專利名稱：莫拉氏菌屬的疫苗抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莫拉氏菌屬、特別是牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)的抗原、編碼這些抗原的核酸序列和用于提高抗莫拉氏菌屬的免疫應(yīng)答的制劑。
背景技術(shù)：
傳染性牛角膜結(jié)膜炎(IBK)是一種經(jīng)濟(jì)上重要的牛疾病，是由革蘭氏陰性球桿菌牛莫拉氏菌所導(dǎo)致的。IBK更普遍地稱為紅眼病，是一種接觸傳染性高的眼部感染，可以從輕微結(jié)膜炎發(fā)展為嚴(yán)重潰瘍、角膜穿孔和失明。在控制IBK中治療性與預(yù)防性措施僅取得有限成功，需要預(yù)防該疾病的疫苗。引起生物毒力的因素有很多，迄今得到認(rèn)定的兩種最重要的屬性是菌毛的表達(dá)和產(chǎn)生溶血素的能力。根據(jù)菌毛的類型，在澳大利亞、英國和美國分離的七種不同的牛莫拉氏菌菌株血清群已經(jīng)得到鑒別(1)。有效的菌毛類疫苗必須含有來自所有七種血清型的足量菌毛，以成為完全保護(hù)性的，因?yàn)閮煞N血清型之間缺乏交叉保護(hù)(2，3)。尚未實(shí)現(xiàn)所有七種菌毛血清型的表達(dá)水平之高足以可用于商品疫苗制備。
理想的疫苗候選者刺激對(duì)抗牛莫拉氏菌的保護(hù)作用，它將是這樣一種分子，在該菌種所有菌株中是非常保守的?？赡艿暮蜻x者是由牛莫拉氏菌產(chǎn)生的溶血素、蛋白酶、脂肪酶和/或磷脂酶(4)。例如，來自牛莫拉氏菌的一種溶血性菌株的部分純化的無細(xì)胞上清液已經(jīng)顯示帶來對(duì)抗異種的野生型攻擊的顯著保護(hù)作用(5)。溶血素在牛莫拉氏菌的所有七種血清型中保守的可能性使它成為對(duì)抗IBK的潛在疫苗候選者。不過，研究人員迄今既不能克隆編碼溶血素的基因，也不能純化該蛋白質(zhì)達(dá)到同源性。雖然如此，任意或所有這些分子單獨(dú)或組合都能夠證實(shí)可用于產(chǎn)生對(duì)抗IBK有效的疫苗。
發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明在于多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所述氨基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1所示序列的同一性為至少70％的序列，更優(yōu)選為至少80％，最優(yōu)選為至少90％。
在本發(fā)明第一方面進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽具有蛋白酶活性。
在第二方面，本發(fā)明在于核酸分子，該核酸分子編碼本發(fā)明第一方面的多肽。
在第三方面，本發(fā)明在于核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.2所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴(yán)格條件下與之雜交的序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少70％的序列，更優(yōu)選為至少80％，最優(yōu)選為至少90％。
在第四方面，本發(fā)明在于用于提高動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含本發(fā)明第一方面的多肽或本發(fā)明第二方面的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
在第五方面，本發(fā)明在于多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所述氨基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性為至少70％的序列，更優(yōu)選為至少80％，最優(yōu)選為至少90％。
在第五方面進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽具有脂肪酶活性。
在第六方面，本發(fā)明在于核酸分子，該核酸分子編碼本發(fā)明第五方面的多肽。
在第七方面，本發(fā)明在于核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.4所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴(yán)格條件下與之雜交的序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少70％的序列，更優(yōu)選為至少80％，最優(yōu)選為至少90％。
在第八方面，本發(fā)明在于用于提高動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含本發(fā)明第五方面的多肽或本發(fā)明第六方面的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
在第九方面，本發(fā)明在于多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.5所述氨基酸序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或其功能片段。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少70％的序列，更優(yōu)選為至少80％，最優(yōu)選為至少90％。
在第九方面進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，該多肽具有溶血素活性。
在第十方面，本發(fā)明在于核酸分子，該核酸分子編碼本發(fā)明第九方面的多肽。
在第十一方面，本發(fā)明在于核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.6所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴(yán)格條件下與之雜交的序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少70％的序列，更優(yōu)選為至少80％，最優(yōu)選為至少90％。
在第十二方面，本發(fā)明在于用于提高動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含本發(fā)明第九方面的多肽或本發(fā)明第十方面的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
本文所用的術(shù)語“功能片段”打算覆蓋保留完全多肽至少10％生物活性的多肽片段。該術(shù)語特別用于涵蓋顯示與完整多肽的免疫交叉反應(yīng)性的片段，例如與片段反應(yīng)也與完全多肽反應(yīng)的配體。
在第十三方面，本發(fā)明在于用于提高動(dòng)物針對(duì)莫拉氏菌屬的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含至少一種多肽，選自由本發(fā)明第一、第五和第九方面的多肽組成的組，可選地還包括佐劑或載體。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該組合物包括本發(fā)明第九方面的多肽和本發(fā)明第一與第五方面的多肽之一，或優(yōu)選地二者皆是。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該莫拉氏菌是牛莫拉氏菌或黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)，最優(yōu)選為牛莫拉氏菌。
在第十四方面，本發(fā)明在于針對(duì)多肽而產(chǎn)生的抗體，該多肽選自由第一、第五和第九方面的多肽組成的組。
正如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所易于領(lǐng)會(huì)的，本發(fā)明的多肽與抗體和從核苷酸序列衍生的探針作為診斷試劑，能夠用于測(cè)定莫拉氏菌屬、特別是牛莫拉氏菌感染。例如，多肽和抗體能夠用在ELISA類測(cè)定法中，而探針能夠用在PCR類測(cè)定法中。探針的長度將提供所需的特異性水平，通常將是至少18個(gè)核苷酸。
遍及本說明書的詞語“包含”或類似表達(dá)將被理解為意味著包括所述要素、整數(shù)或步驟、或要素、整數(shù)或步驟組在內(nèi)，但不排除任意其他要素、整數(shù)或步驟、或要素、整數(shù)或步驟組。
附圖的簡要說明

圖1來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的蛋白酶的核苷酸與氨基酸序列。推定的啟動(dòng)子序列僅有下劃線。推定的核糖體結(jié)合部位以粗體和下劃線表示。推定的起始密碼子以粗體表示。推定的轉(zhuǎn)錄終止子序列用倒置的箭頭指出。核苷酸與氨基酸序列的編號(hào)都表示在左手側(cè)。
圖2來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的脂肪酶的核苷酸與氨基酸序列。推定的啟動(dòng)子序列僅有下劃線。推定的核糖體結(jié)合部位以粗體和下劃線表示。推定的起始密碼子以粗體表示。推定的轉(zhuǎn)錄終止子序列用倒置的箭頭指出。核苷酸與氨基酸序列的編號(hào)都表示在左手側(cè)。
圖3來自牛莫拉氏菌的脂肪酶在其重組形式(pMB1/MC1061)中被表達(dá)時(shí)的熱穩(wěn)定性(在90℃下進(jìn)行加熱)。
圖4(i)天然形式與(ii)重組形式牛莫拉氏菌的生長速率和脂肪酶的表達(dá)水平比較。生長速率以實(shí)心條表示，脂肪酶表達(dá)水平以空心菱形表示。
圖5來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的RTX毒素A亞單位的核苷酸與氨基酸序列。推定的核糖體結(jié)合部位以粗體和下劃線表示。推定的起始密碼子以粗體表示。A亞單位可譯框架的上游是C亞單位編碼區(qū)的一部分(核苷酸1至195)(對(duì)應(yīng)的氨基酸序列以SEQ ID NO8表示)，A亞單位的下游是B亞單位編碼區(qū)的一小部分(核苷酸3080至3250)(對(duì)應(yīng)的氨基酸序列以SEQ ID NO9表示)。核苷酸與氨基酸序列的編號(hào)都表示在左手側(cè)。
發(fā)明的詳細(xì)說明為了更清楚地理解本發(fā)明的本性，現(xiàn)在根據(jù)下列非限制性實(shí)施例描述其優(yōu)選方式。
通用分子生物學(xué)除非另有指示，用在本發(fā)明中的重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序。這類技術(shù)在文獻(xiàn)來源中有所描述和解釋，例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆實(shí)踐指南)，JohnWiley和Sons(1984)；J.Sambrook等，Molecualr CloningALaboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)；T.A.Brown(編者)，Essential MolecularBiologyA Practical Approach(基本分子生物學(xué)實(shí)踐方法)，第1卷和第2卷，IRL Press(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(編者)，DNA CloningA Practical Approach(DNA克隆實(shí)踐方法)，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)；F.M.Ausubel等(編者)，CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物學(xué)方法)，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括迄今所有更新)，引用在此作為參考文獻(xiàn)。
