專利名稱：得自粘膜炎莫拉氏菌的basb027蛋白和basb027基因、抗原、抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(本文稱為“BASB027多核苷酸”)、由所述多核苷酸編碼的多肽(本文稱為“BASB027”或“BASB027多肽”)、生產(chǎn)它們的重組材料和方法。在另一方面，本發(fā)明涉及使用這樣的多肽和多核苷酸的方法，包括對抗細(xì)菌感染的疫苗。在再一方面，本發(fā)明涉及檢測某些病原體感染的診斷測試。
背景技術(shù)：
粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)(也稱為卡他布蘭漢氏菌(Branhamella catarrhalis))是經(jīng)常從人類上呼吸道分離到的革蘭氏陰性細(xì)菌。它引起幾種病狀，主要有嬰兒和兒童中的中耳炎以及上了年紀(jì)的人中的肺炎。它還引起鼻竇炎、醫(yī)院感染，并且不經(jīng)常地引起侵襲性疾病。
從病例數(shù)量以及潛在的后遺癥來看，中耳炎是一種重要的兒童期疾病。在美國每年記錄到超過3.5百萬病例，并且估計80％的兒童在達(dá)到3歲以前至少經(jīng)歷一次耳炎發(fā)作(Klein,JO(1994)Clin.Inf.Dis19:823)。當(dāng)該疾病未得到治療或變成慢性時，可能導(dǎo)致暫時的聽力損失(在液體在中耳積累的情況下)或永久的聽力損失(如果聽覺神經(jīng)受到損傷)。在嬰兒中，這樣的聽力損失可能引起語言學(xué)習(xí)延遲。
從患中耳炎的兒童的中耳主要分離出三種細(xì)菌物種肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，無法定型的(non typeable)流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)以及粘膜炎莫拉氏菌。它們存在于60％到90％的病例中。最近研究的綜述顯示肺炎鏈球菌和NTHi各自代表了約30％的中耳炎病例，而粘膜炎莫拉氏菌代表了約15％的中耳炎病例(Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。從中耳也可以分離到其它細(xì)菌(B型流感嗜血桿菌、釀膿鏈球菌(S.pyogenes)等)，但頻率低得多(2％的病例或更少)。
流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明對于在中耳中發(fā)現(xiàn)的病原體，在上呼吸道中建群(colonization)是發(fā)展成耳炎的絕對必要條件；然而也需要其它必要條件以導(dǎo)致疾病(Dickinson,DP等人(1988)J.Infect.Dis.158:205,Faden,HL等(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol,100:612)。這些對于觸發(fā)細(xì)菌通過咽鼓管遷移到中耳、隨后起始炎癥過程是重要的。這些因素是迄今未知的。已經(jīng)假設(shè)，例如，在病毒感染后免疫系統(tǒng)的短暫異常可能導(dǎo)致不能控制在呼吸道建群(Faden,HL等(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。另外一種解釋是，暴露于環(huán)境因子使得一些孩子更大量地建群，這些孩子由于中耳病原體的持續(xù)存在而隨后變得易于發(fā)展中耳炎(Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。
針對粘膜炎莫拉氏菌的免疫應(yīng)答尚未得到很好的特征鑒定。對從0到2歲跟蹤的嬰兒的鼻咽中順序分離到的菌株的分析指出他們頻繁地獲得并除去新菌株。這指出，在已建群的兒童中建立了對抗這種細(xì)菌的有效免疫應(yīng)答(Faden,HL等(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。
在大多數(shù)測試過的成人中，已經(jīng)鑒定了殺細(xì)菌抗體(Chapman,AJ等(1985)J.Infect Dis.151:878)。粘膜炎莫拉氏菌的菌株在它們抵抗血清殺菌活性的能力上存在變異一般說來，得自患病個體的分離物比得自僅僅已建群的個體的分離物更具有抗性(Hol,C等(1993)Lancet 341:1281,Jordan,KL等(1990)Am.J.Med.88(增刊5A):28S)。因此可以將血清抗性看作是所述細(xì)菌的毒力因子。在從中耳炎恢復(fù)的兒童的血清中已經(jīng)觀察到調(diào)理活性。
除了OMP B1(一種表達(dá)由鐵調(diào)節(jié)的84kDa蛋白，它被患有肺炎的患者的血清識別(Sethi,S.等(1995)Infect.Immun.63:1516))和UspA1以及UspA2(Chen D.等(1999),Infect.Immun.67:1310)外，還沒有鑒定出在人體中由這些不同的免疫應(yīng)答所靶向的抗原。
幾種其它存在于粘膜炎莫拉氏菌表面的膜蛋白已經(jīng)使用生化方法進(jìn)行了特征鑒定，或已經(jīng)鑒定了它們在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫中的潛在關(guān)聯(lián)(綜述見Murphy,TF(1996)Microbiol Rev.60:267)。在小鼠肺炎模型中，對抗一些所述蛋白(UspA,CopB)而產(chǎn)生的抗體的存在促進(jìn)更快地清除肺部感染。另一種多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守，并且與銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的膜孔蛋白存在同源性，已經(jīng)顯示該膜孔蛋白在動物模型中有效對抗所述細(xì)菌。
在過去幾十年中，粘膜炎莫拉氏菌感染的頻率已經(jīng)急劇上升。這已經(jīng)歸因于具有多種抗生素抗性菌株的出現(xiàn)以及免疫系統(tǒng)削弱的人群增加。分離到抵抗一些或所有標(biāo)準(zhǔn)抗生素的粘膜炎莫拉氏菌菌株已經(jīng)不再是不尋常的事。這種現(xiàn)象已經(jīng)創(chuàng)造了亟待滿足的針對該生物的新型抗微生物劑、疫苗、藥物篩選方法以及診斷測試的醫(yī)療需要與需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及BASB027，尤其是BASB027多肽和BASB027多核苷酸，生產(chǎn)它們的重組材料和方法。在另一方面，本發(fā)明涉及使用這樣的多肽和多核苷酸的方法，其中包括預(yù)防和治療微生物疾病。在再一方面，本發(fā)明涉及用于檢測與微生物感染有關(guān)的疾病以及與這樣的感染有關(guān)的病癥的診斷測試，例如檢測BASB027多核苷酸或多肽的表達(dá)或活性的測試。
通過閱讀下面的描述并閱讀本發(fā)明公開內(nèi)容的其它部分，在所公開的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將是非常明顯的。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及如下文更詳細(xì)描述的BASB027多肽和多核苷酸。本發(fā)明尤其涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB027的多肽和多核苷酸，所述粘膜炎莫拉氏菌的BASB027與腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)OMP85外膜蛋白在氨基酸序列同源性上相關(guān)。本發(fā)明特別涉及具有SEQ ID NO:1或3以及SEQ ID NO:2或4分別陳述的核苷酸序列以及氨基酸序列的BASB027?？梢岳斫?，在下面序列表中列舉為“DNA”的序列代表了本發(fā)明的一個實施方案的范例，因為一般技術(shù)人員將認(rèn)識到這樣的序列可以有用地普遍使用于多核苷酸，包括核糖多核苷酸(ribopolynucleotide)。多肽在本發(fā)明的一方面，提供了本文稱為“BASB027”和“BASB027多肽”的粘膜炎莫拉氏菌的多肽及其在生物學(xué)上、診斷上、預(yù)防上、臨床上或治療上有用的變異體，以及包含上述多肽、其變異體的組合物。
本發(fā)明還提供(a)分離的多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列有至少85％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、最優(yōu)選至少97-99％或完全同一性的氨基酸序列；(b)由分離的多核苷酸編碼的多肽，所述分離的多核苷酸包含分別在SEQ ID NO:1或3的全長上與SEQ ID NO:1或3有至少85％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99％或完全同一性的多核苷酸序列；或(c)由分離的多核苷酸編碼的多肽，所述分離的多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列有至少85％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、最優(yōu)選至少97-99％或完全同一性的多肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:2或4中提供的BASB027多肽是得自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC43617)的BASB027多肽。
本發(fā)明還提供了BASB027多肽的免疫原性片段，即與包含SEQID NO:2或4的氨基酸序列的多肽具有相同或基本相同免疫原性的BASB027多肽的連續(xù)部分；這就是說，所述片段(如果需要，偶聯(lián)到載體上)能夠引起識別所述BASB027多肽的免疫應(yīng)答。這樣一種免疫原性片段可以包括例如缺失N端前導(dǎo)序列和/或跨膜結(jié)構(gòu)域和/或C端錨定結(jié)構(gòu)域的BASB027多肽。在優(yōu)選的方面，依照本發(fā)明的BASB027的免疫原性片段包含多肽的基本全部胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽在SEQ ID NO:2的全長上與SEQ ID NO:2或4有至少85％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、最優(yōu)選至少97-99％同一性。
一種片段是具有這樣的氨基酸序列的多肽所述氨基酸序列與本發(fā)明任何多肽的任何氨基酸序列部分但不是全部完全相同。就BASB027多肽而言，片段可以是“獨立式的”，或包含于更大的多肽中，在其中它們形成一個部分或區(qū)域，所述片段最優(yōu)選是作為單個更大多肽中的單個連續(xù)區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括例如具有部分SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或其變異體的截短多肽，例如包括氨基末端氨基酸序列和/或羧基末端氨基酸序列的連續(xù)的一系列殘基。也優(yōu)選由宿主細(xì)胞產(chǎn)生或在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的本發(fā)明的所述多肽的降解形式。更優(yōu)選的是特征在于結(jié)構(gòu)或功能屬性的片段，例如包含α-螺旋和形成α-螺旋的區(qū)、β-折疊和形成β-折疊的區(qū)、轉(zhuǎn)角和形成轉(zhuǎn)角的區(qū)、螺旋(coil)和形成螺旋的區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、α兩親性區(qū)、β兩親性區(qū)、柔性區(qū)(flexibleregion)、表面形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)以及高抗原指示區(qū)的片段。
其它優(yōu)選的片段包括分離的多肽，所述分離的多肽包含具有來自SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，或者所述分離的多肽包括從SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列上截去或缺失了至少15、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。
可以使用本發(fā)明多肽的片段通過肽合成來產(chǎn)生對應(yīng)的全長多肽；因此，可以使用這些片段作為產(chǎn)生本發(fā)明的全長多肽的中間體。
尤其優(yōu)選的是其中以任何組合取代、缺失或添加若干個、5-10個、1-5個、1-3個、1-2個或1個氨基酸的變異體。
本發(fā)明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白的形式，或可以是更大的蛋白(如前體蛋白或融合蛋白)的一部分。包括入添加的氨基酸序列常常是有利的，所述序列包括分泌序列或前導(dǎo)序列、原序列(pro-sequence)、幫助純化的序列(如多組氨酸殘基)或有助于重組生產(chǎn)過程中穩(wěn)定性的添加序列。此外，也考慮了添加外源多肽或脂質(zhì)尾部或多核苷酸序列，以增加最終分子的免疫原性潛力。
在一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程化的可溶性融合蛋白，所述融合蛋白包括本發(fā)明多肽或其片段，以及不同免疫球蛋白亞類(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的不同部分。作為免疫球蛋白優(yōu)選的是人類IgG(尤其是IgG1)的重鏈的恒定部分，其中融合發(fā)生在絞鏈區(qū)。在一個具體的實施方案中，可以簡單地通過插入一個可以用凝血因子Xa切割的切割序列而除去Fc部分。
此外，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及其用于藥物篩選、診斷和治療的應(yīng)用。本發(fā)明的再一方面還涉及編碼這樣的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可以在國際專利申請第WO94/29458號和WO94/22914號中找到。
所述蛋白可以化學(xué)綴合或作為重組融合蛋白而表達(dá)，以使得與非融合蛋白相比，在表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的水平增加。融合配偶體(partner)可以有助于提供T輔助細(xì)胞表位(免疫融合配偶體)，最好是被人識別的T輔助細(xì)胞表位，或者融合配偶體可以幫助以高于天然重組蛋白的產(chǎn)量表達(dá)所述蛋白(表達(dá)增強物)。所述融合配偶體最好同時是免疫融合配偶體和表達(dá)增強配偶體。
融合配偶體包括來自流感嗜血桿菌的蛋白D和來自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。另一種配偶體是稱為LytA的蛋白。最好使用所述分子的C端部分。Lyta得自肺炎鏈球菌，合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶-酰胺酶LytA(由lytA基因編碼{Gene,43(1986)第265-272頁})，該酶是特異性降解肽聚糖骨架中某些鍵的自溶素。LytA蛋白的C端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對膽堿或一些膽堿類似物(如DEAE)的親和性。已經(jīng)利用這種特性研制可用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。已經(jīng)描述了在氨基末端包含C-LytA片段的雜種蛋白的純化{Biotechnology:10,(1992)第795-798頁}。有可能使用在C末端發(fā)現(xiàn)的起始于殘基178的LytA分子的重復(fù)部分，如殘基188-305。
本發(fā)明還包括前面所述多肽的變異體，即由于保守的氨基酸置換而與前面所述多肽不同的多肽，在保守的氨基酸置換中一個殘基被具有相似特征的另一個殘基取代。典型的這樣的取代發(fā)生在Ala、Val、Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香族殘基Phe和Tyr之間。
可以以任何合適方法制備本發(fā)明的多肽。這樣的多肽包括分離的天然出現(xiàn)的多肽、重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽或通過這些方法的組合產(chǎn)生的多肽。制備這樣的多肽的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。
最優(yōu)選本發(fā)明的多肽得自粘膜炎莫拉氏菌，然而，所述多肽優(yōu)選得自同一分類學(xué)屬的其它生物。例如，本發(fā)明的多肽也可以得自同一分類學(xué)科或目的生物。多核苷酸本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供編碼BASB027多肽的多核苷酸，尤其是編碼本文稱為BASB027的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸包括編碼BASB027多肽的區(qū)，所述區(qū)包含SEQ ID NO:1或3中陳述的序列，所述序列包括全長的基因或其變異體。
在SEQ ID NO:1或3中提供的BASB027多核苷酸是得自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC43617)的BASB027多核苷酸。
作為本發(fā)明的再一方面，提供了編碼和/或表達(dá)BASB027多肽和多核苷酸、尤其是粘膜炎莫拉氏菌BASB027多肽和多核苷酸的分離的核酸分子，包括例如未加工的RNA、核酶RNA、mRNA、cDNA、基因組DNA、B-DNA和Z-DNA。本發(fā)明的其他實施方案包括在生物學(xué)上、診斷上、預(yù)防上、臨床上或治療上有用的多核苷酸和多肽及它們的變異體，以及包含所述多核苷酸和多肽的組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及包括至少一個全長基因的分離的多核苷酸、與其密切相關(guān)的多核苷酸以及所述分離的多核苷酸的變異體，其中所述分離的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2或4推導(dǎo)的氨基酸序列的BASB027多肽。
在另一個本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，有得自粘膜炎莫拉氏菌的BASB027多肽或其變異體，所述BASB027多肽包括SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列組成。
使用本文提供的信息，如在SEQ ID NO:1或3中陳述的多核苷酸序列，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法獲得編碼BASB027多肽的本發(fā)明的多核苷酸，所述方法如用粘膜炎莫拉氏菌Catlin細(xì)胞作為起始材料，從細(xì)菌克隆和染色體DNA片段并對其測序，隨后獲得全長的克隆的方法。例如，為獲得本發(fā)明的核苷酸序列，如在SEQ ID NO:1或3中給出的多核苷酸序列，通常用放射標(biāo)記的寡核苷酸探測粘膜炎莫拉氏菌Caltin染色體DNA在大腸桿菌或一些其它合適宿主中的克隆的文庫，其中所述寡核苷酸得自部分序列，最好是17聚體(17-mer)或更長。然后可以使用嚴(yán)格的雜交條件，辨別出帶有與探針相同DNA的克隆。通過用根據(jù)原始多肽或多核苷酸序列設(shè)計得到的測序引物進(jìn)行雜交鑒定出克隆，對如此鑒定的各個克隆測序，則有可能在兩個方向延伸所述多核苷酸序列以確定全長的基因序列。方便的是例如使用由質(zhì)粒克隆制備的變性雙鏈DNA進(jìn)行這樣的測序。Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook等，MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)描述了合適的技術(shù)(尤其見“雜交篩選1.90”和“變性雙鏈DNA模板的測序13.70”)。也可以進(jìn)行直接的基因組DNA測序以獲得全長的基因序列。作為本發(fā)明的說明，在SEQ ID NO:1或3中陳述的每個多核苷酸都在得自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文庫中發(fā)現(xiàn)。
