專利名稱：：人絨毛膜促性腺激素液體制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及含促性腺激素的液體藥物制劑。更具體地涉及以多元醇或非還原糖穩(wěn)定的hCG(人絨毛膜促性腺激素)液體制劑。人們知道，高純度蛋白質(zhì)容易發(fā)生降解，甚至由于接觸空氣中的物質(zhì)而引起。這一特性對于用重組DNA技術制備的蛋白質(zhì)甚至更為明顯。這樣的蛋白質(zhì)常以多糖類如乳糖、或以甘露糖醇、或以蛋白質(zhì)或氨基酸如白蛋白和甘氨酸加以穩(wěn)定。用通常包括冷凍干燥步驟的方法得到干燥粉末，來獲得可注射的穩(wěn)定化的促性腺激素制劑；經(jīng)這樣的方法制成的穩(wěn)定化的制劑，即使儲存在室溫下也可保持較長周期的活性。WO93/11788描述了單獨以蔗糖或以蔗糖和其它穩(wěn)定劑合用進行穩(wěn)定化的含促性腺激素的冷凍干燥的藥物組合物。在所述專利申請中表明，蔗糖給研究中的冷凍干燥組合物提供的穩(wěn)定性優(yōu)于乳糖或甘露糖醇所提供的。迄今無人描述促性腺激素的液體穩(wěn)定化制劑。人們極需得到這種液體制劑，以便使組合物易于注射并避免冷凍粉末的重建，從而簡化使用方法。我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以得到這樣的液體穩(wěn)定化制劑。本發(fā)明的主要目的是提供以多元醇或非還原糖穩(wěn)定化的含hCG的液體藥物組合物。多元醇以甘露糖醇為佳，非還原糖以蔗糖為佳。本發(fā)明的液體制劑以甘露糖醇穩(wěn)定則更佳。溶液以緩沖的水溶液為佳，按本發(fā)明的緩沖液選自磷酸鹽、乙酸鹽或琥珀酸鹽組成的一組。較佳的緩沖液為磷酸鹽，pH以7.00為佳。hCG以重組體為佳，例如可按歐洲專利160699所描述的技術，在CHO(中國倉鼠卵巢)中表達，用相應的DNA轉化，來進行制備。本發(fā)明的進一步目的是提供所述液體藥物組合物的制備方法，包括用含賦形劑的緩沖液溶液稀釋hCG儲備液。本發(fā)明的另一個目的是提供供應市場形式的所述液體藥物組合物，包含在無菌條件下密封于適合使用前儲存的容器中的這種制劑。為了使本發(fā)明的hCG制劑的穩(wěn)定性達到最優(yōu)化，曾以各種pH、過離子強度、介電常數(shù)的不同緩沖液和不同濃度的重組hCG進行過一系列預試驗。為了評估pH和緩沖液的效應，用注射用水配制0.01M磷酸鹽、琥珀酸鹽或乙酸鹽緩沖液溶液。用1MNaOH將pH調(diào)節(jié)為6.0、7.0或8.0。將重組hCG的儲備液加到緩沖系統(tǒng)中，達到5,000IU/ml的溶液。然后將溶液過濾，傾入3ml玻璃小瓶中。這樣制得的制劑的組合物報告于表1。對這些制劑進行了穩(wěn)定性的加速試驗研究，以便通過較高溫度數(shù)據(jù)的外推，可預見制劑室溫儲存于容器中時的穩(wěn)定性。在這種情況下，將樣品儲存于40℃和50℃，按下面的標準條件用HPSEC分析測定其純度以檢查考察重組hCG的穩(wěn)定性。A相0.1M磷酸鹽(pH6.7)+0.1MNa2SO4等效條件(Isocraticcondition)100％A相柱TSKG2000SWXL流速0.5ml/分鐘紫外檢測器214nm注射體積20μl(10,000IU強度)40μl(5,000IU強度)表3報告了用HPSEC測得的重組hCG單體峰的百分率。結果表明，pH6.0和8.0的溶液比pH7.0的溶液的穩(wěn)定性較差，而在緩沖液之間未觀察到明顯的穩(wěn)定性差異。對重組hCG5,000IU/ml溶液評估了離子強度的效應，該溶液以0.01M磷酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液(pH7.0)配制，以NaCl調(diào)節(jié)至如下滲透壓值150,300和400mOsm。制劑的組合物報告于表2。將樣品儲存于4℃、25℃、40℃和50℃，用HPSEC測定重組hCG的穩(wěn)定性。表4所報告的結果表明，離子強度的增加對重組hCG的穩(wěn)定性有負性效應。對以0.01M磷酸鹽和琥珀酸鹽(pH7)配制的含5、10和15％丙二醇的5,000IU/ml重組hCG溶液進行了介電常數(shù)效應的評估。制劑的組合物報告于表2。將樣品儲存于4℃、25℃、40℃和50℃，用HPSEC測定重組hCG的穩(wěn)定性。表4所報告的結果表明，增加丙二醇的百分率對重組hCG的穩(wěn)定性有負性效應。為了評估重組hCG濃度的效應，用HPSEC對分別含2,500、5,000、7,500和10,000IU/ml重組hCG的磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.0)溶液在50℃的穩(wěn)定性監(jiān)測2周。