一種人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法：將溫敏載體NHS-PNIPAM固定化木瓜蛋白酶于pH7.0，0.05mol/LPBS緩沖液中，加入人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體，20～60℃水浴反應(yīng)2～24h，反應(yīng)液于40℃，10000r/min離心15min，沉淀為NHS-PNIPAM固定化木瓜蛋白酶，回收利用，濾液為含抗體Fab片段的水解液，采用蛋白L親和層析對(duì)含抗體片段的水解液進(jìn)行分離純化，獲得抗體Fab片段；本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、純化步驟少、所得抗體片段純度高；本發(fā)明中制備的抗體Fab片段只需經(jīng)過(guò)一步純化就可達(dá)到96.0％以上的純度。
【專利說(shuō)明】一種人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的分離方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體片段的制備方法，特別涉及一種人絨毛膜促性腺激素 單克隆抗體片段的制備方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 人絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotrophin, HCG)是人類受孕后分 泌的一種維持正常妊娠所需的糖蛋白激素，檢測(cè)尿中的HCG即可證實(shí)妊娠。此外，研究發(fā)現(xiàn) HCG的合成與分泌還與婦科疾病及惡性腫瘤等疾病相關(guān)，因此，HCG單克隆抗體不僅可用于 早期妊娠診斷，同時(shí)對(duì)妊娠相關(guān)疾病以及惡性腫瘤等疾病的診斷、鑒定具有一定的參考價(jià) 值。但是，完整的HCG單克隆抗體分子量大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在組織中穿透力差，且Fc片段的存 在在疾病治療中易引起異種間免疫原性以及在早孕檢測(cè)中易產(chǎn)生假陽(yáng)性，從而使抗體在診 斷和治療方面存在局限，而將HCG單克隆抗體片段化后產(chǎn)生的Fab或F (ab) ' 2片段與完整 的抗體相比具有：分子量小，穿透性強(qiáng)；與HCG結(jié)合的特異性增加；免疫原性降低等優(yōu)點(diǎn)，從 而使抗HCG單克隆抗體的應(yīng)用更安全、有效。因此，若能研制出純度高、穩(wěn)定性好的活性HCG 抗體片段并應(yīng)用于妊娠及相關(guān)疾病診斷試劑的開(kāi)發(fā)，必將帶來(lái)可觀的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] 根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及專利報(bào)道，酶解抗體是獲得抗體片段的主要方法，常用的 酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰酶等，其中以木瓜蛋白酶、胃蛋 白酶應(yīng)用最為廣泛，而游離酶水解抗體使酶無(wú)法重復(fù)利用，同時(shí)增加了消化液中抗體片段 的分離純化難度，不利于高純度抗體片段的獲得，將酶固定化不僅增加了酶的穩(wěn)定性，更降 低了后續(xù)抗體片段分離純化的難度。但是，傳統(tǒng)的固定化載體均進(jìn)行異相催化，使酶在催化 過(guò)程中存在一定的空間位阻，導(dǎo)致酶的催化效率降低，而智能型高分子載體固定化酶可通 過(guò)控制反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)均相催化與異相分離，提高了酶的催化效率及重復(fù)使用率。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，該方法 操作簡(jiǎn)便、純化步驟少、所得的抗體片段純度高。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的分離方法，所述方法為： 將固定化木瓜蛋白酶溶于PH7. 0、0. 05mol/L PBS緩沖液中得固定化木瓜蛋白酶溶液，加入 人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體，20?40°C水浴反應(yīng)2?IOh (優(yōu)選于30°C反應(yīng)3h)，反應(yīng) 液離心（優(yōu)選于40°C，10000r/min離心15min)，沉淀為固定化木瓜蛋白酶，回收利用；上清 液為含人絨毛膜促性腺激素抗體片段的水解液；采用蛋白L親和層析對(duì)含人絨毛膜促性腺 激素抗體片段的水解液進(jìn)行分離純化，獲得人絨毛膜促性腺激素抗體片段；所述固定化木 瓜蛋白酶加入量以抗體體積計(jì)為〇. 1?I. 〇mg/ml (優(yōu)選0. 1?0. 3mg/ml)，所述固定化木瓜 蛋白酶載酶量為〇. 03?0. 3g/g載體；所述人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體利用蛋白A親 和層析法從小鼠腹水中純化獲得；