此外，在SEQ ID NO:1或3中陳述的每個DNA序列都包含一個可讀框，所述可讀框編碼具有大約SEQ ID NO:2或4中陳述數(shù)目的所述氨基酸殘基的蛋白，所述蛋白推測的分子量可以使用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的氨基酸殘基分子量值計算出來。
SEQ ID NO:1的多核苷酸，在SEQ ID NO:1的核苷酸號1的起始密碼子和開始于核苷酸號2440的終止密碼子之間，編碼SEQ ID NO:2多肽。
SEQ ID NO:3的多核苷酸，在SEQ ID NO:3的核苷酸號1的起始密碼子和開始于核苷酸號2440的終止密碼子之間，編碼SEQ ID NO:4多肽。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含以下序列或由下列序列組成的分離的多核苷酸(a)多核苷酸序列，分別在SEQ ID NO:1或3的全長上與SEQ IDNO:1或3有至少85％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99％或完全同一性；或(b)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽分別在SEQ ID NO:2或4的全長上與SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列有至少85％同一性、優(yōu)選至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％同一性、甚至更優(yōu)選至少97-99％或100％完全同一性。
可以通過一種方法獲得編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，包括得自除了粘膜炎莫拉氏菌以外的物種的同源物和ortholog，所述方法包括下列步驟在嚴(yán)格條件下(例如，使用45-65℃范圍內(nèi)的溫度和從0.1％到1％的SDS濃度)，用包含或由SEQ ID NO:1或3的序列或它們的片段組成的標(biāo)記或可檢測探針篩選合適的文庫；并分離包含所述多核苷酸序列的全長基因和/或基因組克隆。
本發(fā)明提供了在全長上與SEQ ID NO:1或3中的編碼序列(可讀框)相同的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供了成熟多肽或其片段的編碼序列本身，以及與另一個編碼序列符合讀框地共同存在的成熟多肽或其片段的編碼序列，所述另一個編碼序列如編碼前導(dǎo)序列或分泌序列、前蛋白(pre-protein)序列、原蛋白(pro-protein)序列或前原蛋白(prepro-protein)序列的序列。本發(fā)明的多核苷酸還可以包括至少一個非編碼序列，所述非編碼序列包括例如但不限于至少一個非編碼5’和3’序列，如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列、終止信號(如依賴于rho的終止信號和不依賴于rho的終止信號)、核糖體結(jié)合位點、Kozak序列、穩(wěn)定mRNA的序列、內(nèi)含子以及聚腺苷酸化信號。所述多核苷酸序列也可以包含編碼添加的氨基酸的添加的編碼序列。例如，可以編碼方便純化融合蛋白的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述標(biāo)記序列是在pQE載體(Qiagen,Inc.)中提供并在Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86:821-824 (1989)中描述的六組氨酸肽，或HA肽標(biāo)記物(Wilson等，Cell37:767(1984)，這兩種標(biāo)記序列都可以用于純化與它們?nèi)诤系亩嚯男蛄小１景l(fā)明的多核苷酸也包括但不限于包括結(jié)構(gòu)基因以及與其天然相連的控制基因表達(dá)的序列的多核苷酸。
編碼SEQ ID NO:2或4的BASB027多肽的核苷酸序列可以與分別包含在SEQ ID NO:1或3的核苷酸1-2439中的多肽編碼序列相同。或者它可以是這樣的序列作為遺傳密碼的豐余性(簡并性)的結(jié)果，也編碼SEQ ID NO:2或4的多肽。
如本文所用的術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”包括這樣的多核苷酸所述多核苷酸包括編碼本發(fā)明多肽的序列，其中所述本發(fā)明多肽尤其是細(xì)菌多肽，更尤其是具有SEQ ID NO:2或4陳述的氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB027的多肽。該術(shù)語也包括包含編碼所述多肽的單個連續(xù)區(qū)或不連續(xù)的多個區(qū)(例如，被整合的噬菌體、整合的插入序列、整合的載體序列、整合的轉(zhuǎn)座子序列打斷的多核苷酸，或由于RNA編輯或基因組DNA再組織而打斷的多核苷酸)的多核苷酸以及添加的區(qū)，所述添加的區(qū)也可以包含編碼序列和/或非編碼序列。
本發(fā)明還涉及本文所述的多核苷酸的變異體，所述變異體編碼具有SEQ ID NO:2或4的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽的變異體。本發(fā)明的多核苷酸片段可以用于例如合成本發(fā)明的全長多核苷酸。
更特別優(yōu)選的實施方案是編碼BASB027變異體的多核苷酸，所述BASB027變異體具有SEQ ID NO:2或4的BASB027多肽的氨基酸序列，在所述氨基酸序列中若干個、幾個、5到10個、1到5個、1到3個、2個、1個或0個氨基酸殘基以任意組合被取代、修飾、缺失和/或添加。在其中特別優(yōu)選的是不改變BASB027多肽的性質(zhì)和活性的沉默取代、添加和缺失。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案是這樣的多核苷酸以及與這樣的多核苷酸互補的多核苷酸所述多核苷酸在全長上與編碼具有SEQ IDNO:2或4陳述的氨基酸序列的BASB027多肽的多核苷酸至少85％相同?；蛘?，更高度優(yōu)選的是包括與編碼BASB027多肽的多核苷酸在全長上至少90％相同的區(qū)的多核苷酸，以及與其互補的多核苷酸。在這一方面，尤其優(yōu)選與上述多核苷酸在全長上至少95％相同的多核苷酸。此外，在那些至少95％相同的多核苷酸中至少97％相同的多核苷酸是高度優(yōu)選的，在其中更高度優(yōu)選至少98％和至少99％相同的多核苷酸，而至少99％相同的多核苷酸是最優(yōu)選的。
優(yōu)選的實施方案是編碼這樣的多肽的多核苷酸所述多肽基本保留了與SEQ ID NO:1或3的DNA編碼的成熟多肽同樣的生物功能或活性。
按照本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案，提供了與BASB027多核苷酸序列雜交、尤其是在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸，如SEQ ID NO:1或3中的那些多核苷酸。
本發(fā)明還涉及與本文提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。在這一方面，本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本文所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格條件”和“嚴(yán)格雜交條件”是指只有在序列間有至少95％、最好97％同一性時才發(fā)生雜交。嚴(yán)格雜交條件的一個具體例子是在包含以下物質(zhì)的溶液中于42℃培育過夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯以及20微克/ml變性、剪切過的鮭魚精子DNA隨后在0.1×SSC中于約65℃下洗滌雜交支持體。雜交和洗滌的條件是眾所周知的，并在Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989)中，尤其是該書的第11章舉例說明。也可使用本發(fā)明提供的多核苷酸序列進(jìn)行溶液雜交。
本發(fā)明還提供了包括或由這樣的多核苷酸序列組成的多核苷酸，所述多核苷酸序列通過在嚴(yán)格雜交條件下，用探針在包含所述完整基因的合適文庫中篩選SEQ ID NO:1或3陳述的多核苷酸序列而獲得，其中所述探針具有SEQ ID NO:1或3中陳述的所述多核苷酸序列或其片段的序列；然后分離所述多核苷酸序列?？捎糜讷@得這樣一種多核苷酸的片段包括例如在本文中別處全面描述的探針和引物。
如本文別處關(guān)于本發(fā)明的多核苷酸測定所討論的，本發(fā)明的多核苷酸例如可以用作RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針，以分離編碼BASB027的全長cDNA和基因組克隆，以及分離與BASB027基因有高度同一性、尤其是高度序列同一性的其它基因的cDNA和基因組克隆。這樣的探針一般將包括至少15個核苷酸殘基或堿基對。這樣的探針最好具有至少30個核苷酸殘基或堿基對，可以具有至少50個核苷酸殘基或堿基對。尤其優(yōu)選的探針將具有至少20個核苷酸殘基或堿基對，并將具有少于30個核苷酸殘基或堿基對。
使用SEQ ID NO:1或3提供的DNA序列合成寡核苷酸探針，可以通過篩選分離BASB027基因的編碼區(qū)。然后用標(biāo)記寡核苷酸篩選cDNA文庫、基因組DNA文庫或mRNA文庫，確定所述探針雜交到文庫的哪個成員上，其中所述探針具有與本發(fā)明基因的序列互補的序列。
可用幾種方法獲得全長DNA或延伸短DNA，并且這幾種方法是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知的，例如基于cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)的那些方法(見例如Frohman等，PNAS USA 85:8998-9002,1988)的方法。該技術(shù)的最新改進(jìn)，例如以MarathonTM技術(shù)(ClonetechLaboratories Inc.)為例，已經(jīng)顯著簡化了尋求更長的cDNA。在MarathonTM技術(shù)中，由從選定組織提取的mRNA制備cDNA并在每個末端連接“連接物”序列。然后使用基因特異性和接頭特異性寡核苷酸引物的組合，進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)以擴(kuò)增所述DNA“丟失的”5’端。然后使用“嵌套”引物重復(fù)PCR反應(yīng)，所述“嵌套”引物即是設(shè)計在擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)退火的引物(一般是退火結(jié)合在連接物序列內(nèi)3’及其下游的連接物特異性引物和退火結(jié)合在所述選定基因內(nèi)5’及其上游的基因特異性引物)。然后可以通過DNA測序分析該反應(yīng)的產(chǎn)物，并或者通過將所述產(chǎn)物直接連接到已有DNA上以產(chǎn)生完整序列、或者通過使用新序列的信息設(shè)計5’引物以進(jìn)行另一個全長PCR，構(gòu)建全長DNA。
如本文關(guān)于多核苷酸測定所進(jìn)一步討論的，本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作例如發(fā)現(xiàn)對疾病、尤其是人類疾病治療和診斷的研究試劑和材料。
作為從SEQ ID NO:1或3的序列衍生的寡核苷酸的本發(fā)明的多核苷酸可以用于如本文所述的方法，但最好用于PCR中，以確定本發(fā)明鑒定的多核苷酸是否在感染組織中的細(xì)菌中完整地或部分地轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)認(rèn)識到這樣的序列也可以用于診斷病原體已經(jīng)達(dá)到的感染階段以及感染類型。
本發(fā)明還提供了編碼多肽的多核苷酸，所述多肽是還具有添加的氨基末端氨基酸或羧基末端氨基酸的成熟蛋白，或是在所述成熟多肽內(nèi)部添加了氨基酸的成熟蛋白(例如，當(dāng)所述成熟形式具有多于一條的多肽鏈時)。其中這樣的序列可以在蛋白從前體到成熟形式的加工中起作用，可以使得能進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，可以延長或縮短蛋白的半衰期，或可以便利蛋白測定或生產(chǎn)的操作。由于一般是在體內(nèi)的情況，因此可以通過細(xì)胞酶從所述成熟蛋白上加工除去所述添加的氨基酸。
對于本發(fā)明的每一種并且所有的多核苷酸，都提供了與之互補的多核苷酸。優(yōu)選這些互補多核苷酸與每一個它們與之互補的多核苷酸完全互補。
前體蛋白可能是所述多肽的無活性形式，在所述前體蛋白中所述多肽的成熟形式與一個或多個原序列(prosequence)融合。當(dāng)除去原序列時，這樣的無活性前體通常被激活。在激活前可以除去部分或所有的原序列。這樣的前體一般稱為原蛋白。
除用標(biāo)準(zhǔn)的A、G、C、T/U代表核苷酸外，還用字母“N”描述本發(fā)明的某些多核苷酸?！癗”表示四種DNA或RNA核苷酸中的任何一種均可以出現(xiàn)在DNA或RNA序列中的這樣一個指定位置上，但優(yōu)選N不是這樣的核酸當(dāng)與相鄰核苷酸位置組合時、當(dāng)以正確的可讀框閱讀時，具有在這樣的可讀框內(nèi)產(chǎn)生過早的終止密碼子的效果。
總之，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白、編碼加上前導(dǎo)序列的成熟蛋白(可以稱之為前蛋白)、編碼具有并非前蛋白的前導(dǎo)序列的一個或多個原序列的成熟蛋白的前體、或編碼前原蛋白，即具有前導(dǎo)序列和一個或多個原序列的原蛋白的前體，其中所述前導(dǎo)序列和原序列一般在產(chǎn)生所述多肽的有活性和成熟的形式的加工步驟中除去。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了本發(fā)明的多核苷酸用于治療或預(yù)防目的、尤其是基因免疫接種的用途。
在基因免疫接種中使用本發(fā)明的多核苷酸，將最好使用合適的傳送方法，如直接注射質(zhì)粒DNA進(jìn)肌肉(Wolff等，Hum Mol Genet(1992)1:363.Manthorpe等，Hum.Gene Ther(1983)4:419)、傳送與特異性蛋白載體復(fù)合的DNA(Wu等，J Biol Chem.(1989)264:16985)、用磷酸鈣共沉淀DNA(Benvenisty和Reshef,PNAS USA,(1986)83:9551)、將DNA包入各種形式的脂質(zhì)體內(nèi)(Kaneda等，Science(1989)243:375)、粒子轟擊(Tang等，Nature(1992)356:152,Eisenbraun等，DNA Cell Biol (1993)12:791)以及用克隆的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行體內(nèi)感染(Seeger等，PNAS USA(1984)81:5849)。載體、宿主細(xì)胞、表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及包含一種或多種本發(fā)明多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。也可以使用由本發(fā)明的DNA構(gòu)造物得到的RNA，用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生這樣的蛋白。
可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的方法，從包含表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程化的宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的重組多肽。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及包含一種或多種本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，涉及用這樣的表達(dá)系統(tǒng)遺傳工程化的宿主細(xì)胞，以及涉及通過重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。
為重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，可以遺傳工程化宿主細(xì)胞以引入本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)或其部分或多核苷酸?？梢圆捎迷谠S多標(biāo)準(zhǔn)實驗室手冊中描述的方法將多核苷酸引入所述宿主細(xì)胞，所述實驗室手冊如Davis等，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)和Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，所述方法如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)位、顯微注射、陽離子型脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、scrape loading、彈道引入(ballistic introduction)及感染。
合適宿主的有代表性的例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如鏈球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、腸球菌(enterococci)、大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌屬(streptomyces)、藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、腦膜炎奈瑟氏球菌和粘膜炎莫拉氏菌的細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母、克魯維酵母菌屬(Kluveromyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、擔(dān)子菌(basidiomycete)、白假絲酵母(Candida albicans)和曲霉屬(Aspergillus)的細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，如果蠅屬S2(Drosophila S2)和貪夜蛾屬Sf9(Spodoptera)Sf9的細(xì)胞；動物細(xì)胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞，如裸子植物或被子植物的細(xì)胞。
可以使用非常多種的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這樣的載體其中包括，染色體衍生的載體、附加體衍生的載體和病毒衍生的載體，例如，從細(xì)菌質(zhì)粒衍生的載體、從噬菌體衍生的載體、從轉(zhuǎn)座子衍生的載體、從酵母附加體衍生的載體、從插入元件衍生的載體、從酵母染色體元件衍生的載體、從病毒衍生的載體以及從它們的組合衍生的載體，如那些從質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件衍生的載體(如粘粒和噬菌粒)，其中所述病毒如桿狀病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和甲病毒屬(alphavirus)。所述表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)造物可以包含調(diào)節(jié)以及引發(fā)表達(dá)的控制區(qū)。一般地說，在這一方面，可以使用任何適于在宿主中維持、繁殖或表達(dá)多核苷酸和/或表達(dá)多肽的系統(tǒng)或載體以用于表達(dá)?？梢酝ㄟ^多種眾所周知的常規(guī)技術(shù)中的任何一種將合適的DNA序列插入所述表達(dá)系統(tǒng)中，所述常規(guī)技術(shù)如那些在Sambrook等，MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL，(見上文)中所陳述的技術(shù)。
