTorr，然后在約1-2小時(shí)內(nèi)降壓至約40mTorr。冷卻后，對(duì)聚核苷酸溶液進(jìn)行“首輪干燥或加熱”，這一步對(duì)該方法的效率影響重大。在這首輪加熱中，凍結(jié)溶液首次用5-40小時(shí)的時(shí)間逐步加熱至約-40℃至20℃。在優(yōu)選實(shí)施例中，凍結(jié)溶液首次用5-20小時(shí)的時(shí)間逐步加熱至約-10℃至20℃。另一實(shí)施例中，凍結(jié)溶液逐步加熱至-40℃至10℃。另一實(shí)施例中，凍結(jié)溶液首次用8-20小時(shí)的時(shí)間逐步加熱至約-5℃至5℃。一特別好的實(shí)施例中，凍結(jié)溶液首次加熱至0℃。首輪加熱時(shí)間最好用約5-40小時(shí)完成，約5-20小時(shí)為佳，約6-15小時(shí)更好。部分實(shí)施例中，首次加熱約需10小時(shí)。首輪干燥中除了加熱聚核苷酸溶液之外還需使被加熱溶液處于真空。較好的是，首輪加熱一開(kāi)始就采用真空。加熱步驟中的真空壓力宜低于約250mTorr，低于約25-150mTorr更好。部分實(shí)施例中，真空壓約為40-150mTorr。另一些實(shí)施例中，加熱步驟的真空壓約為60-150mTorr。一優(yōu)選實(shí)施例中，如下施加真空壓力在5分鐘內(nèi)降至200mTorr，然后在約1-2小時(shí)內(nèi)降至要求的壓力。首輪加熱后，將聚核苷酸溶液保持在恒溫恒壓下以平衡聚核苷酸溶液。這一保持步驟以進(jìn)行約1-10小時(shí)為佳，約2-6小時(shí)更好。較好的是，保持步驟的溫度在約-35℃至10℃。部分實(shí)施例中，該溫度在約-10℃至10℃維持約2-10小時(shí)。另一些實(shí)施例中，溫度在約-5℃至5℃維持約5-7小時(shí)。一優(yōu)選實(shí)施例中，該溫度維持在約0℃。較好的是，該保持步驟的真空壓力在約200mTorr，更好的是25-250mTorr，維持約1-10小時(shí)。部分實(shí)施例中，保持步驟的真空壓力維持在約40-150mTorr。部分實(shí)施例中，保持步驟的真空壓力維持在約60-150mTorr。較好的是，所選溫度和壓力是首輪加熱步驟最后達(dá)到的壓力和溫度。在由該保持步驟進(jìn)入下一步時(shí)最好保持真空。保持后，進(jìn)行二次干燥步驟。在約25-250mTorr的壓力下，用約1-20小時(shí)將聚核苷酸溶液第二次逐步加熱至約20-35℃。一優(yōu)選實(shí)施例中，在約25-250mTorr的壓力下，用約1-10小時(shí)將溶液第二次逐步加熱至約20-30℃。另一實(shí)施例中，第二次加熱用約2-3小時(shí)將溫度升至約23-27℃。一優(yōu)選的二次加熱步驟中，溫度被提高至25℃。二次加熱步驟的真空壓力以低于約250mTorr為佳，低于約25-150mTorr更好，部分實(shí)施例中低于約40-110mTorr。二次加熱的時(shí)間以約1-5小時(shí)為宜，約2-3小時(shí)更好。本發(fā)明冷凍干燥過(guò)程一特別好的實(shí)施例中，首次加熱時(shí)間約為7-11小時(shí)，其后保持步驟的時(shí)間約為1小時(shí)，二次加熱的時(shí)間約2小時(shí)。二次加熱后，可以(任選)將聚核苷酸溶液保持在恒溫恒壓下以平衡聚核苷酸溶液。較好的是，這二次保持進(jìn)行約1-10小時(shí)，約2-5小時(shí)更好。部分實(shí)施例中，二次保持約2-3小時(shí)。較好的是，這次保持的溫度維持在約20-30℃，約23-27℃更好，約25℃最好。較好的是，這次保持的真空壓力維持低于約150mTorr，低于約20-100mTorr更好。較好的是，所選溫度和壓力是二次加熱步驟最后達(dá)到的壓力和溫度。一優(yōu)選實(shí)施例中，首輪加熱用約5-30小時(shí)將溶液逐步加熱至約-20℃至20℃，避免溶液的復(fù)熔(液化)。這一步加熱的時(shí)間優(yōu)選約5-20小時(shí)，約5-10小時(shí)更好。這一步加熱的溫度優(yōu)選約-10℃至20℃，約0℃更好。這優(yōu)選的首輪干燥縮短了冷凍干燥全過(guò)程所需的時(shí)間。實(shí)際上，優(yōu)選的首輪干燥使得二次干燥(聚核苷酸溶液在這一步被加熱至約23-27℃)只進(jìn)行約2-3小時(shí)，并形成基本上呈無(wú)定形物理結(jié)構(gòu)的冷凍干燥聚核苷酸，在37℃至少10天以上仍保持至少90％的超螺旋?？傊景l(fā)明過(guò)程適宜在真空下進(jìn)行，始終保持真空，直至完成最后步驟(即，二次加熱和可選的二次保持)。然而，可以在改變各加熱階段的真空壓力，只要真空始終低于約200mTorr。在完成可選的最后保持后，回收所得聚核苷酸組合物，其含水量為所回收組合物總重的約0．5-6wt％。按聚核苷酸組合物總重計(jì)，所回收的聚核苷酸組合物含水約0．