專利名稱：人絨膜促性腺激素疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
一種努力緩和人口增長的有效方法是應(yīng)用抗參與生殖生理的激素的免疫原。可以相信，將免疫原注射到哺乳動物體內(nèi)會導(dǎo)致哺乳動物產(chǎn)生特異性的抗體，使這些激素失活，從而阻礙它們的功能。至少有6種人生殖激素的免疫原制劑已經(jīng)或正在進行臨床試驗一種抗濾泡刺激激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)[Moudgal，NR.等，Prospectives in Primate Reproductive Biology，297-306(1991)]；兩種抗促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasinghormone GnRH)[Ladd，A.等，Biol.Reprod.，1076-1083(1994)；Jayashankar，R.等，Prostate，14，3-11(1989)]；和三種抗絨膜促性腺激素(chorionic gonadtropin CG)[Jones，W.R.等，Lancet，8598，1295-1298(1988)；Talwar，G.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，8532-8536(1994)；和Dirnhofer，S.等，Immun.Today，15，469-474(1994)]。
有以下幾個原因，人絨膜促性腺激素尤其是一個免疫生殖干擾的有吸引力的靶點。首先，這個激素的生理化學(xué)背景十分清楚，是維持懷孕的基本物質(zhì)。第二，它的氨基酸序列已經(jīng)闡明，由一個α和β亞基構(gòu)成的異二聚體。每個單體由單獨一個基因編碼，該基因位于不同的染色體上[Dirnhofer，S.等，J.Endovrin.，141，153-162(1994)]。第三，表明，人絨膜促性腺激素由于循環(huán)存在的抗體導(dǎo)致的免疫失活并不會顯著干擾婦女的其他生理過程，例如排卵作用。
人絨膜促性腺激素的生理特性，例如所提到的，已經(jīng)被廣泛研究。這個糖蛋白有一個相對分子量(Mr)，大約38,000，其中分為大約14,500的α亞基和大約22,000的β亞基。人絨膜促性腺激素的α亞基在結(jié)構(gòu)上和三種腦垂體激素(濾泡刺激激素FSH，黃體激素LH和甲狀腺刺激激素TSH)是一致的。例外，雖然β亞基對于靶組織來說，是受體特異性的，但是α亞基沒有激素特異性。人絨膜促性腺激素的α亞基為其他激素所共有，因此對于完整人絨膜促性腺激素的抗血清可以和其他的激素產(chǎn)生交叉反應(yīng)，然而只針對人絨膜促性腺激素β亞基的抗血清產(chǎn)生較少的交叉反應(yīng)。這些結(jié)果已經(jīng)表明人絨膜促性腺激素的β亞基是一種有效的高特異性的免疫試劑，可調(diào)節(jié)哺乳動物的生殖。
已經(jīng)測試三種以β人絨膜促性腺激素為基礎(chǔ)的免疫原。世界健康組織(World Health Organization WHO)評價一種β人絨膜促性腺激素C末端37個氨基酸的多肽(βhCG-CTP)它在佐劑中偶聯(lián)一種白喉類毒素載體，該佐劑包含一種合成的胞壁酰二肽[Jones，W.R.等.，(1988)Supra]。在這種制劑中，因為β人絨膜促性腺激素βhCG通常是機體自身分子，沒有免疫原性，因而運用例如白喉類毒素載體是必需的。這個研究的最初結(jié)果表明在小鼠子宮重量獲得試驗中，濃度升高的抗βhCG-CTP抗體，可以抵制hCG的生物活性。[Stevens，V.C.等，Am J.Reprod Immunol.，1,307-314(1981)]，一種含有βhCG的相似免疫原制劑顯示，有效降低一群雌性狒狒的生育率，從70％降到低于5％[Stevens，V.C等Fertil Steril.，36，98-105(1981)]。然而，由于事實上，并不是所有的個體對這種制劑能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并且既使產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，抗體滴度也太低，世界健康組織已經(jīng)將這個方面的工作擱置。
以前或現(xiàn)在進行臨床試驗的第二種β人絨膜促性腺激素制劑由國家免疫研究所，新德里完成。由β人絨膜促性腺激素連結(jié)綿羊黃體激素α亞基，在鄰苯二甲酰脂多糖鈉佐劑中連到白喉-破傷風(fēng)類毒素載體上。[Talwar，G.P.等，supra(1994)]。雖然，預(yù)測這種免疫復(fù)合物能有效人絨膜促性腺激素hCG，但是由于α亞基的存在，也會與其它激素產(chǎn)生交叉反應(yīng)。
以前或現(xiàn)在正在臨床試驗的第三種免疫原制劑，由人口委員會，紐約完成。它是以整個β人絨膜促性腺激素亞基為基礎(chǔ)的。[Tsong，Y，等75th Annual Meeting Endocrine Society，拉斯維加基，282(1993)]。β人絨膜促性腺激素在氧化鋁的佐劑中連到破傷風(fēng)類毒素載體上。在這種制劑，存在著潛在的問題，由破傷風(fēng)類毒素導(dǎo)致的載體誘導(dǎo)抗人絨膜促性腺激素抗體產(chǎn)生的抑制。
這些βhCG免疫原的制劑沒有一種被認為可以適合廣泛的商業(yè)用途。首先，獲得合成的或來源于生物組織或液體的βhCG的過程十分繁瑣，需要一組純化步驟，通常會導(dǎo)致低產(chǎn)出、高成本和交叉感染其它蛋白尤其是α人絨膜促性腺激素。
Mukhopadhyhy等，Am J.Reprod，Immunol.，39,172-182(1998)描述了一種用重組DNA方法產(chǎn)生有免疫原性的β人絨膜促性腺激素。Mukhopadhyay和他的伙伴將重組的β人絨膜促性腺激素和氫氧化鋁佐劑，單獨或結(jié)合破傷風(fēng)類毒素載體，給小鼠和猴子注射評價它作為一種出生控制疫苗的免疫原性的潛能。雖然，β人絨膜促性腺激素單獨可以引起免疫反應(yīng)，但重組β人絨膜促性腺激素需和破傷風(fēng)類毒素結(jié)合，這樣能增加抗體滴度。
在這種技術(shù)中存在著一個問題。由于事實上β人絨膜促性腺激素是一個“自身”抗原，因而，當注射時，并不能被免疫系統(tǒng)識別，即免疫系統(tǒng)對于注射的抗原不會產(chǎn)生抗體。一種載體，例如破傷風(fēng)或白喉類毒素對于產(chǎn)生一個免疫反應(yīng)是基本的。將這樣的載體連接到βhCG上使βhCG更加異源化，誘使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生較強的反應(yīng)。然而聯(lián)合載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)存在著載體導(dǎo)致的抑制問題。在接受者免疫系統(tǒng)曾經(jīng)接觸過載體的情況下，免疫系統(tǒng)對載體的反應(yīng)要遠大于對于聯(lián)結(jié)到載體上的抗原反應(yīng)。