在真核細(xì)胞中的重組表達(dá)系統(tǒng)中，為將翻譯后的蛋白分泌進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔、分泌進(jìn)壁膜間隙或分泌進(jìn)胞外環(huán)境，可以將合適的分泌信號引入所表達(dá)的多肽。這些信號對于所述多肽可以是內(nèi)源的，或者它們可以是異源信號。
可以通過眾所周知的方法，從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸提取、陰離子交換層析或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選使用離子金屬親和層析(IMAC)進(jìn)行純化。當(dāng)所述多肽在細(xì)胞內(nèi)合成、分離或純化的過程中變性時，可以使用眾所周知的重折疊蛋白的技術(shù)再生活性構(gòu)象。
所述表達(dá)系統(tǒng)也可以是重組的活微生物，如病毒或細(xì)菌?？梢詫⒛繕?biāo)基因插入活的重組病毒或細(xì)菌的基因組中。用該活載體接種和體內(nèi)感染將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。用于此目的的病毒和細(xì)菌有，例如痘病毒(如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒)、甲病毒屬(新培斯病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(SemlikiForest Virus)、委瑞內(nèi)拉馬腦脊髓炎病毒(Venezuelian EquineEncephalitis Virus))、腺病毒、腺伴隨病毒、細(xì)小核糖核酸病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘-帶狀皰疹病毒等)、利斯特菌氏屬(Listeria)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、卡介苗(BCG)。為獲得活體疫苗，這些病毒和細(xì)菌可以是有毒力的、或以各種方式減毒的。這樣的活體疫苗也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。診斷測定、預(yù)后測定、血清分型測定以及突變測定本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的BASB027多核苷酸及多肽作為診斷試劑的用途。在真核細(xì)胞、尤其是哺乳動物、特別是人類中檢測BASB027多核苷酸和/或多肽將提供對于疾病診斷、疾病分期或傳染性生物對藥物的反應(yīng)的診斷方法?？梢酝ㄟ^多種眾所周知的技術(shù)，以及通過本文提供的方法，在核酸或氨基酸水平上檢測真核生物、尤其是哺乳動物、特別是人類、其中尤其是受到或懷疑受到包含BASB027基因或蛋白的生物感染的人。
可以從推測受到感染和/或已經(jīng)受到感染的個體的身體材料中獲得用于預(yù)后、診斷或其它分析的多肽和多核苷酸。來自這些來源中任何一種的多核苷酸，尤其是DNA或RNA，可直接用于檢測或在分析前通過使用PCR或任何其它擴(kuò)增技術(shù)酶促擴(kuò)增。也可以按同樣方法使用RNA (尤其是mRNA)、cDNA和基因組DNA。使用擴(kuò)增，對個體中存在的傳染性生物或居留生物(resident organism)的物種和株系的特征鑒定，可以通過分析該生物選定多核苷酸的基因型而完成。與由相關(guān)生物選出的參考序列的基因型作比較，通過擴(kuò)增產(chǎn)物大小上的變化可以檢測缺失或插入，其中所述相關(guān)生物最好是同一屬的不同物種或同一物種的不同株系。通過將擴(kuò)增的DNA與標(biāo)記的BASB027多核苷酸序列雜交，可以鑒定點突變?？梢酝ㄟ^DNA酶或RNA酶消化(分別對于DNA或RNA而言)、或通過檢測解鏈溫度或復(fù)性動力學(xué)的差異，將完全配對序列或顯著配對序列與不完全錯配或更顯著錯配雙鏈體區(qū)分開來。也可以通過與參考序列相比，以多核苷酸片段在凝膠上的電泳遷移率的變化檢測多核苷酸序列的差異。這可以使用或不使用變性試劑進(jìn)行。也可以通過直接的DNA測序或RNA測序檢測多核苷酸差異。見例如Myers等，Science,230:1242(1985)。也可以通過核酸酶保護(hù)分析(如RNA酶、V1和S1保護(hù)分析)或化學(xué)切割方法揭示在特定位點的序列改變。見例如Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(1985)。
在另一實施方案中，可以構(gòu)建包含BASB027核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針的陣列，以進(jìn)行例如遺傳突變的有效篩選、血清分型、分類學(xué)分類或鑒定。陣列技術(shù)方法是眾所周知的并具有普遍應(yīng)用性，并可以用于解決分子遺傳學(xué)中的多種問題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖、以及遺傳變異性(見例如Chee等，Science,274:61O(1996))。
因此在另一方面，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，其中包括(a)本發(fā)明的多核苷酸，最好是SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列或其片段；(b)與(a)的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的多肽，最好是SEQ ID NO:2或4的多肽或其片段；或(d)針對本發(fā)明的多肽的抗體，最好是針對SEQ ID NO:2或4的多肽的抗體。
人們會認(rèn)識到，在任何這樣的試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以包含實質(zhì)性的成分。這樣的試劑盒將尤其在診斷疾病或診斷對疾病的易感性方面有用。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的多核苷酸作為診斷試劑。檢測與疾病或致病性有關(guān)的本發(fā)明多核苷酸(最好是SEQ ID NO:1或3)的突變形式，將提供可以幫助或確定疾病診斷、預(yù)測疾病病程、確定疾病階段、或?qū)膊〉囊赘行缘脑\斷工具，所述疾病源于所述多核苷酸的表達(dá)不足、過量表達(dá)或表達(dá)變化?？梢栽诙嗪塑账崴缴贤ㄟ^多種技術(shù)，如那些本文別處描述的技術(shù)，檢測在這樣的多核苷酸上帶有突變的生物、尤其是傳染性生物。
也可以通過多種技術(shù)，在多核苷酸或多肽水平上檢測來自在本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽上帶有突變或多態(tài)性(等位變異)的生物的細(xì)胞，以進(jìn)行例如血清分型。例如，可以使用RT-PCR檢測RNA中的突變。尤其優(yōu)選使用RT-PCR結(jié)合自動化檢測系統(tǒng)，例如GeneScan。RNA、cDNA或基因組DNA也可以經(jīng)PCR用于同樣目的。例如，可以使用與編碼BASB027多肽的多核苷酸互補的PCR引物鑒定和分析突變。
本發(fā)明還提供從5’和/或3’端除去1、2、3或4個核苷酸的引物。這些引物可以用于，尤其是，擴(kuò)增由個體得到的樣品(如身體材料)分離出的BASB027 DNA和/或RNA。所述引物可以用于擴(kuò)增從感染個體分離的多核苷酸，以便隨后可以通過各種技術(shù)研究所述多核苷酸以闡明所述多核苷酸序列。這樣，可以檢測到所述多核苷酸序列中的突變，并用于診斷和/或預(yù)測感染或其階段或病程，或者用于對所述傳染性病原體進(jìn)行血清分型和/或分類。
本發(fā)明還提供了用于診斷疾病、優(yōu)選是細(xì)菌感染、更優(yōu)選是粘膜炎莫拉氏菌導(dǎo)致的感染的方法，包括從得自個體的樣品(如身體材料)中測定具有SEQ ID NO:1或3的序列的多核苷酸的表達(dá)水平的增加?？梢允褂萌魏我环N本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的用于定量多核苷酸的方法，測定BASB027多核苷酸表達(dá)的增加或降低，所述方法如例如擴(kuò)增、PCR、RT-PCR、RNA酶保護(hù)、RNA印跡法、光譜測定法和其它雜交方法。
此外，根據(jù)本發(fā)明的用于檢測與正常對照組織樣品相比BASB027多肽過量表達(dá)的診斷測定，可以用于例如檢測感染的存在。可以用來測定從宿主得到的樣品(如身體材料)中BASB027多肽的水平的測定技術(shù)，對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是熟知的。這樣的分析方法包括放射免疫測定、競爭性結(jié)合測定、蛋白質(zhì)印跡分析、抗體夾心測定、抗體檢測和ELISA測定。
本發(fā)明的多核苷酸可以用作多核苷酸陣列、最好是高密度陣列或網(wǎng)格的成分。這些高密度陣列對于診斷和預(yù)測目的特別有用。例如，有一組點，每個點包括一個不同的基因，并且還包含一種或多種本發(fā)明多核苷酸，該組點可以用于探測，如通過使用雜交或核酸擴(kuò)增，使用從身體樣品獲得或衍生的探針，確定個體中特定多核苷酸序列或相關(guān)序列的存在。這樣一種存在可以指示病原體、尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在，并可以用于診斷和/或預(yù)測疾病或疾病的病程。優(yōu)選包括大量SEQ ID NO:1或3的多核苷酸序列的變異體的網(wǎng)格。還優(yōu)選包括大量編碼SEQ ID NO:2或4的多肽序列的多核苷酸的變異體的網(wǎng)格?？贵w本發(fā)明的多肽和多核苷酸或其變異體、或表達(dá)上述的細(xì)胞可以用作免疫原，以產(chǎn)生分別對這樣的多肽或多核苷酸免疫專一性的抗體。
在本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案中，提供了對抗BASB027多肽或多核苷酸的抗體。
可以使用常規(guī)方法，通過給予動物(最好不是人類)本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸、或二者中其中一種或兩種的帶有表位的片段、二者中其中一種或兩種的類似物、或表達(dá)二者中其中一種或兩種的細(xì)胞，獲得針對本發(fā)明的多肽或多核苷酸而產(chǎn)生的抗體。為制備單克隆抗體，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的任何技術(shù)。實例包括各種技術(shù)，如在以下文獻(xiàn)中的技術(shù)Kohler,G.和Milstein,C.,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today4:72(1983)；Cole等，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，第77-96頁，Alan R.Liss,Inc.(1985)。
可以修改產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利第4,946,778號)，以產(chǎn)生針對本發(fā)明的多肽或多核苷酸的單鏈抗體。此外，可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠、或其它生物或動物(如其它哺乳動物)表達(dá)對本發(fā)明的多肽或多核苷酸免疫專一性的人源化抗體。
另一方面，可以利用噬菌體展示技術(shù)，或者從根據(jù)帶有抗BSAB027而篩選出的人得到的PCR擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞v基因庫的所有組成成分中、或者從原初文庫(naive library)中，選擇對本發(fā)明的多肽有結(jié)合活性的抗體基因(McCafferty等，(1990).Nature 348,552-554；Marks等，(1992)Biotechnology 10,779-783)。也可以通過例如鏈改組，改善這些抗體的親和力(Clackson等，(1991)Nature 352:628)。
可以使用上述抗體來分離或鑒定表達(dá)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的克隆，以通過例如親和層析純化所述多肽或多核苷酸。
因此，其中可以使用對抗BASB027多肽或BASB027多核苷酸的抗體來治療感染，尤其是細(xì)菌感染。
多肽變異體包括在抗原上、表位上或免疫上等同的變異體，這些構(gòu)成本發(fā)明一個具體的方面。
最好修飾所述抗體及其變異體以使其在個體中免疫原性更低。例如，假如所述個體是人，那么最好“人源化”所述抗體，其中將雜交瘤衍生抗體的一個或多個互補決定區(qū)移植到人單克隆抗體中，例如在Jones等(1986),Nature 321,522-525或Tempest等，(1991)Biotechnology 9,266-273中所述。拮抗劑和激動劑-測定和分子也可以使用本發(fā)明的多肽和多核苷酸，評估小分子底物與配體在例如細(xì)胞、無細(xì)胞制備物、化學(xué)文庫以及天然產(chǎn)物混合物中的結(jié)合。這些底物和配體可以是天然底物和配體，或者可以是結(jié)構(gòu)模擬物或功能模擬物。見例如Coligan等，Current Protocols in Immunology1(2)第5章(1991)。
使用與候選化合物直接或間接結(jié)合的標(biāo)記，篩選方法可以僅測量所述候選化合物與所述多肽或多核苷酸的結(jié)合、或所述候選化合物與帶有所述多肽或多核苷酸的細(xì)胞或膜的結(jié)合、或所述候選化合物與帶有所述多肽的融合蛋白的細(xì)胞或膜的結(jié)合。或者，所述篩選方法涉及與標(biāo)記的競爭物的競爭。此外，使用對于包含所述多肽或多核苷酸的細(xì)胞合適的檢測系統(tǒng)，這些篩選方法可以測試所述候選化合物是否導(dǎo)致由于所述多肽或多核苷酸的激活或抑制而產(chǎn)生的信號。一般在一種已知激動劑的存在下測定激活的抑制物，并觀察在所述候選化合物存在下所述激動劑對激活的效應(yīng)。組成型有活性的多肽和/或組成型表達(dá)的多肽和多核苷酸可以用于篩選逆向激動劑或抑制劑的篩選方法中在缺乏激動劑或抑制物的情況下，根據(jù)具體情況測試所述候選化合物是否導(dǎo)致對所述多肽或多核苷酸的激活的抑制。此外，所述測試方法可以僅包括以下步驟將候選化合物與含有本發(fā)明的多肽或多核苷酸的溶液混合，形成混合物，測定所述混合物中BASB027多肽和/或多核苷酸活性，并將所述混合物的BASB027多肽和/或多核苷酸活性與標(biāo)準(zhǔn)的活性作比較。也可以使用融合蛋白，例如如前文所述那些由Fc部分和BASB027多肽制成的融合蛋白，進(jìn)行高通過量篩選測定，以鑒定本發(fā)明多肽的拮抗劑、以及系統(tǒng)發(fā)生上和/或功能上相關(guān)多肽的拮抗劑(見D.Bennett等，JMol Recognition,8:52-58(1995)；和K.Johanson等，J Biol Chem,270(16):9459-9471(1995))。
也可以使用所述多核苷酸、多肽以及結(jié)合本發(fā)明多肽和/或與本發(fā)明多肽相互作用的抗體來配置篩選方法，以測試添加的化合物對細(xì)胞中mRNA和/或多肽的產(chǎn)生的效應(yīng)。例如，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用單克隆抗體和多克隆抗體，可以構(gòu)建ELISA測定以測定多肽的分泌水平或細(xì)胞相關(guān)水平。這可以用于從適當(dāng)操作過的細(xì)胞或組織中發(fā)現(xiàn)可能抑制或增強多肽產(chǎn)生的試劑(也分別稱為拮抗劑或激動劑)。
本發(fā)明還提供了篩選化合物的方法，以鑒定那些增強(激動劑)或阻斷(拮抗劑)BASB027多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是那些制菌和/或殺菌的化合物。所述篩選方法涉及高通過量技術(shù)。例如，為篩選激動劑或拮抗劑，在存在或不存在可能是BASB027激動劑或拮抗劑的候選分子的情況下，將包含BASB027多肽的合成反應(yīng)混合物、細(xì)胞區(qū)室(如膜、胞外被膜或細(xì)胞壁、或它們中任何一種的制備物)與所述多肽的標(biāo)記底物或配體一起溫育。候選分子激動或拮抗BASB027多肽的能力反映在標(biāo)記配體的結(jié)合減少或從這樣的底物生產(chǎn)產(chǎn)物減少。無償結(jié)合的分子，即不誘導(dǎo)BASB027多肽的效應(yīng)的分子很有可能是好的拮抗劑。結(jié)合很好并且根據(jù)具體情況，增加從底物生產(chǎn)產(chǎn)物的速、增加信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或增加化學(xué)通道活性的分子是激動劑。使用報告系統(tǒng)，可以增強(根據(jù)具體情況)對由底物產(chǎn)生產(chǎn)物、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或化學(xué)通道活性的速率或水平的檢測。在這一方面可能有用的報告系統(tǒng)包括但不限于比色法、標(biāo)記底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物、對于BASB027多核苷酸或多肽的活性變化作出應(yīng)答的報告基因、以及本領(lǐng)域內(nèi)已知的結(jié)合測定。
測定BASB027激動劑的另一個例子是競爭性測定，即將BASB027和可能的激動劑與BASB027結(jié)合分子、重組BASB027結(jié)合分子、天然底物或配體、或底物或配體模擬物在合適條件下混合，以進(jìn)行競爭性抑制分析?？梢酝ㄟ^如放射性或顯色化合物來標(biāo)記BASB027，以便可以準(zhǔn)確測定與結(jié)合分子結(jié)合或轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的BASB027分子的數(shù)量，以評估所述可能的拮抗劑的有效性。
可能的拮抗劑其中包括，結(jié)合本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽并因此抑制或消除其活性或表達(dá)的小有機分子、肽、多肽以及抗體?？赡艿霓卓箘┻€可以是小有機分子、肽、多肽，如結(jié)合在結(jié)合分子(如結(jié)合分子)上相同位點的密切相關(guān)的蛋白或抗體，所述蛋白或抗體同時不誘導(dǎo)BASB027所誘導(dǎo)的活性，因此通過排除BASB027多肽和/或多核苷酸使其不能結(jié)合而防止BASB027多肽和/或多核苷酸的作用或表達(dá)。
可能的拮抗劑包括這樣的小分子所述小分子結(jié)合并占據(jù)所述多肽的結(jié)合位點、因此防止其結(jié)合到細(xì)胞結(jié)合分子，以致防止正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小有機分子、肽或肽樣分子。其它可能的拮抗劑包括反義分子(見Okano,J.Neurochem.56:560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSEINHIBITORSOF GENE EXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)對這些分子的描述)。優(yōu)選的可能拮抗劑包括與BASB027相關(guān)的化合物以及BASB027的變異體。