蛋白質(zhì)變體向DNA引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓?，或者體外合成所需的多肽，可以制備氨基酸序列變體。這類變體例如包括氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失、插入或取代?？梢赃M(jìn)行缺失、插入和取代的組合，以得到最終的構(gòu)建體，只要最終的蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有所需特征即可。氨基酸變化還可以改變翻譯后過程，例如改變膜錨著特征，通過插入、缺失或影響天生蛋白質(zhì)的跨膜序列改變細(xì)胞內(nèi)定位，或者修飾它對(duì)蛋白水解裂解作用的易感性。
在設(shè)計(jì)氨基酸序列變體時(shí)，突變部位的定位和突變的本性將取決于所要修飾的特征?？梢詥为?dú)或連續(xù)修飾突變部位，例如通過(1)首先用保守性氨基酸選擇取代，然后用更自由的選擇取代，這取決于所達(dá)到的結(jié)果，(2)缺失靶殘基，或者(3)在與所定位的部位相鄰處插入其他配體的殘基。
可用于鑒別進(jìn)行誘變的殘基或區(qū)域的方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells所述(Science(科學(xué))(1989)2441081-1085)。這里，鑒別一個(gè)殘基或靶殘基組(例如帶電殘基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或帶負(fù)電氨基酸(最優(yōu)選為丙氨酸或多丙氨酸)代替，以影響氨基酸與細(xì)胞內(nèi)或外周圍水性環(huán)境的相互作用。然后通過引入進(jìn)一步的或其他變體精制證明對(duì)取代的功能敏感性的那些結(jié)構(gòu)域。因而，盡管用于引入氨基酸序列變異的部位是預(yù)定的，不過突變本身的本性不必是預(yù)定的。例如，為了優(yōu)化給定部位上的突變性能，可以在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，篩選被表達(dá)變體關(guān)于所需活性的最佳組合。
在氨基酸序列變體的構(gòu)建中存在兩個(gè)主要變量突變部位的定位和突變的本性。它們可以代表天然存在的等位基因或預(yù)定的突變體形式，后者是通過使DNA突變?yōu)榈任换蚧蜃匀唤绮淮嬖诘淖凅w而制成的。一般來說，突變的定位和本性的選擇將取決于所要修飾的特征。
氨基酸序列的缺失一般從約1至30個(gè)殘基，更優(yōu)選為約1至10個(gè)殘基，通常為約1至5個(gè)毗鄰殘基。
氨基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端融合，長度從一個(gè)殘基至含有一百個(gè)或以上殘基的多肽，以及單或多氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。其他插入變體包括蛋白質(zhì)的N-或C-末端與免疫原性多肽的融合，后者例如細(xì)菌多肽，如β內(nèi)酰胺酶或被大腸桿菌trp部位所編碼的酶，或酵母蛋白、牛血清白蛋白和趨化性多肽。包括C-末端與半衰期長的蛋白質(zhì)的融合，后者例如免疫球蛋白恒定區(qū)(或其他免疫球蛋白區(qū)域)、白蛋白或鐵蛋白。
另一組變體是氨基酸取代變體。這些變體除去蛋白質(zhì)分子中的至少一個(gè)氨基酸殘基，并在其位置插入不同的殘基。最相關(guān)的取代誘變部位包括被鑒別為活性部位的部位。其他有關(guān)部位是其中得自各種物種的特定殘基是同一的那些。這些位置對(duì)生物活性來說可能是重要的。這些部位、尤其是屬于至少其他三個(gè)同樣保守的部位序列的那些以相對(duì)保守性方式被取代。這類保守性取代如表1“優(yōu)選的取代”下所示。如果這類取代導(dǎo)致生物活性的變化，那么引入更實(shí)質(zhì)性的變化，在表1中命名為示范的取代，或者進(jìn)一步描述在關(guān)于氨基酸類的下文中；并且篩選產(chǎn)物。
表1
突變體、變體和同源性——蛋白質(zhì)突變體多肽將具有一種或多種突變，它們是氨基酸殘基的缺失、插入或取代。突變體既可以是天然存在的(也就是說，是從天然來源純化或分離的)，也可以是合成的(例如，對(duì)編碼性DNA進(jìn)行部位定向的誘變)。因而顯然，本發(fā)明的多肽既可以是天然存在的，也可以是重組的(也就是說，是利用重組DNA技術(shù)制備的)。
等位基因變體將是在單獨(dú)生物體內(nèi)天然存在的變體。
如果蛋白質(zhì)序列與來自共同祖先的趨異有關(guān)，那么它們是同源的。所以，蛋白質(zhì)的一種物種同系物將是天然存在于另一物種中的等價(jià)蛋白質(zhì)。在任意一種物種內(nèi)，同系物可以以大量等位基因變體的形式存在，它們將被視為蛋白質(zhì)的同系物。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的下列標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以得到等位基因變體和物種同系物。優(yōu)選的物種同系物包括得自同門代表性物種的那些，更優(yōu)選為同綱，進(jìn)而更優(yōu)選為同目。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)Ad.Appl.Math.(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展)，2482-489或Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)，48443-453所述方法)所測(cè)定的，本發(fā)明包括與本發(fā)明的同一性至少50％的蛋白質(zhì)，與本發(fā)明蛋白質(zhì)的同一性優(yōu)選為至少70％或80％，更優(yōu)選為至少90％。這一般將是至少20個(gè)、優(yōu)選為至少30個(gè)毗鄰氨基酸的區(qū)域。
突變體、變體和同源性——核酸突變體多核苷酸將具有一種或多種突變，它們是核苷酸殘基的缺失、插入或取代。突變體既可以是天然存在的(也就是說，是從天然來源分離的)，也可以是合成的(例如，對(duì)DNA進(jìn)行部位定向的誘變)。因而顯然，本發(fā)明的多核苷酸既可以是天然存在的，也可以是重組的(也就是說，是利用重組DNA技術(shù)制備的)。
等位基因變體將是在單獨(dú)生物體內(nèi)天然存在的變體。
如果核苷酸序列與來自共同祖先的趨異有關(guān)，那么它們是同源的。所以，多核苷酸的一種物種同系物將是天然存在于另一物種中的等價(jià)多核苷酸。在任意一種物種內(nèi)，同系物可以以大量等位基因變體的形式存在，它們將被視為多核苷酸的同系物。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的下列標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以得到等位基因變體和物種同系物。優(yōu)選的物種同系物包括得自同門代表性物種的那些，更優(yōu)選為同綱，進(jìn)而更優(yōu)選為同目。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)Ad.Appl.Math.(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展)，2482-489或Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)，48443-453所述方法)所測(cè)定的，本發(fā)明包括與本發(fā)明的同一性至少70％的多核苷酸，與本發(fā)明多核苷酸的同一性優(yōu)選為至少80％或90％，更優(yōu)選為至少95％。這一般將是至少60個(gè)、優(yōu)選為至少90個(gè)毗鄰核苷酸殘基的區(qū)域。
抗體的產(chǎn)生術(shù)語“抗體”應(yīng)當(dāng)被解釋為覆蓋任意特異性結(jié)合物質(zhì)，具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所需特異性。因而，該術(shù)語覆蓋抗體片段、抗體的衍生物、功能等價(jià)物和同系物，包括任何包括免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，天然或合成的均可。因此包括與另一種多肽融合的嵌合分子或等價(jià)物，其中包括免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
本領(lǐng)域技術(shù)人員利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以生產(chǎn)對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)來說是特異性的多克隆或單克隆抗體，例如但不限于Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Springs HarborLaboratory Press(1988)和D.Catty(編者)，AntibodiesA PracticalApproach(抗體實(shí)用方法)，IRL Press(1988)所述的那些。
各種本領(lǐng)域已知程序可以用于生產(chǎn)抗蛋白質(zhì)表位的多克隆抗體。關(guān)于多克隆抗體的生產(chǎn)，大量宿主動(dòng)物都是抗體產(chǎn)生可接受的，利用多肽制備物的一次或多次注射致免疫，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。各種佐劑可以用于增加宿主動(dòng)物的免疫應(yīng)答，取決于宿主的種類，包括但不限于弗羅因德氏佐劑(完全的與不完全的)，礦物凝膠、例如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)、例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、油乳劑、鑰孔戚血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚，和潛在有用的人佐劑、例如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
抗蛋白質(zhì)表位的單克隆抗體可以利用任何為抗體分子的產(chǎn)生而在培養(yǎng)物中提供連續(xù)細(xì)胞系的技術(shù)加以制備。這些技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)，最初由Kohler和Milstein(1975，Nature(自然)256，493-497)所描述，和最近的人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kesber等，1983，ImmunologyToday(今日免疫學(xué))472)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(單克隆抗體與癌癥療法)，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。另外，可以使用為生產(chǎn)“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)，剪接具有適當(dāng)抗原特異性的抗體分子基因以及具有適當(dāng)生物活性的人抗體分子基因(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國國家科學(xué)院院報(bào))，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature(自然)312604-608；Takeda等，1985，Nature(自然)31452-454)?；蛘?，所述用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)經(jīng)過修改，能夠生產(chǎn)4-特異性單鏈抗體。
重組人或人源化版本的單克隆抗體是人治療應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方式。人源化抗體可以按照文獻(xiàn)程序加以制備(例如Jones等，1986，Nature(自然)321522-25；Reichman等，1988，Nature(自然)332323-27；Verhoeyen等，1988，Science(科學(xué))2391534-36)。最近所述用于生產(chǎn)人源化單克隆抗體的“基因轉(zhuǎn)化誘變”策略也可以用于生產(chǎn)人源化抗體(Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國國家科學(xué)院院報(bào))，894285-89)?；蛘撸糜诋a(chǎn)生重區(qū)與輕區(qū)隨機(jī)組合的重組噬菌體文庫的技術(shù)可以用于制備重組抗體(例如Huse等，1989 Science(科學(xué))2461275-81)。