同樣，在技術(shù)上還存在著其它未解決的問題。舉例來說，當前所運用的佐劑例如合成的胞壁酰二肽，鄰苯二甲酰脂多糖鈉或明礬能產(chǎn)生副反應(yīng)，例如當注射時產(chǎn)生紅斑、皮下節(jié)結(jié)、接觸超敏性或肉芽腫炎癥。因而，一種更好的可忍受的佐劑是需要的。另外，許多個體不能對現(xiàn)有的疫苗和免疫治療方法產(chǎn)生反應(yīng)。因而，需要一種免疫治療方法和適當制劑的免疫疫苗，它們對所有治療的人們能有效的免疫反應(yīng)同時避免上述存在的技術(shù)問題。
該發(fā)明可解決這個問題，通過提供一種疫苗，它包含βhCG，以一種良好耐受的脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，誘導(dǎo)宿主哺乳動物產(chǎn)生抗hcG抗體，并且克服了許多個體不反應(yīng)的問題。
發(fā)明摘要該發(fā)明提供了改進的組合物，誘導(dǎo)雌性哺乳動物包括人類的不育。依照該發(fā)明，優(yōu)選的以注射制劑給藥方式給予有效劑量的組合物誘導(dǎo)不育?，F(xiàn)在優(yōu)選的注射制劑包含，以組合制劑，βhCG蛋白和/或它的融合物，片段或類似物和脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑。在一種優(yōu)選的實施方案，脫乙酰殼多糖佐劑包含了脫乙酰殼多糖乳殼多糖乳劑、氫氧化鈉、一種生物可降解油，表面活性劑和一種水溶性緩沖液。(已批準的美國專利申請第08/823,143，在此引入，作為參考)，其中βhCG蛋白和/或其融合蛋白，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到1∶1500(重量/重量)范圍之間?，F(xiàn)優(yōu)選的可生物降解的油是鯊烯。在另一種優(yōu)選的實施方案中，脫乙酰殼多糖佐劑包含，以組合制劑，脫乙酰殼多糖，一種金屬鹽和水溶性緩沖液(美國專利第5,912,000該專利已經(jīng)詳述，作為參考)。其中βhCG蛋白和/或其融合蛋白、片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到1∶1500(重量/重量)范圍之間。現(xiàn)在優(yōu)選的金屬鹽是乙酸鋅、硫酸鎳和硫酸銅，在另外一種優(yōu)選的實施方案中，重組βhCG包含一種融合蛋白，其中βhCG蛋白，或其片段或其類似物被連在任何非hCG多肽上。在現(xiàn)在優(yōu)選的實施方案中，βhCG蛋白或其片段或其類似物是連在β-半乳糖苷酶蛋白或它的片段上，與上述任何一種以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑聯(lián)合使用。
現(xiàn)在的發(fā)明也是針對誘導(dǎo)雌性哺乳動物包括人類不育的方法，通過對哺乳動物注射一種疫苗，它包含βhCG蛋白和/或其融合蛋白、片段或類似物，聯(lián)合脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑。疫苗的劑量是如此，可以有效刺激哺乳動物產(chǎn)生抗體，這種抗體識別哺乳動物天然循環(huán)存在的hCG蛋白并且或阻止懷孕。優(yōu)選的哺乳動物包括，但不是僅限于此，人類、狗、貓、牛、馬、豬、猴、嚙齒動物，大象和兔類動物。
在該發(fā)明實踐中有用的蛋白包含βhCG蛋白和/或其融合物、類似物和有免疫學(xué)活性的片段(注射到哺乳動物中仍保留刺激抗hCG抗體產(chǎn)生的能力)。這樣的有免疫學(xué)活性片段能夠被定義為至少包含一個抗原決定簇，注射到哺乳動物體內(nèi)有效刺激抗體產(chǎn)生(根據(jù)該發(fā)明)或者是它被直接與hCG相關(guān)的抗體識別。
一種優(yōu)選的注射疫苗方式是肌肉注射，腹腔注射或皮下注射。
該發(fā)明也針對用一種交叉免疫方法來誘導(dǎo)哺乳動物不育，其中，注射由一種含有在宿主細胞表達的重組βhCG的疫苗，，隨后又注射第二種疫苗，包含由另一種宿主細胞中表達的重組βhCG。優(yōu)選地，疫苗均是通過注射的。注射的順序是多種多樣的。用于表達βhCG的優(yōu)選的表達系統(tǒng)包括細菌、酵母、桿狀病毒和哺乳動物細胞。作為選擇，可使用交叉免疫方法，每種疫苗包含重組βhCG并使用脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑。
該發(fā)明的另一特點是針對誘導(dǎo)抗原的形成，通過連續(xù)給藥，先是一種表達系統(tǒng)獲得的抗原，隨后再給在第二種表達系統(tǒng)獲得的相同或相似的重組蛋白抗原。優(yōu)選的表達系統(tǒng)包括細菌、酵母、桿狀病毒和哺乳動物表達系統(tǒng)。優(yōu)選的佐劑包括脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑。
發(fā)明詳述該發(fā)明是針對于組合物，它包含βhCG蛋白，并聯(lián)合脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，將它們用于哺乳動物，刺激抗哺乳動物內(nèi)源性βhCG的抗體產(chǎn)生并誘導(dǎo)暫時的不育。另外，該發(fā)明的組合物可用于交叉免疫體系來克服許多哺乳動物對于特定抗原，特別是自身抗原不能引起免疫反應(yīng)的問題。
術(shù)語“核苷酸序列”是指核苷酸多聚物或這些核苷酸的序列，“核酸”和“多聚核苷酸”也可在這互換使用，指核苷酸的多聚物。總的來說，該發(fā)明中提供的核酸片段，可從基因組片段和短的寡聚核苷酸銜接物，或一系列寡聚核苷酸或個體的核苷酸中裝配產(chǎn)生一種合成的核酸。它可在一個重組轉(zhuǎn)錄單位(包含來源于微生物或病毒操縱子或真核基因的調(diào)控元件)中被表達。
術(shù)語“重組體”這里用于指一種多肽或蛋白，它是來源于重組的(例如微生物的或哺乳動物的)表達系統(tǒng)?！拔⑸锏摹笔侵钢亟M多肽或蛋白在細菌或真菌(例如酵母)表達系統(tǒng)中表達獲得。作為一種產(chǎn)物，“微生物重組體”定義為一種蛋白或多肽基本上不是天然內(nèi)源物質(zhì)，并且沒有相關(guān)天然的糖基化。在多數(shù)細菌環(huán)境下例如大腸桿菌表達的多肽或蛋白不能進行糖基化修飾，在酵母中表達的蛋白，總的來說有糖基化制劑，但不同于那些在哺乳動物細菌中表達蛋白的糖基化制劑。