5-6wt％，約1-5wt％為佳，約2-4wt％更好。冷凍干燥的聚核苷酸組合物以含約0．001-1份重量聚核苷酸比1份重量冷凍保護(hù)劑為宜。實(shí)施例之一中，聚核苷酸組合物宜含約0．001-0．5份重量聚核苷酸比1份重量冷凍保護(hù)劑。聚核苷酸組合物以無(wú)定形結(jié)構(gòu)為佳，這可提高組合物的溶解度。提高溶解度可更快地再生和得到更濃的組合物。以下實(shí)施例將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的部分實(shí)施方式。這些實(shí)施例只用于說(shuō)明本發(fā)明而不限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1本發(fā)明的一種優(yōu)選冷凍干燥組合物本發(fā)明的一種優(yōu)選冷凍干燥組合物以質(zhì)粒DNA為聚核苷酸，以蔗糖為冷凍保護(hù)劑，用上述方法制備該組合物。組合物所用的DNA含編碼gD2蛋白的單純性皰疹病毒基因，該基因與巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和SV40句腺苷酸化位點(diǎn)連接。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO97／41892(1997年11月13日公開(kāi))和美國(guó)專(zhuān)利5，593，972的圖8對(duì)該質(zhì)粒，又稱(chēng)質(zhì)粒24，進(jìn)行了描述。表1列出了冷凍干燥前聚核苷酸溶液和一種液體對(duì)照組合物的組成。表1<tablesid="table1"num="001"><table>成分冷凍干燥前的聚核苷酸溶液液體對(duì)照組合物質(zhì)粒DNA0．2％w／v0．2％w／v蔗糖2．0％w／v---磷酸鹽緩沖液(5mM)0．045％w／v磷酸二氫鈉，0．047％w／v磷酸氫鈉---注射用水(qs)100ml100ml布比卡因(促進(jìn)劑)---0．25％w／vEDTA---0．01％w／v檸檬酸鹽緩沖液---30mMpH6．76．4</table></tables>對(duì)表1中的冷凍干燥前溶液進(jìn)行本發(fā)明冷凍干燥，其特征在于冷凍、首次干燥和二次干燥步驟的特定參數(shù)。這些參數(shù)按順序列于表2，包括2次連續(xù)的首次干燥和4次連續(xù)的二次干燥。表2<tablesid="table2"num="002"><table>冷凍干燥周期溫度(℃)真空(mTorr)時(shí)間(分鐘)漸變／保持冷凍步驟-4020030保持首次干燥(2)010030漸變0100720保持二次干燥(4)307520漸變3075180保持25505漸變2550120保持</table></tables>根據(jù)以％超螺旋(％SC)表示的衰變監(jiān)測(cè)以上冷凍干燥聚核苷酸組合物和液體對(duì)照37℃的穩(wěn)定性。用瓊脂糖凝膠法分析各樣品的％SC。瓊脂糖凝膠法是分子生物學(xué)常用于分離不同形式DNA的一種電泳過(guò)程。瓊脂糖凝膠法檢測(cè)依賴(lài)于染料溴乙錠嵌入DNA內(nèi)。該方法使用熒光染料與雙鏈(ds-)DNA結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，熒光是間接測(cè)定的。在含溴乙錠(EtBr)的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行DNA電泳。嵌入DNA后，EtBr的熒光大大增強(qiáng)。用CCD(電荷-偶合裝置)采集熒光信號(hào)。積分造影(AlphaInnotechTM軟件)，計(jì)算樣品中開(kāi)環(huán)和超螺旋質(zhì)粒的相對(duì)量。結(jié)果取決于EtBr與質(zhì)粒的結(jié)合是否一致和均勻。然而，結(jié)果顯示，當(dāng)％SC低于93％時(shí)，凝膠法得出人為的低結(jié)果。因此，發(fā)展產(chǎn)生了一種取代它的HPLC法，參見(jiàn)Montgomery等，Pharmsci．，(增刊，1998)“測(cè)定疫苗產(chǎn)品中質(zhì)粒DNA純度(％超螺旋)的HPLC試驗(yàn)”，摘要2503。質(zhì)粒DNA純度根據(jù)T形超螺旋含量來(lái)測(cè)定。僅一步骨架內(nèi)磷酸二酯鍵水解就足以將超螺旋DNA(SC)轉(zhuǎn)化成開(kāi)環(huán)形式(OC)。這一拓?fù)涓淖兎从吃诃傊悄z上遷移率的改變。目前，最常用的質(zhì)粒DNA純度試驗(yàn)(％SC試驗(yàn))以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)。表3給出描述DNA降解的速度方程。