通過已知技術(shù)可以產(chǎn)生含有分子獨(dú)特型、例如Fu F(ab1)和F(ab2)的抗體片段。例如，這類片段包括但不限于F(ab)E2片段，它可以通過完整抗體分子的胃蛋白酶消化而生產(chǎn)；Fab1片段，它可以通過還原F(ab1)2片段的二硫橋而產(chǎn)生；和兩種Fab片段，它們可以通過將抗體分子用木瓜蛋白酶和還原劑處理而產(chǎn)生。或者，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等，1989，Science(科學(xué))2461275-1281)，以便迅速和容易克隆具有所需特異性的單克隆Fab片段，得到蛋白質(zhì)。
佐劑和載體藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑包括用在組合物中的那些，該組合物適合于口服、直腸、鼻、局部(包括頰和舌下)、陰道、腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外)給藥。它們?cè)谒脛┝亢蜐舛认聦?duì)受者是無毒的。藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的代表性實(shí)例包括但不限于水；等滲溶液，它們優(yōu)選地被緩沖為生理pH(例如磷酸鹽緩沖鹽水或Tris緩沖鹽水)，還可以含有一種或多種甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、乙醇或多肽(例如人血清白蛋白)。組合物適宜為單位劑型，可以通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任意方法加以制備。
如上所述，組合物可以包括佐劑。正如將被理解的，“佐劑”表示由一種或多種物質(zhì)組成的組合物，它增強(qiáng)疫苗組合物的致免疫性和功效。適合的佐劑的非限制性實(shí)例包括角鯊?fù)楹徒酋徬?或其他動(dòng)物來源的油)；嵌段共聚物；洗滌劑，例如Tween-80、QuilA；礦物油，例如Drakeol或Marcol；植物油，例如花生油；從棒狀桿菌屬(Corynebacterium)衍生的佐劑，例如小棒狀桿菌；從丙酸桿菌屬(Propionibacterium)衍生的佐劑，例如痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acne)；牛結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG)；白介素，例如白介素2和白介素12；單核因子，例如白介素1；腫瘤壞死因子；干擾素，例如γ干擾素；組合，例如皂甙-氫氧化鋁或Quil A-氫氧化鋁；脂質(zhì)體；ISCOM佐劑；分支桿菌細(xì)胞壁提取物；合成的糖肽，例如胞壁酰二肽或其他衍生物；阿夫立定；脂質(zhì)A衍生物；葡聚糖硫酸酯；DEAE-葡聚糖或含有磷酸鋁；羧聚乙烯，例如Carbopol’EMA；丙烯酸共聚物乳劑，例如NeocrylA640(例如美國專利No.5,047,238)；牛痘或動(dòng)物痘病毒蛋白；亞病毒粒子佐劑，例如霍亂毒素，或它們的混合物。
基因/DNA分離編碼蛋白質(zhì)的DNA可以得自任意cDNA文庫，該文庫是從據(jù)信以可檢出水平表達(dá)基因mRNA的組織制備的。DNA也可以得自基因組文庫。
用設(shè)計(jì)用來鑒別有關(guān)基因或被其編碼的蛋白質(zhì)的探針或分析工具篩選文庫。關(guān)于cDNA表達(dá)文庫，適合的探針包括識(shí)別并特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的單克隆或多克隆抗體；長約20-80個(gè)堿基的寡核苷酸，編碼相同或不同物種cDNA的已知或可疑部分；和/或互補(bǔ)性或同源性cDNA或其片段，編碼相同或雜交基因。適合于篩選基因組DNA文庫的探針包括但不限于寡核苷酸；cDNA或其片段，編碼包括被表達(dá)序列標(biāo)記等的相同或雜交DNA；和/或同源性基因組DNA或其片段。用所選擇的探針篩選cDNA或基因組文庫可以利用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，如Sambrook等第10-12章所述。
分離編碼有關(guān)蛋白質(zhì)的基因的替代手段是利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法學(xué)，如Sambrook等第14節(jié)所述。該方法要求使用與基因雜交的寡核苷酸探針。
選擇作為探針的寡核苷酸序列應(yīng)當(dāng)是足夠長的和足夠明確的，假陽性是最小化的。實(shí)際的核苷酸序列通?；诨虻谋Ｊ匦曰蚋咄葱院塑账嵝蛄谢騾^(qū)域。寡核苷酸可以在一個(gè)或多個(gè)位置是簡并性的。若篩選其中優(yōu)先密碼子在該物種中的用途已知的物種文庫，簡并性寡核苷酸的使用可能是特別重要的。寡核苷酸必須被標(biāo)記，以便它在與所篩選的文庫中的DNA雜交后能夠被檢出。優(yōu)選的標(biāo)記方法是使用(α-32P)-dATP與多核苷酸激酶，這是本領(lǐng)域熟知的，以放射性標(biāo)記寡核苷酸。不過，其他方法也可以用于標(biāo)記寡核苷酸，包括但不限于生物素基化作用或酶標(biāo)記。
涵蓋所有蛋白質(zhì)編碼序列的DNA是這樣獲得的，篩選所選擇的cDNA或基因組文庫，如果必要的話，利用如Sambrook等第7.79節(jié)所述常規(guī)的引物延長程序，以檢測(cè)可能沒有被逆轉(zhuǎn)錄到cDNA中的mRNA的前體和加工中間體。
用于獲得有關(guān)基因的另一種替代方法是利用Fingels等所述方法之一化學(xué)合成之(Agnew Chem.Int.Ed.Engl.(應(yīng)用化學(xué)國際英文版)28716-734，1989)。這些方法包括三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺與H-膦酸酯法、PCR與其他自動(dòng)引物(autoprimer)法、和固體載體上的寡核苷酸合成。如果基因的全部核酸序列是已知的，或者與編碼鏈互補(bǔ)的核酸序列是可利用的，那么可以使用這些方法，或者如果靶氨基酸序列是已知的，那么人們可以利用關(guān)于每種氨基酸殘基已知的和優(yōu)選的編碼殘基推斷可能的核酸序列。
基本上純化的“基本上純化的”表示已經(jīng)從脂質(zhì)、核酸、其他多肽和其他污染分子中分離的多肽。
雜交本發(fā)明的多核苷酸序列可以在高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NOS 2、4或6所述各序列雜交。本文所用的嚴(yán)格條件是(i)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行雜交后的洗滌，例如0.1×SSC與0.1％(w/v)SDS、50℃；(ii)在雜交期間采用這樣的條件，雜交溫度比雜交中的多核苷酸的雙螺旋熔化溫度低25℃，例如1.5×SSPE、10％(w/v)聚乙二醇6000、7％(w/v)SDS、0.25mg/ml片段化鯡魚精子DNA、65℃；或(iii)例如0.5M磷酸鈉，pH 7.2、5mM EDTA、7％(w/v)SDS和0.5％(w/v)BLOTTO、70℃；或(iv)在雜交期間采用變性劑，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺，與5×SSC、50mM磷酸鈉(pH 6.5)和5×Denhardt溶液(32)、42℃；或(v)例如采用50％(v/v)甲酰胺、5×SSC、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1％(w/v)焦磷酸鈉、5×Denhardt溶液、超聲處理過的鮭魚精子DNA(50μg/ml)和10％葡聚糖硫酸酯、42℃。
實(shí)施例1本實(shí)施例描述來自牛莫拉氏菌的蛋白酶的克隆和鑒定。
細(xì)菌和基因組文庫的構(gòu)建牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是從牛眼收集的場(chǎng)分離物，通過CSIROAnimal Health，Parkville，Australia鑒定(6)。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α以前已有描述(7，8)。
所有酶均購自Promega(Madison，WI，USA)，另有注解除外。
一般的克隆和DNA技術(shù)如文獻(xiàn)所述(9)，另有注解除外。
基因組文庫是這樣構(gòu)建的，利用下述CTAB法在從牛莫拉氏菌Dalton2d菌株提取的基因組DNA上進(jìn)行部分Sau3A消化。將這種DNA用NaCl梯度進(jìn)行尺寸分級(jí)(10)，與預(yù)先已用BamHI消化的粘?？寺≥d體pHC79形成配合物(11)。利用Packagene Lambda DNA包裝系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，USA)將這種DNA包裝在λ噬菌體頭內(nèi)，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌菌株DH5α。將文庫貯存在96孔托盤(50％甘油/luria肉湯/氨芐西林(50μg/ml))和-70℃下。
牛莫拉氏菌的CTAB基因組DNA提取在5ml腦心浸劑(BHI)(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)肉湯中接種取自馬血瓊脂上的新鮮過夜培養(yǎng)基的Dalton 2d菌落，在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)6小時(shí)。該培養(yǎng)物用于接種50ml BHI肉湯，在37℃下?lián)u動(dòng)生長過夜。將40ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至SS34試管，在3000xg下離心10分鐘使細(xì)胞形成粒狀沉淀。將粒狀沉淀再次懸浮在9.5ml含25％蔗糖的TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA(pH8))中后，加入500μl 10％SDS、50μl20mg/ml蛋白酶K和20μl 10mg/ml RNA酶A，將該混合物在37℃軌道搖瓶內(nèi)培養(yǎng)1小時(shí)。向該混合物中加入1.8ml 5M NaCl和1.5ml CTAB(N-鯨蠟基-N，N，N-三甲基-溴化銨)/NaCl溶液，繼續(xù)在65℃下培養(yǎng)20分鐘。使用苯酚/氯仿提取DNA，用0.6體積異丙醇沉淀。將所得DNA用70％乙醇洗滌，干燥，再次懸浮在2ml TE緩沖液中。
篩選基因組文庫的酶活性為篩選顯示蛋白酶活性的克隆體的存在，在37℃下在脫脂乳瓊脂(雙強(qiáng)度哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)/10％脫脂乳)上培養(yǎng)基因組文庫達(dá)24小時(shí)，然后在4℃下冷藏一至兩天。
檢測(cè)到來自基因組文庫的單一克隆體具有抗脫脂乳瓊脂活性。DNA分析確認(rèn)該克隆體含有牛莫拉氏菌Dalton 2d基因組DNA，大小為大約4萬個(gè)堿基。該構(gòu)建體被稱為pJF1。
牛莫拉氏菌蛋白酶克隆體pJF1的核苷酸序列分別利用Wizard Plus SV Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，USA)和Qiagen Plasmid Midi試劑盒(Qiagen Pty.Ltd.，Clifton Hill，Vic，Australia)提取質(zhì)粒和粘粒DNA，用于自動(dòng)測(cè)序。
利用“引物步行”過程測(cè)定插入片段DNA的核苷酸序列(12)。這是利用合成寡核苷酸(Bresatec/Geneworks，Thebarton，SA，Australia)和染劑終止子循環(huán)測(cè)序備用反應(yīng)(Perkin Elmer Corporation，Norwalk，CT，USA)來實(shí)現(xiàn)的。在Applied Biosystems 373A DNA序列分析儀上分析所得序列。