術(shù)語“重組表達載體”是指一種質(zhì)粒，噬菌體或病毒或載體，用來表達一種DNA(RNA)序列獲得多肽。一種表達載體包含一個轉(zhuǎn)錄單元，該單元包含一個組合(1)一個或多個遺傳元件，在基因表達中有調(diào)控作用，例如啟動子或增強子；(2)一個結(jié)構(gòu)或編碼序列，可以轉(zhuǎn)錄成mRNA，并可翻譯成蛋白和(3)合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列。用于酵母或真核表達系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)單元最好包括一個引導(dǎo)序列，使宿主細胞將翻譯好的蛋白分泌到胞外，作為選擇，當重組蛋白表達時沒有引導(dǎo)或轉(zhuǎn)運序列，它也可包含N末端甲硫氨酸殘基。該殘基在產(chǎn)生最終產(chǎn)物時也許能或也許不能隨后從表達的重組蛋白中切除。
術(shù)語“重組表達系統(tǒng)”意思是宿主細胞已經(jīng)將重組轉(zhuǎn)錄單元穩(wěn)定地整合到染色體DNA上或是在染色體外攜帶重組轉(zhuǎn)錄單元。重組表達系統(tǒng)在這定義為一旦誘導(dǎo)連在cDNA片段或合成的基因上的調(diào)控元件，則可表達異源多肽或蛋白。這個術(shù)語也同樣意味著宿主細胞已經(jīng)穩(wěn)定地整合了一個或多個重組遺傳元件，它們在基因表達中有調(diào)控作用，例如啟動子或增強子。在這定義的重組表達系統(tǒng)一旦誘發(fā)連在內(nèi)源的DNA片段或被表達基因上的調(diào)控序列則要表達多肽或蛋白。這些細胞是原核的或真核的細胞。
術(shù)語“天然存在的多肽”是指未經(jīng)遺傳工程的由細胞產(chǎn)生，并且特異地預(yù)期有各種各樣的多肽，后翻譯修飾引起的，包括但不只局限于此，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化、?；?。
術(shù)語“類似物(或變異體)是指任何一種多肽，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生氨基酸插入，缺失和替換而導(dǎo)致的不同于天然存在的多肽。比較同源人的或其他哺乳動物的特定多肽序列，使高度同源的區(qū)域(高度保守區(qū)域)改變的氨基酸數(shù)目最小或用共用序列來替換，從而確定哪個氨基酸也許被替換，增加或缺失而不破壞感興趣的活性(例如可以刺激抗體的產(chǎn)生)的原則。
氨基酸“替換”也許是用另一個氨基酸代替-氨基酸后，仍有相似的結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性，即保守性氨基酸替換。另外，氨基酸“替換”也許是用另一個氨基酸替代后導(dǎo)致所感興趣的活性增加，即非保守性氨基酸替換。
“保守性”氨基酸替代基于所涉及的氨基酸殘基相似性質(zhì)極性，電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，帶正電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸和負電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。典型的插入或缺失在1到5個氨基酸，允許變化能用實驗方法進行測定。可系統(tǒng)的用重組DNA技術(shù)在多肽分子中插入，缺失或替換氨基酸，然后再分析各突變體的活性。
術(shù)語“片段”是指一段氨基酸殘基，至少大約5個氨基酸，常常是大約7個氨基酸，典型地是大約9-13個氨基酸，在一些變化的制劑中，至少大約17或更多氨基酸。
術(shù)語“活性”是指多肽的制劑，包括任何天然存在多肽的生物學(xué)和免疫學(xué)活性。依照該發(fā)明，術(shù)語“免疫學(xué)活性”涉及βhCG是指多肽至少包含其免疫學(xué)活部位中的一個，優(yōu)選地是在注射到哺乳動物后能夠刺激對抗hCG抗體的產(chǎn)生。依照該發(fā)明，一個免疫學(xué)活性片段至少包含一個抗原決定簇，在對哺乳動物給藥以后能有效刺激抗體的產(chǎn)生或者是被直接與hCG相關(guān)的抗體識別。
術(shù)語“感染”指的是通過病毒或病毒性載體將核酸引入到一個合適的宿主細胞中。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意思是將DNA引入到一個合適的宿主細胞中，從而DNA作為染色體外成份或作為染色體整合成份可進行復(fù)制，。
術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指的是適合的宿主細胞吸收一種表達載體，不論編碼序列是否被表達。
該發(fā)明的多肽包括，但不局限于此，一種含有SEQ ID No2的氨基酸序列的多肽(見SEQ ID No2)或者是由一種含有pZ179載體的克隆TOPP2中的(見SEQ ID No1)cDNA插入片段編碼的氨基酸序列的多肽、另外發(fā)明的實施方案包括，但不局限于此，是一種多肽，其含有SEQ ID No4氨基酸序列或者是由在SEQ ID No3中的cDNA編碼的氨基酸序列，該cDNA插入到PZ500載體中。該發(fā)明中的多肽同樣也包含SEQ ID No2或4中βhCG蛋白序列的活性片段或類似物。該發(fā)明的多肽更包含βhCG的融合或修飾物，其中βhCG或類似物融合到其它部分獲得一個更為穩(wěn)定的蛋白或者使它的表達量達到最高。
該發(fā)明蛋白組合物還包含一種脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，優(yōu)選的實施方案包含一脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，由脫乙酰殼多糖乳劑、氫氧化鈉，生物可降解油表面活性劑和水溶性緩沖液組成。另一種脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，包含脫乙酰殼多糖、一種金屬鹽和一種水溶性緩沖液。βhCG蛋白和/或其融合蛋白、片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間，優(yōu)選的生物可降解油是鯊烯。優(yōu)選的金屬鹽包括，但不局限于此，乙酸鋅、硫酸鎳和硫酸銅。
許多類型的細胞可以作為表達蛋白合適的宿主細胞。哺乳動物宿主細胞包括，例如猴COS細胞，中國倉鼠細胞(CHO)，人腎293細胞，人表皮A431細胞，人結(jié)腸205細胞，3T3細胞，CV－1細胞，其它變形的靈長類細胞系，正常雙倍染色體細胞，體外來源于原代組織的細胞系，原代移植體，Hela細胞，小鼠L細胞，BHK、HL-60，U937、HaK和Jurkat細胞。
作為選擇，也可在較低等真核生物例如酵母或原核生物例如細菌中產(chǎn)生蛋白，合適的酵母包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，Schizosaccharomyces pombe，克魯維氏酵母(kluyveromyces)株，假絲酵母(Candida)或任何可以表達異源蛋白的酵母株系。潛在的合適的細菌株包括大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌或任何可以表達異源蛋白的細菌株。優(yōu)選地，表達βhCG蛋白的或它的融合物、類似物或片段的宿主細胞或表達系統(tǒng)是細菌、酵母、哺母動物或桿狀病毒來源的體系。特別優(yōu)選的是酵母和細菌宿主細胞。