表3方程1-是測(cè)得速度常數(shù)，代表DNA的總體降解(SC=超螺旋；OC=開(kāi)環(huán))KobsDNA(SC)→DNA(OC)d&lsqb;DNA&rsqb;dt=-kobs&lsqb;DNA&rsqb;t]]>方程2-擬一次條件下，DNA降解速度方程可寫(xiě)成如下其中，[DNA]是DNA的純度(％SC)或強(qiáng)度方程3-用t=0的初始條件[DNA]=[DNA]0積分以上方程，得以下方程In[DNA]=In[DNA]0-kobst用方程3，代入特定溫度下的％SC(DNA純度)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，得到In(％SC)-時(shí)間曲線，根據(jù)該曲線的斜率可算出kobs。方程4-在任意給定溫度，如下計(jì)算保存期(t90，達(dá)到90％SC的時(shí)間)t90=ln(&lsqb;%SC&rsqb;090)kobs]]>其中，[％SC]0表示t=0時(shí)的DNA純度。方程5-假設(shè)方程4中的[％SC]0=95，給定溫度下質(zhì)粒DNA的保存期可如下計(jì)算t90=0.0541kobs]]>根據(jù)表2中的方程3，得到了上述表1中冷凍干燥聚核苷酸組合物和對(duì)照的In(％SC)-時(shí)間曲線。結(jié)果見(jiàn)圖1。用最小二乘回歸法計(jì)算曲線斜率(-kobs，測(cè)得擬一次速度常數(shù))。圖1顯示，優(yōu)選冷凍干燥組合物的速度常數(shù)比液體對(duì)照組合物的速度常數(shù)至少低10倍。以上結(jié)果還顯示，在37℃，冷凍干燥組合物的保存期比液體至少長(zhǎng)10倍(根據(jù)方案1中的方程5計(jì)算，為54天和4天)。然后，通過(guò)X光衍射，將表1的冷凍干燥聚核苷酸組合物與一種DNA溶液(即含0．2％w／v前文所述含gD2的質(zhì)粒DNA的檸檬酸鹽緩沖液，pH6．4)比較，用乙醇沉淀該溶液[Sambrook，J．等，MolecularCloningColdSpringHarbor，NY，pp．E10=E11，“核酸的濃縮乙醇或異丙醇沉淀”]。以常規(guī)方法獲得兩組合物的X光衍射圖案，顯示，冷凍干燥組合物的X光衍射圖案呈無(wú)定形結(jié)構(gòu)特征，沉淀DNA的衍射圖案呈高度結(jié)晶結(jié)構(gòu)特征。因?yàn)楸景l(fā)明冷凍干燥聚核苷酸組合物的物理特性為無(wú)定形結(jié)構(gòu)和高度孔隙率，本發(fā)明的組合物具有高度水溶性(高達(dá)約20mg／ml)。用常規(guī)HPLC法進(jìn)行溶解度試驗(yàn)。實(shí)施例2本發(fā)明的一種優(yōu)選冷凍干燥組合物用本發(fā)明方法制備本發(fā)明的另一種冷凍干燥組合物，它以實(shí)施例1所述質(zhì)粒DNA為聚核苷酸，以海藻糖為冷凍保護(hù)劑和穩(wěn)定劑。液體對(duì)照與實(shí)施例1所用的相同。表4記錄了冷凍干燥前溶液和液體質(zhì)粒對(duì)照的組成。表4<tablesid="table3"num="003"><table>成分冷凍干燥前的聚核苷酸溶液液體對(duì)照組合物質(zhì)粒DNA0．2％w／v0．2％w／v海藻糖2．0％w／v---磷酸鹽緩沖液(5mM)0．045％w／v磷酸二氫鈉，0．047％w／v磷酸氫鈉---注射用水(qs)100ml100ml布比卡因(促進(jìn)劑)---0．25％w／vEDTA---0．01％w／v檸檬酸鹽緩沖液---30mMpH6．76．4</table></tables>如實(shí)施例1所述對(duì)冷凍干燥前溶液進(jìn)行冷凍干燥，如實(shí)施例1所述根據(jù)以％超螺旋(％SC)表示的衰變測(cè)定該組合物的穩(wěn)定性。用瓊脂糖凝膠法分析各樣品的％SC。圖2顯示表4冷凍干燥聚核苷酸組合物和液體對(duì)照組合物的In(％SC)-時(shí)間曲線。如實(shí)施例1所述，用最小二乘回歸法計(jì)算曲線的斜率(-kobs，測(cè)得速度常數(shù))。圖2的結(jié)果顯示，本發(fā)明冷凍干燥組合物的速度常數(shù)比液體對(duì)照低4倍。該結(jié)果還顯示，37℃下，本發(fā)明冷凍干燥組合物的保存期比液體長(zhǎng)4倍。實(shí)施例3冷凍保護(hù)劑的篩選對(duì)含有質(zhì)粒DNA和不同冷凍保護(hù)劑(蔗糖、海藻糖、PVP和山梨醇)的幾種聚核苷酸溶液進(jìn)行本發(fā)明的冷凍干燥。這些實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒DNA與實(shí)施例1所用的相同，即表達(dá)2型單純性皰疹病毒gD2抗原的質(zhì)粒。表5列出了接受評(píng)價(jià)的8種冷凍干燥前聚核苷酸溶液的組成。冷凍干燥參數(shù)與實(shí)施例1表2中的相同。在如本發(fā)明所述冷凍干燥這些溶液之前和之后，如實(shí)施例1所述以瓊脂糖凝膠法測(cè)定％SC。因此，表5還顯示各聚核苷酸溶液冷凍干燥前的％SC和進(jìn)行本發(fā)明冷凍干燥后的％SC。