自動(dòng)測(cè)序揭示3345bp可譯框架能夠編碼1115個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。按5’至3’方向書寫序列，如圖1所示，其中還有預(yù)期編碼分子量為120kDa的蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列。氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，DNA序列如SEQ ID NO 2所示。
通過可能的上游核糖體結(jié)合部位的存在鑒別關(guān)于成熟蛋白酶蛋白的公認(rèn)起始密碼子。通過與大腸桿菌RBS共有序列的相似性鑒別這種RBS，以前用于鑒別牛莫拉氏菌菌毛蛋白基因(AGGAG)(27)。
由于蛋白酶的秘密本性，假定它在其N-末端序列中含有用于蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)肽。利用可從Expasy網(wǎng)站(http//www.expasy.ch/tools/)得到的預(yù)測(cè)程序(SignalP)進(jìn)行這種分析，可鑒別原核生物的信號(hào)肽，預(yù)測(cè)可能的裂解部位。這種分析僅利用伴隨蛋白質(zhì)/DNA序列所示起始密碼子鑒別信號(hào)肽。
序列對(duì)比利用可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov得到的BlastX與BlastP程序進(jìn)行所推導(dǎo)的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中的序列的對(duì)比。
在氨基酸水平上，從Dalton 2d克隆的蛋白酶顯示下列與所列蛋白質(zhì)的相似性和同一性。生物體 蛋白質(zhì) 相似性 同一性粘質(zhì)沙雷氏菌 ssp-h2-絲氨酸蛋白酶39％ 23％(Serratia marcescens)自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白粘質(zhì)沙雷氏菌 ssp-h1-絲氨酸蛋白酶37％ 22％自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白熒光假單胞菌 絲氨酸蛋白酶同系物 34％ 20％(Pseudomonas fluorescens)托拉假單胞菌 絲氨酸蛋白酶 35％ 21％(Pseudomonas tolaasii)更一般地，牛莫拉氏菌蛋白酶的5’結(jié)構(gòu)域顯示與枯草桿菌蛋白酶(絲氨酸蛋白酶)家族的同源性，而3’區(qū)域類似于大量外膜蛋白。
發(fā)現(xiàn)牛莫拉氏菌序列含有富集大量脯氨酸的區(qū)域，這區(qū)別于所有其他與之密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。
被pJF1編碼的蛋白酶類型為了鑒別被pJF1編碼的蛋白酶活性類型，檢查了一定范圍特異性蛋白酶抑制劑對(duì)牛莫拉氏菌蛋白酶表達(dá)的作用。
利用Bourgeau等(1992)(14)的方法測(cè)定抑制劑活性，并作下列修改。將來自新鮮過夜肉湯培養(yǎng)物的100μl無細(xì)胞上清液與650μl 100mMTris(pH 7.2)和適合體積的抑制劑(PMSF(苯甲磺酰氟)5mM；EDTA 5mM；亮肽素100μg/ml；胃酶抑素50μg/ml)混合。用蒸餾水加至體積達(dá)1ml。將混合物在37℃下培養(yǎng)30分鐘，然后加入10mg azocoll(Calbiochem，Alexandria，NSW，Australia)。將懸液在37℃下培養(yǎng)16小時(shí)，讀取520nm下的光密度。
按照這種方法確認(rèn)了可歸因于被pJF1編碼的蛋白酶的活性是絲氨酸蛋白酶的活性，因?yàn)镻MSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)減少Dalton 2d和pJF1的蛋白酶活性至零。
牛莫拉氏菌中的蛋白酶保守利用蛋白酶編碼區(qū)的內(nèi)部片段作為探針進(jìn)行DNA雜交，以調(diào)查蛋白酶是否存在于代表已知牛莫拉氏菌菌毛血清型的菌株中。
將從牛莫拉氏菌的代表性菌株提取的基因組DNA(15)用XbaI和EcoRI消化，利用瓊脂糖凝膠電泳分離。利用文獻(xiàn)所述方法將DNA轉(zhuǎn)移至Hybond N+濾器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)(9)。用于DNA雜交的探針是經(jīng)過PCR擴(kuò)增的片段，它位于蛋白酶編碼區(qū)的內(nèi)部。利用Megaprime標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照廠商指導(dǎo)將該片段用α32P-dATP標(biāo)記。使用高嚴(yán)格條件(雜交溫度68℃；在室溫下用2×SSC/0.1％ SDS洗滌2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％ SDS洗滌1次)，使所得濾器暴露于放射自顯影膜(Kodak，Rochester，New York，USA)達(dá)5至24小時(shí)，然后顯影。
結(jié)果顯示在pJF1中克隆的蛋白酶基因存在于所有所檢查的牛莫拉氏菌菌株中。
實(shí)施例2本例描述來自牛莫拉氏菌的脂肪酶的克隆和鑒定。
細(xì)菌和質(zhì)粒文庫的構(gòu)建牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是從牛眼收集的場(chǎng)分離物(fieldisolate)，通過CSIRO Animal Health，Parkville，Australia鑒定(6)。大腸桿菌菌株MC1061以前已有描述(16)。
所有酶均購自Promega(Madison，WI，USA)，另有注解除外。一般的克隆和DNA技術(shù)如文獻(xiàn)所述(9)，另有注解除外。
質(zhì)粒文庫是在克隆載體pBR322中構(gòu)建的(17)。它是這樣進(jìn)行的，在1至2kb范圍內(nèi)最大化DNA的量的條件下，用Sau3A部分消化(利用實(shí)施例1所述CTAR法)從Dalton 2d提取的基因組DNA。使該DNA與預(yù)先已用BamHI消化的pBR322連接。將連接后的DNA電穿孔(2.5kV、200Ω和200μF，理論時(shí)間常數(shù)為4.7)到電反應(yīng)潛能大腸桿菌MC1061細(xì)胞內(nèi)。
篩選質(zhì)粒文庫的脂肪酶表達(dá)連接后的DNA向MC1061細(xì)胞的電穿孔之后，在含有Tween 80的培養(yǎng)基[10ml Tween 80(Sigma，St Louis，MO，USA)，5g NaCl，3g瓊脂No.1(Oxoid Ltd.，Basingstoke，Hampshire，U.K.)，10g胨，0.1gCaCl2.H2O/升]上，在37℃下培養(yǎng)文庫達(dá)24小時(shí)，檢測(cè)顯示脂肪酶活性的重組克隆體。
在所篩選的24,000個(gè)克隆體中，發(fā)現(xiàn)有二十八個(gè)顯示脂肪酶活性。DNA分析確認(rèn)所有這些克隆體都含有一個(gè)5.4kb片段的共有DNA。選擇一個(gè)克隆體繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，將其命名為pMB1。
在有些實(shí)驗(yàn)中(見下)，利用對(duì)-硝基苯基棕櫚酸酯作為底物進(jìn)行細(xì)胞外脂肪酶活性的光度測(cè)定(18，19)。使大腸桿菌和/或牛莫拉氏菌在37℃下生長所需時(shí)間。將不含細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液(100μl)與2.4ml酶緩沖液混合(19)，以測(cè)定所分泌的脂肪酶活性。在37℃下培養(yǎng)30分鐘后，測(cè)定410nm下的光密度。一個(gè)酶單位被定義為每分鐘從每ml對(duì)-硝基苯基棕櫚酸酯釋放1nmol對(duì)-硝基苯基的酶量。在Stuer等所述條件下(18)，0.041的410nm下光密度等于1個(gè)酶單位。
牛莫拉氏菌脂肪酶克隆體pMB1的核苷酸序列利用實(shí)施例1所述方法，對(duì)質(zhì)粒pMB1進(jìn)行自動(dòng)DNA測(cè)序。
該分析揭示1851bp的可譯框架能夠編碼617個(gè)氨基酸。按5’至3’方向書寫序列，如圖2所示，其中還有預(yù)期編碼分子量為65.8kDa的蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列。氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，DNA序列如SEQ ID NO 4所示。
利用上述關(guān)于蛋白酶的技術(shù)鑒別脂肪酶蛋白的潛在起始密碼子。
序列對(duì)比利用實(shí)施例1所述方法進(jìn)行序列對(duì)比。
在氨基酸水平上，從牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的脂肪酶顯示下列與所列蛋白質(zhì)的相似性和同一性。生物體蛋白質(zhì)相似性 同一性發(fā)光致病桿菌 三酰甘油脂肪酶36％ 24％(Xenorhabdus luminescens)惡臭假單胞菌 假定的蛋白質(zhì) 36％ 24％(Pseudomonas putida)鼠傷寒沙門氏菌外膜酯酶 35％ 23％(Salmonella typhimurium)銅綠假單胞菌 脂肪酶/酯酶 36％ 23％(Pseudomonas aeruginosa)牛莫拉氏菌被鑒別為可能是GDSL家族(20)脂解酶的新成員。
對(duì)脂肪酶成熟蛋白進(jìn)行N-末端測(cè)序在500ml luria肉湯中，在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)所需大腸桿菌菌株過夜。在5,000rpm下離心15分鐘，使細(xì)胞形成粒狀沉淀，通過0.45μm濾器過濾上清液。向上清液中加入固體硫酸銨至60％飽和度(180g/500ml)，在4℃下攪拌30分鐘使溶解。將該混合物置于4℃下過夜，在7,000rpm下離心30分鐘使所沉淀的蛋白質(zhì)形成粒狀沉淀。將蛋白質(zhì)再次懸浮在3ml重蒸餾水中，使溶解的蛋白質(zhì)對(duì)重蒸餾水透析過夜，以除去所有的鹽。通過0.45μm濾器過濾所得混合物，貯存在-20℃下。
用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，切除。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行自動(dòng)(埃德曼降解)序列分析(28)，在自動(dòng)序列分析儀(470A型，Applied Biosystems)(Applied Biosystems Division，F(xiàn)oster City，CA，USA)中發(fā)生臨界試劑的蒸汽相傳遞(29)，該儀器連接有PTH氨基酸分離系統(tǒng)(120A型PTH分析器，Applied Biosystems)。
利用這種技術(shù)，鑒別了具有兩個(gè)裂隙的17個(gè)氨基酸KEFSQVIIFGDSLXDXG(SEQ ID NO7)，它精確對(duì)應(yīng)于隨附序列所示第26至42個(gè)氨基酸。這種結(jié)果還表明該蛋白質(zhì)最有可能包括參與蛋白質(zhì)分泌的氨基末端信號(hào)肽。該氨基末端對(duì)應(yīng)于隨附序列的第1至25個(gè)氨基酸。
升高兔脂肪酶抗體通過注射被硫酸銨沉淀過的大腸桿菌MC1061/pMB4上清液，升高兔重組脂肪酶抗體。在疫苗接種之前，將脂肪酶制備物加熱至90℃達(dá)90分鐘進(jìn)行滅活。注射30μg該蛋白質(zhì)，以2周為間隔，注射4周。將原代接種物用弗羅因德完全佐劑乳化，隨后用弗羅因德不完全佐劑進(jìn)行疫苗接種。
牛莫拉氏菌脂肪酶的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)從牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的重組脂肪酶是非常熱穩(wěn)定的，因?yàn)槭够钚詼p少97％需要在90℃下加熱105分鐘。圖3闡述了這種現(xiàn)象，酶活性以根據(jù)細(xì)胞外脂肪酶測(cè)定法測(cè)定的“脂肪酶單位”表示。
