專利名稱：T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的治療的制作方法
背景技術(shù)：
自身免疫疾病的特點(diǎn)是個(gè)體的免疫系統(tǒng)攻擊其自身的組織。自身免疫疾病通常是由個(gè)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原的耐受崩潰造成的。在各種自身免疫疾病中為個(gè)體免疫系統(tǒng)所識(shí)別的特異性抗原可能系統(tǒng)性出現(xiàn)或可能是器官特異性的。例如，全身性紅斑狼瘡(SLE)的特征是存在對(duì)DNA、核糖核蛋白、組蛋白和其他非器官特異性分子的自身抗體。其他自身免疫疾病通常以一個(gè)器官的破壞為特征。這種自身免疫疾病包括I型糖尿病，在這種疾病中胰臟Langerhans胰島的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞受到破壞。
在某些自身免疫疾病中，組織破壞主要是由于產(chǎn)生高水平的自身抗體的結(jié)果。這類疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，特征是關(guān)節(jié)軟骨的破壞和滑膜炎癥?；碱愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人的關(guān)節(jié)中有免疫復(fù)合物累積，該復(fù)合物由抗IgG的Fc段和抗IgG分子的自身抗體結(jié)合造成。這種免疫復(fù)合物激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致組織損害。重癥肌無(wú)力是一種進(jìn)行性肌無(wú)力病，它是由于產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)肌肉接點(diǎn)運(yùn)動(dòng)終板的乙酰膽堿受體有活性的自身抗體而引起的。
在其他自身免疫疾病中，組織破壞似乎并非主要由自身抗體所介導(dǎo)，而是由自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)。例如，實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)是一種多發(fā)性硬化動(dòng)物模型，其特征是在腦髓和脊髓發(fā)生脫髓鞘。這種疾病可通過(guò)將來(lái)自患病動(dòng)物的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移給首次受試動(dòng)物而誘導(dǎo)產(chǎn)生。因此，一般認(rèn)為EAE表現(xiàn)為T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，而非B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病(Ben-Nun，A.et al.(1981)Eur.J.Immunol.11，195)。
多發(fā)性硬化(MS)是腦髓和脊髓的一種脫髓鞘病。它是一種進(jìn)行性疾病，其特征表現(xiàn)為影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的神經(jīng)機(jī)能障礙的緩解和加重。這種疾病的癥狀產(chǎn)生于炎性脫髓鞘的病灶，然后形成斑痕，在大腦白質(zhì)、腦干或脊髓中出現(xiàn)“斑”。目前，對(duì)MS沒(méi)有一定的診斷測(cè)試法，而以諸如神經(jīng)機(jī)能障礙開始加重時(shí)的病人的癥狀的程度和/或病人的年齡一類的因素為基礎(chǔ)的診斷和治療體制正處于制定之中。
對(duì)患有MS的病人一般用類固醇治療，目的是使病人的病情緩解或減慢患者的疾病進(jìn)程。其他藥物，例如肌肉松弛藥用于治療這種疾病的特殊癥狀?？捎糜贛S治療的新進(jìn)展包括施用β干擾素，看來(lái)β干擾素有望減緩疾病進(jìn)行，然而，仍然需要有效的MS治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明是關(guān)于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，如多發(fā)性硬化的方法。該方法包括給接受治療者施用有效治療或預(yù)防劑量的T細(xì)胞表面受體拮抗劑，所述T細(xì)胞介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能(helper effectorfunction)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，施用的拮抗劑是一種抗體或其片段，該抗體或其片段與此種T細(xì)胞受體gp39特異性結(jié)合。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是受注射小鼠的每日測(cè)量的DAS單位圖解，在第0日注射75微克PLP-肽(A部)或300微克PLP-肽(B部)并伴隨注射抗pg39抗體(黑色柱)或PBS(灰色柱)，該圖解說(shuō)明施用抗pg39能防止實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎EAE的發(fā)生。
圖2是受注射小鼠中誘導(dǎo)的抑制EAE百分比圖解，在第0日注射PLP肽并在第0日、2日、和6日或在第4日、6日和8日或第7日、9日和11日進(jìn)一步注射抗pg39抗體(黑色柱)或PBS(灰色柱)，該圖解說(shuō)明在誘導(dǎo)所述疾病后施用抗pg39能有效防止EAE。
圖3是移植了接受PLP肽和抗pg39抗體(黑色柱)注射的小鼠供體脾細(xì)胞或僅接受PLP肽注射(灰色柱)以及接受PLP肽注射的小鼠供體脾細(xì)胞之小鼠中每日測(cè)量的DAS單位圖解。