正在考慮一種治療方法，將βhCG聯(lián)合使用脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑注射給哺乳動物，從而產(chǎn)生抗哺乳動物內(nèi)源βhCG的抗體和/或控制哺乳動物的生育，誘導(dǎo)雌性哺乳動物暫時不育。雖然基于目前目的，天然蛋白也可以使用，但是用于免疫的βhCG優(yōu)選的是重組來源的蛋白。重組蛋白有它優(yōu)勢，它們不象天然存在蛋白那樣，可以大規(guī)模較經(jīng)濟的制備。
該發(fā)明的治療方法包括將一種疫苗，包含有效劑量該發(fā)明中的多肽，并結(jié)合脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑給藥到哺乳動物體內(nèi)，從而誘導(dǎo)暫時不育。優(yōu)選的給藥方式，但不避限于此。有肌肉、腹腔內(nèi)或皮下注射。疫苗可以以單劑量注射，然而優(yōu)選兩個或更多劑量。疫苗除了其它可能情況外，可用于誘導(dǎo)較高濃度的抗hCG抗體的產(chǎn)生。
該發(fā)明的治療方法進一步包括交叉免疫體系，它包含一種βhCG蛋白疫苗的組合。由一種宿主細胞產(chǎn)生的重組βhCG疫苗注射到哺乳動物體內(nèi)，隨后又注射由另一種宿主細胞產(chǎn)生的重組βhCG疫苗。這種交叉免疫體系可以克服許多哺乳動物對于某些抗原，特別是“自身”抗原不能引起免疫反應(yīng)的問題。在一種優(yōu)選的實施方案中，注射前，重組βhCG要與脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑聯(lián)合使用。
重組的βhCG蛋白和/或它的融合物、片段、或類似物，由已經(jīng)十分清楚的技術(shù)獲得。總的來說，βhCG基因插入到載體質(zhì)粒中，然后被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細胞中。雖然不是必需的，為了便于表達蛋白的純化可將多聚組氨酸標記的編碼序列加到βhCG基因上。其它修飾可在編碼序列進行，從而獲得類似物，片段和融合物蛋白，轉(zhuǎn)化后的宿主細胞在適合的培養(yǎng)基中生長，被誘導(dǎo)產(chǎn)生所需要的βhCG蛋白，它的類似物或片段和/或融合蛋白。所需的βhCG蛋白用層析方法進行分離。用現(xiàn)代分子生物學(xué)所知技術(shù)中普通和常見技術(shù)載體構(gòu)建，蛋白表達和蛋白純化，一個更為詳細的規(guī)則在隨后例子中給出。
實施例1在細菌表達βhCG蛋白βhCG蛋白的細菌表達是通過構(gòu)建一種載體，pZ179，它包含DNA插入序列具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，載體pZ179來源于PZ98(Gupta，等Biol Reprod.，55410-415(1996))還攜帶編碼β—半乳糖苷酶前20個氨基酸(β—gal)密碼子。在限制性酶切位點Smal和Sall之間的DNA序列為編碼βhCG的第22-165氨基酸的密碼子所替代。一個銜接子(adptor)DNA序列，攜帶限制性酶切位點Smal，Pstl和Bg111，添加在βhCG的DNA 5’末端，這個銜接子序列包括四個編碼子，不是βgal或βhCG天然成份，這些改變提供了一個更加穩(wěn)定的蛋白和使蛋白表達量在大腸桿菌中表達達到最大值。因而，SEQ ID No1中的DNA編碼了一種βhCG/β-gal融合蛋白，無前導(dǎo)序列的βhCG連β-gal片段上，該編碼的融合蛋白的氨基酸序列見SEQ ID No2。
其它對天然βhCG核苷酸序列的改變包括，用Spel限制性酶切位點替換終止密碼子，從而在該蛋白的C末端加上一個多聚組氨酸標記序列。運用pTAC啟動子，因而可添加異丙基β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)來誘導(dǎo)表達。用來表達的宿主菌是TOPP2(Stratagene)。用標準方法將pZ179載體DNA轉(zhuǎn)化到TOPP2載體細胞中。含有pZ179載體DNA的TOPP2克隆(用氨芐青霉素篩選)，在小范圍內(nèi)篩選，得到一個有高表達的克隆。
表達流程，需將一個pZ179/TOPP2克隆接種到一升100毫克/毫升氨芐青霉素的LB肉湯中。培養(yǎng)基置于大約30℃，以大約250rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，直至光密度值為0.4(OD600)，再添加IPTG，濃度約為3mm，誘導(dǎo)重組蛋白表達。誘導(dǎo)大約4個小時，離心，收獲細胞。
為了獲得βhCG融合蛋白，細胞沉淀以大約1克/6毫升的濃度重溶于6M鹽酸胍，100mMNaH2PO4和10mMTris，pH大約8的變性緩沖液中。細胞粘稠懸液在室溫下，振蕩過夜。大約4℃下，17,000rpm轉(zhuǎn)速，離心大約20分鐘，將去除細胞碎片，含有所需βhCG融合蛋白的上清進一步純化。
分離βhCG/β-gal融合蛋白，大約每分鐘10毫升的流速將上清上樣到金屬鎳柱。首先，準備好金屬螯合瓊脂糖快速流動樹脂(pharmacia)，用水沖洗樹脂，將樹脂裝柱，大約5倍柱體積的100mMNiSO4洗柱，更多水洗柱，變性緩沖液洗柱。有βhCG/β-gal融合蛋白的上清上柱后，按下面緩沖液的順序六次洗脫，可獲高純的βhCG/β-gal融合蛋白，各步洗脫組分收集好，并且用紫外280nm波長鑒定。
冼脫液是(1)6M脲素＋20MmTris，pH8(2)6M脲素＋20mMTris＋25mM咪唑，pH8(3)6M脲素＋20mmTris＋25mM咪唑＋300mMNaCl，pH8(4)6M脲素＋20mmTris＋300mMNaCl，pH8(5)6M脲素＋20mM乙酸＋300mMNaCl，pH6(6)6M脲素＋20mM乙酸＋300mMNaCl，pH3.92-4級分有所需βhCG/P-gal融合蛋白，將其合并，然后加入DTT濃度至10mM，以防止蛋白氧化。將級分上G-25葡聚糖凝膠(pharmacia)柱，并用6M脲素50mMTris＋10mMDTT，pH8的緩沖液進行洗脫，脫鹽。用聚丙烯酰胺電泳標準技術(shù)分析蛋白。脫鹽后蛋白以相同緩沖液上樣到Sepharose-Q柱(Pharmacia)，并用100mMNaCl洗脫，從而濃縮，純的βhCG/β-gal融合蛋白-70℃保存。
實施例2βhCG蛋白在酵母中表達βhCG在酵母中的表達開始于克隆一段770堿基對的BamH I片段，它包括βhCG序列，在酵母表達載體YEpFLAG-1(Sigma)N末端的Bg111/BamH1位點上融合了α-成熟因子前導(dǎo)序列。載體唯一的Nrul和Smal位點之間的區(qū)域被去除，并且載體重新連接后，缺失編碼FLAG肽的DNA序列，最終載體命名為PZ500，包含的DNA序列見SEQ ID No3，其編碼的蛋白序列見SEQ ID No4。