[0007] 所述固定化木瓜蛋白酶是以NHS-PNIPAM為載體，以木瓜蛋白酶為底物，以pH 8. 5,0. lmol/L的硼酸緩沖液和N，N-二甲基甲酰胺為反應(yīng)介質(zhì)，在10?25°C水浴振蕩2? l〇h，離心，取沉淀即為固定化木瓜蛋白酶；所述NHS-PNIPAM為N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的 聚N-異丙基丙烯酰胺（平均分子量（M n)為2000,購(gòu)自Sigma公司）；所述NHS-PNIPAM與 木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1:0. 1?1。
[0008] 所述NHS-PNIPAM固定化的原理為：
[0009]

【權(quán)利要求】
1. 一種人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的分離方法，其特征在于所述方法為：將 固定化木瓜蛋白酶溶于PH7. 0,0. 05mol/L PBS緩沖液中得固定化木瓜蛋白酶溶液，加入人 絨毛膜促性腺激素單克隆抗體，20?40°C水浴反應(yīng)2?10h，反應(yīng)液離心，沉淀為固定化木 瓜蛋白酶，回收利用；上清液為含人絨毛膜促性腺激素抗體片段的水解液；采用蛋白L親和 層析對(duì)含人絨毛膜促性腺激素抗體片段的水解液進(jìn)行分離純化，獲得人絨毛膜促性腺激素 抗體片段；所述固定化木瓜蛋白酶加入量以抗體體積計(jì)為〇. 1?I. 〇mg/ml，所述固定化木 瓜蛋白酶載酶量為〇. 03?0. 3g/g載體；所述人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體利用蛋白A 親和層析法從小鼠腹水中純化獲得； 所述固定化木瓜蛋白酶是以NHS-PNIPAM為載體，以木瓜蛋白酶為底物，以pH 8.5， 0. lmol/L的硼酸緩沖液和N，N-二甲基甲酰胺為反應(yīng)介質(zhì)，在10?25°C水浴振蕩2?10h， 離心，取沉淀即為固定化木瓜蛋白酶；所述NHS-PNIPAM為N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚 (N-異丙基丙烯酰胺）；所述NHS-PNIPAM與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1:0. 1?1。
2. 如權(quán)利要求1所述人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的分離方法，其特征在于所 述固定化木瓜蛋白酶溶液是將固定化木瓜蛋白酶溶于含終濃度5?20mmol/L半胱氨酸和 終濃度 I. 〇 ?2. Ommol/L EDTA 的 pH7. 0、0? 05mol/LPBS 緩沖液，制成 0? 1 ?3. Omg/ml 的固 定化木瓜蛋白酶溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的分離方法，其特征在于 所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制備：將NHS-PNIPAM溶于預(yù)先用活化后的4A分子篩 干燥過(guò)夜的N，N-二甲基甲酰胺中，加入木瓜蛋白酶溶液，15°C水浴振蕩2h，將所得反應(yīng) 液用pH7.0、0. 05mol/LPBS緩沖液稀釋，在40°C、11000r/min離心30min，收集沉淀，沉 淀用4°C、pH7.0,0. 05mol/L磷酸緩沖液溶解后再在40°C、llOOOr/min離心30min，重復(fù)3 次，最后獲得的沉淀即得固定化木瓜蛋白酶；所述木瓜蛋白酶溶液是將木瓜蛋白酶用pH 8. 5、0. lmol/L的硼酸緩沖液溶解配制成2. 0?20. 0mg/ml的溶液，所述木瓜蛋白酶活力 為570. 3U/mg ;所述NHS-PNIPAM的質(zhì)量用量以N，N-二甲基甲酰胺體積計(jì)為100mg/ml，所 述木瓜蛋白酶溶液的用量以木瓜蛋白酶質(zhì)量計(jì)，所述木瓜蛋白酶與NHS-PNIPAM質(zhì)量比為 0? 1:1。
4. 如權(quán)利要求1所述人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段的分離方法，其特征在于所 述含人絨毛膜促性腺激素抗體片段的水解液分離純化的方法為：將含人絨毛膜促性腺激素 抗體片段的水解液上蛋白L層析柱，用pH3. 0、0. IM檸檬酸緩沖液洗脫，流速lml/min，收集 洗脫液，立即用pH 9. 0、I. OM的Tris-HCl緩沖液調(diào)pH至7. 0,以Millipore超濾管脫鹽濃 縮，收集截留液即為人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體片段。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104313091SQ201410505048
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月27日
【發(fā)明者】易喻, 應(yīng)國(guó)清, 高虹, 王鴻, 梅建鳳, 陳建澍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)