發(fā)明詳述本發(fā)明是關(guān)于T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病如多發(fā)性硬化癥的治療。這種疾病通過(guò)施用T細(xì)胞表面受體拮抗劑來(lái)治療，所述T細(xì)胞介導(dǎo)接觸依賴型T細(xì)胞輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能。
如此處所定義的，“介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能的分子或受體”是在Th細(xì)胞上表達(dá)并與效應(yīng)細(xì)胞(例如B細(xì)胞)上的配體相互作用的分子或受體，其中受體與配體的相互作用對(duì)效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生是必要的(例如B細(xì)胞活化)。除了涉及到效應(yīng)細(xì)胞的反應(yīng)，已發(fā)現(xiàn)這種分子還涉及T細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能的T細(xì)胞表面上的受體是gp39。在此實(shí)施方案中，拮抗劑是一種分子，它抑制gp39與位于向T細(xì)胞遞呈抗原的細(xì)胞上的gp39配體的相互作用。一種特別優(yōu)選的gp39拮抗劑是抗gp39抗體。另外，該gp39拮抗劑是gp39配體(例如可溶性CD40)的一種可溶形式。
本發(fā)明的方法至少部分基于將抗gp39抗體施用于小鼠從而防止EAE的誘發(fā)并使患EAE動(dòng)物的疾病發(fā)生逆轉(zhuǎn)的觀察。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在治療典型的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病時(shí)，抑制T細(xì)胞上的gp39與其他細(xì)胞上的gp39配體相互作用的藥劑在預(yù)防和治療上都是有效的。這個(gè)結(jié)果對(duì)先前的研究來(lái)說(shuō)是出人意料的，那些研究已將gp39歸于在介導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)中起主要作用?？筭p39抗體在治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病中是有效的這個(gè)發(fā)現(xiàn)構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)。按照本發(fā)明，患有T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病如多發(fā)性硬化癥的被試者通過(guò)施用模擬抗gp39抗體的作用的試劑得到治療。T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病用語(yǔ)“自身免疫病”意指包括一個(gè)被試者的免疫系統(tǒng)與自身抗原起作用以至使該被試者中發(fā)生顯著的組織或細(xì)胞破壞的疾病。術(shù)語(yǔ)“自身抗原”意指包括一個(gè)被試者的任何被該被試者的免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原。術(shù)語(yǔ)“自身抗原”(autoantigen)和自身抗原(Self-antigen)在此可互用，此處所用的術(shù)語(yǔ)“自身”意指一個(gè)被試者的任何成分并包括分子、細(xì)胞和器官。自身抗原可以是肽、核酸或其他生物物質(zhì)。用語(yǔ)“T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病”意指包括那些自身免疫病，在該類疾病中對(duì)自身的反應(yīng)主要涉及與體液免疫機(jī)制相對(duì)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫機(jī)制。因此，本發(fā)明的方法適合于治療組織破壞主要是由活化B細(xì)胞和由不是B淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的那類自身免疫病。然而，即使本發(fā)明的方法是要治療對(duì)自身反應(yīng)主要通過(guò)活化B細(xì)胞和非B淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，該類自身免疫病可以是以自身抗體的存在為特征的。例如，一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病EAE可通過(guò)本發(fā)明的方法治療，該病常常伴隨抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成分如卵磷脂類蛋白質(zhì)的自身抗體的存在?？捎杀景l(fā)明的方法治療的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的非限定性實(shí)施例包括多發(fā)性硬化癥、EAE、I型糖尿病、卵巢炎和甲狀腺炎。gp39拮抗劑按照本發(fā)明的方法，給被試者施用gp39拮抗劑以阻礙T細(xì)胞上的gp39與抗原遞呈細(xì)胞如B細(xì)胞上的gp39配體相互作用從而防止，減輕或改善病情。gp39拮抗劑被定義為一種阻礙這類相互作用的分子。如下面更詳細(xì)的介紹，gp39拮抗劑可以是抗gp39的抗體(例如，抗gp39單克隆抗體)、抗gp39抗體的一個(gè)片段或衍生物(例如，F(xiàn)ab或F(ab)′2段，嵌合抗體或人源化抗體)、一種gp39配體的可溶形式(例如，可溶性CD40)、一種gp39配體的融合蛋白的可溶形式(例如，可溶性CD40Ig)、或破壞或阻礙所述gp39-CD40相互反應(yīng)的藥劑。