專利名稱：貫葉金絲桃提取物及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及貫葉金絲桃的提取物及其制劑，其中的貫葉金絲桃提取物可以通過不溶于水的C1-C5醇的酯類分餾該植物的含水醇、醇或丙酮提取物得到。
貫葉金絲桃開花的頂部含有許多類結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠直接或間接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
實際上，人們早已知道貫葉金絲桃含有一系列的活性化合物如金絲桃素、貫葉金絲桃素和雙黃酮，它們對動物和人具有抗抑郁和抗焦慮活性。這些化合物的作用機理是不相同的抗MAO作用，對五羥色胺釋放的作用，這些將在下文作詳細描述，以及對苯二氮受體的活性。由于在文獻中的所報道的對照數(shù)據(jù)，金絲桃素的活性已經(jīng)討論過很長時間。
最近，用體內(nèi)藥理模型已經(jīng)證實有爭論的金絲桃素抗抑郁活性。實際上，這早已被證實，即當有貫葉金絲桃提取物中所含的二聚原花青素存在下服用金絲桃素時，它具有活性(第45屆藥用植物研究組織年會，1997年9月7-12日，Regensburg，德國，V.Butterwecke等，摘要號011)。
最近貫葉金絲桃素已成為許多研究的目標，這些研究使貫葉金絲桃素作為抗抑郁藥可能起了重要作用；由中請人所進行的試驗證實了該分子具有類似于五羥色胺的活性。其他認為重要的組分是雙黃酮，來自于為天然苯二氮類結(jié)構(gòu)的芹菜甙元，這些報道見“天然存在的苯二氮類結(jié)構(gòu)、分布和功能”，I.Izquierdo和J.Medicine Eds,1993，第33頁。
這些產(chǎn)物，尤其是貫葉金絲桃素，在通常的提取和存放條件下是很不穩(wěn)定的；按照WO97/13489(Schwabe)，貫葉金絲桃素在貫葉金絲桃素的水-醇提取物中的含量在幾周后幾乎下降為零。
按照WO97/13489，為了得到貫葉金絲桃素固定含量的穩(wěn)定提取物，提取、純化和存放應(yīng)當在抗氧化劑如維生素C及其酯、硫酸化氨基酸等的存在下進行。
EP0599307(Schwabe)公開了通過聚乙烯吡咯烷酮和其他化學物質(zhì)去除金絲桃素，金絲桃素起著所不希望的光敏作用；該專利公開了不使用抗氧化劑得到了至少5％貫葉金絲桃素含量的提取物。
比較甲醇的常規(guī)提取物或Commission E專題論文所述的那些與按照EP0599307和WO97/13489制備的提取物之間的藥理和臨床數(shù)據(jù)是沒有意義的。另一方面，貫葉金絲桃素的常規(guī)提取物經(jīng)驗證含有大量黃酮及其他顯著對提取物活性起作用的物質(zhì)，其中所述的黃酮是潛在的自由基清除劑，因此對易氧化的物質(zhì)來說是天然的穩(wěn)定劑。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的，特別是具有活性的貫葉金絲桃素的提取物，它含有對藥理活性起作用的主要化合物，具體是金絲桃素、貫葉金絲桃素、黃酮類和呫噸酮，它可以通過這樣的方法制得，該方法包括下列步驟a)用醇或丙酮提取貫葉金絲桃的開花頂部；b)過濾該提取液并濃縮；c)用水或水/醇混合物稀釋步驟b)中得到的濃縮物；d)用脂肪族的酯類提取步驟c)得到的含水混合液；e)把步驟d)得到的酯類提取液過濾并蒸發(fā)至干；并且，任選，f)用有機酸的含水乙醇溶液溶解并在40℃以下的溫度蒸發(fā)該溶劑。
優(yōu)選實現(xiàn)本發(fā)明的方法是用甲醇或乙醇進行第一次提取(步驟a)，藥材與溶劑的重量/體積比在1∶2到1∶20的范圍內(nèi)，優(yōu)選為1∶2到1∶10的范圍內(nèi)，溫度在室溫到溶劑的回流溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選在室溫至40℃。
用于步驟c)的脂肪族的酯類例如為乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸丁酯；乙酸乙酯是最佳的。
用所述酯類提取是在用等體積的水或用體積比為1∶2到1∶5范圍內(nèi)的醇/水混合液處理濃縮的醇或丙酮提取液之后進行。
含水混合液與酯的體積比不是很嚴格的，能夠在較寬的范圍變化，但通常在1∶0.5到1∶2的范圍內(nèi)。
最好用新配制的等份溶劑重復進行提取，一般至少三次。