表5根據(jù)以上結(jié)果，作為冷凍保護(hù)劑，海藻糖和蔗糖比PVP和山梨醇更有效。沒(méi)有冷凍保護(hù)劑時(shí)，按照本發(fā)明冷凍干燥溶液6得到的磷酸鹽緩沖液冷凍干燥對(duì)照的超螺旋損失超過(guò)30％，冷凍干燥溶液8得到的檸檬酸鹽緩沖液冷凍干燥對(duì)照的損失低于5％。這是因?yàn)椋猁}晶體先于無(wú)定形一元酸鹽凍結(jié)，所以磷酸鹽樣品的pH可能向酸性pH漂移。然而，在有冷凍保護(hù)劑蔗糖的冷凍干燥聚核苷酸組合物中則沒(méi)有這一現(xiàn)象(參見(jiàn)溶液3和7)。所以，有冷凍保護(hù)劑時(shí)，緩沖液種類(lèi)對(duì)冷凍干燥聚核苷酸組合物沒(méi)有任何影響。冷凍干燥聚核苷酸組合物的含水量顯示，PVP沒(méi)有任何良好的冷凍保護(hù)劑特性，因?yàn)?，與含其他冷凍保護(hù)劑的冷凍干燥組合物相比(含水量1-2％)，含PVP的冷凍干燥組合物幾乎完全干燥(＜＜1％)。含PVP的冷凍干燥組合物還顯示超螺旋損失在15％以上。因此，對(duì)于本發(fā)明的冷凍干燥質(zhì)粒DNA組合物來(lái)說(shuō)，蔗糖和海藻糖是優(yōu)良的冷凍保護(hù)劑。實(shí)施例4本發(fā)明冷凍干燥組合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響為了評(píng)價(jià)本發(fā)明冷凍干燥聚核苷酸組合物作為藥物或研究試劑的用途，評(píng)價(jià)了冷凍干燥聚核苷酸組合物和對(duì)照對(duì)免疫應(yīng)答的影響，使用的是實(shí)施例3制備的冷凍干燥組合物。對(duì)照之一是冷凍干燥前的表5中聚核苷酸溶液6，不含冷凍保護(hù)劑(磷酸鹽，冷凍干燥前)。另一對(duì)照是冷凍干燥的表5溶液8，檸檬酸鹽緩沖液組合物，不含冷凍保護(hù)劑(檸檬酸鹽，冷凍干燥后)。該實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)的本發(fā)明冷凍干燥組合物是冷凍干燥的表5聚核苷酸溶液1，以磷酸鹽緩沖液配制，以海藻糖為冷凍保護(hù)劑(海藻糖／磷酸鹽)；冷凍干燥的表5聚核苷酸溶液3，以磷酸鹽緩沖液配制，以蔗糖為冷凍保護(hù)劑(蔗糖／磷酸鹽)；和冷凍干燥的聚核苷酸溶液7，以檸檬酸鹽緩沖液配制，含蔗糖為冷凍保護(hù)劑(蔗糖／檸檬酸鹽)。圖3和4的對(duì)照(023對(duì)照和陰性對(duì)照)相同，含有質(zhì)粒骨架，沒(méi)有g(shù)D2序列和緩沖液。將各冷凍干燥組合物以磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液再生，所述緩沖液都與原冷凍干燥前溶液所用相同。Balb／C小鼠(5個(gè)一組)肌內(nèi)接種各實(shí)施例3冷凍干燥組合物的再生溶液，100μl50μgDNA／劑。組合物中未加其他組分。3周后殺死動(dòng)物。A．細(xì)胞免疫評(píng)價(jià)取出上述小鼠的脾臟，用于以淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。用收獲的脾臟制備單細(xì)胞懸液，然后在有或沒(méi)有20ng／ml純化gD2蛋白存在下，培養(yǎng)這些細(xì)胞，2×105細(xì)胞／格。培養(yǎng)物在37℃、5％CO2中培養(yǎng)4天，然后每格加入20μl含1μCi3[H]胸腺嘧啶的RPMI-1640完全培養(yǎng)基(ICNInc．，CostaMesa，Ca)，再培養(yǎng)18小時(shí)。用多頭樣品收獲器將細(xì)胞收獲在玻璃纖維板上，在β計(jì)數(shù)器(Wallac，F(xiàn)inland)中以常規(guī)液體閃爍法測(cè)定放射性摻入。B．體液免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)收集血清樣品分析對(duì)HSVgD2的抗體(體液)應(yīng)答。用ELSIA分析血清內(nèi)的gD2特異性IgG抗體。簡(jiǎn)而言之，在4℃，以0．4μg／ml純化gD2蛋白涂覆96格平底測(cè)試板(Co-star，Cambridge，MA)，放置過(guò)夜。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板3次，用4％牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉1小時(shí)。然后將50μl適當(dāng)稀釋的血清加至板上，4℃過(guò)夜。用BPST洗滌5次后，加入1∶2000稀釋的過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗小鼠IgG(Sigma，St．Louis，MO)，培養(yǎng)1小時(shí)。用BPST洗板，然后加入底物3，3′，5，5′，-四甲基二氨基聯(lián)苯(TMB)-H2O2(Biotecx，Houston，Tx)。