A.抗體為制備抗-gp39抗體，可用引起哺乳動(dòng)物抗體反應(yīng)之免疫原性形式的gp39蛋白或蛋白質(zhì)片段(例如，肽片段)免疫哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、倉(cāng)鼠、或兔)。在細(xì)胞表面上表達(dá)gp39的細(xì)胞也可用做免疫原。選擇的免疫原包括純化的gp39蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。gp39可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)從表達(dá)gp39細(xì)胞純化，例如gp39 cDNA可在宿主細(xì)胞如細(xì)菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)純化gp39蛋白質(zhì)(Armitage等，Nature，35780-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)Hollenbaugh等，EMBO J.，114313-4319(1992))?？梢詆p39的氨基酸序列為基礎(chǔ)用已知技術(shù)(例如F-moc或T-boc化學(xué)合成法)合成gp39肽(發(fā)表在Armitage等，Nature，35780-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.，1751091-1101(1992)；Hollenbaugh等，EMBO J.，114314-4319(1992))。賦予蛋白質(zhì)以免疫原性的技術(shù)包括結(jié)合到載體技術(shù)或其他本行業(yè)所熟知的技術(shù)。例如，可在佐劑存在時(shí)施用所述蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)血漿或血清中的抗體滴度監(jiān)測(cè)免疫進(jìn)程?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的酶聯(lián)免疫法或其他免疫檢測(cè)法以免疫原作為抗原評(píng)估抗體水平。
按免疫方法操作可得到抗血清，若需要的話可從該血清中分離多克隆抗體。為生產(chǎn)單克隆抗體，可從免疫的動(dòng)物收集產(chǎn)抗體細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合方法與骨髓瘤細(xì)胞融合從而使這些細(xì)胞無(wú)限增殖并產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。這個(gè)技術(shù)是本行業(yè)所熟知的。例如，雜交瘤技術(shù)最初是由Kohler和Mistein(Nature(1975)256495-497)以及其他技術(shù)如人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kazbar等。Immunol.Today(1983)472)、為生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等.Moleclonal Antibodies in CancerTherapy(1985)(Allen R.Bliss，Inc.，page 77-96)和篩選復(fù)合抗體庫(kù)(Huse等.，Science(1989)2461275)發(fā)展起來(lái)的。為生產(chǎn)與所述蛋白或肽起特異性反應(yīng)的抗體，可對(duì)雜交瘤進(jìn)行免疫化學(xué)篩選并分離單克隆抗體。
此處使用的術(shù)語(yǔ)抗體意指包括具有對(duì)gp39蛋白質(zhì)或其肽或gp39融合蛋白的反應(yīng)特異性之抗體片段。可用常規(guī)技術(shù)使抗體成為片段并根據(jù)實(shí)用目的以上述完整抗體的同樣的方式篩選所述片段。例如，通過(guò)用胃蛋白酶處理抗體生成F(ab′)2段?？商幚淼玫降腇(ab′)2段以還原二硫鍵從而生成Fab′段。本發(fā)明的抗體還意指包括有抗gp39部分的雙特異性分子和嵌合分子。
當(dāng)將非人受試者產(chǎn)生的抗體用于人類治療時(shí)，它們不同程度的被辨認(rèn)為外來(lái)物并可在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。比免疫抑制更優(yōu)選的一種減小或消除這個(gè)問(wèn)題的方法是產(chǎn)生嵌合抗體衍生物例如將非人動(dòng)物可變區(qū)和人類恒定區(qū)相結(jié)合的抗體分子。例如，嵌合抗體分子可包括例如帶有人類恒定區(qū)的源于小鼠、大鼠、或其他物種之抗體的抗原結(jié)合區(qū)。各種制備嵌合抗體的方法已有介紹并可將這些方法用于制備含識(shí)別gp39的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體。例如，見Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.816851(1985)；Takeda等，Nature 314452(1985)，Cabilly等，U.S.Patent No.4,816,567；Boss等，U.S.Patent No.4,817,397Tanaguchi等，European Patent Publication EP171496；Uuropean PatentPublication 01734594，United Kindom Patent GB2177096B。預(yù)期這類嵌合抗體在人體中的免疫原性比相應(yīng)的非嵌合抗體的免疫原性要低。