將PZ500質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到S.cerevisiae BJ3505(Sigma)中，首先將100μg鮭魚測試載體DNA和0.1μgPZ500表達載體DNA加到1.5毫升微量離心管中，然后加入100微升BJ3505酵母感受態(tài)細胞，旋轉(zhuǎn)振蕩5秒鐘。加入600微升PLATE緩沖液(4％PEG3350,100mM Lithiumactate，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)，旋轉(zhuǎn)振蕩。30℃溫育，同時放在軌道平臺上，以250rpm振蕩。加入80微升DMSO，42℃，15分鐘熱休克細胞。離心3秒鐘，去除上清，用無菌水重懸細胞，轉(zhuǎn)化的細胞在沒有色氨酸的平板上培養(yǎng)，進行篩選。
表達βhCG的酵母克隆在YPD培養(yǎng)基中生長直至平臺期(其密度不再增加)。載體運用ADH-2啟動子，不需要添加誘導(dǎo)劑，一旦培養(yǎng)基中的碳源被耗盡時由碳饑餓激發(fā)，48小時后，離心去除細胞，上清存于-20℃至純化。
從上清中純化βhCG，加入2倍體積的稀釋液(30mM NaOAC，23mMEDTA，pH4.8)，稀釋后的上清上樣到SP柱(Pharmicia)，該柱已經(jīng)預(yù)先用10倍柱體積的平衡液平衡好(20mM NaOAC，40mM NaCl，15mMEDTA，pH4.8)。
10體積沖洗緩沖液(20mM NaOAC，40mM NaCl，pH4.8)清洗后，再10體積平衡緩沖液洗柱，用金屬鈷柱結(jié)合緩沖液(50mMNaH2PO4，20mM Tris，0.1M NaCl，pH8.0)洗脫蛋白，所獲得的洗脫液上樣到一個金屬鈷柱，10倍結(jié)合緩沖液洗柱，再用100mM咪唑的結(jié)合緩沖液2-3倍柱體積洗脫蛋白，最后PBS pH8.0中透析去除咪唑，純化的蛋白-20℃保存。
實施例3βhCG抗原決定簇的定位為了鑒定抗細菌和酵母表達βhCG的多克隆抗體可識別的βhCG抗原決定簇，合成一組有重疊的小肽，依照商家指導(dǎo)用試劑盒(來于Genosys，The Woodlands，Texas)將小肽點在SPOTS膜上。從SEQ IDNo2的βhCG第一個氨基酸開始合成小肽，每段10個氨基酸。隨后的小肽有3個氨基酸的相同段，導(dǎo)致相鄰小肽之間有3個氨基酸重復(fù)?？辜毦徒湍钢斜磉_的βhCG兔多克隆抗血清，進行探測。用現(xiàn)已經(jīng)十分清楚的技術(shù)鑒定被各自的抗血清識別的抗原決定簇。
分析的結(jié)果表明，抗血清識別抗原決簇相應(yīng)于βhCG的67-76位氨基酸和124-139位氨基酸，其中67-76抗原決定簇殘基位于受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(βhCG的62-81位氨基酸)，另外一個抗原決定簇(124-139位氨基酸)與C末端生物中和小肽(135-169位氨基酸)部分重疊。同樣的方法鑒定被抗βhCG抗體識別的其它βhCG抗原決定簇，和鑒定該發(fā)明實際用時的有用片段。
實施例4βhCG摻入到脫乙酰殼多糖/油乳劑中的制備2％脫乙酰殼多糖，0.5M乙酸鈉溶液的制備是將4.1克乙酸鈉(Sigma Chemical Co.，St louis，MO)溶于50毫升去離子水(18mOhmd1)用大約7毫升冰乙酸(Mallinkrodt Chemical.Paris，KY)將溶液pH調(diào)到4.5，再加1.5毫升冰乙酸，補償脫乙酰殼多糖對溶液pH的影響。補加去離子水，使溶液體積至100毫升。大約2克的脫乙酰殼多糖(Sigma Chemical CO，St Louis MO)慢慢加到乙酸鈉溶液中，不停攪拌2-3小時。在IEC臨床離心機(InternationalEquipment Co.Needham Hts.，MA)上離心，第7檔5分鐘，得到澄清的脫乙酰殼多糖溶液。其中上清輕輕倒出，沉淀是含有不可溶的脫乙酰殼多糖/殼質(zhì)和雜質(zhì)。大約有87到90％(重量)的脫乙酰殼多糖在上清中。
50％氫氧化鈉溶液的制備是將50克氫氧化鈉(Sigma Chemical Co.St Louis，MO)溶于100毫升去離子水。鯊烯/表面活性劑溶液的制備是將1500微升鯊烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯(tetracosahexaene)SigmaChemical Co.St Louis MO)用600微升表面活性劑PluronicL121(BASF Corp Parsippany，NJ)旋轉(zhuǎn)振蕩直至均一。
脫乙酰殼多糖/鯊烯/表面活性劑/抗原乳劑的典型制備是添加大約420微升(溶于水或脲中)的抗原到大約370微升2％脫乙酰殼多糖(0.5M乙酸鈉中)，旋轉(zhuǎn)振蕩，實際用的抗原量可以從低于1微克到幾毫克范圍之間，再將大約10微升50％氫氧化鈉加到抗原/脫乙酰殼多糖中，旋轉(zhuǎn)振蕩。加入大約10微升50％氫氧化鈉的時候，要到有穩(wěn)定的絮狀沉淀形成。再將大約140μl先前制備的鯊烯/表面活性劑溶液添加到上述抗原—脫乙酰殼多糖溶液中。旋轉(zhuǎn)振蕩幾分鐘，在免疫研究，注射前，需再旋轉(zhuǎn)振蕩或抽射器抽吸重新混合。
實施例5含有鋅或銅或鎳的金屬/脫乙酰殼多糖/抗原復(fù)合物的制備制備含有鋅或銅或鎳的脫乙酰殼多糖/金屬復(fù)合物佐劑，首先要制備2％脫乙酰殼多糖溶液，將2克脫乙酰殼多糖(CTC Organics，Atlanta，GA)溶于100毫升2％乙酸中。獲得的溶液用高壓蒸汽滅菌。做為選擇，還可以通過將2克脫乙酰殼多糖溶于100毫升0.5MpH為4.5的乙酸鈉中。乙酸鋅、硫酸鎳或硫酸銅溶液的制備是將其溶于去離子水，其摩爾濃度在0.001至0.2M之間，過濾滅菌。2％的脫乙酰殼多糖用去離子水1∶1稀釋，4ml稀釋后的1％脫乙酸殼多糖溶液加到10毫升所需金屬鹽溶液中。產(chǎn)生的懸浮液在室溫下攪拌2到4小時，混和物用Branson Sonifier250超聲破碎儀超聲處理3到5分鐘，并且混和物PH在超聲過程中用10N NaOH調(diào)到12.0-12.5。如果是鋅鹽時，有白色沉淀生成，鎳鹽時有亮綠色沉淀，銅鹽時，有藍色沉淀。超聲處理后，混合物以2000rpm(即1000×g)離心10分鐘，然后去除上清。含有脫乙酰殼多糖螯合鹽的沉淀用PBS，pH7.2洗2次，每次洗后離心。測定濕的沉淀重量，并用8M脲，pH7.8到8.0，重溶金屬/脫乙酰殼多糖復(fù)合物，存在8M脲素中或PBS中。在室溫下，表明貯存的金屬/脫乙酰殼多糖可以穩(wěn)定存在直至六個月。