在再一方面，本發(fā)明涉及遺傳工程化的可溶性融合蛋白，所述蛋白包括本發(fā)明的多肽或其片段，以及不同亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的不同部分。作為免疫球蛋白優(yōu)選人類IgG(尤其是IgGl)的重鏈的恒定部分，其中融合發(fā)生在絞鏈區(qū)。在具體的實施方案中，可以通過插入能用凝血因子Xa切割的切割序列來簡單地除去Fc部分。此外，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及所述融合蛋白用于藥物篩選、診斷和治療的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面還涉及編碼這樣的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可以在國際專利申請第WO94/29458號和第WO94/22914號中發(fā)現(xiàn)。
本文提供的每一種多核苷酸序列都可以用于發(fā)現(xiàn)和研制抗細(xì)菌化合物。在表達(dá)后，所編碼的蛋白可以用作篩選抗細(xì)菌藥物的靶。此外，相應(yīng)的mRNA上編碼所述編碼蛋白氨基末端區(qū)的多核苷酸序列、或Shine-Delgarno或其它便利翻譯的序列可以用于構(gòu)建控制目的編碼序列表達(dá)的反義序列。
本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動劑或拮抗劑來干擾一種病原體或多種病原體與真核宿主、最好是哺乳動物宿主之間導(dǎo)致感染后遺癥的初始物理相互作用。本發(fā)明的分子尤其可以用于防止細(xì)菌、尤其是革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌附著到留置裝置上真核生物、最好是哺乳動物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，或附著到傷口中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；阻斷介導(dǎo)組織損傷的真核生物、最好是哺乳動物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)菌BASB027蛋白間的細(xì)菌附著，和/或；阻斷除了由于植入留置裝置或其它外科技術(shù)以外引發(fā)的感染中發(fā)病機理的正常進(jìn)行。
按照本發(fā)明的再一方面，提供了BASB027激動劑和拮抗劑，最好是制菌或殺菌的激動劑和拮抗劑。
本發(fā)明的拮抗劑和激動劑也可以用于例如預(yù)防、抑制和/或治療疾病。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明多肽的mimotope。mimotope是與天然肽足夠相似(序列上或結(jié)構(gòu)上)的肽序列，能夠被識別天然肽的抗體識別；或者當(dāng)偶聯(lián)到合適載體時，能夠產(chǎn)生識別天然肽的抗體。
可以通過添加、缺失或取代選定的氨基酸而設(shè)計肽mimotope用于特定用途。因此，可以為了易于綴合于蛋白載體而修飾所述肽。例如，一些化學(xué)綴合方法可能需要包括一個末端半胱氨酸。此外，與蛋白載體綴合的肽可能需要在所述肽綴合末端遠(yuǎn)處包括一個疏水末端，以便所述肽游離的未結(jié)合末端保持與載體蛋白的表面結(jié)合。因此使所述肽呈現(xiàn)出這樣的構(gòu)象所述構(gòu)象與在完整的天然分子中發(fā)現(xiàn)的所述肽的構(gòu)象最密切相似。例如，可以改變所述肽使其具有一個N末端半胱氨酸和一個C末端疏水性酰胺化尾?；蛘?，可以進(jìn)行一個或多個氨基酸的D-立體異構(gòu)體的添加或取代，以產(chǎn)生有益的衍生物，例如以增強所述肽的穩(wěn)定性。
或者，使用如噬菌體展示技術(shù)(EP 0 552 267 B1)的技術(shù)，用本身能夠結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體，可以鑒定肽mimotope。該技術(shù)產(chǎn)生了大量模擬天然肽的結(jié)構(gòu)并因此能夠結(jié)合抗天然肽抗體的肽序列，但所述肽序列本身并不一定與所述天然多肽具有顯著的序列同一性。疫苗本發(fā)明的另一方面涉及在個體、特別是哺乳動物、最好是人類中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括用足以產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答的BASB027多核苷酸和/或多肽或它們的片段或變異體接種所述個體，以保護(hù)所述個體免受感染，尤其是細(xì)菌感染，更特別是粘膜炎莫拉氏菌感染。還提供的是這樣的方法憑借這種方法，這樣的免疫應(yīng)答減慢細(xì)菌的復(fù)制。而本發(fā)明的再一方面涉及在個體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括傳遞核酸載體、序列或核酶給這樣的個體，來指導(dǎo)BASB027多核苷酸和/或多肽、或其片段或變異體的表達(dá)，以在體內(nèi)表達(dá)BASB027多核苷酸和/或多肽、或其片段或變異體，以此誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，如產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答(包括例如產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞)，來保護(hù)所述個體(最好是人類)免受疾病，而不論該疾病是否已經(jīng)在所述個體內(nèi)建立。給予所述基因的一個例子是將其作為顆粒的包被物或者相反而加速進(jìn)入所需細(xì)胞。這樣的核酸載體可以包括DNA、RNA、核酶、修飾過的核酸、DNA/RNA雜種、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。
本發(fā)明的再一方面涉及免疫組合物，當(dāng)所述免疫組合物引入個體、最好是人類中時，由于所述免疫組合物能夠在所述個體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因此在所述個體中誘導(dǎo)針對BASB027多核苷酸和/或由其編碼的多肽的免疫應(yīng)答，其中所述組合物包含重組BASB027多核苷酸和/或由其編碼的多肽，和/或所述組合物包括編碼和表達(dá)所述BASB027多核苷酸的抗原的DNA和/或RNA、由其編碼的多肽、或其它本發(fā)明的多肽。所述免疫應(yīng)答可以用于治療或為預(yù)防目的，并采用抗體免疫和/或細(xì)胞免疫的形式，如由CTL或CD4+T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫。
BASB027多肽或其片段可以與輔蛋白(co-protein)或化學(xué)部分融合，所述化學(xué)部分本身可能產(chǎn)生抗體或不產(chǎn)生抗體，但能夠穩(wěn)定所述第一種蛋白并產(chǎn)生具有抗原性和/或免疫原性的特性、最好是保護(hù)特性的融合或修飾蛋白。因此，融合的重組蛋白最好還包含一種抗原性輔蛋白，或任何其它穩(wěn)定所述蛋白并便利其生產(chǎn)和純化的相對大的輔蛋白，其中所述抗原性輔蛋白如來自流感嗜血桿菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或β-半乳糖苷酶。此外，所述輔蛋白可以在提供對接受所述蛋白的生物的免疫系統(tǒng)的普通性刺激的意義上，作為佐劑起作用。所述輔蛋白可以連接到第一種蛋白的氨基端或者羧基端。
本發(fā)明提供組合物，尤其是疫苗組合物，以及包含本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及免疫刺激性DNA序列的方法，所述免疫刺激性DNA序列如那些在Sato,Y.等Science 273:352(1996)中所述的序列。
本發(fā)明還提供使用所述多核苷酸或其特定片段的方法，其中已經(jīng)顯示在粘膜炎莫拉氏菌感染的動物模型中，在這樣的遺傳免疫實驗中使用的多核苷酸構(gòu)造物中，所述多核苷酸或其特定片段編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的非可變區(qū)。這樣的實驗對于鑒定能夠引起預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)表位特別有用。相信該方法將使得能夠隨后制備特別有用的單克隆抗體，以開發(fā)針對在哺乳動物、尤其是人類中的細(xì)菌感染(尤其是粘膜炎莫拉氏菌感染)的預(yù)防試劑或治療療法，其中所述單克隆抗體得自成功抵御或清除感染的動物的必需器官。
本發(fā)明還包括疫苗制劑，所述疫苗制劑包括本發(fā)明的免疫原性重組多肽和/或多核苷酸以及合適的載體，如藥學(xué)上可接受的載體。由于所述多肽和多核苷酸可能在胃中分解，因此它們中的每一種最好胃腸外給予，包括例如皮下給予、肌內(nèi)給予、靜脈內(nèi)給予或皮內(nèi)給予。適于胃腸外給予的制劑包括水性和非水性無菌注射溶液，所述溶液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、制菌化合物和使得所述制劑與個體的體液(最好是血液)等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌懸浮液，所述懸浮液可以包括懸浮劑或增稠劑。所述制劑可以盛裝在單位劑量或多劑量容器(如封口的安瓿和管形瓶)中，并可以在凍干條件下保存，僅要求在使用前加入無菌液體載體。
本發(fā)明的疫苗制劑也可以包括佐劑系統(tǒng)以增強所述制劑的免疫原性。所述佐劑系統(tǒng)最好優(yōu)先引起TH1型反應(yīng)。
免疫應(yīng)答可以廣義地歸入兩個最基本的類體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(傳統(tǒng)上分別用抗體保護(hù)機制或細(xì)胞效應(yīng)物保護(hù)機制來特征定義)。免疫應(yīng)答的這兩個類被命名為TH1型反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
最基本的TH1型免疫應(yīng)答的特征在于產(chǎn)生抗原特異性單倍型限制性細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及天然殺傷細(xì)胞應(yīng)答。在小鼠中，TH-1型反應(yīng)通常特征為產(chǎn)生IgG2a亞型抗體，而在人中，這些抗體對應(yīng)于IgG1型抗體。TH-2型免疫應(yīng)答的特征在于產(chǎn)生廣泛范圍的免疫球蛋白同種型，在小鼠中所述免疫球蛋白同種型包括IgG1、IgA和IgM。
可以認(rèn)為在這兩種免疫應(yīng)答類型產(chǎn)生背后的推動力是細(xì)胞因子。高水平的TH-1型細(xì)胞因子傾向于促進(jìn)誘導(dǎo)針對給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的TH-2型細(xì)胞因子傾向于促進(jìn)誘導(dǎo)對抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH-1和TH-2型免疫應(yīng)答的區(qū)別并不是絕對的。事實上某個個體會支持被描述為主要是TH1或主要是TH2的免疫應(yīng)答。然而，按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆中所述來考慮細(xì)胞因子家族常常是方便的(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1998)TH1和TH2細(xì)胞不同的淋巴因子分泌模式導(dǎo)致不同的功能特性AnnualReview of Immunology,7，第145-173頁)。傳統(tǒng)上，TH-1型反應(yīng)與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2細(xì)胞因子有關(guān)。其它常常與誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答直接相關(guān)的細(xì)胞因子并不是由T細(xì)胞產(chǎn)生，如IL-12。相比之下，TH2型反應(yīng)與IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有關(guān)。
已知某些疫苗佐劑特別適于刺激TH1或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。傳統(tǒng)上，在接種疫苗或感染后免疫應(yīng)答TH1:TH2平衡的最佳指標(biāo)，包括在體外用抗原再刺激后直接測量T淋巴細(xì)胞的TH1或TH2細(xì)胞因子產(chǎn)生，和/或測量抗原特異性抗體反應(yīng)的IgG1:IgG2a比例。
因此，TH1型佐劑是這樣一種佐劑它優(yōu)先刺激分離的T細(xì)胞群體以在體外用抗原再刺激時產(chǎn)生高水平TH1型細(xì)胞因子，并促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞以及與TH1型同種型有關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白反應(yīng)的產(chǎn)生。
在國際專利申請No.WO94/00153和WO95/17209中描述了能夠優(yōu)選刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑。
3-脫氧乙酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)就是這樣一種佐劑。這可以從GB2220211(Ribi)得知?；瘜W(xué)上它是有4、5或6個乙?；湹?-脫氧乙酰單磷酰脂質(zhì)A的混合物，由Ribi Immunochem,Montana生產(chǎn)。在歐洲專利0689454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公開了3-脫氧乙酰單磷酰脂質(zhì)A的一種優(yōu)選形式。
3D-MPL的顆粒最好小得足以通過0.22微米的膜來進(jìn)行除菌過濾(如歐洲專利0689454中所述)。3D-MPL在每劑量中使用的范圍是10μg-100μg，最好是25-50μg，其中抗原在每劑量中使用的范圍通常是2-50μg。
另一種優(yōu)選的佐劑包括QS21，一種從皂樹(Quillaja SaponariaMolina)的樹皮中得到的Hplc純化的無毒組分。這種佐劑可以可選地與3-脫氧乙酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)混合，其中可以可選地還有一種載體。
美國專利第5,057,540號公開了QS21的生產(chǎn)方法。
以前已經(jīng)描述了含有QS21的無反應(yīng)原性佐劑制劑(WO96/33739)。當(dāng)與抗原一起配制時，已經(jīng)顯示這種包含QS21和膽固醇的制劑是成功的TH1刺激佐劑。
其它為TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激物的佐劑包括免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸，例如WO96/02555中所公開的未甲基化CpG序列。
不同TH1刺激佐劑(如上文所提到的那些)的組合也應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是提供了為TH1細(xì)胞應(yīng)答優(yōu)先刺激物的佐劑。例如，QS21可以與3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比例通常約為1∶10到10∶1；最好是1∶5到5∶1，而實際上常常是1∶1。最佳協(xié)同作用的優(yōu)范圍是2.5∶1到1∶1 3D-MPL∶QS21。
依照本發(fā)明的疫苗組合物中最好還存在一種載體。所述載體可以是水包油乳狀液，或一種鋁鹽，如磷酸鋁或氫氧化鋁。
優(yōu)選的水包油乳狀液包含一種可代謝的油，如角鯊烯、α-生育酚和Tween80。在一個特別優(yōu)選的方面，在依照本發(fā)明的疫苗組合物中的抗原在這樣的乳劑中與QS21和3D-MPL混合。此外所述水包油乳狀液可以含有span85和/或卵磷脂和/或甘油三辛酸酯。
在給予人時，疫苗中使用的QS21和3D-MPL通常在每劑量1μg-200μg的范圍內(nèi)，如10-100μg，最好是10μg-50μg。而水包油乳狀液通常會含有2-10％的角鯊烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween80。角鯊烯α-生育酚的比例最好是等于或小于1，因為這提供了一種更穩(wěn)定的乳狀液?？梢栽?％的水平上使用Span85。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗另外含有一種穩(wěn)定劑是可能有利的。
無毒的水包油乳狀液最好在一種水性載體中含有一種無毒的油，如角鯊?fù)榛蚪酋徬约耙环N乳化劑，如Tween80。所述水性載體可以是例如磷酸緩沖鹽溶液。
WO95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，該制劑涉及在水包油乳狀液中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本發(fā)明還提供了多價疫苗組合物，所述多價疫苗組合物包含與其它抗原組合的本發(fā)明的疫苗制劑，所述其它抗原尤其是可用于治療癌癥、自身免疫病以及相關(guān)病癥的抗原。這樣一種多價疫苗組合物可以包括如前文所述的誘導(dǎo)TH-1的佐劑。
雖然已經(jīng)根據(jù)某些BASB027多肽和多核苷酸而描述本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明覆蓋天然出現(xiàn)的多肽和多核苷酸的片段，以及帶有添加、缺失或取代的相似多肽和多核苷酸，其中所述添加、缺失或取代基本不影響所述重組多肽或多核苷酸的免疫原性特性。組合物、試劑盒以及給藥在本發(fā)明的再一方面，提供了用于給予單個細(xì)胞或多細(xì)胞生物的包含BASB027多核苷酸和/或BASB027多肽的組合物。
本發(fā)明還涉及包含本文所討論的多核苷酸和/或多肽或它們的激動劑或拮抗劑的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可以與非無菌或無菌的一種載體或多種載體組合使用以用于細(xì)胞、組織或生物，所述載體如適于給予個體的藥用載體。這樣的組合物包括例如媒介添加物(media additive)或治療有效量的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體可以包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。所述制劑應(yīng)當(dāng)配合給藥模式。本發(fā)明還涉及診斷用和藥用包和試劑盒，所述包和試劑盒包括一個或多個容器，所述容器中裝有前文所述本發(fā)明的組合物的一種或多種成份。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其它化合物可以單獨使用或與其它化合物如治療化合物結(jié)合使用。
所述藥用組合物可以以任何有效、方便的方式給予，所述方式其中包括例如表面途徑、口服途徑、肛門途徑、陰道途徑、靜脈內(nèi)途徑、腹膜內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、皮下途徑、鼻內(nèi)途徑或皮內(nèi)途徑。
在治療中或用作預(yù)防藥時，可以將所述活性藥劑作為可注射的組合物給予個體，例如作為無菌水性分散體，所述分散體最好是等滲的。
在另一方面，本發(fā)明提供了藥用組合物，所述藥用組合物包括組合了藥學(xué)可接受的載體或賦形劑的治療有效量的多肽和/或多核苷酸(如可溶形式的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸)、激動劑肽或拮抗劑肽或小分子化合物。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。本發(fā)明還涉及醫(yī)藥包和試劑盒，所述醫(yī)藥包和試劑盒包括一個或多個容器，所述容器中裝有前文所述本發(fā)明的組合物的一種或多種成份。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其它化合物可以單獨使用或與其它化合物如治療化合物結(jié)合使用。