為人類治療目的的具有與gp39蛋白質(zhì)或肽的特異反應(yīng)性的單克隆抗體或嵌合抗體可通過(guò)產(chǎn)生人可變區(qū)嵌合體使其進(jìn)一步人源化，在所述嵌合體中可變區(qū)部分，特別是抗原結(jié)合區(qū)的保守框架區(qū)具有人類來(lái)源，而只有高變區(qū)是非人來(lái)源的?？赏ㄟ^(guò)本行業(yè)所知的幾個(gè)技術(shù)的任何一種制備這類改變了的免疫球蛋白分子，(例如，Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)Kozbor等.，Immunology Today，47279(1983)；Olsson等.，Meth.Enzymol.，923-16(1982))，并最好按照PCT Publication WO92/06193或EP0239400教程進(jìn)行制備。例如，Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain可生產(chǎn)供出售的人源化抗體。
生產(chǎn)對(duì)gp39蛋白質(zhì)或肽有反應(yīng)性的特異抗體或抗體片段的另一種方法是用gp39蛋白或肽篩選細(xì)菌中表達(dá)的編碼免疫球蛋白基因的表達(dá)文庫(kù)或其部分。例如，可用噬菌體表達(dá)文庫(kù)在細(xì)菌中表達(dá)完整的Fab段，VH區(qū)和FV區(qū)。例如，見Ward等，Nature，341544-546(1989)；Huse等，Science，2461275-1281(1989)；和McCafferty等，Nature，348552-554(1990)。例如，用gp39肽篩選這類文庫(kù)可鑒定具有對(duì)gp39的反應(yīng)性的免疫球蛋白。另外，SCID-hu小鼠(從Genpharm得到)可用于生產(chǎn)抗體或其片段。
在PCT專利申請(qǐng)?zhí)朩O 95/06666中題為“抗gp39抗體及其應(yīng)用”(其中的教程為參考引用)描述了生產(chǎn)抗gp39，包括抗人gp39和抗小鼠gp39單克隆抗體的方法，以及單克隆抗體，適合本發(fā)明方法中使用。本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗人gp39抗體是mAbs24-31和89-76，它們分別由雜交瘤24-31和89-76產(chǎn)生。按照布達(dá)佩斯條約，產(chǎn)生89-76和24-31抗體的雜交瘤89-76和24-31于1994年9月2日分別儲(chǔ)存在American TypeCulture Collection，Parklawn Drive，Rochville，Md.。給雜交瘤89-76ATCC保藏號(hào)是HB11713，而雜交瘤24-31ATCC保藏號(hào)是HB11712。
按照標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)對(duì)編碼抗gp39抗體的核酸(例如DNA)進(jìn)行操作可生產(chǎn)重組型抗gp39抗體，如嵌合抗體和人源化抗體。因此，本發(fā)明的另一方面是關(guān)于可編碼與gp39，特別是人gp39有反應(yīng)性的免疫球蛋白重鏈或輕鏈或其部分的分離的核酸分子。編碼免疫球蛋白的核酸可編碼免疫球蛋白輕鏈或重鏈的可變區(qū)，或有或無(wú)相連接的重鏈或輕鏈恒定區(qū)(或其部分)。例如，通過(guò)cDNA庫(kù)篩選，PCR擴(kuò)增或其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可從24-31或89-76雜交瘤分離編碼24-31或89-76嵌合抗體的核酸。而且，繼分離和可能的進(jìn)一步操作之后，編碼抗人gp39嵌合抗體可整合到表達(dá)載體中并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以有利于表達(dá)和產(chǎn)生重組形式的抗人gp39抗體。B.gp39的可溶性配體其他可用于產(chǎn)生T細(xì)胞耐受的gp39拮抗劑是gp39配體的可溶形式。gp39的單價(jià)可溶配體如CD40可結(jié)合gp39，從而抑制gp39與B細(xì)胞上的CD40的相互作用。術(shù)語(yǔ)“可溶性”是指配體不與細(xì)胞膜永久結(jié)合?？扇苄詆p39配體可由化學(xué)合成法制備，或最好通過(guò)DNA重組技術(shù)例如通過(guò)只表達(dá)所述配體的細(xì)胞外域(沒(méi)有配體的跨膜域和胞質(zhì)域)制備。優(yōu)選的可溶性gp39配體是可溶性CD40。另外，可溶性gp39配體可以是融合蛋白的形式。這類融合蛋白至少包括附著到第二個(gè)分子上的gp39配體的一部分。例如，CD40可表達(dá)成帶有免疫球蛋白的融合蛋白(例如，CD40 Ig融合蛋白)。在一種實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的融合蛋白包括CD40分子的細(xì)胞外域部分的氨基酸殘基連接著對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白重鏈如Cγ1的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)序列的氨基酸殘基以形成CD40Ig融合蛋白(例如見Linsley等(1991)J.Exp.Med.1783721-730；Capon等(1989)Nature 337，525-531；和Capon U.S.5,115,964)?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)合成法或最好通過(guò)以CD40的cDNA為基礎(chǔ)的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)所述融合蛋白(Stamenkovic等，EMBO J.81403-1410(1989))。