實現(xiàn)任選的步驟f)是把步驟e)中的濃縮物溶解在有機酸的95％乙醇溶液中，其中的有機酸如檸檬酸、蘋果酸、乙酰天冬氨酸或磷酸。
按照M.Brolis等，色譜層析雜志，825(1998),9-16所分析的，當使用自然的植物生物量時，本發(fā)明所得到的提取物含有5-20％(重量)的貫葉金絲桃素，而當使用選擇的植物生物量時可得到含量為10-50％(重量)的貫葉金絲桃素。在兩種情況中，金絲桃素的總含量高于0.5％，而雙黃酮是以1-2％(重量)的含量存在的。這種含量的較大差異取決于收集植物的時間、開花頂部的種子含量和該生物量中所存在的莖含量。
與總提取物相比，在各種用來評價抗抑郁和焦慮作用的藥理模型中該提取物出人意料地具有較高活性，并且不需要進一步的特殊處理隨著時間的推移活性是穩(wěn)定的。
而且，本發(fā)明的方法不需要進一步處理就能夠提供穩(wěn)定的提取物。該提取物應(yīng)當用任何方式遮光以避免光解。
所得到的提取物對五羥色胺(5-HT)的抑制和多巴胺(DA)的攝取具有下列活性。表Ⅰ-按照實施例1制備的貫葉金絲桃素的提取物對抑制3H 5-HT和3H DA攝取的作用。
IC50μg/ml物質(zhì)3H DA3H 5-HT醇提取物 4.05±0.9328.0±1.7己烷提取物0.86±0.023.08±0.62實施例1 0.32±0.042.72±1.1貫葉金絲桃素 1.54±0.234.75±0.79金絲桃素 ＞50 ＞50假-金絲桃素 1.40±0.1327.0±1.10
這些數(shù)據(jù)清楚地表明本發(fā)明的提取物具有高于貫葉金絲桃素和其他已知提取物好幾倍的功效。
在體內(nèi)試驗中，本發(fā)明的提取物已經(jīng)顯示出了比已知產(chǎn)品高的活性，這些已知產(chǎn)品主要是由醇、甲醇、己烷提取物，含有或不含金絲桃素組成；而且該提取物已經(jīng)證實具有較高的可重復生產(chǎn)性和隨著時間作用的穩(wěn)定性。為了在體內(nèi)試驗中證實抗抑郁作用，我們選擇了逃逸缺陷進展試驗和按照文獻中已知模型在喜好酒精的Sardinia鼠上的乙醇消耗抑制試驗。
在逃逸缺陷進展試驗中，本發(fā)明的提取物出人意料地顯示出比已知提取物高的活性和與已知藥物如米帕明的相當活性。在該試驗中，把小鼠固定并使其接受柔和、短暫、不可避免的電擊50分鐘(預(yù)試驗)。24小時后，在動物的尾部試驗動物避開相同刺激的能力，在這種情況下逃逸是不可能的。在30次刺激中平均一只小鼠有26次逃逸(自然對照)，而接受過預(yù)試驗刺激的動物僅有1-3次脫逸(ED對照)。由預(yù)試驗所誘發(fā)的高反應(yīng)性沒有在用抗抑郁藥如米帕明或氟西汀提前治療1-3周的小鼠中出現(xiàn)。在把小鼠暴露給不可避免的壓力前1小時，給小鼠口服貫葉金絲桃素提取物會產(chǎn)生對逃逸試驗的反應(yīng)性有一定增加，如果提前治療進行1-2周時，這種增加還有提高。表Ⅱ貫葉金絲桃素提取物在2周預(yù)試驗的逃逸試驗中對小鼠的抗抑郁作用。物質(zhì) 劑量/mg/kg逃逸數(shù)貫葉金絲桃醇提取物 100016.6±2.8己烷提取物 60017.2±1.6實施例1 20023.3±0.4實施例1 10018.3±0.2實施例1 5013.3±0.4對照ed -- 1.6±0.1自然對照 --24.1±0.1統(tǒng)計分析Kruskal-Wallis 無參數(shù)ANOVA KW=13.462p=0.0012貫葉金絲桃醇提取物對自然 p＜0.01實施例1提取的貫葉金絲桃提取物200mg/kg對自然 n.s.自然對AND p＜0.01在按照文獻已知的步驟對Sardinia小鼠的醇消耗的減少(這是抑郁和焦慮的標志)試驗中，在服用3天后，與對照相比，本發(fā)明的提取物誘發(fā)了醇消耗下降75％且更傾向飲用水，而用甲醇或己烷提取物治療后醇消耗的下降分別是30和40％。
本發(fā)明的提取物能夠包括在口服制劑中，如備用溶液、軟或硬明膠膠囊、片劑和控釋片。在制劑中提取物的劑量在常用劑型中10到100mg/劑量和在控釋制劑中高達300mg的范圍內(nèi)，在這種情況優(yōu)選劑量是每天300mg/劑量。