可以改變所述組合物以適應(yīng)給藥途徑，所述給藥途徑如系統(tǒng)性途徑或口服途徑。系統(tǒng)性給藥的優(yōu)選形式包括注射，一般是通過靜脈內(nèi)注射?？梢允褂闷渌⑸渫緩?，如皮下注射、肌內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射。用于系統(tǒng)性給藥的其它可選方法包括使用滲透劑經(jīng)粘膜和經(jīng)皮給藥，所述滲透劑如膽汁鹽或梭鏈孢酸或其它去污劑。此外，如果本發(fā)明的多肽或其它化合物可以配制到腸制劑或膠囊化制劑中，那么口服給藥也是可能的。這些化合物也可以是以藥膏、糊劑、凝膠、溶液、粉劑等形式表面和/或局部給予。
為給予哺乳動物，尤其是人類，預(yù)期所述活性藥劑的每日劑量水平將從0.01mg/kg到10mg/kg，一般是1mg/kg左右。在任何情況下，醫(yī)師將確定最適于個體的實際劑量，并且該劑量將隨著特定個體的年齡、體重和反應(yīng)而不同。上面的劑量是一般情況的例子。當(dāng)然，有可能有需要更高或更低劑量范圍的個別例子，而這些情況處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所需的劑量范圍取決于肽的選擇、給藥途徑、制劑的性質(zhì)、患者病癥的性質(zhì)以及主治醫(yī)師的判斷。然而，合適的劑量處于0.1-100μg/kg患者體重的范圍內(nèi)。
疫苗組合物方便地采用可注射的形式?？梢允褂贸Ｒ?guī)佐劑以增強免疫應(yīng)答。用于疫苗的合適單位劑量是0.5-5微克/kg的抗原，并且最好以1-3周的間隔給予這樣的劑量1-3次。使用指示的劑量范圍，用本發(fā)明的化合物將不會觀察到阻止將它們給予合適個體的不利的毒理學(xué)效應(yīng)。
然而，考慮到可用的化合物的多樣性以及各種給藥途徑的不同功效，預(yù)期在所需劑量上將有很大變化。例如，預(yù)期口服將比通過靜脈內(nèi)注射給予需要更高劑量。使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的用于優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗程序，可以調(diào)整這些劑量水平上的變化。序列數(shù)據(jù)庫、在有形媒介中的序列以及算法多核苷酸和多肽序列形成有價值的信息來源，使用這樣的信息來源確定它們的2維和3維結(jié)構(gòu)，并鑒定具有相似同一性的其它序列。通過將序列儲存在計算機可讀媒介中并隨后使用在已知的大分子結(jié)構(gòu)程序所存儲的數(shù)據(jù)，或使用所存儲的數(shù)據(jù)，通過眾所周知的搜索工具如GCG程序包搜索序列數(shù)據(jù)庫，大大便利了這些方法。
本發(fā)明還提供的是特征序列或信息串(string)、尤其是基因序列或所編碼的蛋白序列的分析方法。優(yōu)選的序列分析方法包括例如序列同源性分析的方法(如同一性和相似性分析)、DNA、RNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、序列裝配、分支分析、序列基序分析、確定可讀框、核酸堿基調(diào)入(nucleic acid base calling)、密碼子選擇分析、核酸堿基修整(nucleic acid base trimming)以及序列色譜峰分析。
為進(jìn)行同源性鑒定提供了基于計算機的方法。該方法包括下列步驟在計算機可讀媒介中提供包含本發(fā)明多核苷酸的序列的第一個多核苷酸序列；將所述第一個多核苷酸序列與至少一種第二個多核苷酸或多肽序列比較，鑒定同源性。
還為進(jìn)行同源性分析提供了基于計算機的方法，所述方法包括下列步驟在計算機可讀媒介中提供包含本發(fā)明多肽的序列的第一個多肽序列；將所述第一個多肽序列與至少一種第二個多核苷酸或多肽序列比較，鑒定同源性。
在本說明書中引用的所有出版物和參考資料(包括但不限于專利和專利申請)通過引用完整地結(jié)合到本文中，就象具體并單獨地指出每個個別的出版物或參考資料已經(jīng)完全陳述一樣通過引用結(jié)合到本文中。同時以出版物和參考資料的上述方式將本申請要求獲得優(yōu)先權(quán)的任何專利申請通過引用完整地結(jié)合到本文中。定義“同一性”，如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，指根據(jù)情況，通過比較序列而確定的兩種或兩種以上多肽序列或兩種或兩種以上多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域內(nèi)，“同一性”也指根據(jù)情況，通過匹配多肽或多核苷酸序列的信息串而確定的多肽或多核苷酸的序列之間的序列相似程度。通過已知方法，可以容易地計算“同一性”，所述方法包括但不限于那些在以下文獻(xiàn)中描述的方法ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.編輯，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編輯，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of SequenceData，第1部分，Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.編輯，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heine,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,編輯，M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。用于測定同一性的方法設(shè)計用來給出所測試序列之間的最大匹配。此外，測定同一性的方法用公眾可得到的計算機程序編碼。用于測定兩序列間同一性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux,J.等，Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN(Altschul,S.F.等，J.Molec.Biol.215:403-410(1990))以及FASTA(Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448(1988)。公眾可以從NCBI和其它來源公開地得到BLAST程序系列(BLAST Manual,Altschul,S.等，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。也可以使用眾所周知的Smith Waterman算法測定同一性。
用于多肽序列比較的參數(shù)包括下列算法Needleman和Wunsch,J.Mol Biol.48:443-453(1970)比較矩陣(Comparison matrix)得自Henikoff和Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)的BLOSSUM62間隔補償(Gap Penalty):8間隔長度補償2根據(jù)這些參數(shù)可以使用的程序可作為Genetics Computer Group,Madison WI的“間隔(gap)”程序公開地得到。前面提到的參數(shù)是進(jìn)行肽比較(對末端間隔沒有補償)的默認(rèn)參數(shù)。
用于多核苷酸比較的參數(shù)包括下列算法Needleman和Wunsch,J.Mol Biol.48:443-453(1970)比較矩陣匹配=+10，錯配=0間隔補償50
間隔長度補償3可作為Genetics Computer Group,Madison WI的“間隔”程序得到。這些參數(shù)是進(jìn)行核酸比較的默認(rèn)參數(shù)。
根據(jù)情況，對于多核苷酸和多肽來說“同一性”的優(yōu)選意義在下面的(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸實施方案還包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包括與SEQ ID NO:1的參考序列有至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可以與SEQ ID NO:1的參考序列相同，或者與所述參考序列相比，包括多至某一整數(shù)的核苷酸改變，其中所述改變選自以下至少一個核苷酸缺失、取代(包括堿基轉(zhuǎn)換和堿基顛換)或插入，并且所述改變可以發(fā)生在所述參考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置間的任何地方，或者各自單獨散布于參考序列的核苷酸中，或者以一個或多個連續(xù)的組散布于參考序列中，其中所述核苷酸改變的數(shù)量如下確定將定義同一性百分率的整數(shù)除以100，然后乘以SEQ IDNO:1中核苷酸的總數(shù)，隨后從所述SEQ ID NO:1中核苷酸的總數(shù)中減去該乘積，或nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO:1中核苷酸的總數(shù)，y是0.50代表50％、0.60代表60％、0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％、0.90代表90％、0.95代表95％、0.97代表97％或1.00代表100％，而·是乘法運算符的符號，其中將任何xn和y的非整數(shù)乘積從xn減去之前，將該乘積舍入為最接近的整數(shù)。編碼SEQID NO:2的多肽的多核苷酸的改變可能在該編碼序列中產(chǎn)生無義、錯義或移碼突變，并因此在這樣的改變后改變由所述多核苷酸編碼的多肽。
舉例來說，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與SEQ ID NO:1的參考序列相同，即可以100％相同，或者與所述參考序列比較，該序列包括多至某一整數(shù)的核酸改變，以致同一性百分率小于100％同一性。這樣的改變選自以下至少一個核苷酸缺失、取代(包括堿基轉(zhuǎn)換和堿基顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在所述參考多核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置間的任何地方，或者各自單獨散布于參考序列的核酸中，或者以一個或多個連續(xù)的組散布于參考序列中。如下確定對于給定百分率的核酸改變的數(shù)目將定義同一性百分率的整數(shù)除以100，然后乘以SEQ ID NO:1中核酸的總數(shù)，隨后從所述SEQ ID NO:1中核酸的總數(shù)中減去該乘積，或nn≤xn-(xn·y)其中nn是核酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO:1中核酸的總數(shù)，y是例如0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％等等，而·是乘法運算符的符號，其中將任何xn和y的非整數(shù)乘積從xn減去之前，將該乘積舍入為最接近的整數(shù)。
(2)多肽實施方案還包括分離的多肽，所述分離的多肽包括與SEQ ID NO:2的多肽參考序列有至少50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多肽，其中所述多肽序列可以與SEQ ID NO:2的參考序列相同，或者與所述參考序列相比，包括多至某一整數(shù)的氨基酸改變，其中所述改變選自以下至少一個氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，并且所述改變可以發(fā)生在所述參考多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或那些末端位置間的任何地方，或者各自單獨散布于參考序列的氨基酸中，或者以一個或多個連續(xù)的組散布于參考序列中，其中如下確定所述氨基酸改變的數(shù)量將定義同一性百分率的整數(shù)除以100，然后乘以SEQ ID NO:2中氨基酸的總數(shù)，隨后從所述SEQ ID NO:2中氨基酸的總數(shù)中減去該乘積，或na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改變的數(shù)目，xa是SEQ ID NO:2中氨基酸的總數(shù)，y是0.50代表50％、0.60代表60％、0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％、0.90代表90％、0.95代表95％、0.97代表97％或1.00代表100％，而·是乘法運算符的符號，其中將任何xa和y的非整數(shù)乘積從xa減去之前，將該乘積舍入為最接近的整數(shù)。
舉例來說，本發(fā)明的多肽序列可以與SEQ ID NO:2的參考序列相同，即可以100％相同，或者與所述參考序列比較，該序列包括多至某一整數(shù)的氨基酸改變，以致同一性百分率小于100％同一性。這樣的改變選自以下至少一個氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，并且所述改變可以發(fā)生在所述參考多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或那些末端位置間的任何地方，或者各自散布于參考序列的氨基酸中，或者以一個或多個連續(xù)的組散布于參考序列中。給定％同一性的氨基酸改變的數(shù)量如下確定將定義同一性百分率的整數(shù)除以100，然后乘以SEQ ID NO:2中氨基酸的總數(shù)，隨后從所述SEQ ID NO:2中氨基酸的總數(shù)中減去該乘積，或na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改變的數(shù)目，xa是SEQ ID NO:2中氨基酸的總數(shù)，y是例如0.70代表70％、0.80代表80％、0.85代表85％等等，而·是乘法運算符的符號，其中將任何xa和y的非整數(shù)乘積從xa減去之前，將該乘積舍入為最接近的整數(shù)。
“個體”，當(dāng)在本文內(nèi)用以指生物時，指多細(xì)胞真核生物，包括但不限于后生動物、哺乳動物、羊科動物(ovid)、?？苿游?bovid)、猿、靈長類動物和人類。
“分離的”指“通過人的勞動”從其自然狀態(tài)改變，即如果它存在自然界中的話，則它已經(jīng)從原始環(huán)境中改變或取出，或者改變并取出。例如，天然存在于活生物中的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但從其天然狀態(tài)共存的物質(zhì)中分離出來的同樣的多核苷酸或多肽是“分離的”，正如該術(shù)語在本文中使用的一樣。此外，通過轉(zhuǎn)化、遺傳操作或通過任何其它重組方法引入生物中的多核苷酸或多肽是“分離的”，即使它仍然存在于所述生物中，而所述生物可以是活的或非活的。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，所述多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸可以是包括單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的未修飾RNA或DNA或修飾過的RNA或DNA。
“變異體”指與參考多核苷酸或多肽不同、但保持了基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸變異體在核苷酸序列上與另一個多核苷酸即參考多核苷酸不同。所述變異體核苷酸序列的改變可能改變或不改變由所述參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下面討論的，核苷酸變化可能導(dǎo)致由參考序列編碼的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。典型的多肽變異體在氨基酸序列上與另一個多肽即參考多肽不同。一般說來，差異受到限制，以便參考多肽和變異體的序列在總體上緊密相似并且在許多區(qū)相同。變異體和參考多肽可以在氨基酸序列上由于以任何組合的一個或多個取代、添加、缺失而不同。取代或插入的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的殘基。多核苷酸或多肽的變異體可以是天然出現(xiàn)的(如等位變異體)，或者可以是還未知的天然出現(xiàn)的變異體?？梢酝ㄟ^誘變技術(shù)或直接合成來制造多核苷酸和多肽的非天然出現(xiàn)的變異體。
“疾病”指任何由細(xì)菌感染引起或與細(xì)菌感染有關(guān)的疾病，包括例如嬰兒和兒童的中耳炎、年紀(jì)大的人的肺炎、鼻竇炎、醫(yī)院感染和侵襲性疾病、伴有聽力損失的慢性中耳炎、體液在中耳積累、聽覺神經(jīng)損傷、語言學(xué)習(xí)延遲、上呼吸道感染以及中耳的炎癥。
實施例使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實施下面的實施例，所述技術(shù)除另外詳細(xì)描述的外，對于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是熟知并且常規(guī)的。實施例是說明性的，而不限制本發(fā)明。實施例1來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的BASB027基因的發(fā)現(xiàn)和確證性DNA測序首先在包含粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617(也稱為菌株Mc2931)的未完成的基因組DNA序列的Incyte PathoSeq數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO:1的BASB027基因。如SEQ ID NO:2所示，所述BASB027多核苷酸序列的翻譯顯示與腦膜炎奈瑟氏球菌的OMP85外膜蛋白有顯著相似性(在817個氨基酸重疊區(qū)內(nèi)有32％同一性)。
進(jìn)一步用實驗方法證實了BASB027基因的序列。為此目的，使用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒(Qiagen Gmbh)，從1010個粘膜炎莫拉氏菌細(xì)胞(菌株ATCC43617)提取基因組DNA，并使用引物E515515(5’-ACT-ATA-GGG-CAC-GCG-TG-3’)[SEQ ID NO:5]和E515528:(5’-CCT-GCG-TTT-GTT-TGA-TTG-AG-3’)[SEQ ID NO:6]，用1μg該材料進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA擴(kuò)增。在Biorobot9600(Qiagen Gmbh)儀器上純化所述PCR產(chǎn)物，并用Big Dye CycleSequencing試劑盒(Perkin-Elmer)以及ABI377/PRISM DNA測序儀進(jìn)行DNA測序。以豐余性(redundancy)為2，在兩條鏈上進(jìn)行DNA測序，并使用DNASTAR Lasergene軟件包的SeqMan程序裝配全長序列。得到的DNA序列和推導(dǎo)的多肽序列分別如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4顯示。四個核苷酸的差異將SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:1區(qū)別開來。使用DNASTAR Lasergene軟件包的MEGALIGN程序，進(jìn)行SEQ ID NO:1和3的多核苷酸序列的序列對比，該序列對比顯示于圖2；據(jù)計算，它們的同一性水平是99.8％。使用同樣的程序，進(jìn)行SEQ ID NO:2和4的多肽序列的序列對比，該序列對比顯示于圖3；據(jù)計算，它們的同一性水平是99.8％。實施例2在幾種粘膜炎莫拉氏菌菌株中BASB027基因的變異性分析2A限制性片段長度分析(RFLP)如下所述從16個粘膜炎莫拉氏菌菌株(顯示于表1)中提取基因組DNA。將粘膜炎莫拉氏菌在BHI瓊脂平板上劃線形成單菌落，并在37℃培養(yǎng)過夜。挑取三個或四個單菌落，接種到約1.5ml BHI(腦-心浸液)肉湯種子培養(yǎng)基，在搖床上于37℃下約300rpm培養(yǎng)過夜。用該種子培養(yǎng)物接種包含約150ml BHI肉湯的500ml錐形瓶，搖床上于37℃下約175rpm培養(yǎng)約12到16小時，產(chǎn)生用于分離DNA的細(xì)胞物質(zhì)。在Sorvall GSA轉(zhuǎn)子中以約2000×g在室溫下離心15分鐘，收集細(xì)胞。除去上清液并將細(xì)胞沉淀重懸浮于約5.0ml無菌水中。加入等體積裂解緩沖液(200mM NaCl,20mM EDTA,40mMTris-HCl,pH8.0,0.5％(重量/體積)SDS,0.5％(體積比)2-巰基乙醇以及250μg/ml蛋白酶K)并通過溫和攪拌和研磨懸浮細(xì)胞。然后將所述細(xì)胞懸浮物在50℃培育約12小時以裂解細(xì)胞并釋放染色體DNA。通過加入5.0ml飽和NaCl(約6.0M，在無菌水中)并在Sorvall SS34轉(zhuǎn)子中以約5,500×g在室溫下離心，沉淀蛋白質(zhì)的物質(zhì)。通過加入兩倍體積的100％乙醇，從澄清過的上清液中沉淀染色體DNA。收集聚集的DNA，并在小體積的70％乙醇溶液中使用溫和攪拌而洗滌。純化后的染色體DNA重懸浮于無菌水中并在4℃下通過輕微搖擺過夜使其溶解/分散。在260nn下使用1.0O.D.單位約50μg/ml的消光系數(shù)，通過分光光度法測定溶解DNA的濃度。