將本發(fā)明的拮抗劑以適合體內(nèi)用藥的生物學(xué)相容形式施用于被試者。“適合體內(nèi)用藥的生物學(xué)相容形式”是指所述拮抗劑的一種給藥形式，在該形式中所述蛋白質(zhì)的治療作用超過(guò)任何毒副作用。術(shù)語(yǔ)被試者意指包括在其體內(nèi)可引發(fā)免疫反應(yīng)的所有活有機(jī)體，例如哺乳動(dòng)物。被試者的實(shí)例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠、及其轉(zhuǎn)基因物種。可以任何藥物形式在任選的藥用載體中施用gp39拮抗劑，治療活性量的拮抗劑的施用被定義為以必要的劑量和時(shí)間間隔而達(dá)到預(yù)期結(jié)果的有效量。例如，gp39的一種拮抗劑的治療活性量可根據(jù)諸如個(gè)體的病情、年齡、性別和體重以及該拮抗劑引起該個(gè)體體內(nèi)的所需反應(yīng)的能力而有不同。可將劑量體制調(diào)整到能提供所述最佳治療反應(yīng)。例如，每天可給數(shù)份藥或根據(jù)治療情況的要求按比例減少每份藥量。
活性化合物(例如拮抗劑)可以方便的方式施用，如注射(皮下，靜脈內(nèi)等)、口服、吸入、經(jīng)皮施用、或直腸給藥。根據(jù)給藥途徑，可用一種物質(zhì)包被活性化合物以防止化合物受酶、酸和其他可使該化合物失活的天然成分的作用。
為了施用經(jīng)胃腸給藥的gp39拮抗劑，可能有必要將一種物質(zhì)包被該拮抗劑或與該拮抗劑的共給藥以防止拮抗劑失活。例如，一種拮抗劑可在適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑中給藥，伴隨酶抑制劑共同給藥或在載體如脂質(zhì)體中給藥。藥用稀釋劑包括生理鹽水和緩沖水溶液。酶抑制劑包括胰臟胰蛋白酶抑制劑、二異丙基-氟磷酸(DEP)和抑肽酶。脂質(zhì)體包括水包油包水乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan等，(1984)J.Neuroimmunol727)活性化合物還可經(jīng)胃腸外或腹腔內(nèi)給藥。也可用甘油、液體聚乙烯甘醇及其混合物和油類制備分散劑。在常規(guī)儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑可含有一種防腐劑以防微生物生長(zhǎng)。
適合注射使用的藥用組合物包括為臨時(shí)配制無(wú)菌注射液或分散劑用的無(wú)菌水溶液(水溶性溶液)或分散劑和無(wú)菌粉劑。在各種情況下，組合物必須是無(wú)菌的并必須是達(dá)到易于注射程度的流體。所述組合物在生產(chǎn)條件和儲(chǔ)存下必須是穩(wěn)定的并必須保存在抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染活動(dòng)的條件下。所述載體可以是例如含水、乙醇、多羥基化合物(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙烯甘醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩＠缤ㄟ^(guò)使用一種包被如卵磷脂、通過(guò)依靠分散劑維持所需顆粒的大小和通過(guò)使用表面活性劑可保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。可用各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、asorbic acid、乙基汞硫代水楊酸鈉等防止微生物活性。在許多情況下，在組合物中最好包括等滲試劑，例如糖類、多醇類、如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。在組合物中包括延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠可產(chǎn)生注射用組合物的延長(zhǎng)吸收作用。
通過(guò)將在適當(dāng)溶劑中之需要量的活性化合物根據(jù)需要與上述所列配料之一或一種組合相混合然后過(guò)濾除菌可制備無(wú)菌注射液。一般說(shuō)，通過(guò)將所述活性化合物摻入到無(wú)菌載體中制備分散劑所述載體含有一種基本的分散介質(zhì)和上述所列的其他需要成分。就無(wú)菌粉劑來(lái)說(shuō)，為制備無(wú)菌注射液，優(yōu)選的制備方法是產(chǎn)生活性成分(例如，拮抗劑)粉末的真空干燥和冷凍干燥加上來(lái)自前述相應(yīng)無(wú)菌過(guò)濾液的其他所需成分。
如上所述，當(dāng)活性化合物受到適當(dāng)保護(hù)時(shí)例如用一種惰性稀釋劑或一種可吸收的食用載體，就可以口服所述蛋白質(zhì)。如本文所用“藥用載體”包括任何及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包被物、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和延緩吸收劑等。除了受到任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與所述活性化合物不相容的限制外，都要考慮在治療用組合物中使用上述成分。