以下實施例用來更詳細地說明本發(fā)明。實施例1作為活性成分的標準的貫葉金絲桃干燥提取物的制備在25L容量的提取罐中用4×15L的甲醇提取4kg的貫葉金絲桃開花頂部。在真空下把合并的甲醇提取液濃縮到2.5L；用等體積的水稀釋該濃縮物，然后用3×1.5L乙酸乙酯反向提取。過濾有機相并在真空下濃縮至干。把殘余物溶于2g檸檬酸的1.3升95％乙醇溶液中。然后在真空下在不高于40℃把該有機相蒸干得到0.32kg棕黃色提取物，其含有20％的貫葉金絲桃素、0.9％的總金絲桃素(金絲桃素加假金絲桃素)和1％的雙芹菜甙元。實施例2作為活性成分的標準的貫葉金絲桃提取物的制備收集并在不高于60℃的溫度下機械干燥60kg的貫葉金絲桃開花頂部，在柔和回流下用4×20體積的丙酮提取。過濾合并的提取液以除去生物量的殘余物，然后在真空下濃縮至干得到3kg提取物，該提取物含有0.4％的總金絲桃素和大約25％的貫葉金絲桃素。把該提取物懸浮在10L甲醇/水 3∶7的混合液中并用乙酸丁酯反向提取從而完成在多酚類中的抽提，用硅膠的薄層層析檢查抽提，洗脫用乙酸乙酯/甲醇/H2O 100∶13.5∶10。除去水相，而把有機相在Na2SO4上干燥并在真空下不高于40℃的溫度下濃縮至干得到1.6kg的干燥提取物，它含有0.7％的總金絲桃素，大約40％的貫葉金絲桃素和1.4％的雙黃酮。實施例3作為活性成分的標準的貫葉金絲桃多成分提取物的制備收集并在不高于60℃的溫度下機械干燥60kg的貫葉金絲桃開花頂部，用98％的甲醇連續(xù)提取直到可提取物提完；把甲醇提取液濃縮到30L并用等體積的水稀釋濃縮液，在稀釋過程中濾除不溶物；用3×30L水飽和的乙酸乙酯提取清澈的溶液，然后在Na2SO4上干燥并在真空下除去溶劑得到3.8kg的棕色提取物，它含有25％的貫葉金絲桃素、1.2％的總金絲桃素和1.2％的二聚物雙黃酮。實施例4含有實施例1制備的貫葉金絲桃的親脂性提取物的溶液實施例1制備的貫葉金絲桃提取物10.0g甘草酸銨 0.5g1,2-丙二醇 35.0g70％山梨醇溶液 25.0g純化水 適量至100ml實施例5含有實施例2制備的貫葉金絲桃提取物的包衣片實施例2制備的貫葉金絲桃提取物 300.00mg大豆多糖 54.75mg乳糖 46.00mg交聯(lián)羧甲基纖維素 40.00mg鈉-硅二氧化驗室 20.00mg聚乙烯吡咯烷酮5.00mg滑石 2.50mg硬脂酸鎂 1.75mg包衣羥丙基甲基纖維素 10.00mg滑石 8.50mg二氧化鈦 5.00mg三醋汀2.00mg聚山梨酯80 0.50mg氧化鐵紅 1.00mg
權(quán)利要求
1．制備貫葉金絲桃提取物的方法，它包括a)用醇或丙酮提取貫葉金絲桃的開花頂部；b)過濾該提取液并濃縮；c)用水或水/醇混合物稀釋步驟b)中得到的濃縮物；d)用脂肪族的酯類提取步驟c)得到的含水混合液；e)把步驟d)得到的酯類提取液過濾并蒸發(fā)至干；并且，任選，f)用有機酸的含水乙醇溶液溶解并在40℃以下的溫度蒸發(fā)該溶劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用甲醇或乙醇進行步驟a)的提取。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用丙酮進行步驟a)的提取。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用甲醇或乙醇進行步驟c)的稀釋。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4中任選的一個所述的方法，其中步驟d)中所用的脂肪族酯類選自于乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸丁酯。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中使用乙酸乙酯。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中任選的步驟f)的溶解在選自于在95％乙醇溶液中的檸檬酸、蘋果酸、乙酰天冬氨酸或磷酸的有機酸中進行。
8．由權(quán)利要求1-7的方法得到的貫葉金絲桃提取物。
9．按照權(quán)利要求8所述的提取物，它含有10-50％(重量)的貫葉金絲桃素、高于0.5％(重量)的總金絲桃素及含量為1-2％(重量)的雙黃酮類。
10．含有權(quán)利要求8或9的提取物作活性成分的藥物組合物。
11．權(quán)利要求8或9的提取物在制備抗抑郁藥方面的用途。
全文摘要
貫葉金絲桃的提取物,它可以通過用不溶于水的C
文檔編號A61K31/122GK1304314SQ99807127
公開日2001年7月18日 申請日期1999年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月10日
發(fā)明者E·博巴得利, B·蓋貝塔, P·瑪拉佐尼 申請人:因迪納有限公司