顯色30分鐘，然后在Emax微滴板讀數(shù)儀(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)上450nm讀數(shù)。C結(jié)果圖3和4分別顯示了對(duì)以上組合物的細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答。結(jié)果顯示，對(duì)本發(fā)明冷凍干燥檸檬酸鹽／蔗糖組合物的細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答高于對(duì)本發(fā)明冷凍干燥磷酸鹽／檸檬酸鹽組合物和冷凍干燥的檸檬酸鹽／無(wú)冷凍保護(hù)劑對(duì)照的應(yīng)答。就本發(fā)明冷凍干燥組合物的結(jié)果與冷凍干燥前磷酸鹽緩沖液對(duì)照相比，本發(fā)明冷凍干燥過(guò)程和在聚核苷酸組合物中加入冷凍保護(hù)劑(蔗糖或海藻糖)顯然對(duì)細(xì)胞和體液應(yīng)答沒(méi)有不利影響。本發(fā)明的冷凍干燥組合物保留了所含質(zhì)?；蚓酆塑账岬幕钚?。實(shí)施例5對(duì)本發(fā)明冷凍干燥組合物的評(píng)價(jià)對(duì)16種不同的冷凍干燥前溶液進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并在表6中進(jìn)行了描述。各溶液所用的DNA即實(shí)施例1中的含gD2質(zhì)粒。這些溶液在表中以不同的編號(hào)表示，其區(qū)別在于DNA濃度(由編號(hào)的第一個(gè)數(shù)字表示)，所用的冷凍保護(hù)劑(由編號(hào)的第一個(gè)字母表示)，冷凍保護(hù)劑的濃度(由編號(hào)的第二個(gè)數(shù)字表示)，和冷凍干燥后的含水量(編號(hào)中，以L表示低，H表示高)。用注射用水將冷凍干燥前溶液定容至100ml，用表2中的冷凍干燥周期參數(shù)，進(jìn)行本發(fā)明的冷凍干燥。對(duì)表6中的全部冷凍干燥組合物和液體對(duì)照(組合物編號(hào)#96F0254，即實(shí)施例1表1中含1mg／ml質(zhì)粒DNA的液體對(duì)照制劑)進(jìn)行37℃的加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)還包括不加冷凍保護(hù)劑的冷凍干燥質(zhì)粒組合物作為另一對(duì)照。從首日至第30日，間隔不同時(shí)間采集樣品，如實(shí)施例1所述以瓊脂糖凝膠法分析％SC。用％SC數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘回歸分析(表3中的方程3)，計(jì)算出不同組合物中DNA降解的擬一次速度常數(shù)(kobs)。表6還包括不同組合物的置信區(qū)間(CI)95％的kobs和R2(擬和度)。表6％SC結(jié)果顯示，本發(fā)明所有含蔗糖的冷凍干燥組合物在37℃至少4周內(nèi)保持穩(wěn)定(即，實(shí)驗(yàn)周期)。表5中95％置信區(qū)間的擬一次速度常數(shù)(kobs)和R2(擬和度)清楚地顯示，目前臨床組合物(96F-0254)的kobs比含蔗糖為冷凍保護(hù)劑的大多數(shù)本發(fā)明冷凍干燥聚核苷酸組合物高至少10倍。類(lèi)似地，目前臨床組合物的kobs比含海藻糖為冷凍保護(hù)劑的本發(fā)明冷凍干燥聚核苷酸組合物高至少1．5倍。因此，對(duì)本發(fā)明的冷凍干燥聚核苷酸組合物來(lái)說(shuō)，蔗糖是最好的冷凍保護(hù)劑和最好的穩(wěn)定劑。含蔗糖冷凍干燥組合物(編號(hào)2S2L)37℃的保存期(％超螺旋為95％至90％)為54天，相比之下，液體組合物96F0254的保存期為4天。然而，在5℃，目前的臨床組合物可穩(wěn)定2年。所以，可以推斷，本發(fā)明冷凍干燥組合物的保存期可以非常長(zhǎng)。常溫(25℃)下，估計(jì)可在至少6個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。本發(fā)明含海藻糖為冷凍保護(hù)劑的高含水量冷凍干燥組合物比含海藻糖的低含水量類(lèi)似組合物表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。本發(fā)明含蔗糖的低含水量冷凍干燥組合物的速度常數(shù)低于本發(fā)明含蔗糖的高含水量冷凍干燥組合物。因此，挑選實(shí)施例1的冷凍干燥組合物(含2％蔗糖)作為下一步實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選組合物。實(shí)施例6高濃度DNA產(chǎn)品用本發(fā)明優(yōu)選冷凍干燥組合物冷凍干燥大量DNA，用于制備含促進(jìn)劑的高濃度最終藥物產(chǎn)品。