將經(jīng)胃腸外給藥的組合物配制成劑量單位形式對(duì)方便給藥和劑量統(tǒng)一是有特殊優(yōu)越性的。此處所用的劑量單位形式指適合作為接受治療的哺乳動(dòng)物被試者使用的單一劑量的物理上分立的劑量單位；每單位含有計(jì)算好的與需要的藥物載體結(jié)合使用時(shí)能產(chǎn)生理想治療效果之預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格受支配于并依賴于(a)活性化合物獨(dú)具的特點(diǎn)和所要達(dá)到的特殊的治療效果，和(b)合成用于個(gè)體敏感性治療的此類活性化合物之技術(shù)的內(nèi)在限制。
本發(fā)明由下述實(shí)施例做進(jìn)一步解釋，所述實(shí)施例不應(yīng)被看作是對(duì)本發(fā)明的限制。在全部所述應(yīng)用中引用的所有參考、專利和出版的專利應(yīng)用之內(nèi)容均結(jié)合于此作為參考引用。實(shí)施例1
通過(guò)施用抗gp39抗體防止EAE本實(shí)施例證明給小鼠施用抗gp39抗體能防止誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，此處EAE是一種多發(fā)性硬化癥的動(dòng)物模型。
EAE是一種頗具特點(diǎn)的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病模型并且對(duì)人類自身免疫病多發(fā)性硬化癥來(lái)說(shuō)是一種指導(dǎo)性模型。通過(guò)用卵磷脂類蛋白質(zhì)(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PAP)、少突神經(jīng)細(xì)胞髓磷脂蛋白質(zhì)(MOG)、或以這些卵磷脂結(jié)合蛋白序列為基礎(chǔ)合成的肽類同時(shí)給與百日咳細(xì)菌佐劑免疫動(dòng)物，可在易感動(dòng)物如小鼠中誘發(fā)EAE。在免疫動(dòng)物后一到二周，動(dòng)物發(fā)生腦脊髓炎，其特征是外周血管滲潤(rùn)有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并發(fā)生腦髓和脊髓脫髓鞘。動(dòng)物表現(xiàn)出急性、慢性或慢性復(fù)發(fā)性癱瘓。在此實(shí)施例中，分析了在小鼠發(fā)生EAE時(shí)給予抗gp39抗體的效果。
在易感小鼠腹部?jī)蓚?cè)皮下注射(第0日)乳劑誘發(fā)EAE，在該乳劑中含70微克或300微克PLP肽的50微升PBS溶液并含25微克結(jié)核桿菌(H37RA，Difco)的50微升完全Freuds佐劑。在給所述肽的同時(shí)以及兩天后，靜脈給予200微升百日咳桿菌懸液(10.1010在1毫升PBS中)。給小鼠注射的PLP肽的氨基酸序列相應(yīng)于大鼠PLP的139到151氨基酸殘基(Daotigny等，F(xiàn)EBS Lett.18833，1985)。PLP肽是按照固相合成法用f-moc保護(hù)的氨基酸合成的(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149，1963)。用此肽免疫動(dòng)物導(dǎo)致發(fā)生急性EAE，后者在臨床上和病理上等同于用完整中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)卵磷脂或用MBP致敏所誘發(fā)的EAE(Tuohy等，J.Immunol.1421523，1989；Sobel等，J.Neuropathol.Exp.Neurol.49468，1990)。
為確定抗gp39在疾病進(jìn)程中的作用，在第0天用上述方法給小鼠注射PLP肽并在第0、2、4天追加靜脈注射125微克倉(cāng)鼠抗gp39Mabs(Noelle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896550，1992)的200微升PBS溶液或注射125微克正常倉(cāng)鼠抗體(Serv Feinbiochemica)的200微升PBS溶液(對(duì)照組動(dòng)物)。每日評(píng)估EAE臨床體征的嚴(yán)重性并按照平均病廢標(biāo)度(DAS)記分區(qū)分等級(jí)0級(jí)＝無(wú)臨床體征，1級(jí)＝尾部無(wú)力，2級(jí)＝后肢中度癱瘓和運(yùn)動(dòng)失調(diào)，3級(jí)＝后肢嚴(yán)重癱瘓或運(yùn)動(dòng)失調(diào)，4級(jí)＝瀕死狀態(tài)，5級(jí)＝EAE導(dǎo)致死亡。
圖1表示注射70微克PLP肽(A部)或300微克PLP肽(B部)并用抗gp39或?qū)φ湛贵w處理的小鼠疾病進(jìn)程。對(duì)照小鼠和用抗gp39處理之小鼠的DAS記分(此記分反映該病的嚴(yán)重程度)分別用灰色和黑色條塊表示。
結(jié)果表明接受對(duì)照抗體的動(dòng)物發(fā)生了EAE，而接受了抗gp39抗體的動(dòng)物受到保護(hù)沒(méi)有誘發(fā)該病。對(duì)于接受了對(duì)照抗體的動(dòng)物，EAE的最初臨床體征在第11天明顯表現(xiàn)出來(lái)。在這些動(dòng)物中，注射75微克PLP肽的動(dòng)物的最高DAS記分是2.33，在第15-22天觀察到此分?jǐn)?shù)(圖1，A部黑色條塊)，注射300微克PLP肽的動(dòng)物最高DAS記分是3.6，在第16-23天觀察到此分?jǐn)?shù)(圖1，B部灰色條塊)。相反，接受了抗gp39單克隆抗體的動(dòng)物顯示經(jīng)75微克PLP肽誘導(dǎo)EAE后沒(méi)有臨床體征(圖1，A部，黑色條塊)，而經(jīng)300微克PLP肽誘導(dǎo)該病后僅有輕微臨床體征，該體征在第31天完全消失(圖1，B部，黑色條塊)。
因此，給小鼠施用抗gp39抗體完全抑制在這些小鼠中誘發(fā)EAE。