隨后使用MC-D15-BamF(5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAGAGG GGA TCC ACA GGA CTA CAG CGA GTG ACC ATT GAAAGC TTA C-3’)[SEQ ID NO:7]和MC-D15-SalRC(AAG GGC CCAATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AATCTG GAA CTG TAC CGT ATC G-3’)[SEQ ID NO:8]寡核苷酸，對該物質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后使用限制酶(AciⅠ、HindⅢ、MaeⅢ、NlaⅢ、RsaⅠ、Sau3AⅠ)獨立地水解對應(yīng)的BASB027基因擴(kuò)增子，并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)程序，通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離限制產(chǎn)物，所述標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)程序如“Molecular Cloning,a LaboratoryManual，第二版，編輯Sambrook,Fritsch和Maniatis,Cold SpringHarbor press 1989”中描述。得到的電泳凝膠的照片顯示于

圖1。記錄并組合每個菌株對應(yīng)于6種限制酶的RFLP模式。然后確定具有同樣RFLP模式組合的菌株的群。使用這種方法，將在該研究中測試的菌株分成4個基因組群(群1:Mc2906、Mc2908、Mc2912、Mc2926；群2:Mc2905、Mc2907、Mc2909、Mc2911、Mc2913、Mc2960、Mc2975；群3:Mc2910、Mc2912、Mc2956、Mc2969；群4:Mc2931)。這些數(shù)據(jù)支持這一觀點在本研究中使用的粘膜炎莫拉氏菌群體在BASB027基因上顯示有限的核苷酸序列多樣性。表1在本研究中使用的粘膜炎莫拉氏菌菌株的特征
實施例3構(gòu)造表達(dá)重組BASB027的質(zhì)粒A:BASB027的克隆將BamHⅠ和SalⅠ限制位點分別工程化進(jìn)正向互補擴(kuò)增引物([SEQID NO:7])和反向互補擴(kuò)增引物([SEQ ID NO:8])，使得能夠定向克隆約2500bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)商業(yè)上可得的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pQE30(QiaGen，抗氨芐青霉素)，以便成熟BASB027蛋白可以作為在N末端包含(His)6親和層析標(biāo)記的融合蛋白表達(dá)。使用基于硅膠的旋轉(zhuǎn)柱(spin column)(QiaGen)，按照廠家的指導(dǎo)，從擴(kuò)增反應(yīng)物中純化BASB027 PCR產(chǎn)物。為產(chǎn)生克隆所需的BamHⅠ和SalⅠ末端，將純化的PCR產(chǎn)物順序用BamHⅠ和SalⅠ限制酶如廠家(Life Technologies)所推薦的消化完全。第一次限制消化后，在第二次酶消化前，如上所述通過旋轉(zhuǎn)柱純化所述PCR產(chǎn)物以除去鹽，然后在無菌水中洗脫。在與pQE30質(zhì)粒連接前，再次用基于硅膠的旋轉(zhuǎn)柱純化所消化的DNA片段。B表達(dá)載體的產(chǎn)生為制備表達(dá)質(zhì)粒pQE30以用于連接，將其相似地用BamHⅠ和SalⅠ消化完全，隨后用小牛小腸磷酸酶(CIP，約0.02單位/皮摩爾5’末端，Life Technologies)根據(jù)廠家指導(dǎo)處理，以預(yù)防自連接。用比所制備的載體多約5倍摩爾的所述消化片段來進(jìn)行所述連接反應(yīng)。使用T4 DNA連接酶(約2.0單位/反應(yīng)，Life Technologies)，用本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的約20μl的連接反應(yīng)(約16℃，約16小時)。依照本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法，使用一等份連接物(約5μl)轉(zhuǎn)化電感受態(tài)(electro-competent)的M15(pREP4)細(xì)胞。在約1.0ml LB肉湯中于37℃下約2-3小時的生長期后，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種到含卡那霉素(50μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上。在選擇培養(yǎng)基中包括這兩種抗生素，以保證所有轉(zhuǎn)化細(xì)胞都帶有pREP4質(zhì)粒(KnR)和pQE30-BASB027質(zhì)粒(ApR)，其中pREP4質(zhì)粒載有阻抑為pQE30上IPTG誘導(dǎo)型蛋白表達(dá)的表達(dá)所必需的lacⅠq基因。在37℃培養(yǎng)平板過夜約16小時。用無菌牙簽挑取各個KnR/ApR菌落并用于“patch”接種新鮮LB KnR/ApR平板以及約1.0ml LB KnR/ApR肉湯培養(yǎng)基。Patch平板和肉湯培養(yǎng)物或者在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中(平板)、或者在振蕩水浴中37℃下培養(yǎng)過夜。
使用基于全細(xì)胞的PCR分析證實轉(zhuǎn)化子包含所述BASB027 DNA插入片段。在此，將約1.0ml過夜的LB KnR/ApR肉湯培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5ml聚丙烯管，并在Beckmann微量離心機中離心(約3分鐘，室溫，約12,000×g)，收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀懸浮于約200μl無菌水中，并用約10tl等分樣品進(jìn)行約50μl最終體積的PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)包含BASB027正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物。所述PCR反應(yīng)成分的最終濃度基本如實施例2中指示的一樣，但使用約5.0單位的Taq聚合酶。起始的95℃變性步驟增加到3分鐘，以保證熱破碎所述細(xì)菌細(xì)胞并釋放質(zhì)粒DNA。使用ABI9700型熱循環(huán)儀和32個循環(huán)的三步熱擴(kuò)增方法，即95℃，45秒；55-58℃，45秒，72℃，1分鐘，擴(kuò)增來自裂解的轉(zhuǎn)化子樣品的BASB027 PCR片段。熱擴(kuò)增之后，通過瓊脂糖凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中的0.8％瓊脂糖)分析約20μl等份的反應(yīng)物。在凝膠電泳和溴化乙錠染色后，通過紫外線照射使DNA片段可見。與測試樣品平行電泳一個DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)(1Kb梯(ladder),Life Technologies)，并用以估計PCR產(chǎn)物的大小。產(chǎn)生預(yù)期的約2500 bp PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子鑒定為包含BASB027表達(dá)構(gòu)造物的菌株。隨后分析包含表達(dá)質(zhì)粒的菌株的重組BASB027的誘導(dǎo)型表達(dá)。C:PCR陽性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)分析對于上面鑒定的每個PCR陽性轉(zhuǎn)化子，用來自patch平板的細(xì)胞接種含卡那霉素(50μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)的約5.0ml LB肉湯，并在37℃下振蕩培養(yǎng)(約250rpm)過夜。將一等份的過夜種子培養(yǎng)物(約1.0ml)接種進(jìn)含約25ml LB Kn/Ap肉湯的125ml錐形瓶，并在37℃下振蕩培養(yǎng)(約250rpm)直到培養(yǎng)物的濁度達(dá)到O.D.600為0.5，即對數(shù)中期(通常約1.5-2.0小時)。此時將約一半的培養(yǎng)物(約12.5ml)轉(zhuǎn)移到第二個125ml錐形瓶，并加入IPTG(無菌水配制的1.0M貯液，Sigma)達(dá)到1.0mM的終濃度，誘導(dǎo)重組BASB027蛋白的表達(dá)。繼續(xù)在37℃下振蕩培養(yǎng)IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物約4小時。在誘導(dǎo)期后，取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的樣品(約1.0ml)，并在一臺微量離心機中室溫下離心約3分鐘，收集細(xì)胞。將各個細(xì)胞沉淀懸浮于約50μl無菌水中，然后與等體積的含2-巰基乙醇的2X LaemelliSDS-PAGE樣品緩沖液混合，并置于沸水浴中約3分鐘以變性蛋白。將等體積(約15μl)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞和未誘導(dǎo)的細(xì)胞的粗裂解物一式二份地上樣到12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚的微型凝膠，Novex)。在常規(guī)條件下，使用標(biāo)準(zhǔn)SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)，將誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的裂解物樣品與預(yù)染的分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(SeeBlue,Novex)一起電泳。電泳后，一塊膠用考馬斯亮藍(lán)R250(BioRad)染色，隨后脫色以使新型BASB027 IPTG可誘導(dǎo)蛋白可見。使用BioRad Mini-ProteanⅡ印跡儀以及Towbin乙醇(20％)轉(zhuǎn)移緩沖液，4℃下將第二塊膠在PVDF膜(0.45微米孔徑，Novex)上電印跡約2小時。依照本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法封閉膜并進(jìn)行抗體培育。使用單克隆抗RGS(His)3抗體，然后是綴合了HRP的第二兔抗鼠抗體(QiaGen)，證實所述BASB027重組蛋白的表達(dá)和身份。使用或者ABT不溶性底物、或者配有Amersham ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的Hyperfilm,使抗His抗體的反應(yīng)模式可見。D序列證實為進(jìn)一步證實所表達(dá)的IPTG可誘導(dǎo)的重組BASB027蛋白處于正確的可讀框并且不是由于克隆制造物(artifact)(即移碼突變)而產(chǎn)生的假的分子，測定了所克隆插入片段的DNA序列。使用常規(guī)的不對稱PCR循環(huán)測序方法(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing,Perkin-Elmer)，從一條鏈獲得粘膜炎莫拉氏菌BASB027基因的DNA序列。使用未消化的表達(dá)質(zhì)粒DNA(約0.5μg/rxn)作為模板，用合適的pQE30載體特異性測序引物和ORF特異性測序引物(約3.5皮摩爾/rxn)進(jìn)行測序反應(yīng)。除所述模板和測序引物外，每個測序反應(yīng)(約20μl)中還包含四種不同的dNTP(即A、G、C和T)以及四種對應(yīng)的ddNTP(即ddA、ddG、ddC和ddT)終止子核苷酸；同時每種終止子結(jié)合四種熒光染料之一，所述四種熒光染料是Joe、Tam、Rox或Fam。由于插入染料標(biāo)記的ddNTP終止子，單鏈測序延伸產(chǎn)物沿著所述模板在隨機位置終止。使用微量離心大小排阻層析柱(Princeton Genetics)純化熒光染料標(biāo)記的終止產(chǎn)物，在真空下干燥，懸浮于模板再懸浮緩沖液(Template Resuspension Buffer)(Perkin-Elmer)中以進(jìn)行毛細(xì)管電泳，或懸浮于去離子的甲酰胺中以進(jìn)行PAGE，在95℃變性約5分鐘，并通過高分辨率毛細(xì)管電泳(ABI310自動化DNA測序儀，Perkin-Elmer)或高分辨率PAGE(ABI377自動化DNA測序儀)按廠家推薦進(jìn)行分析。收集各個反應(yīng)產(chǎn)生的DNA序列數(shù)據(jù)，并在PowerMac計算機上使用ABI序列分析軟件(Perkin-Elmer)自動化分析相對熒光峰強度。在使用AutoAssembler軟件(Perkin-Elmer)將各自自動化分析的DNA序列合并成共有單鏈序列“信息串”前，人工編輯所述DNA序列以求準(zhǔn)確。測序確定了所述表達(dá)質(zhì)粒以正確的可讀框包含正確的序列。實施例4重組BASB027的產(chǎn)生細(xì)菌菌株用包含編碼來自粘膜炎莫拉氏菌的BASB027的質(zhì)粒(pQE30)的重組表達(dá)菌株大腸桿菌M15(pREP4)產(chǎn)生用于純化重組蛋白的細(xì)胞物質(zhì)。在含有50μg/ml卡那霉素(“Kn”)和100μg/ml氨芐青霉素(“Ap”)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)表達(dá)菌株，以保證pREP4 lacⅠq控制質(zhì)粒和pQE30-BASB027表達(dá)構(gòu)造物都得到保持。為在-80℃深低溫保藏，在含有同樣濃度抗生素的LB肉湯中繁殖所述菌株，然后與等體積含有30％(重量/體積)甘油的LB肉湯混合。培養(yǎng)基用于產(chǎn)生重組蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基包括含50μg/ml Kn和100μg/mlAp的2X YT肉湯(Difco)。以0.25ml/L在用于發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中加入消泡劑(Antifoam 204,Sigma)。為誘導(dǎo)BASB027重組蛋白的表達(dá)，在發(fā)酵罐中加入IPTG(異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷)(1mM，終濃度)。發(fā)酵用0.3ml快速解凍的凍存培養(yǎng)物或來自選擇性瓊脂平板培養(yǎng)物的幾個菌落接種含50ml工作體積的500-ml錐形種子瓶，然后在搖床中以150rpm(Innova2100,New Brunswick Scientific)于37±1℃下培養(yǎng)約12小時。然后用該種子培養(yǎng)物接種含2X YT肉湯和Kn以及Ap抗生素的5-L工作體積的發(fā)酵罐。發(fā)酵罐(Bioflo 3000,NewBrunswick Scientific)以37±1℃,0.2-0.4VVM空氣噴射，Rushton葉輪250rpm操作。在瓶裝種子培養(yǎng)物或發(fā)酵罐中都不控制pH。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐內(nèi)的pH處于6.5到7.3的范圍內(nèi)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到對數(shù)生長中期(約0.7O.D.600單位)時，在發(fā)酵罐中加入IPTG(1.0M貯液，在無菌水中制備)。誘導(dǎo)細(xì)胞2-4小時，然后使用或者28RSHeraeus(Sepatech)或者RC5C超速離心機(Sorvall Instrument)通過離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞糊貯存在-20℃直至進(jìn)一步處理。純化化學(xué)藥品和材料生物技術(shù)級(biotechnology grade)或更高級別的咪唑、鹽酸胍、Tris(羥甲基)和EDTA(乙二胺四乙酸)都得自Ameresco Chemical,Solon,Ohio。Triton X-100(叔辛基苯氧聚乙氧基乙醇)、磷酸二氫鈉和尿素是試劑級或更高級別，得自Sigma Chemical Company,St.Louis,Missouri。冰乙酸和鹽酸得自Mallincrodt Baker Inc.,Phillipsburg,NewJersey。甲醇得自Fisher Scientific,Fairlawn,New Jersey。PefablocSC(4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟)、完全蛋白酶抑制劑混合片劑和PMSF(苯甲基磺酰氟)得自Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,Indiana。苯丁抑制素、胃蛋白酶抑制劑A和E-64蛋白酶抑制劑得自Calbiochem,LaJolla,California。Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽溶液(1X PBS)得自QualityBiological,Inc.,Gaithersburg,Maryland。Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液(10XPBS)得自BioWhittaker,Walkersville,Maryland。無BSA的五組氨酸抗體得自QiaGen,Valencia,California。綴合過氧化物酶的親和純化的山羊抗鼠IgG得自Jackson Immuno Research,West Grove,Penn。AEC單一溶液(single solution)得自Zymed,South San Francisco,California。所有其它試劑都是試劑級或更高級別。