天然對(duì)重組脂肪酶的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以描繪脂肪酶產(chǎn)生的生長速率，比較MC1061pMB1產(chǎn)生重組脂肪酶與牛莫拉氏菌Dalton 2d產(chǎn)生天然形式的脂肪酶。圖4闡述了兩種菌株的生長速率大約相等，但是它們沒有達(dá)到相等的細(xì)胞密度，9小時(shí)后Dalton 2d基本上低于MC1061pMB1。與牛莫拉氏菌Dalton 2d的天然脂肪酶表達(dá)相比，大腸桿菌pMB1構(gòu)建體的脂肪酶表達(dá)水平最高。
將來自大腸桿菌克隆體或牛莫拉氏菌Dalton 2d的無細(xì)胞上清液的蛋白質(zhì)用硫酸銨沉淀，用SDS-PAGE分析，利用重組熱滅活脂肪酶抗血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果。
分別在500ml Luria肉湯或腦心浸劑肉湯中，在37℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)大腸桿菌或牛莫拉氏菌過夜，制備硫酸銨沉淀過的上清液。在5000xg下離心15分鐘，使細(xì)胞形成粒狀沉淀，通過0.45μm濾器過濾上清液。向上清液中加入固體硫酸銨至60％飽和度(180g/500ml)，在4℃下攪拌30分鐘使溶解。將該混合物置于4℃下過夜，在7000xg下離心30分鐘使所沉淀的蛋白質(zhì)形成粒狀沉淀。將蛋白質(zhì)再次懸浮在3ml重蒸餾水中，使溶解的蛋白質(zhì)對(duì)重蒸餾水透析過夜，以除去所有的鹽。通過0.45μm濾器過濾所得混合物，貯存在-20℃下。
將蛋白質(zhì)再次懸浮在100μl 2x樣本緩沖液(5ml 0.5M Tris(pH6.8)，8ml 10％ SDS，4ml甘油，0.8ml β-巰基乙醇，1ml重蒸餾H2O，溴酚藍(lán))中，加熱至100℃達(dá)5分鐘，制備SDS-PAGE用蛋白質(zhì)樣本(100μl)。利用Laemlli的緩沖系統(tǒng)(21)，在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(zhì)。
按照Towbin等的方法(22)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后，利用Bio-Rad微型電池(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至硝基纖維素。用已被MC1061細(xì)胞吸附的重組脂肪酶抗血清(濃度為1/100)對(duì)濾器進(jìn)行免疫印跡分析?？挂驯粶缁?90℃下1小時(shí)45分鐘)的硫酸銨沉淀過的重組脂肪酶的抗血清被升高了，用于以4周間隔接種兔子(三次各50μg)。在致免疫之前和每次疫苗接種之時(shí)從耳緣靜脈采集血樣。
結(jié)果顯示重組脂肪酶陽性構(gòu)建體MC1061/pMB1存在顯著的譜帶，在牛莫拉氏菌Dalton 2d制備物中可檢測(cè)到相對(duì)微小的量。用抗血清檢出的蛋白質(zhì)的大小大約等于牛莫拉氏菌脂肪酶的預(yù)測(cè)分子量大小(65.8kDa)。
被pMB1編碼的脂肪酶類型利用薄層色譜法(TLC)測(cè)定牛莫拉氏菌Dalton 2d的脂肪酶是否顯示磷脂酶活性。磷脂酶類型的特征鑒別本質(zhì)上遵循前人所述方法(23)，但是在100℃下用10％磷鉬酸的乙醇溶液展開后，用肉眼觀察硅膠60板上的分離結(jié)果。所用試劑全部購自Sigma(Sigma，St Louis，MO，USA)。
TLC測(cè)定了當(dāng)使用溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰膽堿作為底物時(shí)，牛莫拉氏菌脂肪酶顯示與商業(yè)上可得到的磷脂酶B相同的酶特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。
牛莫拉氏菌中脂肪酶的保守利用Dalton 2d脂肪酶編碼區(qū)的內(nèi)部片段進(jìn)行DNA印跡分析，以調(diào)查脂肪酶基因是否存在于代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株中。
將從代表每種已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株提取的基因組DNA(15)用HindIII消化，利用瓊脂糖凝膠電泳分離。利用前人所述方法(9)將DNA轉(zhuǎn)移至Hybond N+濾器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)。用于DNA雜交的探針是含有脂肪酶編碼區(qū)內(nèi)部序列的HindIII片段。利用Megaprime標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham，LittleChalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照廠商指導(dǎo)將該片段用α32P-dATP標(biāo)記。使用高嚴(yán)格條件(雜交溫度68℃；在室溫下用2×SSC/0.1％ SDS洗滌2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌1次)，使所得濾器暴露于放射自顯影膜(Kodak，Rochester，New Yor k，USA)達(dá)5至24小時(shí)，然后顯影。
結(jié)果顯示脂肪酶存在于所有所檢查的牛莫拉氏菌菌株中。
為了確認(rèn)脂肪酶基因是否在每種血清型代表性菌株內(nèi)被表達(dá)，所升高的抗重組體熱滅活脂肪酶抗血清用于全細(xì)胞制備物的蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果顯示脂肪酶的確被所有這些牛莫拉氏菌菌株所表達(dá)。
實(shí)施例3細(xì)菌和溶血素克隆體的構(gòu)建牛莫拉氏菌Dalton 2d菌株是從牛眼收集的場(chǎng)分離物，通過CSIROAnimal Health，Parkville，Australia鑒定(6)。
所有代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株表達(dá)溶血活性，在馬血瓊脂上檢測(cè)。
大腸桿菌degP4∷Tn5菌株具有滲漏外膜，有蛋白水解缺陷，前人已有描述(24)。所有酶均購自Promega(Madison，WI，USA)，另有注解除外。
一般的克隆和DNA技術(shù)如文獻(xiàn)所述(9)，另有注解除外。
采用能夠鑒別輸出蛋白質(zhì)的phoA融合技術(shù)(25)，并作一定修改。將來自牛莫拉氏菌Dalton 2d的基因組DNA(利用實(shí)施例1所述CTAB法制備)用Sau3A部分消化。使限制性DNA與一系列載體連接，以便與三種不同閱讀框架內(nèi)的堿性磷酸酶基因融合。使連接后的DNA電穿孔至大腸桿菌degP4∷Tn5內(nèi)，在含有氨芐西林(50μg/ml)和X-P(200μg/ml)(5-溴-3-氯-吲哚基磷酸酯)的luria瓊脂上篩選所得克隆體?？寺◇w的選擇依賴于觀察結(jié)果，也就是如果片段被克隆并且含有輸出序列，那么所得菌落將呈藍(lán)色。滲漏大腸桿菌菌株允許與外膜結(jié)合的蛋白質(zhì)和所分泌的蛋白質(zhì)(都與phoA融合)有別于非分泌性融合蛋白。
牛莫拉氏菌溶血素決定子的測(cè)序選擇存在所分泌的或外膜蛋白基因序列的克隆體，利用實(shí)施例1所述方法進(jìn)行自動(dòng)DNA測(cè)序。發(fā)現(xiàn)這些克隆體之一pMbh1含有200bp的DNA，對(duì)其他RTX毒素的A亞單位顯示較高同源性。利用反向PCR和變性寡核苷酸得到完整A亞單位的序列。2784bp的可譯框架能夠編碼928個(gè)氨基酸。按5’至3’方向書寫序列，如圖5所示，其中還有預(yù)期編碼分子量為98.8kDa的蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸序列。氨基酸序列如SEQ ID NO 5所示，DNA序列如SEQ ID NO 6所示。
利用上述RBS技術(shù)鑒別推定的起始密碼子。沒有進(jìn)行信號(hào)肽分析，因?yàn)锳亞單位不被主動(dòng)分泌。不過由于這些蛋白質(zhì)(RTX)的蛋白序列是非常保守的，該起始密碼子是對(duì)單獨(dú)的氨基酸同源性的選擇之一。
序列同源性在氨基酸水平上，牛莫拉氏菌Dalton 2d溶血素基因產(chǎn)物顯示與若干RTX的A亞單位和其他溶血素具有驚人的相似性，如下表所示。生物體 蛋白質(zhì) 相似性同一性溶血性巴斯德氏菌 LktA蛋白68％ 50％(Pasteurella haemolytica)(白細(xì)胞毒素)大葉性肺炎放線桿菌 RTX毒素決定子 68％ 48％(Actinobacillus pleuropneumoniae)大腸桿菌 溶血素-質(zhì)粒 58％ 43％大腸桿菌 溶血素-染色體 58％ 43％牛莫拉氏菌溶血素的功能互補(bǔ)得到表達(dá)大腸桿菌攜帶染色體的溶血素的構(gòu)建體(pLG900；通過聯(lián)合兩個(gè)質(zhì)粒pLG575(26)和pLG816而生成(克隆到pBluescriptSK內(nèi)的hlyC和hlyA))。pLG900包含克隆到pBluescriptSK內(nèi)的四種RTX操縱子基因hlyC、hlyA、hlyB、hlyD，能夠賦予以前是非溶血性的大腸桿菌細(xì)胞以溶血性表型。使這種構(gòu)建體的A亞單位(hlyA)變異，以便它不再能夠被表達(dá)，但是參與操縱子的其他基因(hlyB、hlyC和hlyD)保持完整。含有該構(gòu)建體的大腸桿菌菌株(pLG900/hlyA陰性)不再是溶血性的。不過，通過在轉(zhuǎn)運(yùn)中提供從牛莫拉氏菌Dalton 2d克隆的溶血素亞單位基因可以恢復(fù)溶血性表型。因而確認(rèn)了所克隆的牛莫拉氏菌溶血素基因編碼最有可能是RTX家族溶血酶成員的結(jié)構(gòu)亞單位。
進(jìn)一步的序列分析已經(jīng)確立，象其他家族成員一樣，牛莫拉氏菌RTXA亞單位基因旁側(cè)是能夠編碼RTX B、C和D蛋白的DNA序列。
RTX A亞單位在牛莫拉氏菌中的保守性為了確定RTX A亞單位基因是否存在于代表已知菌毛血清型的牛莫拉氏菌菌株中，使用RTX A亞單位的編碼區(qū)作為探針進(jìn)行DNA雜交分析。
將從牛莫拉氏菌的七種血清型菌株提取的基因組DNA(15)用EcoRV消化，利用瓊脂糖凝膠電泳分離。利用前人所述方法(9)將DNA轉(zhuǎn)移至Hybond N+濾器(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)。所用探針是含有來自牛莫拉氏菌RTX溶血素A亞單位的所有編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用Megaprime標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)，按照廠商指導(dǎo)將該片段用α32P-dATP標(biāo)記。使用高嚴(yán)格條件(雜交溫度68℃；在室溫下用2×SSC/0.1％ SDS洗滌2次；在68℃下用0.1×SSC/0.1％ SDS洗滌1次)，使所得濾器暴露于放射自顯影膜(Kodak，Rochester，New York，USA)達(dá)5至24小時(shí)，然后顯影。
結(jié)果顯示編碼RTX A溶血素亞單位的基因在所檢查的全部七種代表性牛莫拉氏菌菌株中是保守的。有趣的是，已知這些菌株每種都在馬血瓊脂上顯示溶血性表型。相反，非溶血性牛莫拉氏菌菌株Gordon 26L3沒有與RTX A基因探針雜交，可能提示牛莫拉氏菌僅含有負(fù)責(zé)在馬血瓊脂上檢出的溶血性表型的單一結(jié)構(gòu)基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到，可以對(duì)如具體實(shí)施方式
所示發(fā)明進(jìn)行大量改變和/或修改，而不背離如廣泛描述的發(fā)明精神或范圍。因此，這些實(shí)施方式被視為說明性的而非限制性的。