通過(guò)從卵磷脂成分免疫的動(dòng)物分離到的或從卵磷脂成分體外活化后得到的卵磷脂反應(yīng)性T細(xì)胞的繼承性轉(zhuǎn)移誘發(fā)EAE表明特殊活化的T細(xì)胞與誘導(dǎo)期后的臨床特征的發(fā)生有關(guān)(Pettinelli和McFarlin，J.Immunol.1271420，1979；Mokgtarion等，Nature 309356，1984；Veen等，J.Neuroimmu-nol.21183，1989)。然而，本文描述的實(shí)驗(yàn)顯示施用抗gp39單克隆抗體能防止EAE發(fā)生。在對(duì)照組，用低和高PLP肽誘發(fā)EAE的動(dòng)物中分別在第14天(吸收系數(shù)1.92)和第21天(吸收系數(shù)2.15)觀察到有意義的抗PLP肽抗體反應(yīng)。相反，在經(jīng)gp39處理的動(dòng)物中，接受低和高劑量PLP肽注射的動(dòng)物分別在第14天最初觀察到有意義的抗PLP抗體反應(yīng)并在第31天達(dá)到穩(wěn)定水平(吸收系數(shù)0.928)和(吸收系數(shù)1.54)。在抗gp39單克隆抗體處理的小鼠中有意義的抗PLP抗體反應(yīng)的產(chǎn)生推遲了14天，這表明抗gp39單克隆抗體對(duì)抗體的產(chǎn)生有某些影響。
因此，所述實(shí)施例證明抗gp39能防止EAE發(fā)生并表明可將抗gp39抗體用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，如多發(fā)性硬化癥。實(shí)施例2通過(guò)施用抗gp39抗體逆轉(zhuǎn)EAE實(shí)施例1說(shuō)明了抗gp39抗體對(duì)誘發(fā)EAE的抑制作用。因此，證明了在誘發(fā)該疾病時(shí)免疫小鼠能防止該病的發(fā)生。這個(gè)實(shí)施例表明在誘發(fā)該病后施用所述抗體導(dǎo)致該疾病的消退。
在本實(shí)施例中，通過(guò)注射含150微克PLP肽的乳劑在雌性SJL/j小鼠中誘發(fā)EAE，乳劑制備方法同上所述。為確定在誘發(fā)疾病后給小鼠施用抗gp39抗體時(shí)該抗體的作用，在第0、2和4日，在第4、6和8日或在第7、9和11日給小鼠腹腔內(nèi)注射125微克抗gp39單克隆抗體(Nocllc等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896550，1992)的200微升PBS溶液(抗gp39處理的小鼠)，或僅注射200微升PBS(對(duì)照小鼠)。其結(jié)果以抑制百分?jǐn)?shù)表示，并與抗gp39處理的動(dòng)物及對(duì)照動(dòng)物的每日DAS記分全部記分?jǐn)?shù)比較。
圖2顯示的結(jié)果表明在給小鼠注射PLP肽后最晚7天施用首副劑量的抗gp39抗體，導(dǎo)致對(duì)該病的抑制達(dá)60％以上。因此，抗gp39抗體能夠逆轉(zhuǎn)或抑制EAE。
該結(jié)果進(jìn)一步表明即使在誘導(dǎo)小鼠發(fā)病后僅7天施用首副劑量的抗體導(dǎo)致對(duì)發(fā)病的抑制作用，當(dāng)首副劑量的抗體于誘發(fā)該病后越早施用gp39抗體則效果會(huì)更好些。
因此，給小鼠施用抗gp39抗體能防止小鼠在誘導(dǎo)EAE時(shí)發(fā)生該病并對(duì)患EAE小鼠的EAE起抑制作用。實(shí)施例3在gp39處理的小鼠的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移后EAE的抑制已檢測(cè)了從EAE復(fù)康的Lewis大鼠調(diào)節(jié)抑制性T細(xì)胞(Pesoa等，J.Neuroimmunol.7131，1984)并檢測(cè)了口服卵磷脂成分后的抑制性T細(xì)胞(Lider等，J.Immunol.142748，1989；Hafler等，Ann.NY Acad.Sci.636251，1991)。據(jù)Karpus和Swanborg(J.Immunol.1433492，1989)的推斷，從EAE復(fù)康的大鼠分離的CD4+抑制性T細(xì)胞可通過(guò)對(duì)淋巴因子生成的差異抑制調(diào)減EAE T效應(yīng)細(xì)胞。相反，通過(guò)口服MBP來(lái)抑制Lewis大鼠的EAE是受CD8+T細(xì)胞調(diào)節(jié)的(Miller等，J.Exp.Med.174791，1991)。為確定是否通過(guò)施用抗gp39抗體而防止了EAE的小鼠的T細(xì)胞能夠防止新受試動(dòng)物患EAE進(jìn)行了下述實(shí)施例。
在此實(shí)施例中，按照實(shí)施例1所述方案給第一組小鼠注射了150微克PLP并給第二組小鼠注射了150微克PLP和抗gp39抗體。四個(gè)月后，用二氧化碳安樂(lè)死法處死這些小鼠并取脾臟。用標(biāo)準(zhǔn)氯化銨處理除去紅細(xì)胞(Mishell和Shiigi，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Company，1980)。將來(lái)自個(gè)體脾臟的細(xì)胞(500微升)靜脈輸注給新受試的5Gy灌注的受體雌性SLJ/j小鼠(10-12周齡)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移兩天后，按照實(shí)施例1所述方法通過(guò)腹腔內(nèi)注射150微克PLP肽激發(fā)小鼠并確定DAS記分?jǐn)?shù)。