該組合物含實(shí)施例1所述的質(zhì)粒DNA，在冷凍干燥前溶液中的濃度為0．2％w／v，含2．0％w／v蔗糖冷凍保護(hù)劑，檸檬酸鹽緩沖液(5mM，pH6．7)，100ml注射用水。用實(shí)施例1和表2描述的周期冷凍干燥該組合物。促進(jìn)劑布比卡因以檸檬酸鹽緩沖液(5mM，pH6．7)配制成不同濃度(0．25，0．6，1．0％w／v)，用于再生以上冷凍干燥產(chǎn)物。為了獲得要求的DNA濃度，在冷凍干燥粉末中加入不同量的布比卡因緩沖溶液。所得“藥物”制劑如表7所示，該表記錄了再生后高濃度DNA產(chǎn)品穩(wěn)定性隨時(shí)間(天)的變化(測(cè)定％SC)。表7以上結(jié)果顯示，根據(jù)純度，至少20mg／ml的本發(fā)明再生冷凍干燥聚核苷酸組合物可保持穩(wěn)定18天。還應(yīng)該注意到的是，根據(jù)物理外觀，再生溶液是均勻的。前文中的所有參考文獻(xiàn)和專(zhuān)利都在此作為參考。以上說(shuō)明函蓋了許多修改，這些對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。應(yīng)該認(rèn)為，上述對(duì)本發(fā)明組合物和方法的修改包括在后文權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1．一種冷凍干燥聚核苷酸組合物，它包含(a)至少一種聚核苷酸；(b)至少一種冷凍保護(hù)劑，其中，聚核苷酸與冷凍保護(hù)劑之比約為0．001-1．0份重量聚核苷酸比每1．0份重量冷凍保護(hù)劑；(c)占聚核苷酸溶液總重約0．5-6wt％的水；所述聚核苷酸組合物在37℃至少10天以上保持至少90％超螺旋。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的水占1-5wt％。3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的水占2-3wt％。4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述的聚核苷酸選自ADNA，BDNA，ZDNA，RNA，tRNA，mRNA，以及它們的混合物。5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中的聚核苷酸是雙鏈DNA。6．根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中的聚核苷酸是質(zhì)粒DNA。7．根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中的聚核苷酸是病毒載體。8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包含兩種或兩種以上冷凍保護(hù)劑的混合物。9．根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的組合物，其中所述的冷凍保護(hù)劑是糖醇。10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述的醇選自糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇，和他們的混合物。11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中的冷凍保護(hù)劑是聚乙二醇。12．根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的組合物，其中所述的冷凍保護(hù)劑是糖酸。13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中的糖酸選自醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸(aldaric)及它們的混合物。14．根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的組合物，其中所述的冷凍保護(hù)劑是糖。15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述的糖選自醛糖、酮糖、氨基糖、二糖、多糖，和它們的混合物。16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述的糖選自蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖，和它們的混合物。17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中的冷凍保護(hù)劑是蔗糖。18．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，它基本上呈無(wú)定形物理結(jié)構(gòu)。