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Arg Gln Ala Lys Val Gly Val Ile Asp Thr Gly180 185 190Ile Asn Arg Phe Asn Arg Asp Leu Val Gly Ala Asn Val His Asp Thr195 200 205Gln Ile Glu Cys Val Ser Ala Gly Arg Ser Thr Cys Tyr Thr Pro Glu210 215 220Asn Asp Ser Gly Ile Val Glu Ile Pro Thr Thr Ser Ala Ser Gly Ser225 230 235 240His Gly Asn Gln Met Ala Ala Val Ile Ala Gly Asn Asn Gly Met Thr245 250 255Asn Ala Lys Ile Tyr Gly Ser Asp Ser Ile Asp Arg Arg Ser Asn Gly260 265 270Gly Asn His Phe Leu Met Met Arg Lys Leu Asn Gln Asp His Gly Val275 280 285Lys Ile Phe Asn Asn Ser Trp Gly Ser Asn Asn Thr Asp Gln Trp Tyr290 295 300Tyr Asp Ala Gln Arg Leu Asn Tyr Asn Pro Thr Thr Gly Gln Ile Asn305 310 315 320Pro Asn Pro Tyr Arg Thr Ser Ile Thr Asn Ala Glu Val Thr Leu Pro325 330 335Val Ile His Asp Leu Ile Met Asn Arg Asp Ser Leu Ile Ile Lys Ala340 345 350Thr Gly Asn Glu Gly Leu Asn Asp Ala His Asp Glu Asn Leu Ala Pro355 360 365Leu Met Asn Ser Asn Phe Lys Lys Gly Phe Ile Thr Val Ser Ser Pro370 375 380Arg Glu Asp Phe Gly Lys Ala Asn His Cys Gly Arg Thr Ala Glu Trp385 390 395 400Cys Val Sar Ala Thr Ser Ser Thr Gln Asn Tyr Ala Asn Asp Gly Arg405 410 415Leu Ser Ser Tyr Lys Gly Thr Ser Pro Ala Thr Ala Arg Val Ser Gly420 425 430Thr Ala Val Leu Val Gln Ser Ala Tyr Pro Trp Met Lys Asn Glu Asn435 440 445Ile Ser Gln Thr Ile Leu Gly Thr Ala Lys Asp Phe Ser Glu Ile Thr450 455 460Ala Asn Ser Pro Asn Gly Tyr Gln Gly Leu Arg Lys Val Ser Arg Leu465 470 475 480Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Tyr Tyr Thr Asp Asn Gln Gly Asn Phe485 490 495Tyr Val Pro Gly Asn Val Asn Trp Glu Asn Arg Arg Ile Val Ala Asn500 505 510His Asn Gly Lys Asn Ile Thr Trp Glu Asp Gly Trp Gly Leu Leu Asp515 520 525Pro Glu Ala Ala Ala Lys Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Trp Asp Asn Val530 535 540Glu Leu Asp Thr Lys Gly Thr Pro Leu Ser Val Phe Tyr Asn Asp Leu545 550 555 560Lys Gly Asp Lys Gly Phe Thr Lys Lys Gly Glu Gly Lys Leu Val Phe565 570 575Thr Gly Asn Asn Ser Tyr Lys Gly Asp Ser Val Ile Glu Gly Gly Ser580 585 590Leu Glu Val Asn Gly Asn Asn Gly Gly Ser Thr Met Val Val Lys Gly595 600 605Gly Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Asn Val Ala Asn Val Arg Gln Thr Gly610 615 620Gly Trp Val Asn Asn Glu Gly Asn Leu Asn Ile Arg Gly Asp Tyr Asn625 630 635 640Ile Asn Thr Gln Arg Gly Val Asp Ala Gly Leu Lys Ala Gln Phe Gly645 650 655Asn Met Leu Thr Val Asp Gly Lys Ala Lys Leu Gly Gly Thr Leu Asn660 665 670Leu Thr Gly Glu Thr Lys Asp Gly Ile Ile Ser Lys Ser Gly Ser Arg675 680 685Ser Thr Val Leu Arg Ala Lys Arg Gly Leu Glu Gly Gln Phe Asp Asn690 695 700Tyr Arg Ser Ser Asn Pro Leu Phe Glu Val Thr Asn Val Glu Tyr Thr705 710 715 720Pro Glu Val Asp Arg Asn Gly Arg Val Val Gly Gly Ser Arg Thr Asn725 730 735Asn Asp Val Gln Val Thr Ala Lys Arg Leu Ser Ala Gly Asn Val Val740 745 750Tyr Gly Ile Ser Met Asn Asp Ser Gly Ser Arg Val Ala Gln Asn Leu755 760 765Asp Lys Val Leu Asn Asp Leu Asp Lys Lys Gln Glu Thr Gln Gly Ser770 775 780Leu Thr Ser Asp Glu Lys Gln Phe Ala Asn Arg Val Phe Thr Gly Phe785 790 795 800Glu Asn Met Asn Ser Gly Ala Glu Ser Lys Leu Ser Thr Val Ser Thr805 810 815Asn Arg Glu Leu Tyr Lys Leu Asp Pro Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Ala820 825 830Leu Asn Ala Val Glu Asp Ser Ala Asn His Ala Thr Glu Phe Gly Lys835 840 845Arg Val Ser Ala Pro Arg Gly Val Trp Gly Asn Ile Ser His His Asp850 855 860Tyr Asp Val Glu Leu Glu His Ala Thr Ser Ala Arg Lys Gly Asn Asn865 870 875 880Ile Ser Val Gly Ala Ser Thr Gln Thr Ala Ala Asp Ile Ser Val Gly885 890 895Ala Gln Leu Asp Val Ser Lys Leu Asp Leu Glu Glu Ser Val Tyr Gly900 905 910Ile Gly Asn Lys Thr Lys Thr Asp Ser Ile Gly Leu Thr Val Gly Ala915 920 925Ser Lys Lys Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Ser Gly Trp Val Lys Gly Ala930 935 940Lys Val Asp Thr Glu Ala Asn Arg Gly Glu Asn Ser Asn Lys Val Glu945 950 955 960Tyr Asn Gly Lys Leu Tyr Gly Ala Gly Ile Gln Ala Gly Thr Asn Ile965 970 975Asp Thr Ala Ser Gly Val Ser Val Gln Pro Tyr Ala Phe Val Asn His980 985 990Gln Gln Tyr Lys Asn Asp Gly Ser Phe Asn Asp Gly Leu Asn Val Val99510001005Asp Asp Ile Glu Ala Lys Gln Thr Gln Val Gly Val Gly Ala Asp Met101010151020Val Phe Gln Ala Thr Pro Ala Leu Gln Leu Thr Gly Gly Val Gln Val1025 103010351040Ala His Ala Val Ser Arg Asp Thr Asn Leu Asp Thr Arg Tyr Val Gly104510501055Thr Ala Thr Asp Val Gln Tyr Gly Thr Trp Asp Thr Asp Lys Thr Lys106010651070Trp Ser Ala Lys Val Gly Ala Asn Tyr Asn Val Thr Pro Asn Ser Gln107510801085Val Gly Leu Asn Tyr Ser Tyr Thr Gly Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ser109010951100Gln Val Gly Val Ser Phe Thr Ser Lys Phe1105 1110<210>2<211>4384<212>DNA<213>牛莫拉氏菌<400>2ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360cacacccgtc ctgtggatca ataattaatg aacatatata ctctatttaa tatttcttat 420ttattcgtaa tattgccata aaaataatac attatttcta tattaactaa actgttaata 480tttgtaaata ataaacattt gtttatctaa 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2220tagtagattg ccatctggtt attacggctc ttattacact gacaatcagg gtaatttcta 2280tgttcctggc aatgtcaatt gggaaaaccg tcgaattgtc gctaatcata acggcaagaa 2340cattacatgg gaagatggtt ggggtttgtt agatccagaa gcggccgcta aaggttatgg 2400tggtttctat tgggataatg tggaattaga cactaaaggc acgcctttat ctgtattcta 2460caatgaccta aaaggtgata aaggctttac caaaaaaggt gaaggtaaac ttgtctttac 2520tggtaataat agctataaag gcgactctgt catcgagggt ggttcactag aagtaaatgg 2580taacaacggt ggttcaacca tggttgttaa aggtggtgaa ctaacaggtt atggtaatgt 2640agctaatgtt cgtcaaacag gtggttgggt taacaacgaa ggtaacctaa acatcagagg 2700tgactacaac atcaacactc aacgtggcgt ggatgctggt ctaaaagctc aatttggcaa 2760catgcttacc gtggacggta aggccaaact aggtggtaca ctaaatctaa ctggtgagac 2820caaagatggt atcatcagca aatcaggtag ccgtagcact gtacttcgtg ctaagcgtgg 2880tcttgaaggt caatttgaca attatcgttc aagcaaccca ttatttgaag taacaaatgt 2940tgaatatacg ccagaagtag acagaaatgg cagagtggta ggtggttcac gcacgaacaa 3000tgacgtgcaa gtaactgcca aacgtctaag tgcaggcaat gttgtttatg gcatcagcat 3060gaatgacagt 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gctcggaggt caattggaat ggttttgtga 480atgtaccctc caccaaaacg caaatcaccg accatttgac cgccacaggt ggcaaagccg 540accctaatac cctgtatgcc