圖3顯示所述動(dòng)物的DAS記分?jǐn)?shù)。此結(jié)果表明接受來(lái)自最初經(jīng)PLP肽和抗gp39抗體注射的動(dòng)物的脾細(xì)胞移植的小鼠得到保護(hù)而免于發(fā)生所述疾病，而接受來(lái)自最初僅經(jīng)PLP肽注射的動(dòng)物之脾細(xì)胞移植的小鼠則發(fā)生EAE。而且，考慮到估計(jì)的抗體半衰期是12天，認(rèn)為在所述小鼠中被轉(zhuǎn)移的脾細(xì)胞中沒(méi)有抗體存在。因此，不能通過(guò)抗gp39抗體的存在解釋來(lái)自受PLP肽和抗gp39抗體注射的動(dòng)物供體脾細(xì)胞提供的防護(hù)作用。這些小鼠的DAS記分?jǐn)?shù)表明受體小鼠中的EAE的抑制最可能是由于在轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞懸液中存在的T抑制細(xì)胞群并且所述T抑制細(xì)胞群的作用有效壓倒T效應(yīng)細(xì)胞群。實(shí)施例4gp39陽(yáng)性Th細(xì)胞的檢測(cè)本實(shí)施例證明在患多發(fā)性硬化癥的人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在gp39陽(yáng)性細(xì)胞。
人尸體解剖中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)從荷蘭的阿姆斯特丹的荷蘭腦庫(kù)獲得。按照本行業(yè)所知的方法用CD40-Ig融合蛋白檢測(cè)gp39陽(yáng)性細(xì)胞。用CD40-Ig對(duì)一例MS患者和一例Alzheimer患者的CNS組織切片染色。在此實(shí)施例中，僅使用事先對(duì)其中的抗MBP抗體形成細(xì)胞做過(guò)檢測(cè)的MS患者的CNS組織。染色結(jié)果顯示在MS患者的8微米冠狀大腦切片中存在gp39陽(yáng)性細(xì)胞，但是在Alzheimer患者的冠狀大腦切片中沒(méi)有檢測(cè)到gp39陽(yáng)性細(xì)胞。因此，僅在MS患者的CNS組織切片中檢測(cè)到gp39陽(yáng)性細(xì)胞。在MS患者CNS組織中存在gp39陽(yáng)性細(xì)胞以及僅在MS患者CNS組織中檢測(cè)到抗MBP抗體形成細(xì)胞而在對(duì)照的CNS組織中卻沒(méi)有檢測(cè)到該細(xì)胞表明此類細(xì)胞在MS患者的病理學(xué)上受累的CNS組織中起作用。
在此研究中，我們已經(jīng)表明施用抗gp39Mabs對(duì)激活B細(xì)胞的抑制可導(dǎo)致對(duì)EAE發(fā)生的徹底防護(hù)，而EAE的發(fā)生取決于誘導(dǎo)EAE的抗原劑量并取決于誘導(dǎo)EAE與施用抗gp39Mabs之間的時(shí)間間隔。雖然尚不清楚與EAE誘導(dǎo)和發(fā)生有關(guān)的確切機(jī)制，所述資料表明可將抗gp39抗體用于治療自身免疫病。等價(jià)物熟悉本行業(yè)的人員將知道，或能夠肯定僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)時(shí)，本文所描述的發(fā)明之具體實(shí)施方案有許多等價(jià)物。所述等價(jià)物是要包括在下述權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的方法，包括給被試者施用一種治療上或預(yù)防上有效量的T細(xì)胞表面受體的拮抗劑，所述受體介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能。
2.一種權(quán)利要求1的方法，其中T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病選自多發(fā)性硬化癥、EAE、I型糖尿病、卵巢炎和甲狀腺炎。
3.一種權(quán)利要求1的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病是多發(fā)性硬化癥。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述介導(dǎo)接觸依賴型輔助細(xì)胞效應(yīng)物功能的T細(xì)胞表面上的受體是gp39。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述拮抗劑是一種抗gp39抗體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗gp39抗體是單克隆抗體。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗gp39抗體是抗人gp39抗體。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述單克隆抗體產(chǎn)生于89-76雜交瘤、其ATCC保藏號(hào)為HB11713或24-31雜交瘤、其ATCC保藏號(hào)為HB11712或一種具有其所述gp39結(jié)合特征的抗體。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述單克隆抗體是一種嵌合的單克隆抗體。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述單克隆抗體是一種人源化的單克隆抗體。
11.一種治療多發(fā)性硬化癥的方法，包括給被試者施用治療有效量的抗人gp39抗體。
全文摘要
描述多發(fā)性硬化癥和其他T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病的治療方法。該方法涉及給被試者施用有效治療劑量的T細(xì)胞表面受體拮抗劑,例如抗－gp39抗體,所述T細(xì)胞介導(dǎo)接觸依賴型輔助效應(yīng)功能。
文檔編號(hào)A61P37/06GK1192156SQ96195877
公開日1998年9月2日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者R·J·諾勒, E·克拉森 申請(qǐng)人:達(dá)特茅斯學(xué)院理事, 荷蘭應(yīng)用自然科學(xué)研究組織