抗原與金屬/脫乙酰殼多糖復(fù)合物連結(jié)是通過以下過程含有6個組氨酸的重組蛋白平衡于8M脲素中，然后以大約100∶1的比例與脫乙酰殼多糖金屬復(fù)合物加到一個塑料管中，在室溫下溫育1到3小時。溫育后蛋白/金屬/脫乙酰殼多糖復(fù)合物以1000Kg速度，離心10分鐘，沉淀下來。結(jié)合蛋白的含量可由測定沉淀后上清中蛋白的含量，從原先加入到結(jié)合反應(yīng)中總蛋白量中扣除，即可得到。總的來說，抗原金屬/脫乙酰殼多糖的比例是1∶500(2毫升/克，濕重)。脫乙酰殼多糖蛋白沉淀用PBS沖洗兩次，再用PBS重懸，濃度調(diào)到1毫克抗原/毫升緩沖液，用于下面的注射。
實施例6將重組βhCG給雌性小鼠注射雌性小鼠腹腔注射細菌和酵母重組βhCG(實施例1和2產(chǎn)生的，結(jié)合實施例5佐劑)進行免疫。在首次免疫前，動物進行采血獲得對照血清。經(jīng)過首次免疫，動物在所定間隙進行采血，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗βhCG抗體用ELISA方法測定(該方法在技術(shù)上已經(jīng)十分清楚)。評價抗體抵制注射的天然hCG生物活性的能力。
更為特異性地，十只小鼠注射3次，每次3星期間隔，用25微克純化酵母表達的βhCG以脫乙酰殼多糖和乙酸鋅佐劑(如上制備)，總體積100微升，血清中抗天然hCG的抗體用ELISA測定(在三次疫苗最后一次注射的一個月后)如下表示小鼠號滴度161-116000161-22000161-332000161-416000161-5800080-1 400080-2 800080-3＜25080-4 800080-5＜250小鼠80-3和80-5最初并沒有對由酵母表達的βhCG疫苗產(chǎn)生免疫反應(yīng)。結(jié)果，這些小鼠在2個星期內(nèi)用25μg細菌表達的βhCG疫苗免疫。這種交叉免疫導(dǎo)致注射疫苗三個星期后，ELISA測定抗天然hCG的抗體數(shù)值為4000。在注射疫苗六星期后升高12800，這些結(jié)果闡明了，對酵母βhCG疫苗不產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動物可通過用細菌表達的βhCG疫苗來交叉免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
上述數(shù)據(jù)表明，對于酵母中制備的疫苗不能產(chǎn)生抗體的動物在注射不同宿主細胞產(chǎn)生相同或相似抗原后能產(chǎn)生足夠抗βhCG的抗體量。
實施例7給人注射βhCG雖然前面例子中對小鼠注射的組合物和發(fā)明方法同樣對其他哺乳動物，包括人類有用，用來給人注射的合適的有效試劑，可輕易的用技術(shù)中常用方法確定。
該發(fā)明的有效劑量的組合組可以肌肉、皮下或其他已知方法注射到人體，從而誘導(dǎo)不育或刺激抗體的產(chǎn)生。
如果有人易于在第一次注射該發(fā)明組合物后不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，則可以運用交叉免疫方法。一種由其它宿主細胞產(chǎn)生的βhCG有效劑量通過肌肉或皮下注射。在優(yōu)選的實施方案中，交叉免疫規(guī)則可作為首先規(guī)則。
該發(fā)明并不是局限于所舉的各實施方案，這只是為了解釋該發(fā)明，由同等功能的組合物和方法也在該發(fā)明范圍內(nèi)。真正地，對于技術(shù)精通的人來說，在依照現(xiàn)優(yōu)選的實施方案后，可以預(yù)計在發(fā)明實踐中會產(chǎn)生數(shù)目眾多的修飾物和突變體。在該發(fā)明范圍內(nèi)的限制僅僅是那些在申請的權(quán)利要求中。
序列表<110>ZONAGEN，INC.<120>人絨毛膜促性腺激素<130>27779/35932<140><141><150>60/100,766<151>1998-09-17<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>534<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(534)<400>1atg acc atg att acg gat tcg cta gcc gtc gtt ctg cag cgt cgc gac48Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp1 5 10 15tgg gaa aac ccg ggc tgc aga gat ctc aag gag ccg ctt cgg cca cgg96Trp Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Leu Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg20 25 30tgc cgc ccc atc aat gcc acc ctg gct gtg gag aag gag ggc tgc ccc144Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro35 40 45gtg tgc atc acc gtc aac acc acc atc tgt gcc ggc tac tgc ccc acc192Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr50 55 60atg acc cgc gtg ctg cag ggg gtc ctg ccg gcc ctg cct cag gtg gtg240Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val65 70 75 80tgc aac tac cgc gat gtg cgc ttc gag tcc atc cgg ctc cct ggc tgc288Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys85 90 95ccg cgc ggc gtg aac ccc gtg gtc tcc tac gcc gtg gct ctc agc tgt336Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys100 105 110caa tgt gca ctc tgc cgc cgc agc acc act gac tgc ggg ggt ccc aag384Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys115 120 125gac cac ccc ttg acc tgt gat gac ccc cgc ttc cag gac tcc tct tcc432Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser130 135 140tca aag gcc cct ccc ccc agc ctt cca agc cca tcc cga ctc ccg