atttggattg gctctaatga cttaatttca gcttctcaag 600ccaccacaac agccgaagcc caaaacgcca ttaaaggtgc ggtaactcgc accgtgatag 660acatcgaaac actcaatcaa gcaggggcga caaccatttt ggtgccaaat gtgcctgatt 720tgagcctcac gccccgagcc atctatggcg aaagcctcat ggcaggcgtg caagacaaag 780ccaaactcgc ctcaagtctg tataatagcg gtctgtttga agcattaaat caatccaccg 840ccaacatcat ccctgccaac acctttgccc tactccaaga agcgaccaca aataaagaag 900cctttggttt taaaaacacg caaggcgtgg cgtgtcaaat gcccgctcgt accacagggg 960cggatgatgt ggcttctact tccttggcat gtaccaaagc caatcttata gaaaacgggg 1020caaatgacac ctacgccttt gccgatgaca ttcacccatc gggacgcacg caccgcattt 1080tggcacagta ttaccgttct atcatggacg cccctactca catgggtaaa ctctcaggcg 1140agcttgtcaa aacaggttca gcccacgacc gtcatgttta ccgtcagctt gacaggctta 1200gtggctcaca gcacagcatt tgggcaaacg tccatgccag cgaccgtacc gaccccacca 1260cccaaatcgg cttggacgtg gcaggttcat caagccatac aggggcgtat ctgagccacc 1320aaaaccaaga ttatgtgctg gatgacaccc tatcatcaga tgtcaaaacc attggcatgg 1380ggctgtatca tcgccatgac atcggcaatg tccgtctaaa aggcgtggca ggtatcgacc 1440gacttagcgt ggatacgcac cgccatatcg actgggaggg ggcaagccgt tcgcacacgg 1500cagacaccac cgccagacgt tttcatgcag ggctacaagc cagctatggc atagacatgg 1560gcaaagccac cgtgcgtccg cttatcggcg tacatgccca aaaagtcaaa gtgcgtgatt 1620tggtagagaa tgagcctacc ctatccaccg ccatgcgttt tggcgagcaa gaacaaaagt 1680ccctacaagg cgagattggc gtcgatgtgg cttatccgat tagccctgct ttgactctga 1740cgggcggtat cgctcacgct catgagttta acgatgatga acgcaccatt aatgccactt 1800taacctccat tcgtgaatac acgaagggct ttaatacaag cgttagcacc gacaaatctc 1860acgccaccac cgctcatctg ggcgtacaag ggcaacttgg caaggcaaat attcatgcag 1920gcgttcacgc cacccaccaa gacagcgata cagacgtggg tggttcgctt ggggttcgct 1980tgatgttttg attggctttt aaagataaaa agtggtatca tgccactttt tattttgcca 2040aaaatctatg tttgagtaca tcaaagcctt tcacatcatc gccatgcgat gataagctgt 2100caaacatgag2110<210>5<211>927<212>PRT<213>牛莫拉氏菌<400>5Met Ser Asn Ile Asn Val Ile Lys Ser Asn Ile Gln Ala Gly Leu Asn1 5 10 15Ser Thr Lys Ser Gly Leu Lys Asn Leu Tyr Leu Ala Ile Pro Lys Asp20 25 30Tyr Asp Pro Gln Lys Gly Gly Thr Leu Asn Asp Phe Ile Lys Ala Ala35 40 45Asp Glu Leu Gly Ile Ala Arg Leu Ala Glu Glu Pro Asn His Thr Glu50 55 60Thr Ala Lys Lys Ser Val Asp Thr Val Asn Gln Phe Leu Ser Leu Thr65 70 75 80Gln Thr Gly Ile Ala Ile Ser Ala Thr Lys Leu Glu Lys Phe Leu Gln85 90 95Lys His Ser Thr Asn Lys Leu Ala Lys Gly Leu Asp Ser Val Glu Asn100 105 110Ile Asp Arg Lys Leu Gly Lys Ala Ser Asn Val Leu Ser Thr Leu Ser115 120 125Ser Phe Leu Gly Thr Ala Leu Ala Gly Ile Glu Leu Asp Ser Leu Ile130 135 140Lys Lys Gly Asp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Lys Ala Ser Ile Asp145 150 155 160Leu Ile Asn Glu Ile Ile Gly Asn Leu Ser Gln Ser Thr Gln Thr Ile165 170 175Glu Ala Phe Ser Ser Gln Leu Ala Lys Leu Gly Ser Thr Ile Ser Gln180 185 190Ala Lys Gly Phe Ser Asn Ile Gly Asn Lys Leu Gln Asn Leu Asn Phe195 200 205Ser Lys Thr Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ile Thr Gly Leu Leu Ser Gly210 215 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Lys Glu Leu Glu Ala Glu Arg Val Ile Ala435 440 445Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Asn Asn Ile Gly Glu Leu Ala Gly Ile450 455 460Thr Lys Leu Gly Glu Arg Ile Lys Ser Gly Lys Ala Tyr Ala Asp Ala465 470 475 480Phe Glu Asp Gly Lys Lys Val Glu Ala Gly Ser Asn Ile Thr Leu Asp485 490 495Ala Lys Thr Gly Ile Ile Asp Ile Ser Asn Ser Asn Gly Lys Lys Thr500 505 510Gln Ala Leu His Phe Thr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Gly Thr Glu Ser515 520 525Arg Glu Arg Leu Thr Asn Gly Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Leu Lys530 535 540Phe Gly Arg Val Lys Asn Trp Gln Val Thr Asp Gly Glu Ala Ser Ser545 550 555 560Lys Leu Asp Phe Ser Lys Val Ile Gln Arg Val Ala Glu Thr Glu Gly565 570 575Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Val Asn Ala Lys Ala Gly Asn Asp Asp580 585 590Ile Phe Val Gly Gln Gly Lys Met Asn Ile Asp Gly Gly Asp Gly His595 600 605Asp Arg Val Phe Tyr Ser Lys Asp Gly Gly Phe Gly Asn Ile Thr Val610 615 620Asp Gly Thr Ser Ala Thr Glu A la Gly Ser Tyr Thr Val Asn Arg Lys625 630 635 640Val Ala Arg Gly Asp Ile Tyr His Glu Val Val Lys 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Thr Ser Gln Glu Leu Lys Lys Leu Ala Asp Glu Asn Lys Ser Gln865 870 875 880Lys Leu Ser Ala Ser Asp Ile Ala Ser Ser Leu Asn Lys Leu Val Gly885 890 895Ser Met Ala Leu Phe Gly Thr Ala Asn Ser Val Ser Ser Asn Ala Leu900 905 910Gln Pro Ile Thr Gln Pro Thr Gln Gly Ile Leu Ala Pro Ser Val915 920 925<210>6<211>3231<212>DNA<213>牛莫拉氏菌<400>6atgagaacgt tattttcaga tgaattgttt agagcgattc gtgtagatgg aaattcatcg 60catggtaaga tatctgaatt ttatggaaag tctgttgatt caaaattagc ctcaagaata 120tttgcacaat atcacgaaga tttgacgagc aaattgtcaa ctcagaataa ttttattata 180tctaaagata attaatacaa ccttttctaa cacaacgagg agagacatat tatgtccaat 240ataaatgtaa ttaaatctaa tattcaagca ggcttgaatt caacaaagtc tggattaaaa 300aatctttact tggctattcc caaagattat gatccgcaaa aaggtgggac tttaaatgat 360tttattaaag ctgctgatga attaggtatt gctcgtttag cagaagagcc taatcacact 420gaaacagcaa aaaaatctgt tgacacagta aatcagtttc tctctctcac acaaactggt 490attgctattt ctgcaacaaa attagaaaag ttcttacaaa aacattctac caataagtta 540gccaaagggt tagacagtgt agaaaatatt gatcgtaaat 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1440gagtgggaaa agcaaaatgg cggtcagaac tattttgata aaggctatga ttctcgttat 1500gctgcttatt tagctaataa cttaaaattt ttgtctgagc taaataaaga gttggaagct 1560gaacgtgtta ttgcaatcac ccaacaacgt tgggataata atattggtga gttagcaggt 1620attaccaaat tgggtgaacg cattaagagc ggaaaagctt atgcagatgc ttttgaagat 1680ggcaagaaag ttgaagctgg ttccaatatt actttggatg ctaaaactgg tatcatagac 1740attagtaatt caaatgggaa aaaaacgcaa gcgttgcatt tcacttcgcc tttgttaaca 1800gcaggaactg aatcacgtga acgtttaact aatggtaaat actcttatat taataagtta 1860aaattcggac gtgtaaaaaa ctggcaagtt