Ni-NTA Superflow樹脂得自QiaGen Inc.,Valencia,California。預(yù)制的Tris-甘氨酸4-20％和10-20％聚丙烯酰胺凝膠、所有電泳緩沖液和溶液、SeeBlue預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)、MultiMark多色標(biāo)準(zhǔn)和PVDF轉(zhuǎn)移膜得自Novex,San Diego,Caljfornia。SDS-PAGE銀染試劑盒得自DaiichiPure Chemicals Company Limited,Tokyo,Japan?？捡R斯染色液得自Bio-Rad Laboratories,Hercules,California。AcrodiscPF 0.2m針筒式濾器得自Pall Gelman Science,Ann Arbor,Michigan。GD/X25mm一次性針筒式濾器得自Whatman Inc.,Clifton,New Jersey。透析袋8,000MWCO得自BioDesign Inc.Od New York,Carmal New York。BCA蛋白測定試劑和蛇皮(Snake Skin)透析袋3,500MWCO得自PierceChemical Co.,Rockford,Illinois。提取方法在室溫下解凍細(xì)胞糊30到60分鐘。稱取五到六克材料，置于50ml一次性離心管中。在其中加入5ml/克鹽酸胍(Gu-HCl)緩沖液(6M鹽酸胍，100mM磷酸二氫鈉，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH8.0)。使用PRO300D proscientific勻漿器在3/4功率一分鐘，重懸浮細(xì)胞糊。然后將所述提取混合物置于室溫下溫和攪拌60到90分鐘。60到90分鐘后，在15,800×g下離心所述提取混合物15分鐘(SorvallRC5C離心機，11,500rpm)。倒出上清液(S1)并保存以進(jìn)行進(jìn)一步的純化。保留沉淀(P1)以進(jìn)行分析。BASB027結(jié)合鎳-NTA樹脂在S1中加入3-4ml Ni-NTA樹脂。隨后將其置于室溫下，溫和攪拌一小時。一小時后將S1/Ni-NTA裝填進(jìn)XK 16 Pharmacia柱。然后用1M Gu-HCl緩沖液(1M鹽酸胍，100mM磷酸二氫鈉，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH8.0)洗柱。然后用磷酸緩沖液(100mM磷酸二氫鈉，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH6.3)洗柱。然后用250mM咪唑緩沖液(250mM咪唑，100mM磷酸鈉，一元堿，10mM Tris和0.05％Triton X-100,pH5.9)從柱上洗脫蛋白。最終制劑對0.1％Triton X-100和1x PBS,pH7.4透析過夜并在其中三次更換溶液，去除殘余的鹽酸胍和咪唑，以配制BASB027。鑒定所純化蛋白的特征并如下所述用于產(chǎn)生抗體。生化特征鑒定SDS-PAGE分析和蛋白質(zhì)印跡分析如以前所述(Thebaine等1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)，在4-20％聚丙烯酰胺凝膠中分離純化的重組蛋白，并在100V下1小時將其電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用含5％脫脂粉乳的25ml Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液預(yù)處理所述PVDF膜。使用該預(yù)處理緩沖液進(jìn)行所有隨后的培育。
室溫下用免疫前血清或兔抗His免疫血清的1∶500稀釋物25ml與PVDF膜一起培育1小時。然后用洗滌緩沖液(20mM Tris緩沖液，pH7.5，含有150mM氯化鈉和0.05％Tween-20)洗PVDF膜兩次。室溫下用過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)的1∶5000稀釋物25ml與PVDF膜一起培育30分鐘。然后用洗滌緩沖液洗PVDF膜4次，然后用Zymed(SanFrancisco,CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和過氧化脲各顯色10分鐘。
SDS-PAGE的結(jié)果(圖4)顯示有一種約95kDa的蛋白，該蛋白在SDS-PAGE的蛋白質(zhì)印跡(圖5)中與抗-RGS(His)抗體反應(yīng)。蛋白測序在具有1090型LC的Hewlett-Packard G1000A型測序儀和具有1100型LC的Hewlett-Packard241型測序儀上，使用已經(jīng)很好建立的化學(xué)方法，進(jìn)行所純化蛋白的氨基末端氨基酸測序，以證實產(chǎn)生正確的重組蛋白。實施例5產(chǎn)生針對重組BASB027的抗血清通過用純化的重組BASB027蛋白接種兩只兔，產(chǎn)生對抗BASB027蛋白的多價抗血清。給予每只動物總共接收三次肌內(nèi)(i.m.)免疫接種，每次注射約20μg BASB027蛋白(開始用完全氟氏佐劑，隨后用不完全氟氏佐劑)，間隔約21天。在第一次免疫前(“免疫前取血(pre-bleed)”)和第35和57天從動物取血。
使用純化的重組BASB027蛋白(0.5μg/孔)，通過ELISA測定抗BASB027蛋白效價。效價定義為等于或比按下面公式計算出的大0.1的最高稀釋度兩個抗血清測試樣品的平均OD-兩個緩沖液測試樣品的平均OD。如上面的實施例4所述，用所述抗血清在蛋白質(zhì)印跡中作為第一抗體鑒定所述蛋白。蛋白質(zhì)印跡顯示在免疫后動物的血清中存在抗BASB027抗體(圖6)。實施例6免疫學(xué)特征鑒定蛋白質(zhì)印跡分析35℃下5％CO2中，在巧克力瓊脂平板上培養(yǎng)幾個粘膜炎莫拉氏菌菌株48小時。使用幾個菌落接種250ml瓶中的25ml MullerHinton肉湯。將培養(yǎng)物培養(yǎng)過夜并通過離心收集。然后通過懸浮30μg細(xì)胞于150μl PAGE樣品緩沖液(360mM Tris緩沖液，pH8.8，含4％十二烷基硫酸鈉和20％甘油)并在100℃培育所述懸浮物5分鐘，溶解細(xì)胞。如以前所述(Thebaine等1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)，在4-20％聚丙烯酰胺凝膠中分離所溶解的細(xì)胞，并在100V下1小時，將分離的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用含5％脫脂乳粉的25ml Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液預(yù)處理所述PVDF膜。使用該預(yù)處理緩沖液進(jìn)行所有隨后的培育。
室溫下用免疫前血清或兔免疫血清的1∶500稀釋物25ml培育PVDF膜1小時。然后用洗滌緩沖液(20mM Tris緩沖液，pH7.5，含有150mM氯化鈉和0.05％Tween-20)洗PVDF膜兩次。室溫下用過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)的1∶5000稀釋物25ml培育PVDF膜30分鐘。然后用洗滌緩沖液洗PVDF膜4次，并用Zymed(San Francisco,CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和過氧化脲各顯色10分鐘。
在所有莫拉氏菌菌株中檢測到一種與所述抗血清反應(yīng)的約95kDa(對應(yīng)于BASB027的預(yù)期分子量)的蛋白(圖7)。殺菌活性檢測抗BASB027抗體的補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性，以確定BASB027多肽的疫苗潛力(potential)。如上制備抗血清。使用Zollinger等描述的“血清殺菌測試”(對腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫應(yīng)答，在Manual of Clinical Laboratory Immunology，第三版，第347-349頁中)，檢測免疫前血清和抗BASB027血清在介導(dǎo)補體殺死粘膜炎莫拉氏菌中的活性，但使用粘膜炎莫拉氏菌菌株或品種的細(xì)胞，而不是腦膜炎奈瑟氏球菌細(xì)胞。
兔抗血清的殺菌效價(殺死50％同源菌株)是＜1∶8(免疫前血清)和＞1∶128(免疫血清)。實施例7在人類恢復(fù)期血清中存在針對BASB027的抗體如上面的實施例4和6所述進(jìn)行純化的重組BASB027的蛋白質(zhì)印跡分析，但使用來自受到粘膜炎莫拉氏菌感染的兒童的人類血清庫作為第一抗體制備物。結(jié)果顯示來自天然感染個體的抗血清與所純化的重組蛋白反應(yīng)。實施例8BASB027肽、抗血清的產(chǎn)生以及它們的反應(yīng)性使用眾所周知的方法，在實驗室中產(chǎn)生兩個短氨基酸BASB027特異性肽，所述肽具有CYAKPLNKKQNDQTDT(SEQ ID NO:9)和YLTARRGQQTTLGEVVC(SEQ ID NO:10)的序列。用這些偶聯(lián)到KLH的肽在12周齡無特定病原體的新西蘭雌性兔中產(chǎn)生抗體。兔以約3周間隔接受4次注射，每次注射在完全氟氏佐劑(第一次注射)或不完全氟氏佐劑(第二、第三、第四次注射)中的200μg肽-KLH。在第一次免疫前和第四次注射后一個月從動物取血。
使用游離肽，通過ELISA測定抗肽的中點效價。第四次免疫后一個月，抗肽的中點效價大于15000。如實施例4和6中所述，使用抗肽抗體作為第一抗體，制備純化的重組BASB027的蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果顯示于圖8。保藏材料包含粘膜炎莫拉氏菌Caltin菌株的保藏物已經(jīng)于1997年6月21日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(本文稱為“ATCC”)，保藏號為43617。所述保藏物被描述為卡他布蘭漢氏菌(Frosch和Kolle)并且是凍干制品。1.5-2.9kb插入片段文庫構(gòu)建自從一位患有慢性支氣管炎的礦工的經(jīng)氣管抽吸物中獲得的粘膜炎莫拉氏菌分離物。該保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21:506-508(1982)中描述。
粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在本文內(nèi)稱為“所述保藏菌株”或“所述保藏菌株的DNA”。
所述保藏菌株包含全長的BASB027基因。
包含插入pQE30內(nèi)的粘膜炎莫拉氏菌DNA的載體pMC-D15的保藏物已經(jīng)于1999年2月12日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為207105。
萬一與本文的任何描述有沖突，則調(diào)制(controlling)包含在所述保藏菌株/克隆內(nèi)的多核苷酸的序列以及其編碼的任何多肽的氨基酸序列。
所述保藏菌株已經(jīng)根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款保藏。一旦授予專利后，則所述保藏菌株將是不可撤消地并且無限制或無條件地發(fā)放給公眾。提供所述保藏菌株僅方便本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員，而不是承認(rèn)保藏是實現(xiàn)所需的，如根據(jù)35U.S.C.§112所要求的。
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals<120>新型化合物<130>BM45324<160>10<170>FastSEQ for Windows版本3.0<210>1<211>2442<212>DNA<213>細(xì)菌<400>1atgcgtaatt catattttaa aggttttcag gtcagtgcaa tgacaatggc tgtcatgatg 60gtaatgtcaa ctcatgcaca agcggcggat tttatggcaa atgacattac catcacagga 120ctacagcgag tgaccattga aagcttacaa agcgtgctgc cgtttcgctt gggtcaagtg 180gtgagcgaaa accagttggc tgatggtgtc aaagcacttt atgcaacagg caatttttca 240gatgtgcaag tctatcatca agaagggcgt atcatctatc aggtaaccga aaggccgtta 300atcgctgaga ttaattttga gggcaatcgc ttaattccaa aagaaggtct acaagaaggg 360ctaaaaaatg ctggcttagc tgtgggtcaa ccactaaaac aagccacagt acagatgatc 420gaaaccgagc ttaccaatca atatatatca caaggctatt ataataccga aattactgtc 480aaacagacga tgcttgatgg taatcgtgtt aagcttgata tgacctttgc tgaaggtaaa 540cctgcacggg tggttgatat taatatcatt ggcaatcagc attttagcga tgcagatttg 600attgatgtgc ttgcgattaa ggataataaa atcaatccac tgtctaaagc tgaccgttat 660actcaagaaa agctggtgac cagtttagag aatttgcgtg ctaaatatct caatgcaggg 720tttgtgcgtt ttgagattaa agatgctaag 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2Met Arg Asn Ser Tyr Phe Lys Gly Phe Gln Val Ser Ala Met Thr Met1 5 10 15Ala Val Met Met Val Met Ser Thr His Ala Gln Ala Ala Asp Phe Met20 25 30Ala Asn Asp Ile Thr Ile Thr Gly Leu Gln Arg Val Thr Ile Glu Ser35 40 45Leu Gln Ser Val Leu Pro Phe Arg Leu Gly Gln Val Val Ser Glu Asn50 55 60Gln Leu Ala Asp Gly Val Lys Ala Leu Tyr Ala Thr Gly Asn Phe Ser65 70 75 80Asp Val Gln Val Tyr His Gln Glu Gly Arg Ile Ile Tyr Gln Val Thr85 90 95Glu Arg Pro Leu Ile Ala Glu Ile Asn Phe Glu Gly Asn Arg Leu Ile100 105 110Pro Lys Glu Gly Leu Gln Glu Gly Leu Lys Asn Ala Gly Leu Ala Val115 120 125Gly Gln Pro Leu Lys Gln Ala Thr Val Gln Met Ile Glu Thr Glu Leu130 135 140Thr Asn Gln Tyr Ile Ser Gln Gly Tyr Tyr Asn Thr Glu Ile Thr Val145 150 155 160Lys Gln Thr Met Leu Asp Gly Asn Arg Val Lys Leu Asp Met Thr Phe165 170 175Ala Glu Gly Lys Pro Ala Arg Val Val Asp Ile Asn Ile Ile Gly Asn180 185 190Gln His Phe Ser Asp Ala Asp Leu Ile Asp Val Leu Ala Ile Lys Asp195 200 205Asn Lys Ile Asn Pro Leu Ser Lys Ala Asp Arg Tyr 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<400>3atgcgtaatt catattttaa aggttttcag gtcagtgcaa tgacaatggc tgtcatgatg 60gtaatgtcaa ctcatgcaca agcggcggat tttatggcaa atgacattgc catcacagga 120ctacagcgag tgaccattga aagcttacaa agcgtgctgc cgtttcgctt gggtcaagtg 180gtgagcgaag cacagttggc tgatggtgtc aaagcacttt atgcaacagg caatttttca 240gatgtgcaag tctatcatca agaagggcgt atcatctatc aggtaaccga aaggccgtta 300atcgctgaga ttaattttga gggcaatcgc ttaattccaa aagaaggtct acaagaaggg 360ctaaaaaatg ctggcttagc tgtgggtcaa ccactaaaac aagccacagt acagatgatc 420gaaaccgagc ttaccaatca atatatatca caaggctatt ataataccga aattactgtc 480aaacagacga tgcttgatgg taatcgtgtt aagcttgata tgacctttgc tgaaggtaaa 540cctgcacggg tggttgatat taatatcatt ggcaatcagc attttagcga tgcagatttg 600attgatgtgc ttgcgattaa ggataataaa atcaatccac tgtctaaagc tgaccgttat 660actcaagaaa agctggtgac cagtttagag aatttgcgtg ctaaatatct caatgcaggg 720tttgtgcgtt ttgagattaa agatgctaag cttaatatta atgaagataa aaaccgtatc 780tttgttgaga tttcattgca tgaaggtgag caatatcgct ttggacagac acagtttttg 840ggtaatttaa cttatactca 