ggg480Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly145 150 155 160ccc tcg gac acc ccg atc ctc cca caa act agt cac cac cat cac cac528Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Thr Ser His His His His His165 170 175cat taa534His<210>2<211>177<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Leu Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg20 25 30Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro35 40 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Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro225 230 235 240Ile Leu Pro Gln Thr Ser His His His His His His245 250
權(quán)利要求
1.組合物，它包含β人絨膜促性腺激素蛋白(βhumanchorionic gonadotropin protein βhCG)和/或它的融合物，片段或類似物和一種以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中β人絨膜促性腺激素蛋白(βhCG)含量在大約10微克到大約500微克之間。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中β人絨膜促性腺激素蛋白(βhCG)含量大約是250微克。
4.權(quán)利要求1-3組合物，其中β人絨膜促性腺激素蛋白包含一種重組多肽。
5.權(quán)利要求4組合物，其中一個重組多肽進一步包含SEQ IDNo2或4的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，它包含脫乙酰殼多糖乳劑，氫氧化鈉，一種生物可降解油，一種表面活性劑和一種水溶性緩沖液。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中生物可降解的油是鯊烯。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中βhCG蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中佐劑包含脫乙酰殼多糖乳劑，一種金屬鹽和一種水溶性的緩沖液。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中金屬鹽是醋酸鋅，硫酸鎳和硫酸銅其中的一種。
11.權(quán)利要求9的組合物，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
12.權(quán)利要求4的組合物，其中一種重組β人絨膜促性腺激素蛋白，它包含一種融合蛋白，基本上由β人絨膜促性腺激素蛋白或它的片段或類似物融合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所組成。
13.導(dǎo)致雌性哺乳動物不育的方法，它包含給藥至少一份劑量的疫苗，該疫苗包含β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的片段，類似物并與一種以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑合用，其劑量足以刺激抗體的產(chǎn)生，此抗體可以識別天然循環(huán)存在的人絨膜促性腺激素蛋白(hCG)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量在10微克到500微克之間。
15.權(quán)利要求14的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量是大約250微克。
16.權(quán)利要求13-15的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白包含一種重組多肽。
17.權(quán)利要求16的方法，其中一個重組多肽包含SEQ ID No2和4的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求13的組合物中以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，它包含脫乙酰殼多糖乳劑，氫氧化鈉，一種生物可降解的油，一種表面活性劑和一種水溶性緩沖液。
19.權(quán)利要求18的方法，其中生物可降解的油是鯊烯。
20.權(quán)利要求18的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
21.權(quán)利要求13的方法，其中佐劑包含脫乙酰殼多糖乳劑，一種金屬鹽和一種水溶性的緩沖液。
22.權(quán)利要求21的方法，其中金屬鹽是醋酸鋅，硫酸鎳和硫酸銅其中的一種。
23.權(quán)利要求21的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
24.權(quán)利要求16的方法，其中一種重組β人絨膜促性腺激素蛋白，它包含一種融合蛋白，基本上由β人絨膜促性腺激素蛋白或它的片段或類似物融合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所組成。
25.一種導(dǎo)致雌性哺乳動物不育的方法，它包含a)給藥一種宿主細胞表達的重組β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的類似物，可有可無地，與以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑聯(lián)合施用；并且b)注射由其他不同于步驟(a)的給藥的重組βhCG宿主細胞表達的重組β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的類似物，可有可無地，與一種以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑合用；并且其中步驟b)中β人絨膜促性腺激素蛋白的量足以有效的刺激抗體的產(chǎn)生，此抗體可以識別天然循環(huán)存在的人絨膜促性腺激素蛋白(hCG)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量在大約10微克到大約500微克之間。