acagatggag aggctagttc taaattagat 1920ttctctaaag ttattcagcg tgtagccgag acagaaggca cagacgagat tggtctaata 1980gtaaatgcaa aagctggcaa tgacgatatc tttgttggtc aaggtaaaat gaatattgat 2040ggtggagatg gacacgatcg tgtcttctat agtaaagacg gaggatttgg taatattact 2100gtagatggta cgagtgcaac agaagcaggc agttatacag ttaatcgtaa ggttgctcga 2160ggtgatatct accatgaagt tgtgaagcgt caagaaacca aggtgggtaa acgtactgaa 2220actatccagt atcgtgatta tgaattaaga aaagttgggt atggttatca gtctaccgat 2280aatttgaaat cagtagaaga agtaattggt tctcaattta atgatgtatt caaaggttct 2340aaattcaacg acatattcca tagtggtgaa ggtgatgatt tactcgatgg tggtgctggt 2400gacgaccgct tgtttggtgg taaaggcaac gatcgacttt ctggagatga aggcgatgat 2460ttactcgatg gcggttctgg tgatgatgta ttaaatggtg gtgctggtaa tgatgtctat 2520atctttcgga aaggtgatgg taatgatact ttgtacgatg gcacgggcaa tgataaatta 2580gcatttgcag atgcaaatat atctgatatt atgattgaac gtaccaaaga gggtattata 2640gttaaacgaa atgatcattc aggtagtatt aacataccaa gatggtacat aacatcaaat 2700ttacaaaatt atcaaagtaa taaaacagat cataaaattg agcaactaat tggtaaagat 2760ggtagttata tcacttccga tcaaattgat aaaattttgc aagataagaa agatggtaca 2820gtaattacat ctcaagaatt gaaaaagctt gctgatgaga ataagagcca aaaattatct 2880gcttcggaca ttgcaagtag cttaaataag ctagttgggt caatggcact atttggtaca 2940gcaaatagtg tgagttctaa cgccttacag ccaattacac aaccaactca aggaattttg 3000gctccaagtg tttagtgatt taatttacta gacaatatca ccacccatat cattggttat 3060agattatgaa actagtgata tgggtggtga tacttcttta attagactta atttacaaac 3120ccttaatagt aatttagtta 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1.多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所述氨基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所示序列的同一性為至少70％的序列。
3.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所示序列的同一性為至少80％的序列。
4.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.1氨基酸37至1114所示序列的同一性為至少90％的序列。
5.如權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有蛋白酶活性。
6.核酸分子，該核酸分子包含編碼如權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽的序列。
7.核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.2所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴(yán)格條件下與之雜交的序列。
8.如權(quán)利要求7所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少70％的序列。
9.如權(quán)利要求7所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少80％的序列。
10.如權(quán)利要求7所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.2所示序列的同一性為至少90％的序列。
11.用于提高動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含如權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽或如權(quán)利要求6所要求保護(hù)的的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
12.多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所述氨基酸序列、或與之具有至少50％同一性的序列、或其功能片段。
13.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性為至少70％的序列。
14.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性為至少80％的序列。
15.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.3氨基酸26至616所示序列的同一性為至少90％的序列。
16.如權(quán)利要求12至15任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有脂肪酶活性。
17.核酸分子，該核酸分子包含編碼權(quán)利要求12至16任意一項(xiàng)的多肽的序列。
18.核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.4所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴(yán)格條件下與之雜交的序列。
19.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少70％的序列。
20.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少80％的序列。
21.如權(quán)利要求18所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.4所示序列的同一性為至少90％的序列。
22.用于提高動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含如權(quán)利要求12至16任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽或如權(quán)利要求17所要求保護(hù)的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
23.多肽，該多肽具有如SEQ.ID.NO.5所述氨基酸序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或其功能片段。
24.如權(quán)利要求23所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少70％的序列。
25.如權(quán)利要求23所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少80％的序列。
26.如權(quán)利要求23所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有與SEQ.ID.NO.5所示序列的同一性為至少90％的序列。
27.如權(quán)利要求23至26任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽，該多肽具有溶血素活性。
28.核酸分子，該核酸分子包含編碼權(quán)利要求23至27任意一項(xiàng)的多肽的序列。
29.核酸分子，包含如SEQ.ID.NO.6所述序列、或與之具有至少60％同一性的序列、或在嚴(yán)格條件下與之雜交的序列。
30.如權(quán)利要求29所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少70％的序列。
31.如權(quán)利要求29所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少80％的序列。
32.如權(quán)利要求29所要求保護(hù)的核酸分子，該核酸分子具有與SEQ.ID.NO.6所示序列的同一性為至少90％的序列。
33.用于提高動(dòng)物免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含權(quán)利要求23至27任意一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求28的核酸序列和可選的載體和/或佐劑。
34.用于提高動(dòng)物針對(duì)莫拉氏菌屬的免疫應(yīng)答的組合物，該組合物包含至少一種多肽，選自由如權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽、如權(quán)利要求12至16任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽和如權(quán)利要求23至27任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽組成的組，可選地還包括佐劑或載體。
35.如權(quán)利要求34所要求保護(hù)的組合物，該組合物包含如 23至27任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽，以及如權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽與如權(quán)利要求12至16任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽二者之一，或優(yōu)選地二者皆是。
36.如權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所要求保護(hù)的組合物，其中該莫拉氏菌是牛莫拉氏菌或黏膜炎莫拉氏菌。
37.如權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所要求保護(hù)的組合物，其中該莫拉氏菌是牛莫拉氏菌。
38.針對(duì)多肽而產(chǎn)生的抗體，該多肽選自由如權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽、如權(quán)利要求12至16任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽和如權(quán)利要求23至27任意一項(xiàng)所要求保護(hù)的多肽組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及莫拉氏菌屬、特別是牛莫拉氏菌的抗原、編碼這些抗原的核酸序列和用于提高抗莫拉氏菌屬的免疫應(yīng)答的制劑。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1377369SQ00813618
公開日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月31日
發(fā)明者J·法恩, R·斯圖耐爾, J·坦耐特 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織, 墨爾本大學(xué)