19．根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述的質(zhì)粒DNA在37℃至少20天以上保持至少90％超螺旋。20．一種液體聚核苷酸組合物，它包含以水再生的權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的冷凍干燥組合物，其pH為6．2-7．8。21．一種藥物組合物，包含的活性成分選自(a)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的冷凍干燥組合物；(b)權(quán)利要求20所述的液體組合物；和任選的藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑或載體。22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述的賦形劑或載體適合以下給藥途徑口服、腸胃外、鼻內(nèi)或肺內(nèi)。23．一種治療哺乳動(dòng)物的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求21所述組合物。24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，還包括通過(guò)以下途徑給予所述組合物口服、腸胃外、鼻內(nèi)或肺內(nèi)。25．一種制備冷凍干燥聚核苷酸組合物的方法，包括以下步驟(a)形成聚核苷酸水溶液，pH為6．2至7．8，含0．1-5mg／ml至少一種聚核苷酸，按聚核苷酸溶液總體積計(jì)；和0．5-10wt％至少一種冷凍保護(hù)劑，按聚核苷酸溶液總重計(jì)；(b)將聚核苷酸溶液冷卻至-30℃至-70℃，直至凍結(jié)；(c)施加25mTorr至250mTorr的真空；(d)第一次用5至40小時(shí)將聚核苷酸溶液逐步加熱至-40℃至20℃；(e)將加熱步驟(d)后的聚核苷酸溶液在-35℃至10℃，25mTorr至250mTorr，保持1至10小時(shí)；(f)在25mTorr至250mTorr，用1至20小時(shí)將保溫步驟(e)后的聚核苷酸溶液逐步加熱至20℃至35℃；(g)回收冷凍干燥的聚核苷酸組合物，含水量占所得組合物總重0．5-6wt％。26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述步驟(a)的聚核苷酸溶液還含有緩沖液。27．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，在所述步驟(f)后，還包括將聚核苷酸溶液在25mTorr至150mTorr，20-30℃保持1至10小時(shí)的步驟。28．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中的步驟(d)包括第一次用5-20小時(shí)將所述聚核苷酸溶液逐步加熱至-10℃至20℃。29．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，在步驟(e)中，所述聚核苷酸溶液在-10℃至10℃保持2-10小時(shí)。30．根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，在保持步驟(e)中，所述聚核苷酸溶液在-5℃至5℃保持5-7小時(shí)。31．根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，在保持步驟(e)中，所述聚核苷酸溶液保持在40-150mTorr下。32．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，在冷卻步驟(b)中，用1-5小時(shí)將所述聚核苷酸溶液逐步冷卻至-30℃至-70℃。33．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，在步驟(c)中，將壓力降至50-100mTorr。34．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，步驟c)和(d)之間，將所述聚核苷酸組合物在步驟(b)的溫度和步驟(c)的壓力下保持0．5-5小時(shí)。35．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，在加熱步驟(d)中，用8-20小時(shí)將所述聚核苷酸溶液逐步加熱至-5℃至5℃。36．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，加熱步驟(d)的壓力為40-150mTorr。37．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，在步驟(c)中，如下施加真空由迅速降壓至300-200mTorr，然后然后在1-2小時(shí)內(nèi)逐步降壓至150m-40mTorr。