表5所報告的結果表明，較濃的溶液穩(wěn)定性較高。為了比較各種穩(wěn)定劑和/或賦形劑對重組hCG穩(wěn)定性的效應，用0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)制備含10,000IU/ml重組hCG的六種液體制劑，作為第一步。用蔗糖、甘氨酸、葡萄糖、甘露糖醇、乳糖和NaCl作為穩(wěn)定劑/賦形劑。制劑的組合物報告于表6。通過將樣品儲存于4℃、25℃、40℃和50℃將這些制劑進行穩(wěn)定性試驗，并用生物鑒定和HPSEC進行試驗。接著，在所述第一步結果的基礎上，用蔗糖和甘露糖醇作為穩(wěn)定劑，制備兩種所選擇的制劑各4批。表7報告了這些制劑的組合物。按照歐洲藥典專著進行生物測定。表8報告了HPSEC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，表9報告了生物活性值。結果顯示如下1.一周儲存后，含葡萄糖和乳糖的制劑的生物活性于50℃時明顯地降低。單體峰也低于其它制劑所測得的。2.在甘氨酸和NaCl存在下，與含蔗糖和甘露糖醇的制劑相比，測得的生物活性和純度明顯降低。在這種情況下，重組hCG單體峰百分率的降低不是由于凝聚狀態(tài)的形成，而是由于游離亞單位的增加。表10和表11分別報告了用HPSEC測得的5,000和10,000IU強度的純度。數(shù)據(jù)表明，甚至在50℃儲存3周后，含甘露糖醇的制劑純度高于含蔗糖的制劑。表12和13報告了在50℃儲存1周后蔗糖和甘露糖醇制劑用反相HPLC測得的α亞單位的純度。資料證實含甘露糖醇的制劑比含蔗糖的制劑穩(wěn)定性好。反相HPLC采用如下標準條件進行A相在1升重蒸餾水中加TFA1mlB相在1升乙腈中加TFA0.79ml梯度條件時間A％B％0851520′604021′208022′8515柱AquaporeRP30025cm柱溫40℃流速1ml/分鐘紫外檢測器214nm注射體積10μl表14和15中報告了生物活性測定的結果。甘露糖醇制劑在4℃和25℃放置24小時后未觀察到可察覺的生物活性降低。按照本發(fā)明，液體藥物組合物包含hCG1,000-40,000IU/ml，以10,000IU/ml為佳，包含在0.01M緩沖液中的甘露糖醇10-180mg/l，以54.6mg/ml為佳。藥物制備實施例材料磷酸85％RPEACD(CarloErba)；甘露糖醇DAB，PhEurBP，F(xiàn)U，USP，F(xiàn)CC，E421(Merck)，NaOH1M(Merck)，注射用水。用作制劑小瓶的基本容器包括3ml玻璃小瓶(DIN2R)(I型硼硅玻璃)，橡皮塞(PharmagummiW1816V50)，鋁環(huán)和翻轉帽(flipoffcap)(PharmaMetalGmbH)。含甘露糖醇的重組hCG溶液的制備將磷酸(0.98g)加到注射用水(600ml)中。如果需要，用1MNaOH將pH調(diào)節(jié)至7.0。將甘露糖醇(54.6g)加到磷酸溶液中，再校正pH，如果需要，用1MNaOH或1∶5稀釋的磷酸調(diào)節(jié)至7.00±0.2。然后將重組hCG儲備液(10MIU或20MIU，如果所需的最終強度分別為5,000或10,000IU)加到賦形劑溶液中，再校正pH，如果需要，用1MNaOH或1∶5稀釋的磷酸調(diào)節(jié)至7.00±0.2。用注射用水使溶液成為1升。然后在層流下在不大于1.5大氣壓的壓力下使此溶液經(jīng)0.22μm的Millipak20濾器過濾，將溶液收集到燒瓶中，緩和地攪拌約1分鐘。然后用0.5ml重組hCG溶液充填小瓶。表1r-hCG溶液組合物</tables>表2r-hCG溶液組合物離子強度/介電常數(shù)</tables>充填體積1mlFOS＝磷酸鹽緩沖液SUC＝琥珀酸鹽緩沖液7.0＝pH7.0PG5＝丙二醇5％PG10＝丙二醇10％PG15＝丙二醇15％150，300，400克分子滲透壓濃度表3r-hCG純度(％)HPSEC數(shù)據(jù)pH/緩沖效應</tables>W＝周ACE＝乙酸鹽緩沖液SUC＝琥珀酸鹽緩沖液FOS＝磷酸協(xié)緩緩沖液6/7/8＝pH6.0，7.0，8.0表4r-hCG純度(％)HPSEC數(shù)據(jù)離子強度/介電常數(shù)</tables>-＝未測試FOS＝磷酸鹽緩沖液SUC＝琥珀酸鹽緩沖液7.0＝pH7.0PG5＝丙二醇5％PG10＝丙二醇10％PG15＝丙二醇15％W＝周150，300，400＝克分子滲透壓濃度表5r-hCG純度(％)HPSEC數(shù)據(jù)濃度效應</tables>Fos/25002,