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NO:1來自菌株ATCC43617的粘膜炎莫拉氏菌BASB027多核苷酸序列ATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTACCATCACAGGACTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTGGTGAGCGAAAACCAGTTGGCTGATGGTGTCAAAGCACTTTATGCAACAGGCAATTTTTCAGATGTGCAAGTCTATCATCAAGAAGGGCGTATCATCTATCAGGTAACCGAAAGGCCGTTAATCGCTGAGATTAATTTTGAGGGCAATCGCTTAATTCCAAAAGAAGGTCTACAAGAAGGGCTAAAAAATGCTGGCTTAGCTGTGGGTCAACCACTAAAACAAGCCACAGTACAGATGATCGAAACCGAGCTTACCAATCAATATATATCACAAGGCTATTATAATACCGAAATTACTGTCAAACAGACGATGCTTGATGGTAATCGTGTTAAGCTTGATATGACCTTTGCTGAAGGTAAACCTGCACGGGTGGTTGATATTAATATCATTGGCAATCAGCATTTTAGCGATGCAGATTTGATTGATGTGCTTGCGATTAAGGATAATAAAATCAATCCACTGTCTAAAGCTGACCGTTATACTCAAGAAAAGCTGGTGACCAGTTTAGAGAATTTGCGTGCTAAATATCTCAATGCAGGGTTTGTGCGTTTTGAGATTAAAGATGCTAAGCTTAATATTAATGAAGATAAAAACCGTATCTTTGTTGAGATTTCATTGCATGAAGGTGAGCAATATCGCTTTGGACAGACACAGTTTTTGGGTAATTTAACTTATACTCAAGCAGAACTTGAGGCACTGCTTAAATTCAAAGCAGAAGAAGGGTTTTCACAAGCCATGCTTGAGCAAACAACAAACAATATCAGTACCAAATTTGGTGACGATGGCTATTATTATGCTCAAATCCGTCCTGTAACACGCATTAATGATGAAAGTCGTACGGTTGATGTGGAATATTATATTGACCCTGTACACCCTGTCTATGTACGCCGTATTAATTTTACAGGTAACTTTAAGACCCAAGATGAAGTACTCCGTCGTGAGATGCGACAACTTGAAGGTGCGTTGGCATCTAATCAAAAAATCCAGCTGTCTCGTGCACGCTTGATGCGGACTGGGTTTTTTAAACATGTTACCGTTGATACTCGTCCAGTACCCAACTCACCTGATCAGGTTGATGTAAATTTTGTGGTTGAAGAACAACCTTCAGGATCATCAACCATCGCAGCAGGCTACTCTCAAAGTGGTGGTGTAACTTTTCAATTTGATGTTTCTCAAAATAACTTTATGGGTACAGGTAAGCACGTCAATGCTTCGTTTTCTCGCTCTGAGACCCGTGAGGTGTATAGTTTGGGTATGACCAACCCATACTTTACCGTAAATGGCGTCTCGCAAAGCTTGAGTGGCTACTATCGTAAAACCAAGTATGATAACAAGAACATTAGTAATTATGTACTTGATTCTTATGGTGGCTCATTAAGCTATGGATATCCAATTGATGAAAATCAACGCATAAGCTTTGGTCTGAATGCTGACAATACCAAGCTTCATGGCGGTCGTTTTATGGGCATTAGTAATGTCAAGCAGCTGATGGCAGATGGTGGCAAAATTCAAGTGGATAATAATGGCATTCCTGATTTTAAGCATGATTACACAACCTACAATGCCATTTTGGGGTGGAATTATTCAAGTCTAGATCGCCCTGTATTTCCAACCCAAGGCATGAGTCATTCTGTAGATTTGACGGTTGGTTTTGGTGATAAAACTCATCAAAAAGTGGTTTATCAAGGCAATATCTATCGCCCATTTATCAAAAAATCAGTCTTGCGTGGATACGCCAAGTTAGGCTATGGCAATAATTTACCATTTTATGAAAATTTCTATGCAGGCGGCTATGGTTCGGTTCGTGGCTATGATCAATCCTCTTTGGGTCCACGCTCACAAGCCTATTTGACAGCTCGTCGTGGTCAACAAACCACACTAGGAGAGGTTGTTGGTGGTAATGCTTTGGCAACTTTCGGCAGTGAGCTGATTTTACCTTTGCCATTTAAAGGTGATTGGATAGATCAGGTGCGTCCAGTGATATTCATTGAGGGCGGTCAGGTTTTTGATACAACAGGTATGGATAAACAAACCATTGATTTAACCCAATTTAAAGACCCACAAGCAACAGCTGAACAAAATGCAAAAGCAGCCAATCGCCCGCTACTAACCCAAGATAAACAGTTGCGTTATAGTGCTGGTGTTGGTGCAACTTGGTATACGCCCATTGGTCCTTTATCTATTAGCTATGCCAAGCCATTGAATAAAAAACAAAATGATCAGACCGATACGGTACAGTTCCAGATTGGTAGTGTCTTTTAASEQ ID NO:2由SEQ ID NO:1的多核苷酸序列推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB027多肽序列MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVMSTHAQAADFMANDITITGLQRVTIESLQSVLPFRLGQVVSENQLADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNRLIPKEGLQEGLKNAGLAVGQPLKQATVQMIETELTNQYISQGYYNTEITVKQTMLDGNRVKLDMTFAEGKPARVVDINIIGNQHFSDADLIDVLAIKDNKINPLSKADRYTQEKLVTSLENLRAKYLNAGFVRFEIKDAKLNINEDKNRIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGNLTYTQAELEALLKFKAEEGFSQAMLEQTTNNISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVHPVYVRRINFTGNFKTQDEVLRREMRQLEGALASNQKIQLSRARLMRTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDVNFVVEEQPSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKHVNASFSRSETREVYSLGMTNPYFTVNGVSQSLSGYYRKTKYDNKNISNYVLDSYGGSLSYGYPIDENQRISFGLNADNTKLHGGRFMGISNVKQLMADGGKIQVDNNGIPDFKHDYTTYNAILGWNYSSLDRPVFPTQGMSHSVDLTVGFGDKTHQKVVYQGNIYRPFIKKSVLRGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGSVRGYDQSSLGPRSQAYLTARRGQQTTLGEVVGGNALATFGSELILPLPFKGDWIDQVRPVIFIEGGQVFDTTGMDKQTIDLTQFKDPQATAEQNAKAANRPLLTQDKQLRYSAGVGATWYTPIGPLSISYAKPLNKKQNDQTDTVQFQIGSVFSEQ ID NO:3來自菌株ATCC43617的粘膜炎莫拉氏菌BASB027多核苷酸序列ATGCGTAATTCATATTTTAAAGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACTCATGCACAAGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTACCATCACAGGACTACAGCGAGTGACCATTGAAAGCTTACAAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTGGTGAGCGAAAACCAGTTGGCTGATGGTGTCAAAGCACTTTATGCAACAGGCAATTTTTCAGATGTGCAAGTCTATCATCAAGAAGGGCGTATCATCTATCAGGTAACCGAAAGGCCGTTAATCGCTGAGATTAATTTTGAGGGCAATCGCTTAATTCCAAAAGAAGGTCTACAAGAAGGGCTAAAAAATGCTGGCTTAGCTGTGGGTCAACCACTAAAACAAGCCACAGTACAGATGATCGAAACCGAGCTTACCAATCAATATATATCACAAGGCTATTATAATACCGAAATTACTGTCAAACAGACGATGCTTGATGGTAATCGTGTTAAGCTTGATATGACCTTTGCTGAAGGTAAACCTGCACGGGTGGTTGATATTAATATCATTGGCAATCAGCATTTTAGCGATGCAGATTTGATTGATGTGCTTGCGATTAAGGATAATAAAATCAATCCACTGTCTAAAGCTGACCGTTATACTCAAGAAAAGCTGGTGACCAGTTTAGAGAATTTGCGTGCTAAATATCTCAATGCAGGGTTTGTGCGTTTTGAGATTAAAGATGCTAAGCTTAATATTAATGAAGATAAAAACCGTATCTTTGTTGAGATTTCATTGCATGAAGGTGAGCAATATCGCTTTGGACAGACACAGTTTTTGGGTAATTTAACTTATACTCAAGCAGAACTTGAGGCACTGCTTAAATTCAAAGCAGAAGAAGGGTTTTCACAAGCCATGCTTGAGCAAACAACAAACAATATCAGTACCAAATTTGGTGACGATGGCTATTATTATGCTCAAATCCGTCCTGTAACACGCATTAATGATGAAAGTCGTACGGTTGATGTGGAATATTATATTGACCCTGTACACCCTGTCTATGTACGCCGTATTAATTTTACAGGTAACTTTAAGACCCAAGATGAAGTACTCCGTCGTGAGATGCGACAACTTGAAGGTGCGTTGGCATCTAATCAAAAAATCCAGCTGTCTCGTGCACGCTTGATGCGGACTGGGTTTTTTAAACATGTTACCGTTGATACTCGTCCAGTACCCAACTCACCTGATCAGGTTGATGTAAATTTTGTGGTTGAAGAACAACCTTCAGGATCATCAACCATCGCAGCAGGCTACTCTCAAAGTGGTGGTGTAACTTTTCAATTTGATGTTTCTCAAAATAACTTTATGGGTACAGGTAAGCACGTCAATGCTTCGTTTTCTCGCTCTGAGACCCGTGAGGTGTATAGTTTGGGTATGACCAACCCATACTTTACCGTAAATGGCGTCTCGCAAAGCTTGAGTGGCTACTATCGTAAAACCAAGTATGATAACAAGAACATTAGTAATTATGTACTTGATTCTTATGGTGGCTCATTAAGCTATGGATATCCAATTGATGAAAATCAACGCATAAGCTTTGGTCTGAATGCTGACAATACCAAGCTTCATGGCGGTCGTTTTATGGGCATTAGTAATGTCAAGCAGCTGATGGCAGATGGTGGCAAAATTCAAGTGGATAATAATGGCATTCCTGATTTTAAGCATGATTACACAACCTACAATGCCATTTTGGGGTGGAATTATTCAAGTCTAGATCGCCCTGTATTTCCAACCCAAGGCATGAGTCATTCTGTAGATTTGACGGTTGGTTTTGGTGATAAAACTCATCAAAAAGTGGTTTATCAAGGCAATATCTATCGCCCATTTATCAAAAAATCAGTCTTGCGTGGATACGCCAAGTTAGGCTATGGCAATAATTTACCATTTTATGAAAATTTCTATGCAGGCGGCTATGGTTCGGTTCGTGGCTATGATCAATCCTCTTTGGGTCCACGCTCACAAGCCTATTTGACAGCTCGTCGTGGTCAACAAACCACACTAGGAGAGGTTGTTGGTGGTAATGCTTTGGCAACTTTCGGCAGTGAGCTGATTTTACCTTTGCCATTTAAAGGTGATTGGATAGATCAGGTGCGTCCAGTGATATTCATTGAGGGCGGTCAGGTTTTTGATACAACAGGTATGGATAAACAAACCATTGATTTAACCCAATTTAAAGACCCACAAGCAACAGCTGAACAAAATGCAAAAGCAGCCAATCGCCCGCTACTAACCCAAGATAAACAGTTGCGTTATAGTGCTGGTGTTGGTGCAACTTGGTATACGCCCATTGGTCCTTTATCTATTAGCTATGCCAAGCCATTGAATAAAAAACAAAATGATCAGACCGATACGGTACAGTTCCAGATTGGTAGTGTCTTTTAASEQ ID NO:4由SEQ ID NO:3的多核苷酸序列推導(dǎo)出的粘膜炎莫拉氏菌BASB027多肽序列MRNSYFKGFQVSAMTMAVMMVMSTHAQAADFMANDITITGLQRVTIESLQSVLPFRLGQVVSENQLADGVKALYATGNFSDVQVYHQEGRIIYQVTERPLIAEINFEGNRLIPKEGLQEGLKNAGLAVGQPLKQATVQMIETELTNQYISQGYYNTEITVKQTMLDGNRVKLDMTFAEGKPARVVDINIIGNQHFSDADLIDVLAIKDNKINPLSKADRYTQEKLVTSLENLRAKYLNAGFVRFEIKDAKLNINEDKNRIFVEISLHEGEQYRFGQTQFLGNLTYTQAELEALLKFKAEEGFSQAMLEQTTNNISTKFGDDGYYYAQIRPVTRINDESRTVDVEYYIDPVHPVYVRRINFTGNFKTQDEVLRREMRQLEGALASNQKIQLSRARLMRTGFFKHVTVDTRPVPNSPDQVDVNFVVEEQPSGSSTIAAGYSQSGGVTFQFDVSQNNFMGTGKIVNASFSRSETREVYSLGMTNPYFTVNGVSQSLSGYYRKTKYDNKNISNYVLDSYGGSLSYGYPIDENQRISFGLNADNTKLHGGRFMGISNVKQLMADGGKIQVDNNGIPDFKHDYTTYNAILGWNYSSLDRPVFPTQGMSHSVDLTVGFGDKTHQKVVYQGNIYRPFIKKSVLRGYAKLGYGNNLPFYENFYAGGYGSVRGYDQSSLGPRSQAYLTARRGQQTTLGEVVGGNALATFGSELILPLPFKGDWIDQVRPVIFIEGGOVFDTTGMDKQTIDLTQFKDPQATAEQNAKAANRPLLTQDKQLRYSAGVGATWYTPIGPLSISYAKPLNKKQNDQTDTVQFQIGSVFSEQ ID NO:5ACT ATA GGG CAC GCG TGSEQ ID NO:6CCT GCG TTT GTT TGA TTG AGSEQ ID NO:7AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ACA GGA CTA CAG 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權(quán)利要求
1．分離的多肽，所述多肽包含的一段氨基酸序列與由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4選出的氨基酸序列有至少85％同一性。
2．如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的分離的多肽，其中所述氨基酸序列與由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4選出的氨基酸序列有至少95％同一性。
3．如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的多肽，所述多肽包含由以下選出的氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4。
4．SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的分離的多肽。
5．如權(quán)利要求1到4中任一項所要求保護(hù)的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原性與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽基本相同。
6．分離的多核苷酸或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含的一段核苷酸序列編碼分別在SEQ IDNO:2、4的全長上與SEQ ID NO:2、4的氨基酸序列有至少85％同一性的多肽。
7．分離的多核苷酸或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含的一段核苷酸序列與編碼SEQ ID NO:2、4的核苷酸序列在整個編碼區(qū)上有至少85％同一性。
8．分離的多核苷酸或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含的一段核苷酸序列分別在SEQ ID NO:1、3的全長上與SEQ ID NO:1、3的核苷酸序列有至少85％同一性。
9．如權(quán)利要求6到8中任一項所要求保護(hù)的分離的多核苷酸，其中所述與SEQ ID NO:1、3的同一性至少為95％。
10．分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽的核苷酸序列。
11．包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的多核苷酸的分離的多核苷酸。
12．分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含的一段核苷酸序列編碼通過在嚴(yán)格雜交條件下，使用具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3的序列或它們的片段的標(biāo)記探針篩選合適文庫可獲得的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4的多肽。
13．表達(dá)載體或重組的活微生物，所述表達(dá)載體或重組的活微生物包含依照權(quán)利要求6-12中任一項的分離的多核苷酸。
14．宿主細(xì)胞或所述宿主細(xì)胞表達(dá)分離的多肽的亞細(xì)胞部分或膜，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求13的表達(dá)載體，所述分離的多肽包含與由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4選出的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列。
15．產(chǎn)生多肽的方法，所述多肽包含與由SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4選出的氨基酸序列有至少85％同一性的氨基酸序列，所述方法包括在足以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基中回收所述多肽。
16．表達(dá)權(quán)利要求6-12中任一項的多核苷酸的方法，包括用包含所述多核苷酸中至少一種的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后在足以表達(dá)所述多核苷酸中任何一種的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
17．疫苗組合物，包含有效量的權(quán)利要求1到5中任一項的多肽以及一種藥學(xué)上可接受的載體。
18．疫苗組合物，包含有效量的權(quán)利要求6到12中任一項的多核苷酸以及一種藥學(xué)上有效的載體。
19．依照權(quán)利要求17或18中任一項的疫苗組合物，其中所述組合物包含至少一種其它粘膜炎莫拉氏菌抗原。
20．對如權(quán)利要求1到5中任一項要求保護(hù)的多肽或免疫片段具有免疫特異性的抗體。
21．診斷粘膜炎莫拉氏菌感染的方法，包括鑒定來自懷疑受到這樣一種感染的動物的生物學(xué)樣品中如權(quán)利要求1-5中任一項所要求保護(hù)的多肽的存在，或?qū)λ龆嚯木哂忻庖咛禺愋缘目贵w的存在。
22．組合物在制備藥物中的用途，所述組合物包含免疫有效量的如權(quán)利要求1-5中任一項所要求保護(hù)的多肽，所述藥物用于在動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
23．組合物在制備藥物中的用途，所述組合物包含免疫有效量的如權(quán)利要求6-12中任一項所要求保護(hù)的多核苷酸，所述藥物用于在動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
24．可用于治療患有粘膜炎莫拉氏菌疾病的人類的治療組合物，所述組合物包含至少一種針對權(quán)利要求1-5的多肽的抗體以及一種合適的藥學(xué)載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了BASB027多肽和編碼BASB027多肽的多核苷酸,以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生這樣的多肽的方法。還提供了診斷、預(yù)防和治療應(yīng)用。
文檔編號A61P31/04GK1311820SQ99809199
公開日2001年9月5日 申請日期1999年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月3日
發(fā)明者C·維納爾斯懷德巴索爾斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司