38．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，在加熱步驟(f)中，用2-3小時(shí)將聚核苷酸溶液加熱至23-27℃。39．根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，加熱步驟(f)的壓力為40-110mTorr。40．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，加熱步驟(d)進(jìn)行7-11小時(shí)；保持步驟(e)進(jìn)行1小時(shí)，加熱步驟(f)進(jìn)行2小時(shí)。41．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中的冷凍保護(hù)劑選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇，和它們的混合物。42．根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的冷凍保護(hù)劑是蔗糖和聚乙二醇。43．一種用權(quán)利要求25至42中任一項(xiàng)所述方法制備的冷凍干燥聚核苷酸產(chǎn)品。44．根據(jù)權(quán)利要求43所述的產(chǎn)品，其中所述的聚核苷酸在37℃至少10天以上保留至少90％超螺旋。45．一種液體聚核苷酸組合物，它包含以水溶液中再生的權(quán)利要求43所述的冷凍干燥聚核苷酸產(chǎn)品，其pH為6．2-7．8。46．一種藥物組合物，包含的活性成分選自(a)權(quán)利要求43所述的冷凍干燥組合物；(b)權(quán)利要求45所述的液體組合物；和任選的藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑或載體。47．根據(jù)權(quán)利要求46所述的組合物，其中所述的賦形劑或載體適合以下給藥途徑口服、腸胃外、鼻內(nèi)或肺內(nèi)。48．一種治療哺乳動(dòng)物的方法，包括給予有效量的權(quán)利要求46所述組合物。49．根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，還包括通過(guò)以下途徑給予所述組合物口服、腸胃外、鼻內(nèi)或肺內(nèi)。50．一種冷凍干燥聚核苷酸組合物的改進(jìn)方法，該方法包括冷凍所述組合物，讓所述凍結(jié)組合物處于真空，進(jìn)行首輪干燥，提高以上干燥步驟產(chǎn)物所處的壓力，進(jìn)行二次干燥步驟，回收冷凍干燥產(chǎn)物，改進(jìn)在于以下步驟對(duì)含有冷凍保護(hù)劑的聚核苷酸溶液進(jìn)行首輪干燥，所述溶液已被冷卻至凍結(jié)并處于真空下，所述首輪干燥包括用5-30小時(shí)將溶液逐步加熱至-20℃至20℃，避免所述溶液的復(fù)熔；所述首輪干燥縮短了整個(gè)冷凍干燥過(guò)程所需的時(shí)間，得到基本為無(wú)定形物理結(jié)構(gòu)的冷凍干燥聚核苷酸，它在37℃至少10天以上保留至少90％超螺旋。51．根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的加熱時(shí)間是5-20小時(shí)。52．根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的加熱時(shí)間是5-10小時(shí)。53．根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的溫度是-10℃至20℃。54．根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的溫度是0℃。55．根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，還包括二次干燥，期間，用2-3小時(shí)將聚核苷酸溶液加熱至23-27℃。全文摘要一種冷凍干燥的聚核苷酸組合物,包含至少一種聚核苷酸和至少一種冷凍保護(hù)劑,其中聚核苷酸與冷凍保護(hù)劑的比例為約0.001—0.1份重量聚核苷酸比每1份重量冷凍保護(hù)劑。該組合物還含占最終冷凍干燥組合物總重約0.5—6wt%的水。本發(fā)明聚核苷酸組合物的特征在于穩(wěn)定性提高,在37℃,至少10天以上仍保持至少90%超螺旋結(jié)構(gòu)。該冷凍干燥聚核苷酸組合物的溶解度也提高了。一種得到上述穩(wěn)定的冷凍干燥聚核苷酸組合物的冷凍干燥聚核苷酸的改進(jìn)方法,采用特殊的首輪干燥。文檔編號(hào)A61K48/00GK1294520SQ99803874公開(kāi)日2001年5月9日申請(qǐng)日期1999年3月12日優(yōu)先權(quán)日1998年3月13日發(fā)明者S·穆蘇努里,P·P·德呂卡申請(qǐng)人:美國(guó)家庭用品有限公司