27.權(quán)利要求26的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量是大約250微克。
28.權(quán)利要求25的方法，其中一個重組多肽包含SEQ ID No2或4的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求25的方法，其中以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑包含脫乙酰殼多糖乳劑，氫氧化鈉，一種生物可降解的油，一種表面活性劑和一種水溶性緩沖液。
30.權(quán)利要求29的方法，其中生物可降解的油是鯊烯。
31.權(quán)利要求29的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
32.權(quán)利要求25的方法，其中佐劑包含脫乙酰殼多糖，一種金屬鹽和一種水溶性的緩沖液。
33.權(quán)利要求32的方法，其中金屬鹽是醋酸鋅，硫酸鎳和硫酸銅其中一種。
34.權(quán)利要求32的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
35.權(quán)利要求25的方法，其中重組β人絨膜促性腺激素蛋白，它包含一種融合蛋白，基本上由β人絨膜促性腺激素蛋白或它的片段或類似物結(jié)合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所組成。
36.在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的方法包含a)給藥由一種宿主細胞表達的重組β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的類似物，并可有可無地，與一種以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑合用；并且b)給藥由其他不同于步驟a中給藥重組βhCG的宿主細胞表達的重組β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的類似物，可有可無地，與一種以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑合用；并且其中步驟b)中β人絨膜促性腺激素蛋白給藥量足以刺激抗體的產(chǎn)生，此抗體可以識別天然循環(huán)存在的人絨膜促性腺激素蛋白(hCG)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量在大約10微克到大約500微克之間。
38.權(quán)利要求37的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量是大約250微克。
39.權(quán)利要求37的方法，其中一個重組多肽另外包含SEQ IDNo2或4的氨基酸序列。
40.權(quán)利要求36的方法，其中以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑，它包含脫乙酰殼多糖乳劑，氫氧化鈉，一種生物可降解的油，一種表面活性劑和一種水溶性緩沖液。
41.權(quán)利要求40的方法，其中生物可降解的油是鯊烯。
42.權(quán)利要求40的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
43.權(quán)利要求36的方法，其中佐劑包含脫乙酰殼多糖，一種金屬鹽和一種水溶性的緩沖液。
44.權(quán)利要求43的方法，其中金屬鹽是醋酸鋅，硫酸鎳和硫酸銅其中一種。
45.權(quán)利要求43的方法，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
46.權(quán)利要求36的方法，其中重組β人絨膜促性腺激素蛋白，它包含一種融合蛋白，基本上由β人絨膜促性腺激素蛋白或它的片段或類似物連接到β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所組成。
47.β人絨膜促性腺激素蛋白在導(dǎo)致哺乳動物暫時性的不育的藥物合成中的應(yīng)用，其中該藥物為一種可注射的制劑，包含β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的片段，類似物，可有可無地，與一種以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑合用，其劑量足以刺激抗體的產(chǎn)生，此抗體可以識別天然循環(huán)存在的人絨膜促性腺激素蛋白(hCG)。
48.權(quán)利要求47的用途，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量在大約10微克到大約500微克之間。
49.權(quán)利要求48的用途，其中β人絨膜促性腺激素蛋白的含量是250微克。
50.權(quán)利要求47的用途，其中β人絨膜促性腺激素蛋白包含一種重組多肽。
51.權(quán)利要求50的用途，其中重組多肽包含氨基酸序列SEQ IDNo2和4。
52.權(quán)利要求47的用途，其中以脫乙酰殼多糖為基礎(chǔ)的佐劑包含脫乙酰殼多糖乳劑，氫氧化鈉，一種生物可降解的油，一種表面活性劑和一種水溶性緩沖液。
53.權(quán)利要求52的用途，其中生物可降解的油是鯊烯。
54.權(quán)利要求52的用途，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
55.權(quán)利要求47的用途，其中佐劑包含乙酰甲殼質(zhì)乳劑，一種金屬鹽和一種水溶性的緩沖液。
56.權(quán)利要求55的用途，其中金屬鹽是醋酸鋅，硫酸鎳和硫酸銅其中一種。
57.權(quán)利要求55的用途，其中β人絨膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或類似物與佐劑的比例在大約1∶20(重量/重量)到大約1∶1500(重量/重量)之間。
58.權(quán)利要求50的用途，其中重組β人絨膜促性腺激素蛋白包含一種融合蛋白，基本上由β人絨膜促性腺激素蛋白或它的片段或類似物融合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所組成。
全文摘要
一種應(yīng)用重組技術(shù)獲得人絨膜促性腺激素蛋白β亞基(βhCG)的方法,編碼該蛋白,片段以及它類事物的新DNA序列并且用這些重組蛋白并加上佐劑通過免疫滅活懷孕激素從而干擾哺乳動物懷孕。
文檔編號A61P15/00GK1326359SQ99813381
公開日2001年12月12日 申請日期1999年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月17日
發(fā)明者J·哈里斯, M·馬蒂尼茲 申請人:佐納根有限公司