500IU/mlr-hCGFos/50005,000IU/mlr-hCGFos/75007,500IU/mlr-hCGFos/100001,0000IU/mlr-hCG表6液體制劑小瓶組合物</tables>緩沖液H3PO40.01M，pH7.0充填體積0.5ml表7液體制劑小瓶組合物</tables></tables>充填體積0.5ml表8與不同賦形劑的兼容性HPSEC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)純度(％)</tables>W＝周充填體積＝0.5mlFOS＝磷酸鹽緩沖液SAC＝蔗糖，GLY＝甘氨酸，GLU＝葡萄糖，MAN＝甘露糖醇，LAT＝乳溏N.T.＝未測試表9與不同賦形劑的兼容性生物測定數(shù)據(jù)(IU/ml)</tables>W＝周充填體積＝0.5ml*＝一次有效測試n.v.＝無有效測試-＝未測試FOS＝磷酸鹽緩沖液SAC＝蔗糖，GLY＝甘氨酸，GLU＝葡萄糖，MAN＝甘露糖醇，LAT＝乳溏N.T.＝未測試表10液體制劑濃度5,000IU/小瓶HPSEC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)純度(％)制劑開發(fā)</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表11液體制劑濃度10,000IU/小瓶HPSEC穩(wěn)定性數(shù)據(jù)純度(％)制劑開發(fā)</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表12液體制劑用RP-HPLC測得α亞單位純度</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表13液體制劑用RP-HPLC測得α亞單位純度</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表14液體制劑生物測定數(shù)據(jù)(IU/ml)</tables></tables>W＝周NV＝無有效測試S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效測試表14(續(xù))</tables></tables>W＝周NV＝無有效測試S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效測試表15液體制劑10,000IU小瓶生物測定數(shù)據(jù)(IU/ml)</tables></tables>W＝周NV＝無有效測試S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效測試表15(續(xù))</tables></tables>W＝周NV＝無有效測試S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效測試權利要求1.液體藥物組合物，包含人絨毛膜促性腺激素和穩(wěn)定劑量的多元醇或非還原糖。2.如權利要求1所述的液體藥物組合物，其中多元醇為甘露糖醇。3.如權利要求1所述的液體藥物組合物，其中非還原糖為蔗糖。4.如權利要求1所述的液體藥物組合物，其中人絨毛膜促性腺激素是重組體。5.如權利要求1-4之一所述的液體藥物組合物，其中溶液是緩沖的水溶液。6.如權利要求5所述的液體藥物組合物，其中緩沖溶液選自乙酸鹽、琥珀酸鹽和磷酸鹽組成的一組。7.如權利要求6所述的液體藥物組合物，其中緩沖液為磷酸鹽緩沖液。8.如權利要求5-7之一所述的液體藥物組合物，其中緩沖溶液為pH7.00。9.如權利要求5-8之一所述的液體藥物組合物，其中緩沖溶液為0.01M。10.如權利要求1所述的液體藥物組合物，包含1,000-40,000IU/mlhCG和在pH為7.00的0.01M磷酸鹽緩沖液中的甘露糖醇10-180mg/l。11.制備權利要求1所述液體藥物組合物的方法，其特征在于用含賦形劑的緩沖液稀釋hCG儲備液。12.權利要求1所述液體藥物組合物的供應市場形式，其特征在于在無菌條件下密封于適合使用前儲存的容器中。全文摘要本發(fā)明涉及包含以多元醇或非還原糖穩(wěn)定的hCG的液體藥物組合物。該組合物以甘露糖醇穩(wěn)定為佳。在最佳實施例中,這些組合物是在pH7的磷酸鹽緩沖液中的水溶液。這些組合物易于注射,因此避免了冷凍干燥粉末的重建,簡化了使用方法。文檔編號A61K31/047GK1179724SQ95197791公開日1998年4月22日申請日期1995年3月21日優(yōu)先權日1995年3月21日發(fā)明者F·薩馬利塔尼,P·納塔爾申請人:應用研究系統(tǒng)Ars股份公司